CN113670876A - 基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法 - Google Patents

基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料(AuNCs‑MnO2NSs)构建的毒死蜱比率荧光检测法。本发明，MnO2NSs具有荧光猝灭作用和仿酶催化活性，高效猝灭AuNCs荧光，同时催化邻苯二胺生成发光氧化产物OPDox，AChE催化硫代乙酰胆碱生成的硫代胆碱，可将MnO2NSs还原生成Mn2+，降低荧光猝灭能力和仿酶活性，使得AuNCs(645nm)荧光强度升高，OPDox(550nm)荧光强度下降。毒死蜱可特异抑制AChE活性，从而根据体系荧光切换，构建毒死蜱的比率荧光法(线性范围0.005‑0.25μg mL‑1，检出限0.27ng mL‑1)。同时建立便携化水凝胶平台，借助手持紫外灯可清晰显示，随着毒死蜱浓度增加，体系由红色变为黄色。本发明提升了检测毒死蜱的灵敏度和抗干扰能力，水凝胶便携试剂盒也为农药现场检测提供可能。

Description

基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于二氧化锰纳米片(MnO2Nanosheets，MnO2 NSs)仿酶荧光复合材料的制备方法，并建立了乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)介导的毒死蜱比率荧光法，同时构建了水凝胶平台，为现场检测毒死蜱便携式试剂盒的开发提供一种新方法及可靠依据。
背景技术
毒死蜱(Chlorpyrifos，CP)是目前世界上应用最广泛的中等毒性有机磷农药之一，杀虫谱广，在土壤中持效期较长。目前，我国CP主要应用于水稻、玉米、小麦和棉花的种植过程中，但CP的过度使用和不当使用也造成了土壤、水体等的严重污染，环境中存在的CP可通过生物富集作用残存动植物体内，通过食物链进入人体，抑制胆碱酯酶的活性，导致神经毒性和生殖毒性，甚至影响胚胎的正常生长发育，对人类身体健康安全造成严重威胁。因此，对环境及农产品中CP残留检测至关重要。传统CP检测方法主要有色谱法、质谱法、酶联免疫法等，虽然这些方法有检出限低、准确度高、选择性好等优点，但在快检领域的应用表现出一定的局限性，如前处理复杂、需专业操作人员、成本高、耗时长等。基于酶(如乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶等)的荧光传感器具有简单、快速、灵敏度高等优点，已经被开发应用于毒死蜱的检测中。目前，酶基荧光传感器通常为单一荧光信号输出，非常容易受到如仪器参数、检测微环境、荧光探针局部浓度等因素影响，进而影响传感器对目标物的精确定量分析。本方法建立的比率荧光法，构建了自校准系统，可有效减弱仪器和环境带来的干扰，是克服以上问题、确保可靠性的最有效策略。同时，本方法建立的毒死蜱比率荧光探针随着CP浓度变化，在紫外灯下呈现明显的颜色变化，易于肉眼识别，便于现场、实时、便携式测量，因此，本方法在毒死蜱及其他农药残留检测分析方面具有重要的应用价值。
二氧化锰纳米片(MnO2 Nanosheets，MnO2 NSs)是一种与环境有良好相容性的二维纳米材料，MnO2 NSs中MnO6八面体中Mn2+的d-d跃迁使其吸收光谱较宽(200-600nm)，与许多有机染料、荧光纳米颗粒、量子点和金属纳米团簇的荧光激发、发射光谱重叠，使MnO2 NSs具有很强的荧光猝灭能力；Mn4+的价态为中间价，使MnO2 NSs具有强氧化能力，可以通过与还原性物质(如谷胱甘肽、硫代胆碱)的氧化还原反应快速降解为Mn2+，将MnO2 NSs荧光猝灭能力和氧化能力联合使用可开发“猝灭-恢复”型荧光传感器实现对目标物的检测。同时，MnO2 NSs还具有类氧化酶活性，可催化氧化邻苯二胺(O-Phenylenediamine，OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'–Tetramethylbenzidine，TMB)等生成发光氧化产物。