JPH09500411A - 蛍光性ポリマー標識された接合体および中間体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特異性結合分析に有用である高蛍光性接合体を提供し、この接合体は蛍光性ポリマーに結合した特異性結合肢を含む。蛍光性ポリマーは固定化された複数のシグナル発生基を有する骨格ポリマーと、必要に応じポリマーに結合したシクロデキストリン成分とからなっている。さらに、６−シクロデキストリンモノアルデヒドを作成させるための新規な方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光性ポリマー標識された接合体および中間体 技術分野 本発明は、特異性結合分析に有用である蛍光性接合体に関する。より詳細には 本発明は、高蛍光性ポリマーに連結した特異性結合肢を含む高蛍光性の水溶性接 合体のための組成物および中間体に関するものである。発明の背景 細胞表面に対し抗体により示される結合の親和性はしばしば、細胞試料（以下 、試験試料と称する）の血球測定および／または血液学的分析に用いられる画像 形成システムの基礎として活用される。画像形成システムはしばしば、試験試料 に含まれる特定細胞の表面における部位に特異的に結合する結合性分子として抗 体を使用する。抗体が細胞の表面に結合したかどうかを検出するには、これを蛍 光性分子で標識（ｔａｇもしくはｌａｂｅｌ）する。抗体とその蛍光性分子とを 総合して接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と称する。 典型的な血球測定もしくは血液学的分析においては接合体を、一般に各種の細 胞集団を含有する血液もしくはそのフラクショ ンである試験試料と接触させて試験混合物を形成する。この混合物を、接合体が 或る種の細胞集団の表面における標的部位に結合するのに充分な時間および充分 な条件下で培養する。培養時間の後、エネルギー源が接合体の蛍光性分子を励起 して、蛍光発生させる。この蛍光を、たとえば結合した接合体の蛍光により細胞 画像を検出するカメラによって検出する。画像形成システムに現在使用されてい るカメラは高感度であり、その結果とし極めて高価である。これらカメラは、比 較的低い蛍光を有する接合体をも検出せねばならないので、高感度でなければな らない。たとえば画像形成システムに現在使用されている接合体は典型的には約 １２，０００のＭｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆＥｑｕｉｖａｌｅｎｔ Ｓｏｌｕｂｌ ｅ Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ（ＭＥＳＦ）値を有する。１２，０００のＭＥＳ Ｆ値を有する蛍光染色された細胞は、１２ビット、４，０９６レベルおよび５０ ０×３８６ピクセルを有する光電冷却チャージド・カプルド・デバイス（ＣＣＤ ）カメラによって確実に画像形成することができる。この種のカメラは価格が約 ２万ドルであって、画像形成システムの製造コストを高くしている主因である。 より感度が低く、したがってより安価なカメラでも検出しうるＭＥＳＦ値を持 った接合体を製造する試みが幾つかなされている。接合体の蛍光を増大させる従 来の試みは、より明るい接合体を得るために接合体結合効率を犠牲にしてきた。 たとえば接合体の蛍光の増大を試み、抗体を複数の蛍光性分子（しばしば螢光体 と称する）でランダム標識している。このランダム標識は抗体当りの螢光体の個 数を増大させるが、同時に螢光体を抗体の結合領域にも結合させる。この領域が 螢光体により結合されると、もはや標的を結合することができず、したがって細 胞表面を画像形成することができず、その所定の目的を果たしえない。