CN112485452A - 金属团簇作为人工抗体定量蛋白丰度的方法 - Google Patents

Abstract

金属团簇作为人工抗体定量蛋白丰度的方法，涉及一种细胞、组织提取物或血清中低丰度蛋白的检测及定量方法。所述方法包括人工抗体特异性识别细胞、组织裂解液或血清中通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的目标蛋白，以及通过分析人工抗体的本征荧光信号及其催化底物产生的化学发光信号定量检测目标蛋白的丰度。其中，所述人工抗体由金属团簇核与其上修饰的靶向目标蛋白的靶向肽组成。使用本发明的方法，能够快速、精准的定量分析细胞、组织或血清生物样本中蛋白的表达量。

Description

金属团簇作为人工抗体定量蛋白丰度的方法

技术领域

本发明涉及一种细胞、组织提取物或血清中低丰度蛋白的检测及定量方法。更具体的，本发明涉及使用金属团簇作为人工抗体代替经典蛋白免疫印迹技术中的荧光素标记或辣根过氧化物酶标记的抗体，从而进行蛋白标记及丰度检测。

背景技术

金属团簇通常由几个到几十个金属原子组成核心，外面由有机单分子或者生物大分子作为保护基团。其具有尺寸小，分散性良好等特点，尤其是生物分子保护的金属团簇通常不但具有纳米材料独特的物理化学性质，更具有良好的生物识别及生物相容性。近年来，其被材料科学、物理学、化学、生物医学、环境科学等多个领域学者所关注。通过生物矿化的方法制备的生物大分子保护的金属团簇由于其荧光可调性，原子数制备可控及良好的生物相容性被用于生物组织标记成像。其新颖的类酶催化活性，在生物传感等分析领域具有潜在的应用前景。这种既具有可控荧光发射，又具有高效生物催化活性，同时兼备靶向性的金属团簇可作为人工抗体。该人工抗体既具备荧光素修饰的抗体的荧光特性，又具备辣根过氧化物酶修饰的抗体的催化活性，可用于蛋白丰度的检测分析。

传统对特异性蛋白定量检测的方法应用最为广泛的是酶联免疫吸附法(ELISA)。此方法是从细胞或组织中提取溶解蛋白，将一系列已知浓度的标准蛋白或一系列天然样本的提取蛋白加入到包被有捕获抗体的样品孔中，然后与标记有辣根过氧化物酶的检测抗体孵育，通过检测抗体催化3',3',5',5',-四甲基联苯胺(TMB)显色统计吸光度。将标准蛋白产生的吸光度与样本蛋白的吸光度相比较，从而得到样本中目标蛋白的含量，此方法目前被认为是蛋白含量检测的金标准。但是这种方法需要的样本量较多，当样品量极少又想获得相对准确的分析数据时，ELISA法不能满足。

传统的蛋白质免疫印迹技术的优势是可以分析高丰度蛋白的小体积生物样本。其原理是首先利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将提取的天然样本蛋白简单分离，然后通过电转移将蛋白条带转移到硝化纤维素(NC)膜或者聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。随后，使目标抗体与膜共孵育，通过与目标蛋白结合的抗体的荧光信号或修饰的辣根过氧化物酶催化产生的化学发光信号的强度来反映目标蛋白的相对含量。这种方法通常是半定量分析蛋白，不能获得目标蛋白的准确含量。

因此，目前急需建立一种准确定量少量样本中蛋白含量，或者准确定量蛋白含量极低的样本中蛋白表达量的分析方法。

发明内容

本申请提供了快速、准确的检测细胞、组织提取物或血清中蛋白丰度的检测方法。

具体的，本申请涉及一种金属团簇作为人工抗体定量细胞、组织提取物或血清中蛋白丰度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备人工抗体金属团簇，所述的人工抗体金属团簇由金属团簇金属原子核心和靶向多肽组成；

(2)使人工抗体金属团簇与聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的待测样本提取目标蛋白接触；

(3)通过与目标蛋白结合的人工抗体的本征荧光信号及其催化底物产生的化学发光信号定量检测待测样品中目标蛋白表达量。

其中步骤(1)作为人工抗体的金属团簇是通过以下步骤获得：

将含金属元素的溶液与靶向多肽溶液在室温条件下混合均匀，之后加入NaOH溶液调节pH值到12，所形成的溶液继续在37℃避光搅拌，超滤获得金属团簇。

金属元素与靶向多肽的摩尔比为1:0.8-1.2。金属团簇的粒径为2到5nm。

组成金属团簇核心的金属元素是指在待测样本中基本不含或者含量极低的元素，例如金、银或铂。可使用的金属溶液可以是HAuCl₄、AgNO₃、H₂PtCl₆溶液。

所述靶向多肽分子可以是天然来源或者合成的多肽，其可以靶向目标蛋白，如金属基质蛋白酶、整合素蛋白、血管内皮细胞生长因子受体、钙粘连蛋白等。

如一种靶向金属基质蛋白酶14(MMP14)，多肽序列为H₂N-CHWKHLHNTKTFL-COOH(SEQ ID NO.1)与H₂N-HWKHLHNTKTFLC-COOH(SEQ ID NO.2)；靶向N-钙粘连蛋白，多肽序列为H₂N-CSWTLYTPSGQSK-COOH(SEQ ID NO.3)与H₂N-SWTLYTPSGQSKC-COOH(SEQ ID NO.4)等。