与其他大部分具有仿酶活性的纳米材料相比，MnO2 NSs催化氧化过程无需H2O2，对检测环境要求更低，更适合现场检测。因此，MnO2 NSs可作为开发比率型荧光传感器的有利工具材料。目前，针对农药的现场快速检测，已经开发出胶体纳米金颗粒试纸条对农药进行定性或者半定量的检测，这些试纸条有成本较低、操作方便、便于携带等优点，但试纸条稳定性较差。因此，采用固相传感载体特别是基于水凝胶的响应平台，具有稳定性高、抗干扰能力强和灵活性好的优点，为实现农药现场快速检测提供可能。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术存在的操作复杂、成本高、单荧光易受干扰等问题，提供了一种基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的一步合成方法，并基于MnO2NSs对金纳米簇(Gold nanoclusters，AuNCs)的高效猝灭及催化氧化OPD生成发光氧化产物2，3-二氨基吩嗪(2,3-Diaminophenazine，OPDOX)，利用AChE来触发MnO2 NSs的分解，同时根据CP对AChE的高效抑制作用，开发了操作简单的毒死蜱比率荧光法，有效降低环境和仪器带来的干扰，同时借助手持紫外灯下体系颜色的变化，实现了对毒死蜱的可靠、灵敏检测和可视化监测，为比率荧光传感器在有机磷农药残留检测中的应用提供新方法。同时制备一种水凝胶体系，为CP的现场快速检测试剂盒的制备提供一种新思路。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种基于金纳米簇-二氧化锰纳米片的毒死蜱比率荧光法，其步骤如下：
A、牛血清白蛋白功能化的金纳米簇(AuNCs)的制备：
将HAuCl4(10mmol L-1)和BSA(50mg mL-1)放于37℃温育10min，按体积比1:1混合，剧烈搅拌2-5min；将NaOH(1mol L-1)相比于上述混合溶液1:20加入到上述溶液中，于37℃下剧烈搅拌反应12小时，即可获得黄色AuNCs溶液，通过透析(1kDa)进行纯化，冷冻抽干获得黄色AuNCs粉末，超纯水溶解稀释至0.20mg mL-1备用。
B、MnO2 NSs仿酶荧光复合材料的制备：
将步骤A的AuNCs溶液与超纯水按照体积比80:313混合，缓慢搅拌5min；然后将MnCl2·4H2O(50mmol L-1)相比于上述混合溶液3:655加入到上述溶液中，缓慢搅拌1小时；随后将NaOH(1mol L-1)相比于上述混合溶液1:99加入到上述溶液中，缓慢搅拌反应4小时，得到棕黄色AuNCs-MnO2 NSs复合材料溶液，通过透析(1kDa)进行纯化，放置于4℃备用。
C、毒死蜱比率荧光分析：
在多个1.5mL离心管中分别加入25μL不同浓度的CP、25μL 180mU mL-1AChE混匀，在37℃下300rpm反应40min。然后加入25μL 2mmol L-1ATch、25μL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0，100mmol L-1)混匀，在37℃下300rpm反应25min。随后加入50μL步骤B的AuNCs-MnO2 NSs、25μL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0，100mmol L-1)、300μL超纯水混匀，在37℃下300rpm反应15min。最后加入5μL 0.6mmol L-1OPD和320μL超纯水混匀，短暂离心后，在50℃、300rpm避光震荡条件下反应10min，于25℃下静置5min。在室温下使用荧光分光光度计、紫外-可见分光光度计测定溶液的荧光发射光谱和紫外-可见吸收光谱并进行紫外光下拍照。
D、水凝胶平台的制备：
称量60mg海藻酸钠，倒入15mL离心管中，加入3mL超纯水，摇晃后超声30min取出备用。
