CN112067817A - 一种不同环境污染物造成dna损伤的化学发光体外评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，该技术方案以磁性微球作为载体，将富含G碱基的DNA作为固定相固定于磁性微球表面。采用Fenton试剂在反应中产生的具有强氧化能力的·OH将G碱基氧化为8‑OHdG，再利用抗体的特异识别，就可以检测DNA上受到氧化损伤产生的8‑OHdG量，从而建立8‑OHdG与磁性微球上结合的抗体量的关系。利用抗体上修饰有HRP能产生化学发光信号，建立DNA上受到氧化损伤产生的8‑OHdG与化学发光强度的对应关系，从而得到氧化产生的8‑OHdG量与化学发光强度的量化关系，间接实现8‑OHdG的定量分析检测，而且大大提高了检测灵敏度和精密度。

Description

一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，进一步涉及核酸适配体技术，具体涉及一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法。
背景技术
DNA氧化损伤与衰老、疾病、癌症以及环境当中所存在的有害物质有着毋庸置疑的联系，8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’deoxyguanosine，8-OHdG)是DNA氧化损伤产生的加合物，由于8-OHdG在人体中不能进一步代谢，从而会分散在血液和尿液中。因此8-OHdG也就成为预防疾病，提前预防癌症发生的主要标志物。因此研究8-OHdG检测新方法越来越受到重视，研究一种满足不同层次的快速灵敏性高并且简便的检测方法具有重要意义。
8-OHdG通过血液运输并排泄到尿液中而不会进一步代谢。因此，可以通过检测尿液中8-OHdG的浓度判断DNA的氧化损伤浓度。目前，32P后标记法是应用最广泛，灵敏度最高的8-OHdG检测方法，但32P在实验过程中会对实验人员本身形成放射性损害，且如果实验废液处理不当，还会造成环境污染。所以该法不适宜推广。另外，常见的8-OHdG检测方法还有高效液相色谱-电化学检测法、高效毛细管电泳法、气相-质谱联用法、同位素稀释质谱法等，但这些方法存在成本高、处理复杂、只能实现微量制备等问题导致无法满足大批量样本快速筛查的需要。因此，开发用于检测痕量8-OHdG的高灵敏度，方便且成本有效的传感器是必要的。
利用抗原与抗体特异性结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性的方法已成为分析化学领域中的常见方法，这里使用了环境污染物氧化了固定在磁性微球上DNA单链上的G碱基产生抗原8-OHdG，加入8-OHdG抗体与8-OHdG特异性结合而联接在磁性微球载体上，用磁性洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，继续加入HRP标记的二抗与8-OHdG抗体特异性结合，使得在磁性微球载体上的HRP量与受检物质8-OHdG的量成一定的比例。该方法在大多数实验室中易于执行，特异性好，重现性佳，灵敏度高。
发明内容
针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价的制备方法及其应用，用于解决现有技术中8-OHdG适体传感器检测方法灵敏性差、结果不稳定，制备效率低、应用效果不佳的技术缺陷。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，包括以下步骤：
1)通过羧氨反应将氨基封端并富含G碱基的DNA报告序列固定于羧基磁性微球表面，得到磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物；
2)向步骤1)加入Fe2+/H2O2试剂，使得Fenton反应氧化DNA上的G碱基得到8-OHdG；
3)向步骤2)加入过量的Goat anti-8-OHdG，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG；
4)将步骤3)加入过量的HRP标记的Rat-anti-goat IgG，使HRP标记的Rat-anti-goat IgG充分识别Goat anti-8-OHdG并固定在磁性微球上，反应后取固相，即得到8-OHdG适体传感器；
5)向步骤4)所述8-OHdG适体传感器HRP化学发光底物混匀，而后检测发光信号CL值。
作为优选，步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基封端的DNA报告序列用量比为3:1～2(μL:pmoL)的比例加入氨基封端的DNA报告序列，于35～39℃震荡反应50～70min。