步骤(3)人工抗体定量检测目标蛋白是通过以下步骤进行：

利用人工抗体的本征荧光信号，即通过免疫荧光分析的方法进行；或者利用人工抗体的催化化学发光信号，即通过免疫化学发光的方法进行，先制备发光信号或发光信号与浓度的标准曲线，然后将实际待测物质反应后的得到的发光信号或发光信号与标准曲线进行比较，进而换算得到丰度。

其中免疫荧光的方法是通过数字凝胶成像设备采集识别目标蛋白的人工抗体的荧光条带，后期统计荧光强度而进行。

免疫化学发光的分析方法是通过与目标蛋白结合的人工抗体的类似于过氧化物酶的催化活性，催化化学发光底物产生化学发光信号，并通过统计其灰度值得到信号强度。可使用的化学发光底物试剂，可以是鲁米诺(luminol)、异鲁米诺(isoluminol)、吖啶酸丙磺酸盐(NSP-SA)等。也可使用对过氧化物酶敏感的可产生光吸收信号、发生颜色反应的化学试剂，如重氮胺基苯(diazoaminobenzene,DAB)、邻苯二胺(o-phenylenediamine,OPD)等。

免疫化学发光的方法通过人工抗体催化H₂O₂与鲁米诺产生化学发光信号，通过数字凝胶系统采集化学发光信号进行目标蛋白检测与定量。

免疫化学发光的方法通过人工抗体催化H₂O₂与异鲁米诺产生化学发光信号，通过数字凝胶系统采集化学发光信号进行目标蛋白检测与定量。

免疫化学发光的方法通过人工抗体催化H₂O₂与重氮胺基苯生成棕黄色产物而采集灰度值进行目标蛋白的检测与定量。

酶联免疫方法通过纳米酶催化H₂O₂与邻苯二胺生成橘色产物而采集灰度值进行目标蛋白的检测与定量。

所述利用人工抗体进行提取蛋白定量的方法包括同时分析标准蛋白与提取蛋白的免疫荧光、免疫化学发光，并将相应的光学信号做回归分析进行蛋白定量分析过程。

使用本发明的方法，能够快速、精准的定量分析细胞、组织或血清生物样本中蛋白的表达量。

采用本发明的方法可以检测到pg mL^-1含量的物质。

附图说明

图1：靶向金属基质蛋白酶MMP14的两种金团簇，金团簇1(a)与金团簇2(b)的高分辨透射电镜图。

图2：(a)金团簇1作为人工抗体对MMP14进行的免疫荧光检测，左为提取蛋白，右为标准蛋白；(b)金团簇1作为人工抗体对MMP14进行的免疫化学发光检测，左为提取蛋白，右为标准蛋白。

图3：(a)金团簇1用作人工抗体对提取蛋白中MMP14进行免疫荧光(虚线)和免疫化学发光(实线)检测的统计曲线图。(b)金团簇1用作人工抗体针对标准蛋白MMP14进行免疫荧光(虚线)免疫化学发光(实线)检测的统计曲线。

图4：(a)金团簇2作为人工抗体对提取蛋白MMP14进行的免疫荧光检测，左为提取蛋白，右为标准蛋白；(b)金团簇2作为人工抗体对MMP14进行的免疫化学发光检测，左为提取蛋白，右为标准蛋白。

图5：(a)金团簇2用作人工抗体对提取蛋白中MMP14进行免疫荧光(虚线)和免疫化学发光(实线)检测的统计曲线图。(b)金团簇2用作人工抗体针对标准蛋白MMP14进行免疫荧光(虚线)免疫化学发光(实线)检测的统计曲线。

图6：靶向钙粘连蛋白N-Cadherin的两种银团簇1(a)与银团簇2(b)的高分辨透射电镜图。

图7：(a)银团簇1作为人工抗体对N-Cadherin进行的免疫荧光检测，左为提取蛋白，右为标准蛋白；(b)银团簇1作为人工抗体对N-Cadherin进行的免疫化学发光检测，左为提取蛋白，右为标准蛋白。

图8：(a)银团簇1用作人工抗体对提取蛋白中N-Cadherin进行免疫荧光(虚线)和免疫化学发光(实线)检测的统计曲线图。(b)银团簇1用作人工抗体针对标准蛋白N-Cadherin进行免疫荧光(虚线)免疫化学发光(实线)检测的统计曲线。

