CN109837083B - 一种有机/无机杂化双功能荧光纳米花及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有机/无机杂化双功能荧光纳米花及其制备方法与应用。所述有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料由蛋白包裹的荧光金纳米簇、小分子人工抗原和钙离子组装而成；具体可按照如下方法制备：配制蛋白包裹的荧光金纳米簇和小分子人工抗原的溶液；向溶液中加入氯化钙溶液并振荡混匀；将上述处理的所述溶液在避光的条件下进行静置反应即得。本发明制备方法操作简单、成本低廉、反应条件温和、绿色环保，所制备的有机/无机杂化双功能荧光纳米花可作为荧光检测探针用于免疫学检测领域；根据荧光金纳米簇上蛋白以及小分子人工抗原的不同，可以形成多种荧光检测探针用于检测不同的目标物分子，在多残留高通量检测等方面有着很高的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种有机/无机杂化双功能荧光纳米花及其制备方法与应用，属于纳米材料领域以及生物学领域。
背景技术
荧光金纳米簇是近几年出现的一种新型荧光纳米材料，它是由几个到几百个原子组成的粒径为0.2～3nm的核壳型纳米材料，具有较强的光致发光、良好的光稳定性、大的斯托克斯位移和高的荧光量子产率，它已成功被用于过氧化氢、重金属离子、茶多酚等物质的检测。因为荧光金纳米簇的超小粒径和抗体/抗原等生物识别材料偶联效率不高且不易纯化，且相对量子点和有机染料来说，荧光强度较弱，所以将其作为荧光标记物用于免疫检测中的报道很少。
发明内容
本发明的目的是提供一种有机/无机杂化双功能荧光纳米花及其制备方法与应用，本发明提供的制备方法操作简单、成本低廉、反应条件温和、绿色环保；所制备的有机/无机杂化双功能荧光纳米花可作为荧光检测探针用于基于抗原抗体特异性识别的磁分离荧光免疫分析方法中。
本发明所提供的有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料其由蛋白包裹的荧光金纳米簇、小分子人工抗原和钙离子组装而成；具体是以蛋白(如牛血清白蛋白)包裹的荧光金纳米簇(AuNCs@BSA)和小分子人工抗原为有机组分，与钙离子形成有机/无机杂化的具有三维花状纳米结构的双功能荧光纳米材料。
所述有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料按照包括如下步骤的方法制备：
(1)配制蛋白包裹的荧光金纳米簇和小分子人工抗原的溶液；
(2)向所述溶液中加入氯化钙溶液并振荡混匀；
(3)将步骤(2)处理的所述溶液在避光的条件下进行静置反应，即得所述有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料。
上述的制备方法中，步骤(1)中，采用磷酸盐缓冲液配饰所述溶液；
所述蛋白可为任何适合于作为小分子人工抗原中的载体蛋白的蛋白，如牛血清白蛋白；
所述小分子人工抗原可为克伦特罗人工抗原、喹乙醇人工抗原或诺氟沙星人工抗原；
根据检测目标物分子的不同，选择相应的蛋白和小分子人工抗原。
上述的制备方法中，步骤(1)中，所述蛋白包裹的荧光金纳米簇是按照包括如下步骤的方法制备的：
将所述蛋白和氯金酸混合进行反应(如37℃)，然后加入NaOH溶液(1M)调节pH至11～13(如12)，继续反应(如在37℃条件下搅拌反应12小时)即得，纯水透析后，收集并放于4℃保存备用；
所述蛋白的浓度可为50mg/mL，所述氯金酸的浓度可为10mM。
上述的制备方法中，步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液的浓度可为3～5mmol/L；
所述蛋白包裹的荧光金纳米簇与所述小分子人工抗原的质量投料比可为8～10：1，具体可为9：1；
所述溶液中蛋白的浓度可为0.2～0.5mg/mL，具体可为0.2mg/mL。
上述的制备方法中，步骤(2)中，所述氯化钙溶液的浓度可为100～120mmol/L，具体可为120mmol/L。
上述的制备方法中，步骤(3)中，所述静置反应的条件如下：
温度为37℃，时间为14～16小时；
所述静置反应结束后，采用离心方式收集所述有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料。
