CN107287297B - 基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤dna的方法 - Google Patents

基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤dna的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法，包括以下步骤：(1)CQDs表面生物功能化处理：在表面氨基化的CQDs溶液中加入戊二醛，静置10～40min后，加入氧化损伤DNA，4℃下保存备用；(2)AuNPs制备和表面生物功能化处理：利用柠檬酸钠还原高氯金酸的方法制备AuNPs，8‑OHdG抗体通过抗体上的氨基端连接到制备得到的AuNPs表面，AuNPs和8‑OHdG抗体的物质的量比为1:10～1:50；(3)氧化损伤DNA的测定：将8‑OHdG抗体修饰的AuNPs溶液加入到氧化损伤DNA修饰的CQDs溶液中，孵育0.5～2小时后进行荧光强度测定。本发明快速、简便、灵敏。

Description

基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损 伤DNA的方法
技术领域
本发明涉及一种氧化损伤DNA的检测技术方法，尤其涉及一种基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法。
背景技术
环境雌激素具有类似生物体内激素性质，能干扰人体内分泌系统的正常生理功能。常见的环境雌激素有双酚A、邻苯二甲酸酯类塑化剂以及与雌二醇结构相似的类固醇衍生物合成雌激素等。这些环境污染物具有高亲脂性或脂溶性，易通过食物链进入人体，富集于动物和人体中。环境雌激素在人体内代谢，产生活性氧自由基如羟自由基、超氧阴离子等，攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子，生成氧化性加合物8-羟基脱氧鸟苷，导致DNA氧化损伤，进而诱发基因突变和细胞癌变。
目前，常用的DNA氧化损伤检测主要有高效液相色谱结合电化学检测，气质联用分析法，这些方法操作成本相对较高，且假阳性高。伴随着免疫学技术的快速发展，8-羟基脱氧鸟苷多克隆抗体的发展和单克隆抗体的使用为酶联免疫吸附测定(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)的发展提供了条件。ELISA虽然特异性强、灵敏度高，但存在交叉反应，可能导致检测值比真实值偏高。
近年来，生物传感器趋向于微型化、集成化、智能化方向发展，在早期快速疾病诊断治疗方面展示出了广阔的应用前景。荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)生物传感器是荧光生物传感器的一种类型，在一个荧光基团(供体)的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向另一个荧光基团(受体)转移的过程，可广泛应用于生物化学领域分子检测、快速抗原检测、癌症标记物检测等。FRET传感器系统中需要两个不同的荧光基团，传统的有机荧光基团价格昂贵，且荧光不稳定，容易发生不可逆的光漂白，不适合可靠长期检测。这就要求我们发展新型的低成本稳定的FRET荧光传感体系用于环境雌激素代谢引起DNA损伤和修复分析研究。
发明内容
为了克服已有检测损伤DNA的方法的速度较慢、工序复杂、灵敏度较差等不足，本发明提供了一种快速、简便、灵敏的基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)CQDs表面生物功能化处理：在表面氨基化的CQDs溶液中加入戊二醛，所述CQDs溶液和戊二醛的体积比为：(100～300)：(1～6)；静置10～40min后，加入氧化损伤DNA，4℃下保存备用；
(2)AuNPs制备和表面生物功能化处理：利用柠檬酸钠还原高氯金酸的方法制备AuNPs，8-OHdG抗体通过抗体上的氨基端连接到制备得到的AuNPs表面，AuNPs和8-OHdG抗体的物质的量比为1:10～1:50；
(3)氧化损伤DNA的测定：将8-OHdG抗体修饰的AuNPs溶液加入到氧化损伤DNA修饰的CQDs溶液中，孵育0.5～2小时后进行荧光强度测定。