图9：(a)银团簇2作为人工抗体对N-Cadherin进行的免疫荧光检测，左为提取蛋白，右为标准蛋白；(b)银团簇2作为人工抗体对钙粘连蛋白N-Cadherin进行的免疫化学发光检测，左为样本，右为标准蛋白。

图10：(a)银团簇2用作人工抗体对提取蛋白中N-Cadherin进行免疫荧光(虚线)和免疫化学发光(实线)检测的统计曲线图。(b)银团簇2用作人工抗体针对N-Cadherin进行免疫荧光(虚线)免疫化学发光(实曲线)检测的统计曲线图。

具体实施方式

下面将结合附图及实施例对本发明进行详细描述，以便于本领域技术人员理解和实施本发明，并进一步认识本发明的优点。

除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：合成多肽保护的金团簇作为人工抗体

在本实施例中，MMP14的靶向肽序列分别为H₂N-CHWKHLHNTKTFL-COOH(SEQ IDNO.1)，和H₂N-HWKHLHNTKTFLC-COOH(SEQ ID NO.2)。

在合成过程中，首先将5mg多肽(SEQ ID NO.1)充分溶解在1.45mL超纯水中，配成多肽水溶液，在室温下与0.117mL浓度为25mM的HAuCl₄搅拌均匀，并在充分搅拌条件下逐滴加入0.24mL浓度为0.5M的NaOH溶液，调节pH值为12。该体系继续放置37℃条件下24h，之后用截留分子量为30kDa超滤管3700rpm转速下离心10min去除大颗粒，将上清液转移到截留分子量为3kDa的超滤管中继续浓缩靶向多肽保护的金团簇，至此金团簇1制备完成。如图1(a)所示，金团簇1的平均粒径在1.2nm左右。同理，按照相同的投料比及反应条件，可以制备出多肽(SEQ ID NO.2)保护的金团簇2，如图1(b)所示，金团簇2的平均粒径在1.3nm左右。

实施例2：使用金团簇1作为人工抗体定量检测蛋白裂解液中MMP14丰度

利用实施例1制备的金团簇1作为人工抗体定量检测人宫颈癌细胞系Caski细胞蛋白裂解液中MMP14的方法，主要包括以下内容：

1)聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离标准蛋白与样品蛋白

准备两块1.5mm、15个孔的10％浓度的聚丙烯酰胺凝胶。每一块凝胶在最两端的上样孔中加3μL预染的marker，17μL上样缓冲溶液，紧邻加marker的上样孔依次加入1、2、4、6、8、10pg的标准MMP14蛋白(MMP14标准蛋白来源于博士德生物科技公司，纯度>95％)。此六个上样孔作为标准对照孔，样本孔与标准孔之间预留一个空白孔只加20μL 1×上样缓冲溶液用于区分标准孔与样品孔。随后，紧挨空白孔依次加入1、4、8、12、16、20μL蛋白裂解液(蛋白裂解液加入5×上样缓冲溶液，100℃金属浴充分变性)，并用19、16、12、8、4、0μL 1×上样缓冲溶液补齐上样体积。将两块凝胶置于同一电泳槽中，恒压80mV分离蛋白后，使其中一块凝胶继续进行蛋白免疫印迹操作中转膜步骤，将分离后蛋白于恒流200mA，2h转移置PVDF膜上，转膜后凝胶与之前未转膜操作的凝胶一起进行考马斯亮蓝染色，以确定转膜效率。

2)建立免疫荧光分析方法标准曲线

将上述步骤中负载有蛋白的PVDF膜在western blot封闭液(碧云天生物科技公司)室温封闭1h后，用含0.1％吐温-20的TBST洗涤液漂洗3min。去除洗涤液后，在4℃下，PVDF膜在5mL 200μM的实施例1中制备的金团簇1人工抗体工作液中避光孵育10h。随后用上述洗涤液充分漂洗膜。将PVDF膜置于数字凝胶成像仪中，采用绿色激发灯激发，设置曝光时间10s，收集膜在699nm处的荧光信号，如图2(a)所示。将所得条带用image J软件统计其荧光值。以标准孔对应的蛋白上样质量为横坐标，对应的荧光值为纵坐标，做线性回归分析即可得免疫荧光标准曲线，如图3(b)所示且标准曲线的线性关系良好(R²＝0.99)。

3)金团簇1作为人工抗体采用免疫荧光的方法定量Caski细胞裂解液中MMP14含量

按照上述步骤2中建立标准曲线时的数据采集和统计方法一致。采集到提取蛋白所对应的数据图如图2(a)所示，将样品孔对应的体积做横坐标，对应荧光值为纵坐标，进行线性回归分析，如图3(a)所示，工作曲线线性良好(R²＝0.99)。

将工作曲线的每个数据点对应的荧光值代入到步骤2所得标准曲线中，结合样品孔对应加样体积，即可获得该体积样品对应的标准蛋白的质量，从而获得所加样品中含有MMP14的质量。将上述数值取平均值即可获得更准确蛋白含质量。如12μL样品对应的荧光值为392941，将其带入到标准曲线中，所对应标准蛋白质量为16.2pg，故12μL Caski细胞裂解液样品中含有MMP14的质量为16.2pg。考虑校准转膜效率(80％)，及考虑到样品稀释比率(80％)，即Caski细胞裂解液中MMP14的浓度为2109pg mL^-1。