作为优选，步骤1)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应50～70min后，取固相后用PBST缓冲溶液洗涤。在该优选技术方案中，利用PBST缓冲溶液洗涤，旨在去除未连接至磁性微球表面的报告序列，洗涤次数可以优选为3次。
作为优选，步骤1)还包括以下操作：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的BSA溶液，于35～39℃条件下震荡50～70min，得磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物。利用BSA缓冲溶液洗涤，旨在以封闭磁性微球表面多余结合位点，洗涤次数可以优选为3次。
作为优选，步骤2)包括以下操作：磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物，加入1mL的0.5～1.5M FeCl2和1mL的1～3M H2O2并在35～39℃恒温震荡反应10-14h。其中FeCl2/H2O2溶液的PH为3。
作为优选，步骤3)再加入100μL稀释倍数为1:1000的Goat anti-8-OHdG恒温震荡反应50～70min，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG，并固定在磁性微球表面。该步骤在恒温震荡1h，有利于Goat anti-8-OHdG充分捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG。
作为优选，步骤4)加入100μL稀释倍数为1:100000的HRP标记的Rat-anti-goatIgG在35～39℃下恒温震荡反应50～70min，使HRP标记的Rat-anti-goat IgG充分识别Goatanti-8-OHdG并固定在磁性微球上，用PBST洗涤磁性微球，即得到8-OHdG适体传感器。该步骤用PBST洗涤磁性微球优选次数为3次。
作为优选，步骤5)8-OHdG适体传感器悬浮于50μL HRP化学发光底物A液中，再用移液枪将其转移至圆柱形玻璃测量皿中，用移液枪移取50μL HRP化学发光底物B液至玻璃测量皿中，待充分混合均匀后放入化学发光检测仪中，而后检测发光信号CL值。
作为优选，以上技术方案中所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。
作为优选，所述检测发光信号CL值，是利用BPCL微弱化学发光仪实现的。
在以上技术方案中，所述咪唑缓冲液同样可选用常规配方。所述PBST缓冲溶液可以是含有137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4·12H2O，2mM KH2PO4，0.05％Tween20的水溶液，其pH是7.2～7.6。
在以上技术方案中，氨基端的DNA报告序列：
5′-AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAGGGTTTTTTT-NH2-3′。
该物质可自试剂销售公司定制、购得。
在以上技术方案中，所述的Goat anti-8-OHdG，Rat-anti-goat IgG物质可自试剂销售公司定制、购得。
所述过量的Goat anti-8-OHdG，，是指构建磁性微球-8OHdG适体传感器的反应中，前者量较多、使结合反应完成后仍存在未结合有Goat anti-8-OHdG的磁性微球-8-OHdG复合物游离于体系中的情形；具体的Goat anti-8-OHdG用量可根据对待测样品中8-OHdG的含量的估算来确定，当然亦可参照本发明实施例中Goat anti-8-OHdG用量来实施本发明。所述过量的Rat-anti-goat IgG，是指构建磁性微球-8OHdG适体传感器的反应中，前者量较多、使结合反应完成后仍存在未结合有Rat-anti-goat IgG的磁性微球-8-OHdG复合物游离于体系中的情形；具体的Rat-anti-goat IgG用量可根据对待测样品中8-OHdG的含量的估算来确定，当然亦可参照本发明实施例中Rat-anti-goat IgG用量来实施本发明。