在酶标条孔中分别加入10μL不同浓度的CP、10μL AChE(180mU mL-1)、100μL海藻酸钠和30μL Ca(NO3)2·4H2O(5mg mL-1)搅拌均匀后于37℃下反应40min，再加入10μL Tris-HCl缓冲液和10μL ATch(2mmol L-1)搅拌均匀后反应25min；随后再加入20μL AuNCs-MnO2NSs、10μL Tris-HCl缓冲液搅拌均匀后继续反应15min；加入2μL OPD(0.6mmol L-1)后搅拌均匀后于50℃下反应10min，冷却后进行紫外光下拍照。
本发明机理如下：
AuNCs-MnO2 NSs仿酶荧光复合材料中，MnO2 NSs可有效猝灭AuNCs的荧光。ATch在AChE的催化下生成TCh，TCh可将MnO2 NSs还原生成Mn2+，使MnO2 NSs荧光猝灭能力大大减弱，同时，其类氧化酶活性大大降低，体系中645nm处AuNCs的荧光升高，550nm处OPDOX的荧光下降。通过CP对AChE的不可逆抑制，构建CP比率荧光法。本比率荧光法，利用简单方法合成了水溶性好、发光稳定的AuNCs-MnO2 NSs，充分发挥了AChE的高效催化和CP对AChE活性的特异抑制作用，使本方法有灵敏度高、选择性好、可靠性高的应用优势。
本发明提供的这种酶介导的比率荧光检测方法，为比率荧光探针在有机磷农药检测中的实际应用提供技术手段，为水凝胶固相便携试剂盒在毒死蜱检测中提供技术支撑，在环境检测、食品分析方面展现出巨大的应用前景。
附图说明
图1：实施例4所述，为基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法的原理示意图。
图2：实施例4所述，为本方法的可行性验证，邻苯二胺、仿酶荧光复合材料、仿酶荧光复合材料+邻苯二胺、仿酶荧光复合材料+硫代乙酰胆碱+邻苯二胺、仿酶荧光复合材料+硫代乙酰胆碱+乙酰胆碱酯酶+邻苯二胺和仿酶荧光复合材料+硫代乙酰胆碱+乙酰胆碱酯酶+邻苯二胺+毒死蜱的荧光光谱。
图3：实施例3所述，基于仿酶荧光复合材料+邻苯二胺荧光体系实现AChE的有效检测。图为仿酶荧光复合材料+硫代乙酰胆碱+邻苯二胺体系存在不同浓度AChE(0,0.25,0.5,2.5,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30mU mL-1)的荧光光谱。
图4：实施例3所述，为荧光比率(F550/F645)与AChE浓度的线性关系图。
图5：实施例3所述，为仿酶荧光复合材料+硫代乙酰胆碱+邻苯二胺体系存在不同浓度AChE(0,0.25,0.5,2.5,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30mU mL-1)的紫外-可见吸收光谱。
图6：实施例3所述，为仿酶荧光复合材料+硫代乙酰胆碱+邻苯二胺体系存在不同浓度AChE(0,0.25,0.5,2.5,4,5,6,7,8,9mU mL-1)时溶液在紫外光下照片。
图7：实施例4所述，基于仿酶荧光复合材料传感探针实现毒死蜱的比率荧光分析，为在仿酶荧光复合材料+硫代乙酰胆碱+乙酰胆碱酯酶+邻苯二胺体系存在不同浓度毒死蜱(0,0.005,0.025,0.05,0.1,0.15,0.25μg mL-1)的荧光光谱。
图8：实施例4所述，为荧光比率(F550/F645)与毒死蜱浓度对数的线性关系图。
图9：实施例4所述，为在仿酶荧光复合材料+硫代乙酰胆碱+乙酰胆碱酯酶+邻苯二胺体系存在不同浓度毒死蜱(0,0.005,0.025,0.05,0.1,0.15,0.25μg mL-1)的紫外-可见吸收光谱。
图10：实施例4所述，为仿酶荧光复合材料+硫代乙酰胆碱+乙酰胆碱酯酶+邻苯二胺体系存在不同浓度毒死蜱(0,0.00005,0.00025,0.0005,0.0025,0.005,0.025,0.05,0.1,0.15,0.25μg mL-1)存在时溶液在紫外光下照片。
图11：实施例4所述，为其他物质(0.5μg mL-1)对本分析方法检测毒死蜱(0.25μgmL-1)的干扰反应。
