CN108822833A - 双发光的硅纳米粒子/金纳米簇复合物比率荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

双发光的硅纳米粒子/金纳米簇复合物比率荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于双发光硅纳米粒/金纳米簇复合物的甲亢平比率荧光探针的制备方法和应用。本发明成功制备了蓝色荧光的SiNPs和红色荧光的AuNCs，通过EDC/NHS活化和偶联，制备了由SiNPs和AuNCs组成的新型功能化纳米复合物SiNPs/AuNCs，显示出双荧光发射。当加入甲亢平CBZ时，由于CBZ中共轭结构与AuNCs之间发生电子转移，AuNCs的荧光强度在666nm处明显降低，而SiNPs的荧光强度在450nm处几乎不变，由此构置了新的用于CBZ检测的比率荧光探针体系。在最佳实验条件下，线性检测CBZ的浓度范围为0‑5μM，最低检测限为0.02μM。

Description

双发光的硅纳米粒子/金纳米簇复合物比率荧光探针及其制 备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料和荧光探针的制备技术领域，具体涉及一种基于硅纳米粒/金纳米簇复合物的甲亢平比率荧光探针的制备方法和应用。
背景技术
甲亢平(CBZ)是硫代咪唑家族的一种药物，通过促进甲状腺分泌甲状腺激素而广泛用于治疗人体甲亢和格雷夫斯病。这种药物虽然可以在人类和动物的生长过程中起到重要作用，但也可能会引起一些副作用，如皮肤发炎，过敏和发烧引起的咽炎。甚至在极少数情况下，还可能引起如肾炎和肝硬化等严重疾病。因此，对甲亢平的测定在临床分析和药物用量控制中具有重要意义。电位滴定法、比色法、色谱法和电泳法等传统方法已被用于测定甲亢平，然而这些方法普遍存在耗时费力，仪器昂贵，操作复杂等缺陷。当前，开发一种简单、快速、高效的甲亢平检测方法依然是十分必要的。
金纳米簇AuNCs具备量子产率高，Stokes位移大，光/化学稳定性高，毒性低等诸多优点，已广泛用于生化分析和生物成像应用领域。AuNCs由几个到几十个金原子组成，具有离散的电子能级，一般尺寸小于2nm且与传导电子的费米波长相当，由于表面等离子体谱带消失，可观察到尺寸依赖性荧光性质。目前，基于AuNCs的荧光传感器已被应用于检测生物分子，如Niu等人开发了CDs/AuNCs纳米复合物作为荧光探针用于镉离子和L-抗坏血酸的检测。Ding等人将BSA作为稳定剂制备了AuNCs，并与异硫氰酸荧光素FITC形成复合物，分别作为参考和响应信号实现对pH的检测。Song等人通过使用AuNCs和CdSe/ZnS QDs@SiO2作为双发射纳米颗粒，开发了基于羧肽酶Y来监测酶活性的荧光方法。
硅是地壳中含量第二多的元素，在生物地球化学进程中起着至关重要的作用。硅纳米粒SiNPs是一种新型的荧光纳米材料，由于其独特的光学特性，水溶性好，优异的生物相容性，电子透过性，表面切割性，高的光稳定性，低毒性和低成本等优势引起了广泛的关注。与有机染料和半导体量子点相比，SiNPs的低毒性和良好的生物相容性在生物学和生物医学研究中具有较大的优势。截至目前，尚未有采用SiNPs/AuNCs复合物来构建甲亢平比率荧光探针的国内外文献和相关专利的报道。
发明内容
针对以上现有技术，本发明的目的是提供一种用于检测甲亢平的SiNPs/AuNCs复合物比率荧光探针的制备方法和应用，基于该双发光复合物的比率荧光探针能够对甲亢平进行高效的定量检测。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
在本发明的第一个方面，提供一种双发光SiNPs/AuNCs复合物的制备方法，该方法包括：将蓝色荧光的硅纳米粒和红色荧光的金纳米簇通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺钠(EDC/NHS)偶联，制得双发光SiNPs/AuNCs复合物。
在本发明的第二个方面，提供采用上述方法制得双发光SiNPs/AuNCs复合物。
在本发明的第三个方面，提供上述双发光SiNPs/AuNCs复合物比率荧光探针用于检测甲亢平的应用。