在利用本发明方法执行检测时，可以先利用该方法对一组不含8-OHdG的标准溶液进行检测，以绘制出时间与发光信号CL值之间的线性关系，而后再对待测样品执行检测，将检测结果带入上述线性关系以获得实际检测值。其中标注曲线的绘制是利用本发明方法绘制的，而其中注入浓度梯度的选择、图表模式的选择、误差的校正等可以依照本领域的一般技术常识确定。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，采用Fenton试剂在反应中产生的具有强氧化能力的·OH将G碱基氧化为8-OHdG，再利用抗体的特异识别，就可以检测DNA上受到氧化损伤产生的8-OHdG量，从而建立8-OHdG与磁性微球上结合的抗体量的关系。而抗体上修饰有HRP，利用HRP产生化学发光的原理，建立DNA上受到氧化损伤产生的8-OHdG与化学发光强度的对应关系，从而得到氧化产生的8-OHdG量与化学发光强度的量化关系，间接实现8-OHdG的定量分析检测。该方法在大多数实验室中易于执行，特异性好，重现性佳，灵敏度高。
附图说明
图1是本发明检测方法的原理示意图。
图2是本发明实施例2中不同的天然抗氧物对本发明检测的氧化损伤方法考察的实验结果。
图3是本发明实施例3中几种水环境中的污染物对DNA进行氧化损伤测试考察实验结果。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
本发明的原理为：以羧基磁性微球作为固定分离载体，通过Fenton反应氧化DNA序列上G碱基得到8-OHdG，通过抗体识别8-OHdG，将HRP标记的IgG识别抗体并固定在磁性微球表面组建传感器，基于HRP化学发光体系产生化学发光信号，建立化学发光强度与8-OHdG量的正相关关系，实现8-OHdG的化学发光检测。
首先通过羧氨反应将氨基封端并富含G碱基的DNA报告序列固定于羧基磁性微球表面；然后加入Fe2+/H2O2试剂，使得Fenton反应氧化DNA上的G碱基；之后通过特异识别分别将Goat-anti-8-OHdG和标记有HRP的Rat-anti-goat IgG固定在磁性微球表面，由于HRP和发光底物反应后产生化学发光信号，因此8-OHdG量与标记有HRP的Rat-anti-goat IgG相关，而固定在磁性微球上的标记有HRP的Rat-anti-goat IgG又与DNA报告序列氧化损伤产生的8-OHdG相关，所以能够间接的通过传感器化学发光强度测定8-OHdG的量。当DNA受到Fenton反应产生的·OH攻击产生氧化损伤后，8-OHdG也就随之增加，此时CL强度表现为最高。当DNA在受到Fenton试剂氧化过程中加入抗氧化剂时，即产生的8-OHdG量相对较低时，相较于没有受到Fenton试剂氧化的空白组产生的CL变化量(ΔCL)随着抗氧化剂加入，8-OHdG产生的量逐渐减少。实验原理如图1所示。
实施例1
DNA损伤的化学发光体外评价方法如下：
1酶联免疫传感器制备
取40μg羧基磁性微球于1.5mL离心管中，通过磁性分离器将羧基磁性微球与上清液进行分离，移除上清液后加入100μL咪唑缓冲液(0.1moL/L,pH 6.0)洗涤磁性微球并反复操作三次；将洗涤后的磁性微球重新悬浮于含有EDC的100μL咪唑溶液中，放置在37℃恒温震荡20min，使羧基磁性微球被充分活化；然后加入70pmoL氨基封端的DNA报告序列于磁性微球中继续震荡反应1h，报告序列则可以通过羧氨反应与表面富含羧基基团的磁性微球反应，从而固定在磁性微球表面；待磁性分离后用PBST洗涤三次去除未连接至磁性微球表面的报告序列，之后加入10％BSA溶液100μL，37℃恒温震荡1h以封闭磁性微球表面多余结合位点，反应结束后用PBST重复洗涤三次磁性微球；
随后加入1mL的0.5～1.5M FeCl2和1mL的1～3M H2O2溶液并在37℃恒温震荡反应12h；通过磁性分离除去上清液后用PBST洗涤三次，再加入100μL稀释倍数为1:1000的Goatanti-8-OHdG恒温震荡反应1h，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG，并固定在磁性微球表面；磁性分离去除上清液后用PBST洗涤三次，最后加入100μL稀释倍数为1:100000的HRP标记的Rat-anti-goat IgG在37℃下恒温震荡反应1h，使HRP标记的Rat-anti-goat IgG充分识别Goat anti-8-OHdG并固定在磁性微球上；之后再次通过磁性分离去除上清液，用PBST洗涤磁性微球并重复三次，待测。
2化学发光检测
将上述已经制备好的传感器悬浮于50μL HRP化学发光底物A液中，再用移液枪将其转移至圆柱形玻璃测量皿中，用移液枪移取50μL HRP化学发光底物B液至玻璃测量皿中，待充分混合均匀后放入化学发光检测仪中，化学发光信号由BPCL微弱化学发光仪检测，由仪器所连电脑终端显示并记录，化学发光强度以输出信号峰值定量。