图12：实施例4所述，为本分析方法检测毒死蜱(0.25μg mL-1)的特异性(其它种类农药浓度为0.5μg mL-1)。
图13：实施例6所述，为邻苯二胺、仿酶荧光复合材料、仿酶荧光复合材料+邻苯二胺、仿酶荧光复合材料+硫代乙酰胆碱+邻苯二胺、仿酶荧光复合材料+硫代乙酰胆碱+乙酰胆碱酯酶+邻苯二胺和仿酶荧光复合材料+硫代乙酰胆碱+乙酰胆碱酯酶+邻苯二胺+不同浓度毒死蜱(0,0.00005,0.00025,0.0005,0.0025,0.005,0.025,0.05,0.1,0.15,0.25μg mL-1)存在时水凝胶在紫外光下照片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步地说明。
实施例1：牛血清白蛋白功能化的金纳米簇AuNCs的制备
将5mL的HAuCl4(10mmol L-1)和5mL的BSA(50mg mL-1)放于37℃温育10min，将两者混合，剧烈搅拌5min。将0.5mL的NaOH(1mol L-1)加入到上述溶液中，于37℃下剧烈搅拌反应12小时，即可获得黄色AuNCs溶液，通过透析(1kDa)进行纯化，冷冻抽干获得黄色AuNCs粉末，超纯水溶解稀释至0.20mg mL-1备用。
实施例2：MnO2 NSs仿酶荧光复合材料的制备
取实施例1的2mL AuNCs溶液加入到7.825mL超纯水中，缓慢搅拌5min。然后，将0.075mL MnCl2·4H2O(50mmol L-1)加入到上述溶液中，缓慢搅拌1小时；随后加入0.1mLNaOH(1mol L-1)，缓慢搅拌反应4小时，得到棕黄色AuNCs-MnO2 NSs复合材料溶液，通过透析(1kDa)进行纯化，放置于4℃备用。
实施例3：乙酰胆碱酯酶的比率荧光传感探针设计
检测AuNCs-MnO2 NSs+OPD荧光体系对AChE的敏感性，将2mmol L-1的ATch与不同浓度的AChE(0-600mU mL-1)混匀，在37℃下混合反应25min，随后加入50μL实施例2的AuNCs-MnO2 NSs混匀，在37℃下混合反应15min。最后加入5μL 0.6mmol L-1OPD和320μL超纯水混匀，短暂离心后，在50℃、300rpm避光震荡条件下反应10min，于25℃下静置5min。随着AChE的浓度增加，体系645nm处AuNCs荧光强度逐渐升高，550nm处OPDOX荧光强度逐渐下降(图3)，吸光度逐渐降低(图5)。在AChE终浓度为0.25-9mU mL-1范围内，体系荧光比率(F550/F645，其中F550和F645分别表示体系在550nm和645nm处的荧光强度)与AChE浓度线性相关(R2＝0.991)，当AChE终浓度大于9mU mL-1时，体系荧光比率(F550/F645)几乎不变(图4)。在紫外光下可清晰看到随着AChE浓度的增加，体系颜色中AuNCs特征红色荧光变强，OPDOX特征黄色荧光变弱(图6)。
实施例4：毒死蜱的比率荧光法建立
基于酶的特异性识别调控的AuNCs-MnO2 NSs比率荧光传感平台，构建CP检测体系(图1)。在多个1.5mL离心管中分别加入25μL不同浓度的CP、25μL 180mU mL-1AChE混匀，在37℃下300rpm反应40min。然后加入25μL 2mmol L-1ATch、25μL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0，100mmol L-1)混匀，在37℃下300rpm反应25min。将上述反应液与50μL实施例2的AuNCs-MnO2NSs、25μL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0，100mmol L-1)、300μL超纯水混匀，在37℃下300rpm反应15min。最后加入5μL 0.6mmol L-1OPD和320μL超纯水混匀，短暂离心后，在50℃、300rpm避光震荡条件下反应10min，于25℃下静置5min。在室温下使用荧光分光光度计、紫外-可见分光光度计测定溶液的荧光发射光谱和紫外-可见吸收光谱并进行紫外光下拍照。
