CN113720791B - 一种纳米模拟酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米模拟酶的制备方法，该方法制备得到的纳米模拟酶稳定性更高，储存时间更长。本发明还公开了由上述方法制备得到的纳米模拟酶，采用该纳米模拟酶检测过氧化钙，不仅降低了检测成本，且简化了检测步骤。本发明公开了一种纳米模拟酶在检测过氧化钙含量的应用，该纳米模拟酶与天然过氧化物酶不同，不易受环境酸碱度的影响；且本发明的纳米模拟酶简化了传统过氧化物酶法需要调节pH的操作步骤，降低了检测成本，成功实现了对面粉中过氧化钙快速、准确的测量。且采用本发明的纳米模拟酶检测面粉中过氧化钙的含量，可消除增白剂过氧化苯甲酰的干扰，操作步骤简单，可用于对实际样品的分析。

Description

一种纳米模拟酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食品检测领域，涉及一种纳米模拟酶及其制备方法和应用。
背景技术
过氧化钙(CaO2)为白色晶体状固体，不溶于水，易溶于甲醇、乙醚等有机溶剂，一般用作防腐剂、杀菌剂、漂白剂、增白剂等。将过氧化钙添加到小麦粉中，可较大程度地漂白小麦粉，同时提高面筋筋力和面团韧性。我国曾广泛使用过氧化钙作为小麦粉处理剂，并规定其最大添加量为0.5g/kg。但研究表明，食用含过量过氧化钙的小麦粉会刺激胃肠道，引发胃部不适，长期食用则会加重人体肝脏代谢负担，从而导致慢性疾病的发生。我国已于2011年禁用过氧化钙作为小麦粉处理剂使用。
目前已报道的检测过氧化钙含量的方法有热分解法、高锰酸钾法、间接碘量法、EDTA法等，而这些方法只适用于过氧化钙纯品的分子，并不能用于小麦粉中过氧化钙的检测。组合分析法可以分别检测小麦粉中过氧化钙、雕白粉、大白粉、滑石粉等四种违禁添加物的含量，该发依次通过酸碱度测试、鲁米诺化学发光测试、灰分测试以及灰分的X射线荧光全元素分析(XRF)和X射线晶体衍射分析(XRD)来进行综合判断。但该方法操作繁琐，且所需以为多为大型一起。分光光度计比色检测法是基于过氧化钙在酸性介质中可生成过氧化氢，过氧化氢在辣根过氧化物酶(HPR)的催化作用下，以KI为增敏剂，可快速氧化季胺[4,4’-(二甲氨基)-二苯基甲烷]显色的原理，建立了小麦粉中过氧化钙的定性检测，但天然酶因其本身具有局限性，如难以制备和提纯、成本高、稳定性差、贮存条件苛刻等缺点，一定程度上增加了检测成本。因此，研究得到一种低成本、操作简单的检测面粉中过氧化钙含量的方法至关重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种纳米模拟酶的制备方法，该方法制备得到的纳米模拟酶具有稳定性高、灵敏性好的特点。
本发明的目的之二在于提供上述制备方法得到的纳米模拟酶。
本发明的目的之三在于提供上述纳米模拟酶的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种纳米模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)向去离子水中加入酸化后的FeCl3溶液，搅拌后匀速滴加Na2SO3，当溶液颜色由红棕色变为黄色时，缓慢加入NH3·H2O溶液并剧烈搅拌，反应得到黑色的Fe3O4纳米颗粒；将混合物冷却至室温，通过外部磁场分离出Fe3O4磁性纳米粒子，洗涤、干燥；
(2)将Fe3O4磁性纳米粒子加入到氯仿中形成混合溶液，然后添加至含CTAB的水溶液中得到分散液，将上述分散液添加至由去离子水、乙二醇、NH3·H2O组成的混合物中，水浴加热并搅拌，然后加入正葵烷搅拌反应，随后滴加1,3,5-三甲苯并继续搅拌，然后加入硅酸四乙酯继续搅拌至反应结束，将反应产物离心，随后萃取、洗涤并干燥，即得包覆SiO2层的Fe3O4纳米颗粒；