4)建立免疫化学发光分析方法标准曲线

在上述步骤2，3荧光信号采集结束后，在PVDF膜上均匀加入1mL含有250mMluminol和250mM H₂O₂的化学发光底物。随后，采用数字凝胶成像仪采集曝光数据，如图2(b)所示。将所得数据灰度值用image J软件进行统计，以标准孔对应的蛋白上样量为横坐标，对应的灰度值为纵坐标，做线性回归分析可得到关于金团簇1作为人工抗体针对金属基质蛋白酶MMP14的免疫化学发光标准曲线，如图3(b)所示且标准曲线的线性关系良好(R²＝0.99)。

5)金团簇1作为人工抗体采用免疫化学发光的方法定量Caski细胞裂解液中MMP14含量

按照上述步骤4中建立标准曲线时的数据采集和统计方法一致。采集到提取蛋白所对应的数据如图3(a)所示，以所加样品体积为横坐标，各提取蛋白样品孔所统计的灰度值为纵坐标，回归曲线线性关系良好(R²＝0.99)。

将工作曲线的每个数据点对应的灰度值代入到步骤4所得标准曲线中，结合样品孔对应加样体积，即可得该体积样品对应的标准蛋白的质量，从而获得所加样品中含有MMP14的量。将这些数值取平均值即可获得更准确蛋白含量。如16μL样品对应的灰度值为1644592，将其带入到标准曲线中，所对应标准蛋白质量为24.1pg，故16μL Caski细胞裂解液样品中含有MMP14的质量为24.1pg，考虑校准转膜效率(80％)及样品稀释比率(80％)，即Caski细胞裂解液中MMP14的浓度为2354pg mL^-1。

采用经典ELISA测得该Caski细胞裂解液样品中MMP14含量为2325pg mL^-1，本发明中采用的免疫荧光和免疫化学发光的方法与此数值非常接近，进一步证明本发明方法的可靠性。

实施例3：使用金团簇2作为人工抗体定量检测蛋白裂解液中MMP14丰度

利用实施例1制备的金团簇2作为人工抗体定量检测人宫颈癌细胞系Hela细胞蛋白裂解液中MMP14的方法，主要包括以下内容：

1)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离标准蛋白与样品蛋白

类似于实施例2中加样方法。准备两块1.5mm、15个孔的10％浓度的聚丙烯酰胺凝胶。每一块凝胶在最两端的上样孔中加3μL预染的marker，17μL 1×上样缓冲溶液，紧邻加marker的上样孔一次加入0.5、1、2、3、4、5pg的标准MMP14蛋白(MMP14标准蛋白来源于博士德生物科技公司，纯度>95％)。此六个上样孔作为标准对照孔，样本孔与标准孔之间预留一个空白孔只加20μL 1×上样缓冲溶液用于分离标准孔与样品孔。随后，紧挨空白孔依次加入10、12、14、16、18、20μL蛋白裂解液(蛋白裂解液加入5×上样缓冲溶液，100℃金属浴充分变性)，并用10、8、6、4、2、0μL 1×上样缓冲溶液补齐。将两块凝胶置于同一电泳槽中，恒压80mV分离蛋白后，使其中一块凝胶继续进行蛋白免疫印迹操作中转膜步骤，将分离后蛋白于恒流200mA，2h转移置PVDF膜上，转膜后凝胶与之前未转膜操作的凝胶一起进行考马斯亮蓝染色，以确定转膜效率。

2)建立免疫荧光分析方法标准曲线

将上述步骤中负载有蛋白的PVDF膜在western blot封闭液(碧云天生物科技公司)室温封闭1h后，用含0.1％吐温-20的TBST洗涤液漂洗3min。去除洗涤液后，PVDF膜在5mL200μM的实施例1中制备的金团簇2人工抗体工作液中4℃避光孵育10h，随后用上述洗涤液充分漂洗膜。将PVDF膜置于数字凝胶成像仪中，采用绿色激发灯激发，设置曝光时间10s，收集699nm处荧光信号，如图4(a)所示。将所得条带用image J软件统计其荧光值。以标准孔对应的蛋白上样质量为横坐标，对应的荧光值为纵坐标，做线性回归分析即可得免疫荧光标准曲线，如图5(b)所示且标准曲线的线性关系良好(R²＝0.99)。

3)金团簇2作为人工抗体采用免疫荧光的方法定量Hela细胞裂解液中MMP14含量。

按照上述步骤2中建立标准曲线时的数据采集和统计方法一致。采集到提取蛋白所对应的数据图如图4(a)所示，将样品孔对应的体积做横坐标，对应荧光值为纵坐标，进行线性回归分析，如图5(a)所示，工作曲线线性良好(R²＝0.99)。