本实施例1以羧基磁性微球为载体的前提下，组装了检测8-OHdG的传感器。利用Fenton试剂的强氧化能力将固定于羧基磁性微球表面的富含G碱基的单链DNA中G碱基氧化成为8-OHdG，再结合标记有HRP的抗体实现8-OHdG的灵敏检测。
在优化实验条件下(40μg羧基磁性微球用量，70pmoL的报告序列，Goat-anti-8-OHdG稀释倍数为1:1000，HRP标记的Rat-anti-goat IgG稀释倍数为1:100000)，Fenton试剂用量低至10nmoLFe2+/20nmoL H2O2仍然可以检测到氧化损伤所产生的8-OHdG。
实施例2
不同的天然抗氧物对本发明检测的氧化损伤方法考察
1酶联免疫传感器制备
取200μg羧基磁性微球平均分配5个1.5mL离心管中，通过磁性分离器将羧基磁性微球与上清液进行分离，移除上清液后每管加入100μL咪唑缓冲液(0.1moL/L,pH 6.0)洗涤磁性微球并反复操作三次；将洗涤后的每管磁性微球重新悬浮于含有EDC的100μL咪唑溶液中，放置在37℃恒温震荡20min，使羧基磁性微球被充分活化；然后每管加入70pmoL氨基封端的DNA报告序列于磁性微球中继续震荡反应1h，报告序列则可以通过羧氨反应与表面富含羧基基团的磁性微球反应，从而固定在磁性微球表面；待磁性分离后用PBST洗涤三次去除未连接至磁性微球表面的报告序列，之后每管加入10％BSA溶液100μL，37℃恒温震荡1h以封闭磁性微球表面多余结合位点，反应结束后用PBST重复洗涤三次磁性微球；
随后每管加入1mL的0.5～1.5M FeCl2和1mL的1～3M H2O2溶液，并依次向每管中加入槲皮素(Que)、白藜芦醇(Res)、绿原酸(CA)、原花青素(PC)、熊果酸(UA)几种抗氧化剂，各抗氧化剂的量和浓度为200μL 2mg/mL，并在37℃恒温震荡反应12h；通过磁性分离除去上清液后用PBST洗涤三次，每管再加入100μL稀释倍数为1:1000的Goat anti-8-OHdG恒温震荡反应1h，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG，并固定在磁性微球表面；磁性分离去除上清液后用PBST洗涤三次，最后每管加入100μL稀释倍数为1:100000的HRP标记的Rat-anti-goat IgG在37℃下恒温震荡反应1h，使HRP标记的Rat-anti-goat IgG充分识别Goat anti-8-OHdG并固定在磁性微球上；之后再次通过磁性分离去除上清液，用PBST洗涤磁性微球并重复三次，待测。
2化学发光检测
将上述已经制备好的传感器悬浮于50μL HRP化学发光底物A液中，再用移液枪将其转移至圆柱形玻璃测量皿中，用移液枪移取50μL HRP化学发光底物B液至玻璃测量皿中，待充分混合均匀后放入化学发光检测仪中，化学发光信号由BPCL微弱化学发光仪检测，由仪器所连电脑终端显示并记录，化学发光强度以输出信号峰值定量。
利用几种抗氧化剂槲皮素(Que)、白藜芦醇(Res)、绿原酸(CA)、原花青素(PC)、熊果酸(UA)清除·OH的能力，有效地对DNA氧化过程起到保护作用，其中白藜芦醇和原花青素的抗氧化能力较强，实验结果如图2所示。
实施例3
不同水环境中的污染物对DNA进行氧化损伤测试考察
1酶联免疫传感器制备
取400μg羧基磁性微球平均分于10个1.5mL离心管中，通过磁性分离器将羧基磁性微球与上清液进行分离，移除上清液后每管加入100μL咪唑缓冲液(0.1moL/L,pH 6.0)洗涤磁性微球并反复操作三次；将洗涤后的磁性微球重新悬浮于含有EDC的100μL咪唑溶液中，放置在37℃恒温震荡20min，使羧基磁性微球被充分活化；然后每管加入70pmoL氨基封端的DNA报告序列于磁性微球中继续震荡反应1h，报告序列则可以通过羧氨反应与表面富含羧基基团的磁性微球反应，从而固定在磁性微球表面；待磁性分离后用PBST洗涤三次去除未连接至磁性微球表面的报告序列，之后每管加入10％BSA溶液100μL，37℃恒温震荡1h以封闭磁性微球表面多余结合位点，反应结束后用PBST重复洗涤三次磁性微球；
随后选取了水环境中的几种污染物，包括1mmoL的重金属离子(Hg2+、Ag2+、Pb2+、Cr6 +、Ni2+)、甲苯、甲醛和双酚A对DNA的影响，同时与Fenton试剂对DNA氧化损伤程度相比较，向管中加入不同污染物和Fenton试剂后，并在37℃恒温震荡反应12h；通过磁性分离除去上清液后用PBST洗涤三次，每管再加入100μL稀释倍数为1:1000的Goat anti-8-OHdG恒温震荡反应1h，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG，并固定在磁性微球表面；磁性分离去除上清液后用PBST洗涤三次，最后每管加入100μL稀释倍数为1:100000的HRP标记的Rat-anti-goat IgG在37℃下恒温震荡反应1h，使HRP标记的Rat-anti-goat IgG充分识别Goat anti-8-OHdG并固定在磁性微球上；之后再次通过磁性分离去除上清液，用PBST洗涤磁性微球并重复三次，待测。