本方法原理可行(图2)，随着CP的浓度增加，体系645nm处荧光逐渐下降，550nm处荧光逐渐上升(图7)。在CP终浓度为0.005-0.25μg mL-1范围内，荧光比率(F550/F645)与CP浓度的对数线性相关，线性方程为F550/F645＝2.71+0.92LogC毒死蜱(R2＝0.998)，检出限(LOD)为0.27ng mL-1(图8)，可满足CP的检测。同时，随着CP的浓度增加，体系中MnO2 NSs量逐渐升高，吸光度逐渐升高(图9)，在紫外光下可清晰看到随着CP浓度的增加，体系颜色中红色变弱，黄色变强(图10)，可实现CP的裸眼定性分析。
样品中常见阳离子(Na+、K+、Mg2+)、氨基酸(谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸)、维生素(维生素B1)不会显著影响检测体系的荧光比率变化(图11)，表明该方法具有良好的抗干扰能力。而且，本发明构建的方法对激素类农药(2，4-二氯苯氧乙酸)、菊酯类农药(高效氯氟氰菊酯)、新烟碱类农药(氯噻啉、烯啶虫胺)、氯化烟碱类农药(啶虫脒、吡虫啉)均没有相应，只有CP(0.25μg mL-1)可引起显著的变化(图12)，表明该方法对甲基对氧磷具有较高选择性。
实施例5：实际样品中CP含量的测定
利用本发明，采用标准加入法，对实际样品中的CP进行检测，探讨其实用性。具体样品包括自来水和松花江水，自来水与松花江水利用0.22μm滤膜过滤后，直接添加CP标准液，终浓度分别为0.01、0.05和0.25μg mL-1，并利用本发明开发的比率荧光方法进行检测。如表1所示，实际样品中CP的添加回收率为95.2-101％，相对标准偏差(RSD)在0.64％-7.44％之间，表明该检测方法可应用于实际样品检测中。
表1：应用本发明开发的比率荧光策略检测实际样品中的毒死蜱(n＝3)
Figure BDA0003221348720000071
实施例6：水凝胶平台的制备
称量60mg海藻酸钠，倒入15mL离心管中，加入3mL超纯水，摇晃后超声30min取出备用。
在酶标条孔中分别加入10μL不同浓度的CP、10μL AChE(180mU mL-1)、100μL海藻酸钠和30μL Ca(NO3)2·4H2O(5mg mL-1)搅拌均匀后于37℃下反应40min，再加入10μL Tris-HCl缓冲液和10μL ATch(2mmol L-1)搅拌均匀后反应25min；随后再加入20μL AuNCs-MnO2NSs、10μL Tris-HCl缓冲液搅拌均匀后继续反应15min；加入2μL OPD(0.6mmol L-1)后搅拌均匀后于50℃下反应10min，冷却后进行紫外光下拍照。
如图13所示，该凝胶呈非流动状态，可作为固相传感载体。在紫外光下可清晰看到随着CP浓度的增加，体系颜色中红色变弱，黄色变强，可实现CP的裸眼定性分析。

Claims (9)

1.基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法，其特征在于，其步骤如下：
A、牛血清白蛋白；简称BSA，功能化的金纳米簇；简称AuNCs的制备：
将HAuCl4和BSA放于放于37℃温育10min，按体积比1:1混合，剧烈搅拌2-5min；将NaOH相比于上述混合溶液1:20加入到上述溶液中，于37℃下剧烈搅拌反应12小时，即可获得黄色AuNCs溶液，通过透析进行纯化，冷冻抽干获得黄色AuNCs粉末，超纯水溶解稀释至0.20mgmL-1备用；
B、二氧化锰纳米片；简称MnO2 NSs仿酶荧光复合材料的制备：
将步骤A的AuNCs溶液与超纯水按照体积比80:313混合，缓慢搅拌5min；然后将50mmolL-1MnCl2·4H2O相比于上述混合溶液3:655加入到上述溶液中，缓慢搅拌1小时；随后将1molL-1NaOH相比于上述混合溶液1:99加入到上述溶液中，缓慢搅拌反应4小时，得到棕黄色AuNCs-MnO2 NSs仿酶荧光复合材料溶液，通过1kDa透析进行纯化，放置于4℃备用；