(3)将硝酸铜溶于去离子水中，调节pH至10-11，向其中加入步骤(2)得到的包覆SiO2层的Fe3O4纳米颗粒并分散均匀得到混合液，水浴反应生成黑色沉淀，洗涤、干燥得到Fe3O4@SiO2@CuO纳米颗粒。
进一步地，所述步骤(1)中FeCl3与NH3·H2O的摩尔比为1:11.33，FeCl3与Na2SO3摩尔比为3:1。
进一步地，所述步骤(2)中Fe3O4与硅酸四乙酯的添加比例为13.8g:1mL。
进一步地，所述步骤(3)中硝酸铜与包覆SiO2层的Fe3O4的质量比为7:1。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种纳米模拟酶由上述制备方法得到。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
纳米模拟酶用于检测过氧化钙含量。
进一步地，所述纳米模拟酶用于检测面粉中过氧化钙含量。
进一步地，所述纳米模拟酶检测面粉中过氧化钙含量的过程如下：
(1)建立过氧化钙不同浓度梯度与吸光度的标准曲线；
(2)称取面粉试样，加入丙酮溶剂，充分振荡混匀后离心得到沉淀物；向所得沉淀物中加入醋酸溶液进行反应，将反应产物进行离心，取上清液定容，即得待检液；
(3)取步骤(2)得到的待检液于缓冲液中，向其中依次加入纳米模拟酶、TMB，水浴加热，于652nm处测定吸光度；与步骤(1)的标准曲线对比，计算面粉中过氧化钙的含量。
进一步地，所述步骤(1)具体为：称取过氧化钙，加入醋酸溶液进行反应，将反应产物进行离心，取上清液定容即过氧化钙标准工作液；按照浓度梯度将过氧化钙标准工作液添加至缓冲溶液中，依次加入纳米模拟酶、TMB，水浴加热，于652nm处测定吸光度，即得过氧化钙不同浓度梯度与吸光度的标准曲线。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种纳米模拟酶的制备方法，该方法制备得到的纳米模拟酶稳定性更高，储存时间更长。本发明还提供了由上述方法制备得到的纳米模拟酶，采用该纳米模拟酶检测过氧化钙，不仅降低了检测成本，且简化了检测步骤。本发明提供了一种纳米模拟酶在检测过氧化钙含量的应用，该纳米模拟酶与天然过氧化物酶不同，不易受环境酸碱度的影响；且本发明的纳米模拟酶简化了传统过氧化物酶法需要调节pH的操作步骤，降低了检测成本，成功实现了对面粉中过氧化钙快速、准确的测量。且采用本发明的纳米模拟酶检测面粉中过氧化钙的含量，可消除增白剂过氧化苯甲酰的干扰，操作步骤简单，可用于对实际样品的分析。
附图说明
图1为采用本发明过氧化钙检测的标准曲线。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
本发明的纳米模拟酶为Fe3O4@SiO2@CuO纳米颗粒，其制备方法如下：
(1)化学共沉淀法制备Fe3O4内核：在通有N2的三颈烧瓶中加入10.33mL去离子水，然后加入3mL用盐酸酸化后的FeCl3溶液(2mol/L)，搅拌0.5h后匀速滴加2mL Na2SO3(1mol/L)，当溶液颜色由红棕色变成黄色时，开始缓慢加入80mL浓度0.85mol/L的NH3·H2O溶液并剧烈搅拌，反应沉淀出黑色的Fe3O4纳米颗粒。将混合物冷却至室温，通过外部磁场分离出Fe3O4磁性纳米粒子，将其用0.02mol/L NaCl溶液和去离子水洗涤两次，然后在45℃下真空干燥。