进一步，所述步骤(1)中，CQDs的浓度为25μg/mL,戊二醛的质量分数为50％，氧化损伤后带有8-OHdG的DNA的浓度范围为0pM～30μM。
再进一步，所述步骤(2)中，8-OHdG抗体浓度为1mg/mL，AuNPs浓度为5～10nM。
更进一步，所述步骤(3)中，每100μL～300μL CQDs溶液，戊二醛的体积为1μL～6μL，所述8-OHdG抗体修饰的AuNPs溶液的体积为10～50μL。
本发明利用碳量子点(Carbon quantum dots，CQDs)和金纳米颗粒(Goldnanoparticles，AuNPs)构成荧光共振能量转移体系的供体和受体对，以波长为300nm紫外光激发CQDs，发射440nm荧光为检测信号。通过对不同浓度的带有8-OHdG的DNA进行检测，实现氧化损伤DNA检测的目的。
本发明利用CQDs较好的荧光稳定性和荧光强度，且表面容易生物功能化修饰，AuNPs易于合成，具有较宽的吸收光谱等特点，作为构成荧光共振能量转移体系的供体和受体对。当检测到氧化损伤的DNA时，CQDs和AuNPs的距离在10nm以内。在波长为300nm的紫外光激发下，CQDs的荧光通过荧光共振能量转移到AuNPs上，被CQDs淬灭。以上荧光强度变化可通过荧光分光光度计进行分析，达到检测分析氧化损伤DNA的目的。
本发明的有益效果主要表现在：将表面生物功能化的CQDs和AuNPs构成荧光共振能量转移系统，用于氧化受损DNA的检测分析。实验表明该方法构建的荧光传感器可用于快速、简便、灵敏的氧化损伤DNA的分析检测。
附图说明
图1为本发明检测方法的检测原理图；
图2为本发明CQDs的透射电子显微镜(TEM)图；
图3为本发明CQDs的荧光曲线图；
图4为本发明AuNPs的透射电子显微镜(TEM)图；
图5为AuNPs的吸收特性曲线；
图6为本发明方法检测氧化损伤DNA荧光强度峰值随浓度变化关系；
图7为不同氧化损伤DNA浓度的荧光峰值变化示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。
参照图1～图7，一种基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)CQDs表面生物功能化处理：在表面氨基化的CQDs溶液中加入戊二醛，所述CQDs溶液和戊二醛的体积比为：(100～300)：(1～6)；静置10～40min后，加入氧化损伤DNA，4℃下保存备用；
(2)AuNPs制备和表面生物功能化处理：利用柠檬酸钠还原高氯金酸的方法制备AuNPs，8-OHdG抗体通过抗体上的氨基端连接到制备得到的AuNPs表面，AuNPs和8-OHdG抗体的物质的量比为1:10～1:50；
(3)氧化损伤DNA的测定：将8-OHdG抗体修饰的AuNPs溶液加入到氧化损伤DNA修饰的CQDs溶液中，孵育0.5～2小时后进行荧光强度测定。
进一步，所述步骤(1)中，CQDs的浓度为25μg/mL,戊二醛的质量分数为50％，氧化损伤后带有8-OHdG的DNA的浓度范围为0pM～30μM。
再进一步，所述步骤(2)中，8-OHdG抗体浓度为1mg/mL，AuNPs浓度为5～10nM。
更进一步，所述步骤(3)中，每100μL～300μL CQDs溶液，戊二醛的体积为1μL～6μL，所述8-OHdG抗体修饰的AuNPs溶液的体积为10～50μL。
本发明利用表面氨基化的CQDs通过戊二醛和单链DNA上的氨基连接，将氧化损伤的单链DNA固定到CQDs的表面，AuNPs表面修饰8-OHdG抗体，可用于连接CQDs上氧化损伤带有8-OHdG的DNA。当检测到氧化损伤的DNA时，CQDs和AuNPs的距离在10nm以内。在波长为300nm的紫外光激发下，CQDs的荧光通过荧光共振能量转移到AuNPs上，被CQDs淬灭。上述现象可通过荧光强度变化进行分析，进而检测氧化损伤DNA。与传统的检测方法相比，操作过程简单，易于测量。并能实现DNA损伤的体外研究。
实例1：一种基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法，过程如图1所示：
(1)CQDs表面生物功能化处理：在25μg/mL,100μL表面氨基化的CQDs溶液中加入1μL戊二醛(质量分数50％)静置30min后，加入氧化损伤DNA，浓度范围为1pM～30μM，4℃下保存备用；