在本发明的第四个方面，提供一种检测甲亢平的分析方法，该方法包括使用上述双发光SiNPs/AuNCs复合物进行检测的步骤。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明成功制备了蓝色荧光的SiNPs和红色荧光的AuNCs，通过EDC/NHS活化和偶联，制备了SiNPs与AuNCs组成的新型功能化纳米复合物SiNPs/AuNCs，显示出双荧光发射特征。当加入CBZ时，由于CBZ中共轭结构与AuNCs之间发生电子转移，AuNCs荧光强度在666nm处明显降低，而SiNPs荧光强度在450nm处几乎不变，由此构置了新的用于CBZ检测的比率荧光探针体系。在最佳实验条件下，检测CBZ的线性线性范围为0-5 μM，最低检测限为0.02μM。实现了对CBZ的简单、快速和高效检测。实验结果表明，相比样品中可能存在的其他分子，该探针对CBZ的响应具备高选择性和高灵敏性，可高效测定人血清样品中的CBZ，同时具有较高检测回收率和较低相对标准偏差。
(2)本发明纳米复合物SiNPs/AuNCs的制备方法简单，制备效率高。
附图说明
构成本发明一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：SiNPs/AuNCs纳米复合物比率荧光探针的构造和甲亢平检测的示意图。
图2：(a)SiNPs,AuNCs以及SiNPs/AuNCs纳米复合物的红外光谱；(b)SiNPs和AuNCs的吸收光谱；(c)SiNPs/AuNCs的XPS光谱；(d)Au 4f的XPS光谱。
图3：SiNPs,AuNCs和SiNPs/AuNCs纳米复合物的荧光发射光谱。
图4：(a)加入不同浓度CBZ后SiNPs/AuNCs的荧光发射光谱；(b)I450/I666和CCBZ之间拟合的线性关系。
图5：加入5μM CBZ，1.0mM其他生物分子和离子后SiNPs/AuNCs纳米复合物的相对荧光强度(F0-F/F0)变化。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中检测甲亢平的方法存在不足，为解决如上的技术问题，本发明提出了一种双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物的制备方法，该方法包括：将蓝色荧光硅纳米粒和红色荧光金纳米簇通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和 N-羟基琥珀酰亚胺钠偶联，制备得到双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物。
本发明中蓝色荧光的硅纳米粒并没有特别的限定，可通过现有技术中多种方法制备得到。为了使甲亢平的检测效果更加优异，在本发明优选的实施方式中，提供了蓝色荧光的硅纳米粒的制备方法，该方法包括：将(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTES)与分散有乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)的水溶液混合，搅拌均匀；然后将得到的混合物进行水热反应；再将含有产物的溶液进行透析，干燥，得到蓝色荧光的硅纳米粒。具体包括以下步骤：将2mLAPTES加入到分散有0.392g EDTA的8mL二次蒸馏水中，然后将混合物搅拌10min；将混合物密封于不锈钢高压釜中，然后在180℃下加热1h；产物自然冷却，将溶液在截留分子量为1000Da的透析袋中透析24小时，间隔1h换水一次；最后将产物冷冻干燥得到粉末，即为蓝色荧光的硅纳米粒。
本发明通过以上方法制备得到的蓝色荧光的硅纳米粒粒径为1～2.5nm。
本发明中的红色荧光的金纳米簇并没有特别限定，可通过现有技术中多种方法制备得到。为了使甲亢平的检测效果更加优异，在本发明优选的实施方式中，提供了一种红色荧光的金纳米簇的制备方法，该方法包括：使用牛血清白蛋白作为稳定剂和氢氧化钠作为还原剂制备红色荧光的金纳米簇。进一步包括：将HAuCl4水溶液和BSA溶液混合，搅拌均匀；向混合液中加入NaOH溶液进行孵育；最后纯化干燥制备得到红色荧光的金纳米簇。具体包括以下步骤：在37℃恒温条件下，在剧烈搅拌下将HAuCl4水溶液(5mL,10mM)加入到BSA溶液(5mL,50mg mL-1)中；2min后逐滴将NaOH溶液(0.5mL,1M)加入混合物中，并将混合物在37℃下孵育12h；所得溶液在10000rpm下离心10min，纯化干燥后获得红棕色粉末，即为红色荧光的金纳米簇。
本发明通过以上方法制备得到的红色荧光的金纳米簇的平均粒径为1nm。
在本发明优选的实施方式中，所述双发光硅纳米粒/金纳米簇复合物的制备方法包括：