さらに複 数の螢光体による抗体の標識はしばしば抗体のＦｃ部分を阻害せずに残し、試験 試料に含有された細胞の表面に存在しうるＦｃリセプタを結合することができる 。このように結合する能力のため、接合体の非特異的結合が生じて誤った画像を もたらす。 画像形成接合体の蛍光を増大させる他の試みにおいては、複数の螢光体をポリ マーに付着させると共にポリマーを抗体に付着させている。しかしながら、この 接合体は顕著に消去され、したがって制限量のスペースの限られたポリマー骨格 における 複数螢光体の間隔が不充分で信号損失が生ずるため所定の目的を果さない。 画像形成接合体の蛍光を増大させるさらに他の試みにおいては、蛍光性微粒子 もしくはコロイド粒子を抗体に付着させて、接合体の蛍光を増大させる。しかし ながら、この種の接合体は不溶性であるという欠点を有する。不溶性であると、 試験試料中にしばしば存在する食細胞により異物として認識される。その結果、 これら接合体は食細胞により摂取され、この種の細胞による蛍光は食細胞におけ る蛍光性粒子に基づくものとなり、細胞表面におけるマーカーに結合した接合体 の結果でなくなる。 シクロデキストリンとして知られる分子が接合体合成の技術分野で使用されて いる。シクロデキストリンは周知の水溶性環式オリゴ糖類であって、疎水性の中 心キャビティと親水性の外側領域とを有する。一般に、シクロデキストリン分子 の形状は円筒状であって、円筒の１端部は他端部よりも大きい開口を有する。大 きい方の開口は二次リムとして知られ、他方の開口は一次リムとして知られる。 大きい方の二次リムを通って小分子が侵入しうるキャビティがシクロデキストリ ン分子の２つの開 口の間に存在し、水性系においてはシクロデキストリン分子（「ホスト」）のキ ャビティが小分子量の疎水性分子（「ゲスト」）との錯生成をもたらす疎水性微 小環境を与える。 高分子シクロデキストリンを作る努力も、接合体に関連した蛍光を増大させる 試みでなされている。理論的に、単一のシクロデキストリン分子の錯生成特性は 数個のシクロデキストリン分子を互いに近接させることにより拡大することがで きる（すなわち、数個のシクロデキストリン分子を互いに近接させ、ゲスト分子 がシクロデキストリン分子のキャビティに侵入する確率を増大する）。したがっ て、この理論によれば、高分子シクロデキストリン分子が形成されると複数のゲ スト分子を収容することができることになる。さらに、高分子シクロデキストリ ン分子のゲスト分子がシグナル発生基であれば、たとえば螢光体が互いに近接し て存在し、ポリマーに関連した蛍光が単一螢光体のそれよりも大となるであろう 。したがって、接合体を高分子シクロデキストリンを含有する螢光体で作成すれ ば、その蛍光は理論的に単一蛍光体で作成された接合体よりも大となるであろう 。 数種のシクロデキストリン系ボリマーが上記理論を実現すべ く製造されている。しかしながら、これらポリマーはその所望の作用を著しく制 限する問題を有する。これらシクロデキストリン系ポリマーは、シクロデキスト リンの一次および二次リムに数個の反応性基を有するよう改変されたシクロデキ ストリン単量体を用いて合成され、これらモリマーをその一次および二次リムを 介して反応させると共に複数回にわたりその複数の反応性基によって反応させる 。シクロデキストリン分子がその二次リム部位で結合されると、疎水性キャビテ ィに対する大きい開口が妨げられる。その結果、ゲスト分子がシクロデキストリ ンのキャビティに侵入するのが困難となり、ホストとしてのシクロデキストリン の用途が減殺される。さらに、複数の反応性基を有するシクロデキストリンでポ リマーを形成させれば高度の架橋が生ずる。架橋が生ずると、シクロデキストリ ンは二次リムにより結合されて上記問題を生ずるだけでなく、シクロデキストリ ンのマトリックスも形成される。