将工作曲线的每个数据点对应的荧光值代入到步骤2所得标准曲线中，结合样品孔对应加样体积，即可获得该体积样品对应的标准蛋白的质量，从而获得所加样品中含有MMP14的量。将上述数值取平均值即可获得更准确蛋白含量。如10μL样品对应的荧光值为65295，将其带入到标准曲线中，所对应标准蛋白质量为3.8pg，故10μL Hela细胞裂解液样品中含有MMP14的质量为3.8pg，考虑校准转膜效率(80％)及到样品稀释比率(80％)，即Hela细胞裂解液中MMP14的浓度为594pg mL^-1。

4)建立免疫化学发光分析方法标准曲线

在上述步骤2，3荧光信号采集结束后，可在PVDF膜上均匀加入1mL含有250mMluminol和250mM H₂O₂的化学发光底物。随后，采用数字凝胶成像仪采集曝光数据，如图4(b)所示。将所得数据灰度值用image J软件进行统计，以标准孔对应的蛋白上样质量为横坐标，对应的灰度值为纵坐标，做线性回归分析即可得到关于金团簇2作为人工抗体针对金属基质蛋白酶MMP14的免疫化学发光标准曲线，如图5(b)所示且标准曲线的线性关系良好(R²＝0.99)。

5)金团簇2作为人工抗体采用免疫化学发光的方法定量Hela细胞裂解液中MMP14含量

按照上述步骤4中建立标准曲线时的数据采集和统计方法一致。采集到提取蛋白所对应的数据如图5(a)所示，以所加样品体积为横坐标，各提取蛋白样品孔所统计的灰度值为纵坐标绘制工作曲线，如图5(a)所示，回归曲线线性关系良好(R²＝0.99)。

将工作曲线的每个数据点对应的灰度值代入到步骤4所得标准曲线中，结合样品孔对应加样体积，即可获得该体积样品对应的标准蛋白的质量，从而获得所加样品中含有MMP14的量。将这些数值取平均值即可获得更准确蛋白含量。如16μL样品对应的灰度值为800495，将其带入到标准曲线中，所对应标准蛋白质量为5.2pg，故16μL Hela细胞裂解液样品中含有MMP14的质量为5.2pg，考虑校准转膜效率(80％)及及样品稀释比率(80％)，即Hela细胞裂解液中MMP14的浓度为508pg mL^-1。

采用经典ELISA测得该Hela细胞裂解液样品MMP14含量为504pg mL^-1，本发明中采用的免疫荧光和免疫化学发光的方法与此数值非常接近，进一步证明本发明方法的可靠性。

实施例4：合成多肽保护的银团簇作为人工抗体

在本实施例中，N-Cadherin的靶向肽序列分别为H₂N-CSWTLYTPSGQSK-COOH(SEQID NO.3)，和H₂N-SWTLYTPSGQSKC-COOH(SEQ ID NO.4)。

5mg多肽(SEQ ID NO.3)充分溶解在1.7mL超纯水中，配成多肽水溶液，在室温下与0.134mL浓度为25mM的AgNO₃搅拌均匀，并在充分搅拌条件下逐滴加入0.3mL浓度为0.5M的NaOH溶液，调节pH值为12。该体系继续放置55℃条件下12h。之后用截留分子量为30kDa超滤管3700rpm转速下离心10min去除大颗粒，将上清液转移到截留分子量为3kDa的超滤管中继续浓缩靶向多肽保护的银团簇，至此银团簇1制备完成。如图6(a)所示，银团簇1的平均粒径在1.9nm左右。同理，按照相同的投料比及反应条件，可以制备出多肽(SEQ ID NO.4)保护的银团簇2，如图6(b)所示，银团簇2的平均粒径在2.1nm左右。

实施例5：使用银团簇1作为人工抗体检测定量蛋白裂解液中N-Cadherin丰度

利用实施例4制备的银团簇1作为人工抗体检测定量人肺癌细胞系A549细胞蛋白裂解液中钙粘连蛋白N-Cadherin的方法，主要包括以下内容：

1)聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离标准蛋白与样品蛋白

准备两块1.5mm、15个孔的10％浓度的聚丙烯酰胺凝胶。每一块凝胶在最两端的上样孔中加3μL预染的marker，27μL上样缓冲溶液，紧邻加marker的上样孔一次加入10、20、40、60、80、100pg的标准N-Cadherin蛋白(N-Cadherin标准蛋白来源于博士德生物科技公司，纯度>95％)。此六个上样孔作为标准对照孔，样本孔与标准孔之间预留一个空白孔只加25μL上样缓冲溶液用于分离标准孔与样品孔。随后，紧挨空白孔依次加入5、10、15、20、25、30μL蛋白裂解液(蛋白裂解液加入5×上样缓冲溶液，100℃金属浴充分变性)，并用25、20、15、10、5、0μL 1×上样缓冲溶液补齐上样体积。将两块凝胶置于同一电泳槽中，恒压80mV分离蛋白后，使其中一块凝胶继续进行蛋白免疫印迹操作中转膜步骤，将分离后蛋白于恒流200mA，2h转移置PVDF膜上，转膜后凝胶与之前未转膜操作的凝胶一起进行考马斯亮蓝染色，以确定转膜效率。