将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺钠溶解在磷酸盐缓冲液中得到EDC/NHS混合液，将此混合液、蓝色荧光的硅纳米粒和红色荧光的金纳米簇混合，然后进行超声处理，得到双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物。
优选的，所述蓝色荧光的硅纳米粒和红色荧光的金纳米簇的质量比例为1:(1.5～3)。
具体的制备方法包括：
将15mg的EDC和10mg的NHS溶解于5mL的PBS(1mM,pH＝7.4)中；在搅拌下，将1mL的EDC/NHS加入到20mL(1mg mL-1)的AuNCs中，再将10mL(1mg mL-1)的SiNPs 加入，在超声处理下混合30min，即得双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物。
在本发明一个典型的实施方式中，采用上述方法制备得到的双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物。该复合物能够显示出双荧光发射，在360nm波长光激发下，能够在450nm和666nm处显示出两个不同的荧光发射峰。
在本发明又一个典型的实施方式中，提供上述双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物在制备用于检测甲亢平的比率荧光探针中的应用。其荧光探针构造和甲亢平检测如图1所示。
在本发明又一个典型的实施方式中，提供一种检测甲亢平的方法，该方法包括使用上述双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物检测的步骤。
当加入甲亢平CBZ时，由于CBZ中共轭结构与AuNCs之间发生电子转移，AuNCs的荧光强度在666nm处明显降低，而SiNPs荧光强度在450nm处几乎不变，由此构置了新的用于CBZ检测的比率荧光探针体系，实现了对CBZ的高灵敏和选择性检测。
在本发明优选的实施方式中，提供一种检测甲亢平的分析方法，该方法包括使用上述双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物进行检测的步骤。
进一步的，该方法包括以下步骤：
(1)标准曲线的绘制：在双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物溶液中加入不同浓度的甲亢平溶液，检测不同浓度目标物的荧光发射强度，绘制标准曲线及得到线性方程；
(2)实际样品检测：将实际样品加入双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物溶液中，检测其荧光发射强度，根据步骤(1)中的线性方程，即得甲亢平的浓度。
为使本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
1、试剂与仪器
试剂：甲亢平，HAuCl4，BSA，MW＝68000，NaOH，(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTES)，N-羟基琥珀酰亚胺钠(NHS)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)从阿拉丁试剂网购买。Lyz，GSH，AA，葡萄糖，KCl，CaCl2，MgCl2， BaCl2购买自国药集团化学试剂有限公司。所有化学试剂均为分析纯。适当地混合Na2HPO4和NaH2PO4制备磷酸盐水缓冲液PBS。实验中使用二次蒸馏水。
仪器：UV-2450紫外分光光度计(日本岛津)；JEM-1400透射电子显微镜；NicoletUSA 5700傅立叶变换红外光谱仪；FLSP 920荧光分光光度计(Edinburgh Instruments,U.K.)；RE52CS-2旋转蒸发器；TG1650-WS高速离心机；Thermo ESCALAB 250XiX射线光电子能谱(XPS)(美国赛默飞世尔科技)。
2、SiNPs，AuNCs与SiNPs/AuNCs复合物的制备
SiNPs的制备：将2mL APTES加入到分散有0.392g EDTA 8mL二次蒸馏水中，然后将混合物搅拌10分钟。将此混合物密封于不锈钢高压釜中，在180℃下加热1h。产物自然冷却，将溶液在截留分子量为1000Da的透析袋中透析24小时，间隔1h换水一次。将产物冷冻干燥得到粉末，然后分散在二次蒸馏水中用于进一步表征和使用。