C、毒死蜱比率荧光分析：
在多个1.5mL离心管中分别加入25μL不同浓度的CP、25μL 180mU mL-1AChE混匀，在37℃下300rpm反应40min；然后加入25μL 2mmol L-1ATch、25μL pH＝8.0 100mmol L-1Tris-HCl缓冲液混匀，在37℃下300rpm反应25min；随后加入50μL步骤B的AuNCs-MnO2NSs、25μL pH＝8.0 100mmol L-1Tris-HCl缓冲液、300μL超纯水混匀，在37℃下300rpm反应15min；最后加入5μL 0.6mmol L-1OPD和320μL超纯水混匀，短暂离心后，在50℃、300rpm避光震荡条件下反应10min，于25℃下静置5min；在室温下使用荧光分光光度计、紫外-可见分光光度计测定溶液的荧光发射光谱和紫外-可见吸收光谱并进行紫外光下拍照；
D、水凝胶平台的制备：
称量60mg海藻酸钠，倒入15mL离心管中，加入3mL超纯水，摇晃后超声30min取出备用；
在酶标条孔中分别加入10μL不同浓度的CP、10μL 180mU mL-1AChE、100μL海藻酸钠和30μL 5mg mL-1Ca(NO3)2·4H2O搅拌均匀后于37℃下反应40min，再加入10μL Tris-HCl缓冲液和10μL 2mmol L-1ATch搅拌均匀后反应25min；随后再加入20μL AuNCs-MnO2 NSs、10μLTris-HCl缓冲液搅拌均匀后继续反应15min；加入2μL 0.6mmol L-1OPD后搅拌均匀后于50℃下反应10min，冷却后进行紫外光下拍照。
2.如权利要求1所述的一种基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法，其特征在于，步骤A所述的HAuCl4的浓度为10mmol L-1，BSA的浓度为50mg mL-1，NaOH的浓度为1mol L-1。
3.如权利要求1所述的一种基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法，其特征在于，步骤A所述HAuCl4及BSA需提前在37℃下温育10min，整个合成过程在37℃下进行。
4.如权利要求1所述的一种基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法，其特征在于，步骤B所述的MnCl2·4H2O的浓度为50mmol L-1，NaOH的浓度为1mol L-1。
5.如权利要求1所述的一种基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法，其特征在于，步骤C所述的Tris-HCl缓冲液pH为8.0，浓度为100mmol L-1。
6.如权利要求1所述的一种基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法，其特征在于，步骤C进行荧光光谱测定时，对AuNCs参数设置为激发波长为580nm，发射波长范围为600-850nm；对氧化型邻领苯二胺；简称OPDOX参数设置为激发波长为440nm，发射波长范围为460-700nm；激发与发射狭缝分别为10、10nm，响应时间为0.25s。
7.如权利要求1所述的一种基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法，其特征在于，步骤C中AuNCs最佳发射波长位于645nm处，OPDOX最佳发射波长位于550nm处。
8.如权利要求1所述的一种基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法，其特征在于，步骤C进行紫外-可见吸收光谱检测的扫描范围为700-300nm。
9.如权利要求1所述的一种基于二氧化锰纳米片仿酶荧光复合材料的毒死蜱比率荧光法，其特征在于，手持紫外灯下拍照在365nm照射下进行。
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