その結果、重合されるシクロデキストリンの個 数が制限され、重合したシクロデキストリンの多くがマトリックス内に埋め込ま れる。多くのシクロデキストリンは近接するが、極めて少数の二次開口しか利用 可能でなくなり、極めて少数のゲスト／ホスト複合体しか形成 しえない。上記ポリマーに関連する諸問題はその製造方法から発生する。特に、 ポリマーを合成すべく用いる単量体シクロデキストリンは反応性過多である。 有用な重合体シクロデキストリンを合成するには、適切に反応する単量体シク ロデキストリンでブロックを構築することが必要である。この種の反応性シクロ デキストリンの例は６−シクロデキストリン モノアルデヒドである。６−シク ロデキス卜リン モノアルデヒドへの経路も従来記載されているが、その合成方 法は毒性かつ潜在的に爆発性の中間体の合成を含む複数の工程を必要とする。さ らに、これら方法は入手困難かつ高価な材料を必要とする。したがって、シクロ デキストリンの錯生成特性を特に接合体合成に関し効果的に使用するには、一層 安全かつ一層効率的な６−シクロデキストリン モノアルデヒドへの経路が必要 となる。 画像形成システムの経費を低減させるには、最も高価な部品の１つのコストを 減少させればよい。具体的には、画像形成システムに低コストのカメラを使用す ることができれば、全システムのコストは著しく低減するであろう。画像形成接 合体技術の現状からすると、これは現実的でない。したがって、低コス トカメラにより検出できるシグナルを発生しうる接合体に対する要請が存在する 。 発明の要点 本発明によれば、比較的低い感度を有する検出装置によっても検出しうるよう な量の蛍光を発する接合体が提供される。さらに、中間体およびこれら中間体の 合成に有用な新規な方法も提供される。本発明の接合体は、特異性結合肢に固定 化された蛍光体を用いる実質的にあらゆる用途に用いることができる。 ここに提供される接合体は、少なくとも１種の高蛍光性ポリマーに共有結合し た特異性結合肢を含む。高蛍光性ポリマーは、蛍光性化合物を直接結合させた骨 格ポリマーからなっている。或いは、骨格ポリマーはそこに共有結合したシクロ デキストリン分子を有することもでき、蛍光性化合物をシクロデキストリン分子 の疎水性微小環境内に収容して、シグナル発生基をポリマーと間接的に結合させ ることができる。蛍光性化合物を骨格ポリマーに直接結合させれば、シクロデキ ストリン分子を結合シグナル発生基と連携させることによりポリマーに間接付加 することができ、或いはシクロデキストリンを共有結合させることにより蛍光性 ポリマーにシクロデキストリンを付加すること もできる。 本発明の他の特徴によれば、６−シクロデキストリン モノアルデヒドの作成 方法も提供される。ここに提供される方法は、シクロデキストリン分子に対する アルデヒド基の部位特異性導入を可能にする。この方法はシクロデキストリン分 子の一次リムにアルデヒド基を１個だけ導入することにより反応性シクロデキス トリン分子を形成するが、これは反応した際に架橋せず、大きい方の二次リムの 開口を妨げることもない。 ６−シクロデキストリン モノアルデヒドの作成方法は、（ａ）式 ［式中、Ｘは であり、 ｎは５、６もしくは７である］ のシクロデキストリン分子を、式 ［式中、Ｘおよびｎは上記の意味を有する］ のモノトシレート誘導体に変換し； （ｂ）工程（ａ）のモノトシレート誘導体を式 ［式中、Ｘおよびｎは上記の意味を有する］ の６−シクロデキストリン モノアルデヒドに変換する工程からなっている。 図面の簡単な説明 第１図はアルファー（α）、ベータ（β）およびガンマ（γ）シクロデキスト リンおよびそのグルコース単位の番号付け方式を示している。発明の詳細な説明 以下の定義を本発明に適用する：定義 ここで用いる「分析物」という用語は検出もしくは測定すべき化合物もしくは 組成物を意味し、少なくとも１個のエピトープもしくは結合部位を有する。