AuNCs的制备：使用BSA作为稳定剂和NaOH作为还原剂来制备红色荧光的AuNCs。实验步骤如下：在37℃恒温条件下，在剧烈搅拌下将HAuCl4水溶液(5mL,10mM)加入到 BSA溶液(5mL,50mg mL-1)中。2min后逐滴将NaOH溶液(0.5mL,1M)加入混合物中，将混合物在37℃下孵育12h。所得溶液在10000rpm下离心10min纯化干燥，获得红棕色粉末并分散在二次水中用于进一步表征和使用。
SiNPs/AuNCs纳米复合物的制备：将15mg EDC和10mg NHS溶解于5mL的PBS(1 mM,pH＝7.4)中。在搅拌下，将1mL EDC/NHS加入到20mL(1mg mL-1)AuNCs中，再加入10mL(1mgmL-1)SiNPs，在超声处理下混合30分钟。该溶液保持在4℃保存，以备进一步使用。
3、结果
光谱表征：FT-IR光谱证实了AuNCs存在的有机官能团，如图2(a)所示。在3415cm-1处表现出O-H和N-H伸缩振动，在1651cm-1处羧基的C＝O伸缩振动和1490cm-1处的N-H 弯曲振动。这些官能团可归因于来自BSA的-NH2，-COOH和-OH亲水基团。在SiNPs的 FT-IR光谱图2(a)中显示了宽的N-H和O-H伸缩振动，最大值为1587和1410cm-1，证实了羧基和胺基团的存在，而1136和1028cm-1处的峰归因于Si-O键伸缩振动。吸收光谱表征如图2(b)所示，AuNCs在～500nm处显示特征吸收带，而SiNPs在～265nm处具有特征吸收带，CBZ在～290nm处具有尖锐吸收峰。图2(c)是SiNPs/AuNCs纳米复合物XPS表征。图中285.9，400.5，532.6，102.4和84eV处五个峰分别来自C 1s，N 1s，O 1s，Si 2p和Au 4f。在图2(d)中，Au 4f的XPS光谱在83.8eV和86eV存在两个峰值，证明在AuNCs中Au的价态在Au(0)和Au(1)之间。
研究制备样品的光谱性质：在360nm最佳波长激发下，图3中观察到相应的发射光谱。 SiNPs/AuNCs纳米复合物的发射光谱在450nm和666nm处显示两个不同的荧光峰，这来自于SiNPs和AuNCs的两个特征荧光发射峰。
实施例2
在SiNPs/AuNCs纳米复合物溶液中加入CBZ的浓度范围为0-5μM时，在图4(a)中可以观察到在666nm处荧光发射强度呈现规律性下降，而SiNPs在450nm处荧光几乎不变。在图4(b)中绘制了I450/I666与CCBZ之间的线性关系，在0至5μM范围内表现出良好的线性关系。线性方程表示为I450/I666＝104.1CCBZ+0.742(R2＝0.9993)。由3σ/k(σ是空白溶液的六次重复检测标准偏差，k是校准曲线斜率)计算出检测限LOD为0.02μM。
实施例3
CBZ的选择性和灵敏性以及在实际样品中的检测：在搅拌条件下，将CBZ加入到含有 SiNPs/AuNCs纳米复合物中制备一组混合溶液，其中CBZ最终浓度调节为0-5μM。在360nm激发下分别测量不同浓度混合溶液的荧光发射光谱。荧光发射峰强度～450nm来自SiNPs(I450)，在～666nm来自AuNCs(I666)被转化为(I450/I666)。绘制I450/I666和CCBZ之间的线性关系，构建CBZ的比率荧光传感器。在同时存在CBZ(5μM)与其他生物分子如AA，GSH，Lyz，葡萄糖，KCl，CaCl2，MgCl2和BaCl2(0.1μM)，PBS(1mM,pH 7.4)分散的SiNPs/AuNCs 纳米复合物。分别测量含有各类分子的不同混合物溶液的荧光发射光谱。真实样品的检测，取一位健康青年志愿者的真实人血清样品用PBS稀释50倍，不需进一步处理。加入一系列含有CBZ标准浓度到复合物溶液中，静置20min。
结果：与其他CBZ检测方法相比如表1所示，本实验设计的比率荧光传感器的检测范围宽，LOD低。该荧光探针对于CBZ检测具备一定的优越性。为评估该探针对CBZ的选择性和灵敏性检测，选择可能在人真实血清中共存的生物分子或离子作为CBZ潜在干扰物，包括Lyz，GSH，AA，葡萄糖，KCl，CaCl2，MgCl2和BaCl2。对比实验结果如图5所示， 5μM CBZ引起相对荧光强度(F0-F)/F0发生显著变化，而其它干扰物仅引起轻微变化。这些结果意味着，潜在干扰不足以对(F0-F)/F0产生明显影响。如表2所示，通过线性方程计算该探针检测CBZ的检测值与添加的检测值基本相符，检出回收率高达98.2-101％，相对标准偏差RSD较低。
表1不同分析方法对CBZ检测的简要比较。.
