CN110330974B - 一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针的制备方法，包括以下步骤：(1)硅量子点制备：将3‑氨丙基三乙氧基硅烷、柠檬酸钠在甘油中反应，得到硅量子点；(2)碲化镉量子点制备：将碲粉、硼氢化钠等反应得到碲氢化钠前驱体；将NaHTe前驱体加入到反应溶液中得到红色CdTe量子点；(3)适配体接枝的硅量子点制备：将制得硅量子点、N‑(3‑二甲氨基丙基)‑N‑乙基碳二亚胺盐酸盐、N‑羟基琥珀酰亚胺、玉米赤霉烯酮适配体在HEPES缓冲溶液中反应生成表面接枝玉米赤霉烯酮适配体的硅荧光量子点；(4)比率荧光探针的合成：将红色碲化镉量子点、表面接枝有玉米赤霉烯酮适配体的硅量子点混合制成荧光探针。本发明荧光探针选择性高、灵敏度高，制备简单，成本低。

Description

一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针的制备及应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体为一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针的制备及应用。
背景技术
玉米赤霉烯酮是一种由镰刀菌分泌，广泛污染谷物类粮食作物的真菌毒素，具有雌激素干扰和肝脏、免疫、遗传毒性。玉米赤霉烯酮污染不仅极大危害农牧业发展，更引发严重的食品安全问题，因此建立简单、快速、灵敏和廉价的玉米赤霉烯酮检测方法对控制谷物及农副产品中毒素含量具有重要的现实应用和社会意义。近年来，相继发展了薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、液质联用法以及酶联免疫法等，这些方法往往存在灵敏度低，或操作复杂，或仪器昂贵的缺点。
发明内容
为解决以上现有问题，本发明提供一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针的制备及应用。本发明通过以下技术方案实现。
一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)硅量子点制备：将3-氨丙基三乙氧基硅烷、柠檬酸钠在甘油中反应，得到硅量子点；
(2)碲化镉量子点制备：将碲粉、硼氢化钠、二次水通气反应得到碲氢化钠前驱体；将氯化镉、巯基丙酸、二次水混合调节pH在10左右，然后将NaHTe前驱体加入到上述混合溶液中，延长反应时间，得到红色CdTe量子点；
(3)适配体接枝的硅量子点制备：将步骤(1)制得硅量子点、N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、玉米赤霉烯酮适配体在HEPES缓冲溶液中反应生成表面接枝玉米赤霉烯酮适配体的硅荧光量子点；
(4)荧光探针的合成：将红色碲化镉量子点、表面接枝有玉米赤霉烯酮适配体的硅量子点、N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺在MES缓冲溶液中反应制成荧光探针。
优选的，所述步骤(1)的反应是在185℃条件下在惰性气体环境中搅拌反应1.5h。
优选的，所述步骤(1)制得的硅量子点为蓝色荧光硅量子点。
优选的，所述步骤(2)中将NaHTe前驱体溶液加入到氩气饱和的氯化镉 和巯基丙酸混合溶液中，室温搅拌反应，之后在100℃条件下回流反应20h。
优选的，所述步骤(2)反应中的氯化镉、碲粉和巯基丙酸各物质的量之比为1：2.4：0.5。
优选的，所述步骤(3)中N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液的反应是在超声波条件下进行。
更优选的，所述步骤(4)制得的荧光探针以超纯水作为透析液，透析24h，收集透析袋内的溶液，冻干保存。
本发明的有益效果：
本发明一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针本发明荧光探针仅对玉米赤霉烯酮有荧光响应，对其他真菌毒素包括黄曲霉毒素、呕吐毒素均无反应，另外对常见粒子Na+、K+、Ca2 +、Co2+、Cu2+、Mg2+、Fe3+、Al3+、 SO4 2-、Cl-均无反应，具有很好的选择性和特异性。该探针可以用于实际样品中玉米赤霉烯酮的定量检测。
本发明一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针选择性高、灵敏度高，制备工艺简单、成本低，易于规模化生产。
附图说明
图1为本发明一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针与玉米赤霉烯酮反应的荧光增量图；
图2为本发明一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针对玉米赤霉烯酮浓度的荧光强度线性关系图；