(2)Fe3O4纳米颗粒表面包覆二氧化硅层：将0.74mL含有Fe3O4磁性纳米粒子的氯仿溶液(8.4mg/mL)添加到5mL的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液(0.08mol/L)中，将分散液加入到由30mL去离子水，10mL乙二醇和0.7mL NH3·H2O组成的混合物中，70℃水浴加热并以120rpm的速度搅拌10min。然后加入0.7mL正葵烷搅拌40min，随后逐滴滴加0.17mL1,3,5-三甲苯并搅拌2h以进行均质化。加入0.45mL硅酸四乙酯(TEDS)继续搅拌3h后离心，沉淀即为包覆了SiO2层的Fe3O4纳米颗粒，将其放入含有60mg NH4NO3的60mL乙醇中，并在60℃下搅拌2h。重复萃取3次以除去表面活性剂CTAB，然后离心收集产物，用乙醇洗涤后在45℃下真空干燥。
(3)原位生成CuO得到Fe3O4@SiO2@CuO纳米颗粒：将0.07g硝酸铜在15mL去离子水中充分溶解后，用1mol/L的NaOH调节溶液的pH值至10～11之间，加入步骤(2)制备得到的0.01g包覆了SiO2层的Fe3O4纳米颗粒，震荡10min使其分散均匀。将混合液在80℃下水浴24h，生成黑色沉淀，用去离子水和无水乙醇洗涤两次，在45℃下真空干燥，得到Fe3O4@SiO2@CuO纳米颗粒。
实验例1
纳米模拟酶的应用
本发明纳米模拟酶Fe3O4@SiO2@CuO纳米颗粒用于检测面粉中过氧化钙含量，具体过程如下：
(1)建立过氧化钙浓度与吸光度的标准曲线的过程如下：取1mg过氧化钙，加入1mL醋酸(0.2mol/L)，震荡5min使之充分反应，加水定容至10mL EP管中，即为过氧化钙标准工作液。按浓度梯度从过氧化钙标准工作液中分别取10～100μL至400μL醋酸钠缓冲液(pH为3.6，浓度0.2mol/L)中，加入50μL Fe3O4@SiO2@CuO纳米模拟酶(1mg/mL)，再加入10μL TMB，40℃水浴加热15min后，于652nm处测定吸光度。
(2)取如表1所示的面粉样品量于烧杯中，加入15mL丙酮溶剂，充分震荡摇匀后，离心弃去上清液得到沉淀物。向沉淀物中加入5mL 0.2mol/L醋酸溶液反应5min，离心后取上清液加水定容于10mLEP管中，即为待检液。
(3)取一定量的待检液于400μL醋酸钠缓冲液(pH为3.6)中，加入实施例1制备得到的纳米模拟酶—50μL Fe3O4@SiO2@CuO(1mg/mL，溶剂为超纯水)，再加入10μL TMB溶液(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，浓度10mg/L，溶剂为DMSO)，40℃水浴加热15min，于652nm处测定吸光度。与过氧化钙浓度与吸光度的标准曲线对比，计算小麦面粉中过氧化钙的含量，测试结果如表1所示。其中RSD(相对标准偏差)的计算过程为：在实际样品检测过程中，每个样品检测平行重复6次，对应得到6个吸光度数值，计算得到标准偏差。RSD、加标回收率计算公式如下：
过氧化钙浓度与吸光度的标准曲线如图1所示，表明该体系在652nm处吸光度值与过氧化钙浓度在0.0～100.0mg/L范围内存在线性关系(y＝0.02011x+0.06095)，相关系数为R2＝0.99842。
对一份不添加过氧化钙的空白小麦面粉样品进行11次重复检测，吸光度分别为0.0713、0.0711、0.0723、0.0709、0.0721、0.0708、0.0728、0.0712、0.0723、0.0717、0.0704，计算得到标准偏差，根据标准偏差与过氧化钙浓度—吸光度标准曲线的关系，得出检出限为11.27×10-2mg/L。
表1
由表1可知，本发明采用Fe3O4@SiO2@CuO纳米颗粒为纳米模拟酶检测面粉中过氧化钙的含量，每组设置不同加标量测定并重复测试，取平均值得出最终的加标回收率及RSD。该方法在过氧化钙浓度0-100mg/L范围内符合比尔定律，加标回收率为95.9％-113.8％，RSD为1.28％-2.65％，具有较好的重现性。