2)建立免疫荧光分析方法标准曲线

将上述步骤中负载有蛋白的PVDF膜在western blot封闭液(碧云天生物科技公司)室温封闭1h后，用含0.1％吐温-20的TBST洗涤液漂洗3min。去除洗涤液后，在4℃下，PVDF膜在5mL 200μM的实施例4中制备的银团簇1人工抗体工作液中避光孵育10h。随后用上述洗涤液充分漂洗膜。将PVDF膜置于数字凝胶成像仪中，采用蓝色激发灯激发，设置曝光时间1s，收集560nm处荧光信号，如图7(a)所示。将所得数据用image J软件统计其荧光值。以标准孔对应的蛋白上样质量为横坐标，对应的荧光值为纵坐标，做线性回归分析即可得到关于银团簇1作为人工抗体针对N-Cadherin的免疫荧光标准曲线，如图8(b)所示且标准曲线的线性关系良好(R²＝0.96)。

3)银团簇1作为人工抗体采用免疫荧光的方法定量A549细胞裂解液中N-Cadherin蛋白含量

按照上述步骤2中建立标准曲线时的数据采集和统计方法一致。采集到提取蛋白所对应的数据图如图7(a)所示，将样品孔对应的体积做横坐标，对应荧光值为纵坐标，进行线性回归分析，如图8(a)所示，工作曲线线性良好(R²＝0.99)。

将工作曲线的每个数据点对应的荧光值代入到步骤2所得标准曲线中，结合样品孔对应加样体积，即可获得该体积样品对应的标准蛋白的质量，从而获得所加样品中含有N-Cadherin的量。将上述数值取平均值即可获得更准确蛋白含量。如25μL样品对应的荧光值为115154，将其带入到标准曲线中，所对应标准蛋白质量为33.3pg，故25μL A549细胞裂解液样品中含有N-Cadherin的质量为33.3pg。考虑到校准转膜效率(60％)及样品稀释比率(80％)，即A549细胞裂解液中N-Cadherin的浓度为2775pg mL^-1。

4)建立免疫化学发光分析方法标准曲线

在上述步骤2，3荧光信号采集结束后，在PVDF膜上均匀加入1mL含有250mMluminol和250mM H₂O₂的化学发光底物。随后，采用数字凝胶成像仪采集曝光数据，如图7(b)所示。将所得数据灰度值用image J软件进行统计，以标准孔对应的蛋白上样体积为横坐标，对应的灰度值为纵坐标，做线性回归分析即可得到关于银团簇1作为人工抗体针对N-Cadherin的免疫化学发光标准曲线，如图8(b)所示且标准曲线的线性关系良好(R²＝0.98)。

5)银团簇1作为人工抗体采用免疫化学发光的方法定量A549细胞裂解液中MMP14含量

按照上述步骤4中建立标准曲线时的数据采集和统计方法一致。采集到提取蛋白所对应的数据如图8(a)所示，以所加样品体积为横坐标，各提取蛋白样品孔所统计的灰度值为纵坐标。回归曲线线性关系良好(R²＝0.98)。

将工作曲线的每个数据点对应的灰度值代入到步骤4所得标准曲线中，结合样品孔对应加样体积，即可获得该体积样品对应的标准蛋白的质量，从而获得所加样品中含有N-Cadherin的量。将这些数值取平均值即可获得更准确蛋白含量。如30μL样品对应的灰度值为495806，将其带入到标准曲线中，所对应标准蛋白质量为53.4pg，故20μL A549细胞裂解液样品中含有N-Cadherin的质量为53.4pg。考虑校准转膜效率(60％)及到样品稀释比率(80％)，即A549细胞裂解液中N-Cadherin的浓度为3709pg ml^-1。

采用经典ELISA测得该批A549细胞裂解液样品N-Cadherin蛋白含量为3053pg mL^-1，本发明中采用的免疫荧光和免疫化学发光的方法与此数值非常接近，进一步证明本发明方法的可靠性。

实施例6：使用银团簇2作为人工抗体定量检测蛋白裂解液中N-Cadherin丰度

利用实施例4制备的银团簇2作为人工抗体定量检测人肺癌细胞系H157细胞蛋白裂解液中N-Cadherin的方法，主要包括以下内容：

1)聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离标准蛋白与样品蛋白

类似于实施例5中加样方法。准备两块1.5mm、15个孔的10％浓度的聚丙烯酰胺凝胶。每一块凝胶两端的上样孔中加3μL预染的marker，22μL1×上样缓冲溶液，紧邻加marker的