2化学发光检测
将上述已经制备好的传感器悬浮于50μL HRP化学发光底物A液中，再用移液枪将其转移至圆柱形玻璃测量皿中，用移液枪移取50μL HRP化学发光底物B液至玻璃测量皿中，待充分混合均匀后放入化学发光检测仪中，化学发光信号由BPCL微弱化学发光仪检测，由仪器所连电脑终端显示并记录，化学发光强度以输出信号峰值定量。
选取了几种水环境中的污染物对DNA进行氧化损伤测试，结果发现重金属离子中的Cr6+对DNA造成的氧化损伤较大，实验结果如图3所示。
实施例4
一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，包括以下步骤：
1)通过羧氨反应将氨基封端并富含G碱基的DNA报告序列固定于羧基磁性微球表面，得到磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物；
2)向步骤1)加入Fe2+/H2O2试剂，使得Fenton反应氧化DNA上的G碱基得到8-OHdG；
3)向步骤2)加入Goat anti-8-OHdG，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG；
4)将步骤3)加入HRP标记的Rat-anti-goat IgG，使HRP标记的Rat-anti-goat IgG充分识别Goat anti-8-OHdG并固定在磁性微球上，反应后取固相，即得到8-OHdG适体传感器；
5)向步骤4)所述8-OHdG适体传感器HRP化学发光底物混匀，而后检测发光信号CL值。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.1M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35℃震荡孵育15min，而后以磁性微球与氨基封端的DNA报告序列用量比为3:1(μL:pmoL)的比例加入氨基封端的DNA报告序列，于35℃震荡反应50min。取固相后用PBST缓冲溶液洗涤。利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入10％的BSA溶液，于35℃条件下震荡50min，得磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物。
步骤2)磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物，加入1mL的0.5M FeCl2和1mL的1M H2O2并在37℃恒温震荡反应10h。
步骤3)再加入100μL稀释倍数为1:1000的Goat anti-8-OHdG恒温震荡反应50min，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG，并固定在磁性微球表面。
步骤4)加入100μL稀释倍数为1:100000的HRP标记的Rat-anti-goat IgG在35℃下恒温震荡反应50min，使HRP标记的Rat-anti-goat IgG充分识别Goat anti-8-OHdG并固定在磁性微球上，用PBST洗涤磁性微球，即得到8-OHdG适体传感器。
步骤5)8-OHdG适体传感器悬浮于50μL HRP化学发光底物A液中，再用移液枪将其转移至圆柱形玻璃测量皿中，用移液枪移取50μL HRP化学发光底物B液至玻璃测量皿中，待充分混合均匀后放入化学发光检测仪中，而后检测发光信号CL值。
实施例5
一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，包括以下步骤：
1)通过羧氨反应将氨基封端并富含G碱基的DNA报告序列固定于羧基磁性微球表面，得到磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物；
2)向步骤1)加入Fe2+/H2O2试剂，使得Fenton反应氧化DNA上的G碱基得到8-OHdG；
3)向步骤2)加入Goat anti-8-OHdG，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG；
4)将步骤3)加入HRP标记的Rat-anti-goat IgG，使HRP标记的Rat-anti-goat IgG充分识别Goat anti-8-OHdG并固定在磁性微球上，反应后取固相，即得到8-OHdG适体传感器；