其中，[1]Spectroscopy Letters.34(2001)325-334.；[2]Analytica ChimicaActa.505(2004)129-133.)； [3]Analyst,1995,120(1):129-133.；[4]Analytica ChimicaActa.308(1995)457-461.；[5]Journal of the Chinese Chemical Society.51(2004)363-366。
表2通过使用CBZ比率FL探针检测真实人血清样品中的CBZ。
注释：a样品是通过用PBS 50倍稀释实际人血清制备。
b所有检测结果表示均为六次重复测定的平均值±标准偏差(SD)。
c相对标准偏差(RSD)定义为(SD/平均)×100％。
本发明制备了蓝色荧光的SiNPs和红色荧光的AuNCs，通过EDC/NHS偶联，制备了SiNPs和AuNCs新型功能化纳米复合物SiNPs/AuNCs，显示双荧光发射。当加入CBZ时， CBZ中共轭结构与AuNCs之间发生电子转移，AuNCs荧光强度在666nm处明显降低，而 SiNPs荧光强度在450nm处几乎不变，由此构置了新的用于CBZ检测的比率荧光探针体系。在最佳实验条件下，线性检测CBZ范围为0-5μM，最低检测限为0.02μM。实现了对CBZ 高灵敏和选择性检测。实验结果表明，该比率荧光探针复合物对CBZ的选择性和灵敏性检测要高于实际样品中可能共存的其他分子，能够高效测定人血清样品中的CBZ，且具有高检测回收率和低RSD。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于硅纳米粒/金纳米簇复合物的甲亢平比率荧光探针的制备方法，其特征是，该方法包括：将蓝色荧光的硅纳米粒和红色荧光的金纳米簇通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺钠活化和偶联，制备得到双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述蓝色荧光的硅纳米粒是通过以下方法制备得到：将(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTES)与分散有乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)的水溶液混合，搅拌均匀；然后将混合物进行水热反应；反应结束后将含有产物的溶液进行透析，干燥，得到蓝色荧光的硅纳米粒。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述红色荧光的金纳米簇通过以下方法制备得到：将HAuCl4水溶液和牛血清白蛋白溶液混合，搅拌均匀；再向混合液中加入NaOH溶液进行孵育；纯化干燥后制备得到红色荧光的金纳米簇。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物的制备方法包括：
将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺钠溶解在磷酸盐缓冲液中得到EDC/NHS混合液；将此混合液、蓝色荧光的硅纳米粒和红色荧光的金纳米簇混合，进行超声处理，得到双发光的硅纳米粒/金纳米簇复合物；
优选的，所述蓝色荧光的硅纳米粒和红色荧光的金纳米簇的质量比为1:(1.5～3)。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述蓝色荧光的硅纳米粒粒径为1～2.5nm。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：红色荧光的金纳米簇平均粒径为1nm。
7.采用权利要求1～6中任一项所述的方法制备得到双发光硅纳米粒/金纳米簇复合物。
8.如权利要求7所述的双发光硅纳米粒/金纳米簇复合物，其特征是：该复合物能够显示出双荧光发射，在360nm波长光激发下，在450nm和666nm处显示出两个不同的荧光发射峰。
9.权利要求7或8所述的双发光硅纳米粒/金纳米簇复合物作为比率荧光探针在检测甲亢平中的应用。
10.一种检测甲亢平的分析方法，其特征是：该方法包括使用权利要求7或8所述的双发光硅纳米粒/金纳米簇复合物进行检测的步骤。
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