上样孔一次加入10、20、40、60、80、100pg的标准N-Cadherin蛋白(N-Cadherin标准蛋白来源于博士德生物科技公司，纯度>95％)。此六个上样孔作为标准对照孔，样本孔与标准孔之间预留一个空白孔只加20μL 1×上样缓冲溶液用于分离标准孔与样品孔。随后，紧挨空白孔依次加入1、5、10、15、20、25μL蛋白裂解液(蛋白裂解液加入5×上样缓冲溶液，100℃金属浴充分变性)，并用24、20、15、10、5、0μL 1×上样缓冲溶液补齐上样体积。将两块凝胶置于同一电泳槽中，恒压80mV分离蛋白后，使其中一块凝胶继续进行蛋白免疫印迹操作中转膜步骤，将分离后蛋白于恒流200mA，2h转移置PVDF膜上，转膜后凝胶与之前未转膜操作的凝胶一起进行考马斯亮蓝染色，以确定转膜效率。

2)建立免疫荧光分析方法标准曲线

将上述步骤中负载有蛋白的PVDF膜在western blot封闭液(碧云天生物科技公司)室温封闭1h后，用含0.1％吐温-20的TBST洗涤液漂洗3min。去除洗涤液后，在4℃下，PVDF膜在5mL 200μM的实施例4中制备的银团簇2人工抗体工作液中避光孵育10h。随后用上述洗涤液充分漂洗膜。将PVDF膜置于数字凝胶成像仪中，采用蓝色激发灯激发，设置曝光时间1s，收集膜在560nm处荧光信号，如图9(a)所示。将所得条带用image J软件统计其荧光值。以标准孔对应的蛋白上样质量为横坐标，对应的荧光值为纵坐标，做线回归分析即可得免疫荧光标准曲线，如图10(b)所示且标准曲线的线性关系良好(R²＝0.97)。

3)银团簇2作为人工抗体采用免疫荧光的方法定量H157细胞裂解液中N-Cadherin含量

按照上述步骤2中建立标准曲线时数据采集和统计方法一致，采集到的数据图如图9(a)所示，将样品孔对应的体积做横坐标，对应荧光值为纵坐标，绘制工作曲线，如图10(a)所示，工作曲线线性良好(R²＝0.99)

将工作曲线的每个数据点对应的荧光值代入到步骤2所得标准曲线中，结合样品孔对应加样体积，即可获得该体积样品对应的标准蛋白的质量，从而获得所加样品中含有N-Cadherin的质量。将上述数值取平均值即可获得更准确蛋白含量。如15μL样品对应的荧光值为124373，将其带入到标准曲线中，所对应标准蛋白质量为13.8pg，故15μL H157细胞裂解液样品中含有N-Cadherin的质量为13.8pg。考虑到校准转膜效率(60％)及样品稀释比例(80％)，即H157细胞裂解液中N-Cadherin的浓度为1917pg mL^-1。

4)建立免疫化学发光分析方法标准曲线

在上述步骤2，3荧光信号采集结束后，可在PVDF膜上均匀加入1mL含有250mMluminol和250mM H₂O₂的化学发光底物。随后，采用数字凝胶成像仪采集曝光数据，如图9(b)所示。将所得数据灰度值用imageJ软件进行统计，以标准孔对应的蛋白上样量为横坐标，对应的灰度值为纵坐标，做线性回归分析即可得到关于银团簇2作为人工抗体针对钙粘连蛋白N-Cadherin的免疫化学发光标准曲线，如图10(b)所示且标准曲线的线性关系良好(R²＝0.93)。

5)银团簇2作为人工抗体采用免疫化学发光的方法定量H157细胞裂解液中N-Cadherin含量

按照上述步骤4中建立标准曲线时的数据采集和统计方法一致。采集到提取蛋白所对应的数据如图10(a)所示，以所加样品体积为横坐标，各提取蛋白样品孔所统计的灰度值为纵坐标。回归曲线线性关系良好(R²＝0.96)。

将工作曲线的每个数据点对应的灰度值代入到步骤4所得标准曲线中，结合样品孔对应加样体积，即可得该体积样品对应的标准蛋白的质量，从而获得所加样品中含有N-Cadherin的量。将这些值取平均值即可获得更准确蛋白含量。如9μL样品对应的灰度值为414185，将其带入到标准曲线中，所对应标准蛋白质量为18.4pg，故9μL H157细胞裂解液样品中含有N-Cadherin的质量为9.05pg，考虑到校准转膜效率(60％)及样品稀释比例(80％)，即H157细胞裂解液中N-Cadherin的浓度为2095pg ml^-1。

采用经典ELISA测得该H157细胞裂解液样品N-Cadherin含量为2270pg mL^-1，本发明中采用的免疫荧光和免疫化学发光的方法与此数值非常接近，进一步证明本发明方法的可靠性。