5)向步骤4)所述8-OHdG适体传感器HRP化学发光底物混匀，而后检测发光信号CL值。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于37℃震荡孵育20min，而后以磁性微球与氨基封端的DNA报告序列用量比为2:1(μL:pmoL)的比例加入氨基封端的DNA报告序列，于37℃震荡反应60min。取固相后用PBST缓冲溶液洗涤。利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8％的BSA溶液，于37℃条件下震荡60min，得磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物。
步骤2)磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物，加入1mL的1M FeCl2和1mL的2M H2O2并在37℃恒温震荡反应12h。
步骤3)再加入100μL稀释倍数为1:1000的Goat anti-8-OHdG恒温震荡反应60min，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG，并固定在磁性微球表面。
步骤4)加入100μL稀释倍数为1:100000的HRP标记的Rat-anti-goat IgG在37℃下恒温震荡反应60min，使HRP标记的Rat-anti-goat IgG充分识别Goatanti-8-OHdG并固定在磁性微球上，用PBST洗涤磁性微球，即得到8-OHdG适体传感器。
步骤5)8-OHdG适体传感器悬浮于50μL HRP化学发光底物A液中，再用移液枪将其转移至圆柱形玻璃测量皿中，用移液枪移取50μL HRP化学发光底物B液至玻璃测量皿中，待充分混合均匀后放入化学发光检测仪中，而后检测发光信号CL值。
实施例6
一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，包括以下步骤：
1)通过羧氨反应将氨基封端并富含G碱基的DNA报告序列固定于羧基磁性微球表面，得到磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物；
2)向步骤1)加入Fe2+/H2O2试剂，使得Fenton反应氧化DNA上的G碱基得到8-OHdG；
3)向步骤2)加入Goat anti-8-OHdG，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG；
4)将步骤3)加入HRP标记的Rat-anti-goat IgG，使HRP标记的Rat-anti-goat IgG充分识别Goat anti-8-OHdG并固定在磁性微球上，反应后取固相，即得到8-OHdG适体传感器；
5)向步骤4)所述8-OHdG适体传感器HRP化学发光底物混匀，而后检测发光信号CL值。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于39℃震荡孵育25min，而后以磁性微球与氨基封端的DNA报告序列用量比为3:2(μL:pmoL)的比例加入氨基封端的DNA报告序列，于39℃震荡反应70min。取固相后用PBST缓冲溶液洗涤。利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入12％的BSA溶液，于37℃条件下震荡70min，得磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物。
步骤2)磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物，加入1mL的1.5M FeCl2和1mL的3M H2O2并在37℃恒温震荡反应14h。
步骤3)再加入100μL稀释倍数为1:1000的Goat anti-8-OHdG恒温震荡反应70min，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG，并固定在磁性微球表面。
步骤4)加入100μL稀释倍数为1:100000的HRP标记的Rat-anti-goat IgG在39℃下恒温震荡反应70min，使HRP标记的Rat-anti-goat IgG充分识别Goat anti-8-OHdG并固定在磁性微球上，用PBST洗涤磁性微球，即得到8-OHdG适体传感器。