本发明提供的有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料能够作为荧光检测探针应用于基于抗原抗体特异性识别的磁分离荧光免疫分析方法中。
具体分析时，可按照如下步骤进行：
根据待分析的目标物分子，确定蛋白和小分子人工抗原；然后根据本发明方法制备有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料；在样品或目标物标准溶液中加入生物素-亲和素系统介导的小分子抗体偶联的磁珠，反应后，进行磁分离，弃上清，再加入等体积含有有机/无机杂化双功能荧光纳米花的溶液，继续振荡反应，磁分离后，取上清于96孔板中测其荧光强度；根据建立的标准曲线定量检测样品中目标物的浓度。
荧光金纳米簇以及小分子人工抗原中都含有蛋白，所以本发明同时将荧光金纳米簇和小分子人工抗原作为有机组分，合成有机/无机杂化材料即可以达到富集荧光纳米簇增强荧光的目的，同时实现荧光金纳米簇标记小分子人工抗原，因为反应条件温和、绿色无污染，参与反应的有机组分的性质都不受影响，所以本发明方法有效解决了荧光金纳米簇作为荧光标记物在免疫检测中应用的问题。
本发明具有如下优点：
本发明提供的制备方法操作简单、成本低廉、反应条件温和、绿色环保，所制备得到的有机/无机杂化双功能荧光纳米花可作为荧光检测探针用于免疫学检测领域；根据荧光金纳米簇上蛋白以及小分子人工抗原的不同，可以形成多种荧光检测探针用于检测不同的目标物分子，在多残留高通量检测等方面有着很高的推广应用价值。
附图说明
图1为本发明有机/无机杂化双功能荧光纳米花的制备方法的示意图。
图2为本发明制备的有机/无机杂化双功能荧光纳米花的透射电镜图。
图3为基于抗原抗体特异性识别的磁分离荧光免疫分析方法的原理图。
图4为基于抗原抗体特异性识别的磁分离荧光免疫分析方法检测克伦特罗的定量标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：合成牛血清白蛋白包裹的荧光金纳米簇
所有玻璃仪器经重铬酸溶液浸泡24小时后，用蒸馏水冲洗干净。先将配制好的溶液在37℃放置30min，然后将BSA溶液(50mg/mL)和HAuCl4溶液(10mM)在37℃等体积混合，磁力搅拌反应2min后，逐滴加入NaOH溶液(1M)调节pH至12.0，继续在37℃条件下搅拌反应12小时，溶液颜色由亮黄色变为棕黄色。将制备好的AuNCs@BSA用透析袋(100KDa)在纯水中透析12小时后，用无菌离心管收集并放于4℃保存。将制备好的AuNCs@BSA在紫外灯下观察，呈现明显的红色荧光，荧光光谱表征结果说明其最大激发和发射波长分别为360nm和640nm，以上结果说明AuNCs@BSA合成成功。
实施例2：制备有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料
用3mmol/L的PBS缓冲液配制同时含有AuNCs@BSA和克伦特罗人工抗原的溶液，体系中的蛋白终浓度为0.2mg/ml，AuNCs@BSA和克伦特罗人工抗原的投料比为9：1(质量)。然后向体系中加入150μL的氯化钙溶液(120mM)，在涡旋仪上混匀后，放在室温下避光静置反应过夜，通过离心的方法收集合成的有机/无机杂化抗原荧光纳米花材料，并用超纯水洗涤2～3遍，最终用等体积的水重悬，备用。反应前后体系的荧光强度变化以及蛋白消耗率见表1，并通过透射电镜对合成的有机/无机杂化抗原荧光纳米花材料进行表征(见图2)，结果初步说明有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料制备成功。
表1有机/无机杂化双功能荧光纳米花合成前后蛋白消耗率及荧光变化
实施例3：生物素化克伦特罗单克隆抗体的制备
将商品化的活化生物素用DMSO溶解，以0.1M的碳酸钠缓冲液为反应体系，向其中分别加入生物素溶液和克伦特罗单克隆抗体，在室温下振荡反应2.5小时，反应完成后在0.01M的PBS缓冲液中进行透析48小时，最终收集并测蛋白浓度约为0.68mg/mL。
实施例4：基于抗原抗体特异性识别的磁分离荧光免疫分析方法的建立
基于抗原抗体特异性识别的磁分离荧光免疫分析方法的基本原理如图3所示，以超纯水为反应体系，分别配制含有不同浓度的克伦特罗标准品(浓度分别为0、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16、32、64、128μg/l)，然后分别向体系中加入30μL生物素-亲和素系统介导的克伦特罗单抗偶联的磁珠，反应10min后，进行磁分离，弃上清，再加入等体积含有有机/无机杂化双功能荧光纳米花的溶液，继续振荡反应10min，磁分离后，取上清100μL于96孔板中测其荧光强度。实验结果(图4)表明，随着体系中克伦特罗标准品浓度增加，体系的荧光强度上升，且荧光强度和标准品浓度对数在一定范围呈比较好的线性关系，相关系数为0.9925，因此可利用该标准曲线测定克伦特罗的浓度。