本发明以生物靶向性的多肽分子为生物配体模板，采用生物矿化的方法合成同时兼备荧光特性及生物靶向性的金属团簇。金属团簇类似于荧光素标记或者辣根过氧化物酶标记的抗体，可作为新一代人工抗体，结合经典蛋白免疫印迹技术去检测识别定量细胞、组织裂解液或血清中目标蛋白的含量。采用该基于人工抗体的免疫荧光和免疫化学发光的方法，不仅可以准确定量蛋白裂解液中丰度高的蛋白，对于样本量珍贵、丰度低的蛋白定量检测优势更为显著。

尽管本发明已经参照附图和优选实施例进行了说明，但是，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本发明的各种更改、变化和等同物由所附的权利要求书的内容涵盖。

Claims (8)

1.一种金属团簇作为人工抗体定量细胞、组织提取物或血清中蛋白丰度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备人工抗体金属团簇，所述的人工抗体金属团簇由金属团簇金属原子核心和靶向多肽组成；

(2)使人工抗体金属团簇与聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的待测样本提取目标蛋白接触；

(3)通过与目标蛋白结合的人工抗体的本征荧光信号及其催化底物产生的化学发光信号定量检测待测样品中目标蛋白表达量。

2.按照权利要求1所述的一种金属团簇作为人工抗体定量细胞、组织提取物或血清中蛋白丰度的方法，其特征在于，其中步骤(1)作为人工抗体的金属团簇是通过以下步骤获得：

将含金属元素的溶液与靶向多肽溶液在室温条件下混合均匀，之后加入NaOH溶液调节pH值到12，所形成的溶液继续在37℃避光搅拌，超滤获得金属团簇；

金属元素与靶向多肽的摩尔比为1:0.8-1.2。金属团簇的粒径为2到5nm。

3.按照权利要求2所述的一种金属团簇作为人工抗体定量细胞、组织提取物或血清中蛋白丰度的方法，其特征在于，组成金属团簇核心的金属元素是指在待测样本中基本不含或者含量极低的元素，例如金、银或铂。可使用的金属溶液可以是HAuCl₄、AgNO₃、H₂PtCl₆溶液。

4.按照权利要求1所述的一种金属团簇作为人工抗体定量细胞、组织提取物或血清中蛋白丰度的方法，其特征在于，所述靶向多肽分子是天然来源或者合成的多肽，其可以靶向目标蛋白，如选自金属基质蛋白酶、整合素蛋白、血管内皮细胞生长因子受体、钙粘连蛋白等。

5.按照权利要求1所述的一种金属团簇作为人工抗体定量细胞、组织提取物或血清中蛋白丰度的方法，其特征在于，步骤(3)人工抗体定量检测目标蛋白是通过以下步骤进行：

利用人工抗体的本征荧光信号，即通过免疫荧光分析的方法进行；或者利用人工抗体的催化化学发光信号，即通过免疫化学发光的方法进行，先制备发光信号或发光信号与浓度的标准曲线，然后将实际待测物质反应后的得到的发光信号或发光信号与标准曲线进行比较，进而换算得到丰度。

6.按照权利要求5所述的一种金属团簇作为人工抗体定量细胞、组织提取物或血清中蛋白丰度的方法，其特征在于，其中免疫荧光的方法是通过数字凝胶成像设备采集识别目标蛋白的人工抗体的荧光条带，后期统计荧光强度而进行。

免疫化学发光的分析方法是通过与目标蛋白结合的人工抗体的类似于过氧化物酶的催化活性，催化化学发光底物产生化学发光信号，并通过统计其灰度值得到信号强度，使用的化学发光底物试剂，是鲁米诺(luminol)、异鲁米诺(isoluminol)、吖啶酸丙磺酸盐(NSP-SA)，也或使用对过氧化物酶敏感的可产生光吸收信号、发生颜色反应的化学试剂，如重氮胺基苯(diazoaminobenzene,DAB)、邻苯二胺(o-phenylenediamine,OPD)等。

7.按照权利要求6所述的一种金属团簇作为人工抗体定量细胞、组织提取物或血清中蛋白丰度的方法，其特征在于，免疫化学发光的方法通过人工抗体催化H₂O₂与鲁米诺产生化学发光信号，通过数字凝胶系统采集化学发光信号进行目标蛋白检测与定量；

免疫化学发光的方法通过人工抗体催化H₂O₂与异鲁米诺产生化学发光信号，通过数字凝胶系统采集化学发光信号进行目标蛋白检测与定量；

免疫化学发光的方法通过人工抗体催化H₂O₂与重氮胺基苯生成棕黄色产物而采集灰度值进行目标蛋白的检测与定量；

酶联免疫方法通过纳米酶催化H₂O₂与邻苯二胺生成橘色产物而采集灰度值进行目标蛋白的检测与定量；。

8.按照权利要求1所述的一种金属团簇作为人工抗体定量细胞、组织提取物或血清中蛋白丰度的方法，其特征在于，

所述利用人工抗体进行提取蛋白定量的方法包括同时分析标准蛋白与提取蛋白的免疫荧光、免疫化学发光，并将相应的光学信号做回归分析进行蛋白定量分析过程。

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