步骤5)8-OHdG适体传感器悬浮于50μL HRP化学发光底物A液中，再用移液枪将其转移至圆柱形玻璃测量皿中，用移液枪移取50μL HRP化学发光底物B液至玻璃测量皿中，待充分混合均匀后放入化学发光检测仪中，而后检测发光信号CL值。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南昌大学
<120> 一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagaacctg ggggagtatt gcggaggagg gttttttt 38

Claims (9)

1.一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于包括以下步骤：
1)通过羧氨反应将氨基封端并富含G碱基的DNA报告序列固定于羧基磁性微球表面，得到磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物；
2)向步骤1)加入Fe2+/H2O2试剂，使得Fenton反应氧化DNA上的G碱基得到8-OHdG；
3)向步骤2)加入过量的Goat anti-8-OHdG，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG；
4)将步骤3)加入过量的HRP标记的Rat-anti-goat IgG，使HRP标记的Rat-anti-goatIgG充分识别Goat anti-8-OHdG并固定在磁性微球上，反应后取固相，即得到8-OHdG适体传感器；
5)向步骤4)所述8-OHdG适体传感器HRP化学发光底物混匀，而后检测发光信号CL值。
2.根据权利要求1所述的一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基封端的DNA报告序列用量比为3:1～2(μL:pmoL)的比例加入氨基封端的DNA报告序列，于35～39℃震荡反应50～70min。
3.根据权利要求2所述的一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应50～70min后，取固相后用PBST缓冲溶液洗涤。
4.根据权利要求3所述的一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的BSA溶液，于35～39℃条件下震荡50～70min，得磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物。
5.根据权利要求1所述的一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于步骤2)包括以下操作：向步骤1)磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物，加入1mL的0.5～1.5M FeCl2和1mL的1～3M H2O2并在35～39℃恒温震荡反应10-14h。
6.根据权利要求1所述的一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于步骤3)包括以下操作：向步骤2)再加入100μL稀释倍数为1:1000的Goatanti-8-OHdG恒温震荡反应50～70min，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG，并固定在磁性微球表面。
7.根据权利要求1所述的一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于步骤4)包括以下操作：向步骤3)加入100μL稀释倍数为1:100000的HRP标记的Rat-anti-goat IgG在35～39℃下恒温震荡反应50～70min，使HRP标记的Rat-anti-goatIgG充分识别Goat anti-8-OHdG并固定在磁性微球上，用PBST洗涤磁性微球，即得到8-OHdG适体传感器。
8.根据权利要求1所述的一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于步骤5)包括以下操作：取步骤4)8-OHdG适体传感器悬浮于50μL HRP化学发光底物A液中，再用移液枪将其转移至圆柱形玻璃测量皿中，用移液枪移取50μL HRP化学发光底物B液至玻璃测量皿中，待充分混合均匀后放入化学发光检测仪中，而后检测发光信号CL值。
9.根据权利要求1～8任一项所述的一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。
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