Claims (8)
1.一种有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料，其由蛋白包裹的荧光金纳米簇、小分子人工抗原和钙离子组装而成；
所述有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料按照包括如下步骤的方法制备：
(1)配制所述蛋白包裹的荧光金纳米簇和所述小分子人工抗原的溶液；
所述蛋白为牛血清白蛋白；
所述小分子人工抗原为克伦特罗人工抗原、喹乙醇人工抗原或诺氟沙星人工抗原；
所述蛋白包裹的荧光金纳米簇是按照包括如下步骤的方法制备：
将所述蛋白和氯金酸溶液等体积混合进行反应，然后加入NaOH溶液调节pH至11～13，继续反应即得；
采用磷酸盐缓冲液配制所述溶液；
所述磷酸盐缓冲液的浓度为3～5mmol/L；
所述蛋白包裹的荧光金纳米簇与所述小分子人工抗原的质量投料比为8～10：1；
所述溶液中蛋白的浓度为0.2～0.5mg/mL；
(2)向所述溶液中加入氯化钙溶液并振荡混匀；
(3)将步骤(2)处理的所述溶液在避光的条件下进行静置反应，即得所述有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料。
2.根据权利要求1所述的有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料，其特征在于：步骤(2)中，所述氯化钙溶液的浓度为100～120mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料，其特征在于：步骤(3)中，所述静置反应的条件如下：
温度为37℃，时间为14～16小时。
4.权利要求1-3中任一项所述有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制所述蛋白包裹的荧光金纳米簇和所述小分子人工抗原的溶液；
所述蛋白为牛血清白蛋白；
所述小分子人工抗原为克伦特罗人工抗原、喹乙醇人工抗原或诺氟沙星人工抗原；
所述蛋白包裹的荧光金纳米簇是按照包括如下步骤的方法制备的：
将所述蛋白和氯金酸溶液等体积混合进行反应，然后加入NaOH溶液调节pH至11～13，继续反应即得；
采用磷酸盐缓冲液配制所述溶液；
所述磷酸盐缓冲液的浓度为3～5mmol/L；
所述蛋白包裹的荧光金纳米簇与所述小分子人工抗原的质量投料比为8～10：1；
所述溶液中蛋白的浓度为0.2～0.5mg/mL；
(2)向所述溶液中加入氯化钙溶液并振荡混匀；
(3)将步骤(2)处理的所述溶液在避光的条件下进行静置反应，即得所述有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述氯化钙溶液的浓度为100～120mmol/L。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述静置反应的条件如下：
温度为37℃，时间为14～16小时。
7.权利要求1-3中任一项所述有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料在作为荧光检测探针中的应用；
所述有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料用于基于抗原抗体特异性识别的磁分离荧光免疫分析方法中。
8.基于抗原抗体特异性识别的磁分离荧光免疫分析方法，包括如下步骤：
根据待分析的目标物分子，确定蛋白和小分子人工抗原，制备权利要求1-3中任一项所述有机/无机杂化双功能荧光纳米花材料；在样品或目标物标准溶液中加入生物素-亲和素系统介导的小分子抗体偶联的磁珠进行反应，然后进行磁分离，弃上清，再加入等体积含有所述有机/无机杂化双功能荧光纳米花的溶液，继续振荡反应，磁分离后，取上清于多孔板中测其荧光强度；根据建立的标准曲线定量检测样品中目标物的浓度。
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