(2)AuNPs制备及表面功能化处理：AuNPs通过柠檬酸钠还原高氯金酸制得。去离子水在磁力搅拌加热器上加热至沸腾，15μL高氯金酸(14.3％)加入到50μL沸水中，搅拌加热5min后，迅速加入5mL柠檬酸钠(1％)溶液，在搅拌加热下进行反应。溶液颜色逐渐由浅黄变成紫色，再变成酒红色。当溶液颜色不再改变时，继续保持溶液在搅拌状态下加热15min，关闭加热器，溶液搅拌冷却至室温，制得的AuNPs在4℃下保存备用。制备得到的AuNPs浓度为6nM，AuNPs和8-OHdG抗体的物质的量比为1:20混合均匀，静置12h，将8-OHdG抗体通过抗体上的氨基端连接到AuNPs表面。
(3)氧化损伤DNA检测分析：将上述8-OHdG抗体修饰的AuNPs加入到氧化损伤DNA修饰的CQDs溶液中，孵育30min后，8-OHdG抗体和氧化损伤带8-OHdG的DNA进行特异性结合，使得CQDs和AuNPs的距离在10nm以内。在波长为300nm的紫外光激发下，通过荧光分光光度计进行荧光强度测定，得到基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法。
表面功能化处理的CQDs，用透射电子显微镜(TEM)对其进行表征，得到结果如图2所示。CQDs在PBS溶液中具有较好的分散性，尺寸均匀，碳量子点的平均直径为4nm。在波长为300nm的紫外光激发下，得到如图3所示的CQDs荧光特性图。CQDs在400nm到460nm的范围内有较好的荧光特性，荧光峰值在440nm左右。
制备得到的AuNPs及其表面利用8-OHdG抗体功能化，TEM对其形貌进行表征后得到如图4所示的结果。经表面功能化后的AuNPs在PBS溶液中均匀分散，尺寸均匀，平均直径为15nm。AuNPs的吸收特性如图5所示，AuNPs有较宽的吸收谱，其中吸收峰在527nm。
将氧化损伤后带有8-OHdG的DNA固定到CQDs表面，加入经8-OHdG抗体修饰的AuNPs，30min后进行测试，在300nm的紫外光激发下，测得不同浓度氧化损伤的DNA后生物传感器的荧光强度，如图6所示。从图中可以看出，随着氧化损伤DNA浓度的增加，荧光强度减弱，这是因为高浓度的氧化损伤DNA能够结合更多的AuNPs，在激发光的激发下，发生荧光共振能量转移，测得的荧光强度减弱。因此，进一步证明基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测损伤DNA方法的成功制备。不同氧化损伤DNA浓度的荧光峰值变化如图7所示。以荧光的峰值(y)为纵坐标，氧化损伤DNA浓度为横坐标，制作线性曲线，线性关系公式为y＝1.4006ln[x]+5.6797，线性度为0.9884。随着氧化损伤DNA浓度的增加，荧光强度减弱。本发明中的基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法能够实现氧化损伤DNA的检测分析，成本低、简便且易于操作。

Claims (1)

1.一种非疾病诊断目的的基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(1)CQDs表面生物功能化处理：在表面氨基化的CQDs溶液中加入戊二醛，所述CQDs溶液和戊二醛的体积比为：(100～300)：(1～6)；静置10～40min后，加入带有8-OHdG的氧化损伤DNA，4℃下保存备用；
CQDs的浓度为25μg/mL,戊二醛的质量分数为50％，氧化损伤后带有8-OHdG的DNA的浓度范围为100pM～10μM；
(2)AuNPs制备和表面生物功能化处理：利用柠檬酸钠还原高氯金酸的方法制备AuNPs，8-OHdG抗体通过抗体上的氨基端连接到制备得到的AuNPs表面，AuNPs和8-OHdG抗体的物质的量比为1:10～1:50；
8-OHdG抗体浓度为1mg/mL，AuNPs浓度为5～10nM；
(3)氧化损伤DNA的测定：将8-OHdG抗体修饰的AuNPs溶液加入到氧化损伤DNA修饰的CQDs溶液中，每100μL～300μL CQDs溶液，戊二醛的体积为1μL～6μL，所述8-OHdG抗体修饰的AuNPs溶液的体积为10～50μL；孵育0.5～2小时后进行荧光强度测定。
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