未加入增白剂过氧化苯甲酰的小麦粉含有微量的脂溶性类胡萝卜素等色素，上述色素易被丙酮提取显淡黄色或更深的黄色。加入过氧化苯甲酰的小麦粉基本不含色素，不能被丙酮提取显色，故将含过氧化苯甲酰的小麦粉与丙酮混合，并不能被丙酮提取显色，该提取液为无色透明状态。本发明检测小麦面粉样品时，对样品进行前处理，即取1g小麦面粉样品于烧杯中，加入15mL丙酮溶剂，充分震荡摇匀后，离心得黄色上清液，表明该检测的小麦面粉中不含过氧化苯甲酰，故排除过氧化苯甲酰的干扰。
综上，本发明提供了一种纳米模拟酶在检测面粉中过氧化钙含量的应用，该纳米模拟酶与天然过氧化物酶不同，不易受环境酸碱度的影响；且本发明的纳米模拟酶简化了传统过氧化物酶法需要调节pH的操作步骤，降低了检测成本，成功实现了对面粉中过氧化钙快速、准确的测量。且采用本发明的纳米模拟酶检测面粉中过氧化钙的含量，可消除增白剂过氧化苯甲酰的干扰，操作步骤简单，可用于对实际样品的分析。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种纳米模拟酶的应用，其特征在于，所述纳米模拟酶用于检测面粉中过氧化钙含量；所述纳米模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)向去离子水中加入酸化后的FeCl3溶液，搅拌后匀速滴加Na2SO3，当溶液颜色由红棕色变为黄色时，缓慢加入NH3·H2O溶液并剧烈搅拌，反应得到黑色的Fe3O4纳米颗粒；将混合物冷却至室温，通过外部磁场分离出Fe3O4磁性纳米粒子，洗涤、干燥；
(2)将Fe3O4磁性纳米粒子加入到氯仿中形成混合溶液，然后添加至含CTAB的水溶液中得到分散液，将上述分散液添加至由去离子水、乙二醇、NH3·H2O组成的混合物中，水浴加热并搅拌，然后加入正葵烷搅拌反应，随后滴加1,3,5-三甲苯并继续搅拌，然后加入硅酸四乙酯继续搅拌至反应结束，将反应产物离心，随后萃取、洗涤并干燥，即得包覆SiO2层的Fe3O4纳米颗粒；
(3)将硝酸铜溶于去离子水中，调节pH至10-11，向其中加入步骤(2)得到的包覆SiO2层的Fe3O4纳米颗粒并分散均匀得到混合液，水浴反应生成黑色沉淀，洗涤、干燥得到Fe3O4@SiO2@CuO纳米颗粒；
其中，步骤(1)中FeCl3与NH3·H2O的摩尔比为1:11.33，FeCl3与Na2SO3摩尔比为3:1；步骤(2)中Fe3O4与硅酸四乙酯的添加比例为13.8g:1mL；步骤(3)中硝酸铜与包覆SiO2层的Fe3O4的质量比为7:1。
2.如权利要求1所述的纳米模拟酶的应用，其特征在于，所述纳米模拟酶检测面粉中过氧化钙含量的过程如下：
(1)建立过氧化钙不同浓度梯度与吸光度的标准曲线；
(2)称取面粉试样，加入丙酮溶剂，充分振荡混匀后离心得到沉淀物；向所得沉淀物中加入醋酸溶液进行反应，将反应产物进行离心，取上清液定容，即得待检液；
(3)取步骤(2)得到的待检液于缓冲液中，向其中依次加入纳米模拟酶、TMB，水浴加热，于652nm处测定吸光度；与步骤(1)的标准曲线对比，计算面粉中过氧化钙的含量。
3.如权利要求2所述的纳米模拟酶的应用，其特征在于，所述步骤(1)具体为：称取过氧化钙，加入醋酸溶液进行反应，将反应产物进行离心，取上清液定容即过氧化钙标准工作液；按照浓度梯度将过氧化钙标准工作液添加至缓冲溶液中，依次加入纳米模拟酶、TMB，水浴加热，于652nm处测定吸光度，即得过氧化钙不同浓度梯度与吸光度的标准曲线。
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