图3为本发明一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针对其他真菌毒素及常见离子的荧光响应分析。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明的技术方案作更为详细、完整的说明。
具体实施例1，玉米赤霉烯酮荧光探针的制备，包括以下步骤：
(1)硅量子点的制备：将0.3180g的柠檬酸钠加入到8mL的甘油中，通入氩气保护，搅拌20min 后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)(作为硅源)，继续搅拌10min后转移到油浴锅中，温度升高至185℃继续反应1.5h。溶液由原先的透明无色变为黄色，且在紫外灯的照射下有明亮的蓝色荧光，表明硅量子点的生成。将冷却至室温的硅点粗品转移至截留分子量为3500Da(MWCO:3500)的透析袋中，以超纯水作为透析液，透析24h，收集透析袋内的溶液，冻干保存。
(2)碲化镉量子点的制备：在10mL圆底烧瓶中加入0.0636g Te粉、0.363g硼氢化钠、8mL娃哈哈纯净水，通氩气磁力搅拌，得到NaHTe前驱体溶液；在250mL圆底烧瓶中加入0.25mmol氯化镉、53 μg/mL巯基丙酸、180mL水，然后用1mol/L NaOH调pH＝10,然后定容至198mL。取2mL NaHTe前驱体溶液加入到上述氩气饱和的氯化镉 和巯基丙酸混合溶液中，室温搅拌反应30min,之后100℃反应20h，得到红色量子点溶液。以超纯水作为透析液，透析24h，收集透析袋内的溶液。
(3)适配体接枝的硅量子点制备：在1mL硅量子点溶液中缓慢加入1.5mL N-(3-二甲氨基丙基)-N- 乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液(浓度为200μg/mL)，超声反应20min，然后加入 1mL 5μM的玉米赤霉烯酮适配体溶液(pH＝7.4,HEPES缓冲溶液配制)，然后在25℃反应2h，最后，以超纯水作为透析液，透析24h，收集透析袋内的溶液以未反应的适配体和过量的试剂通过透析除去。
(4)荧光探针的合成：取2mL碲化镉量子点溶液和1mL适配体接枝的硅量子点溶液，分散在8mL MES缓冲溶液(0.1mM)中，然后加入1mL N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液(浓度为1mg/mL)，室温反应2h；将红色碲化镉量子点、表面接枝有玉米赤霉烯酮适配体的硅量子点、N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺在MES缓冲溶液中反应制成比率荧光探针。最后，以超纯水作为透析液，透析24h，收集透析袋内的溶液。冻干保存。
具体实施例1中制得的玉米赤霉烯酮比率荧光探针与玉米赤霉烯酮反应的荧光光谱测试：称取0.5mg 实施例1制得玉米赤霉烯酮荧光探针，配成浓度为0.5mg/mL的MES缓冲溶液(0.1mM)，作为母液。荧光光谱测试：将30μL上述母液加入到一定量的MES缓冲溶液(0.1mM)，然后分别加入不同浓度的玉米赤霉烯酮溶液，使荧光探针的终浓度为0.05mg/mL，玉米赤霉烯酮最终浓度分别为0μg/mL、0.6μg/mL、 4μg/mL、6μg/mL、9μg/mL、12μg/mL、13μg/mL。玉米赤霉烯酮加入后，即时测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定以400nm激发：激发与发射的狭缝宽度为5nm/5nm。所得荧光增量图见图1。
该实验结果表明，反应后荧光强度随玉米赤霉烯酮浓度的增加，452nm波长处荧光强度逐渐增加；反应后荧光强度与0-13μg/mL范围内的玉米赤霉烯酮浓度呈线性关系，可以用于玉米赤霉烯酮含量的定量分析检测，以610nm波长处荧光强度为参比波长，以452nm波长处荧光强度为测试波长，两者荧光强度之比与玉米赤霉烯酮浓度的线性关系曲线见图2。
具体实施例1制得的玉米赤霉烯酮比率荧光探针与其他真菌毒素和常见离子反应状况分析。称取0.5 mg实施例1制得玉米赤霉烯酮荧光探针，配成浓度为0.5mg/mL的MES缓冲溶液(0.1mM)，作为母液。荧光光谱测试：将30μL上述母液加入到一定量的MES缓冲溶液(0.1mM)，然后分别加入不同真菌毒素和常见离子的溶液，使荧光探针的终浓度为0.05mg/mL，玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素、呕吐毒素、Na+、 K+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Fe3+、Al3+、SO4 2-、Cl-的最终浓度1μg/mL。荧光发射光谱测定以400nm 激发：激发与发射的狭缝宽度为5nm/5nm。所得荧光增量图见图3。
以上结果表明：实施例1制得的荧光探针对玉米赤霉烯酮具有高度的选择性和特异性，并且在上述条件下，能够从黄曲霉毒素、呕吐毒素等常见的真菌毒素中区分出玉米赤霉烯酮，而且其他离子如Na+、K+、 Ca2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Fe3+、Al3+、SO4 2-、Cl-不干扰玉米赤霉烯酮的测定。
具体实施例1中制得的荧光探针的应用：检测市售的小麦粉和玉米粉中玉米赤霉烯酮。称取0.5g小麦粉和玉米粉，分别加入20mL 0μg/mL，2μg/mL，4μg/mL的玉米赤霉烯酮溶液(甲醇：水＝8：2)， 500W、80℃微波提取5min，离心取上清液，氮气吹干，用于荧光光谱检测；称取0.5mg实施例1制得玉米赤霉烯酮荧光探针，配成浓度为0.5mg/mL的MES缓冲溶液(0.1mM)，作为母液。加入0μg/mL玉米赤霉烯酮标准溶液的小麦粉和玉米粉作为对照，采用具体实施例1制得的荧光探针分别对其余浓度的玉米赤霉烯酮进行检测。
荧光光谱测试：将30μL上述母液加入到玉米赤霉烯酮提取浓缩液中，使用MES缓冲溶液(0.1mM) 为溶剂，使荧光探针的终浓度为0.05mg/mL，荧光发射光谱测定以400nm激发：激发与发射的狭缝宽度为5nm/5nm。检测结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002126889470000041
以上结果表明：实施例1制得的玉米赤霉烯酮比率荧光探针在检测玉米赤霉烯酮时准确率高，回收率在98.50-104.52％。
显然，所描述的实施例仅是本发明的个别实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施，都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）硅量子点制备：将3-氨丙基三乙氧基硅烷、柠檬酸钠在甘油中反应，在185℃条件下在惰性气体环境中搅拌反应1.5h，得到硅量子点；
（2）碲化镉量子点制备：将碲粉、硼氢化钠、二次水通气反应得到碲氢化钠前驱体；将氯化镉、巯基丙酸、二次水混合调节pH在10左右，然后将NaHTe前驱体加入到上述混合溶液中，延长反应时间，得到红色CdTe量子点；
具体是将NaHTe前驱体溶液加入到氩气饱和的氯化镉 和巯基丙酸混合溶液中，室温搅拌反应，之后在100℃条件下回流反应20h；
（3）适配体接枝的硅量子点制备：将步骤(1)制得硅量子点、N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、玉米赤霉烯酮适配体在HEPES缓冲溶液中反应生成表面接枝玉米赤霉烯酮适配体的硅荧光量子点；
（4）荧光探针的合成：将红色碲化镉量子点、表面接枝有玉米赤霉烯酮适配体的硅量子点、N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺在MES缓冲溶液中反应制成荧光探针。
2.根据权利要求1所述的一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）制得的硅量子点为蓝色荧光硅量子点。
3.根据权利要求1所述的一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）反应中的氯化镉、碲粉和巯基丙酸各物质的量之比为1：2.4：0.5。
4.根据权利要求1所述的一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液的反应是在超声波条件下进行。
5.根据权利要求1所述的一种玉米赤霉烯酮比率荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）制得的荧光探针以超纯水作为透析液，透析24h，收集透析袋内的溶液，冻干保存。
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Selection and identification of ssDNA aptamers recognizing zearalenone;Xiujuan Chen et al.,;《Anal Bioanal Chem.》;20130608;第405卷;第6573-6581页 *
采用SELEX 技术筛选玉米赤霉烯酮单克隆抗体DNA 适配子的初步研究;邹绮;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)农业科技辑》;20131015(第10期);第D046-13页 *

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