分析 物は、天然の結合肢が存在し或いは結合肢を設定しうる任意の物質とすることが できる。分析物は限定を意図するものでないが毒素、有機化合物、蛋白質、ペプ チド、微生物、人間もしくは動物の血液に含まれる細胞、細胞表面抗原、アミノ 酸、炭水化物、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物（治療目的で投与される もの、並びに不法目的で投与されるものを包含する）、ウィルス粒子および上記 任意の物質の代謝物もしくはその抗体を包含する。たとえば、この種の分析物は 限定を意図するものでないがフェリチン；クレアチニンキナーゼ（ＣＫ−ＭＢ） ；ジゴキシン；フェニトイ ン；フェノバルビトール；カルバマゼピン；バンコマイシン；ゲンタマイシン； テオフィリン；バルプロン酸；キニジン；ロイチン化ホルモン（ＬＨ）；卵胞刺 激ホルモン（ＦＳＨ）；エステラジオール；プロゲステロン；ＩｇＥ抗体；ビタ ミンＢ２マイクログロブリン；グリケート化ヘモグロビン（Ｇｌｙ Ｈｂ）；コ ルチソール；ジギトキシン；Ｎ−アセチルプロカインアミド（ＮＡＰＡ）；プロ カインアミド；風疹に対する抗体、たとえば風疹−ＩｇＧおよび風疹−ＩｇＭ； トキソプラスマ症に対する抗体、たとえばトキソプラスマ症ＩｇＧ（Ｔｏｘｏ− ＩｇＧ）およびトキソプラスマ症ＩｇＭ（Ｔｏｘｏ−ＩｇＭ）；テストステロン ；サリチル酸塩；アセトアミノフェン；Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ ）；Ｂ型肝炎核抗原に対する抗体、たとえば抗Ｂ型肝炎核抗原ＩｇＧおよびＩｇ Ｍ（抗ＨＢＣ）；ヒト免疫不全症ウィルス１および２（ＨＴＬＶ）；Ｂ型肝炎ｅ 抗原（ＨＢｅＡｇ）；Ｂ型肝炎ｅ抗原に対する抗体（抗ＨＢｅ）；甲状腺刺激ホ ルモン（ＴＳＨ）；チロキシン（Ｔ４）；全トリヨードチロニン（全Ｔ３）；遊 離トリヨードチロニン（遊離Ｔ３）；癌胎児抗原（ＣＥＡ）；α胎児蛋白質（Ａ ＦＰ）；並びに限定を意図するものでないが乱用および管 理された麻薬物質、たとえばアンフェタミン；メタアンフェタミン；バルビチュ レート、たとえばアモバルビタール、セコバルビタール、ペントバルビタール、 フェノバルビタールおよびバルビタールを包含；ベンゾジアゼピン、たとえばリ ブリウムおよびバリウム(valium)；カナビノイド、たとえばハシシおよびマリハ ナ；コカイン；フェンタニル；ＬＳＤ；メタプアロン；アヘン薬、たとえばヘロ イン、モルフィネ、コデイン、ヒドロモルホン、ヒドロコドン、メタドン、オキ シコドン、オキシモルホンおよびアヘン；フェンシクリジン；プロポキシフェン などを包含する。「分析物」という用語はさらに任意の抗原性物質、ハプテン、 抗体、巨大分子およびその組合せ物を包含する。 ここで用いる「シクロデキストリン」という用語はα，βもしくはγシクロデ キストリンを意味する。 ここで用いる「最適化された高蛍光性ポリマー」という用語は、固定化された 複数のシグナル発生基を有するポリマーを意味する。固定化されたシグナル発生 基は、シグナル発生基から発生したシグナルを最大化させると共に、複数のシグ ナル発生基が互いに近すぎた際の消去作用を最小化させるよう、ポリマーに沿っ て並べられる。 ここで用いる「一次試薬」という用語は、分析物を特異的に結合すると共に、 結合する分析物と一次試薬を結合する接合体との間のブリッジとして使用される 試薬を意味する。 ここで用いる「シグナル発生基」という用語は、エネルギーを吸収して光もし くは蛍光を発しうる蛍光性化合物（しばしば、蛍光体と称する）を意味する。シ グナル発生基の例は限定を意図するものでないがフルオレセン、カスケードブル ー、テキサスレッド（登録商標）、ｐ−フタロシアニン、シアニン染料、チアゾ ール、ダンシル、ナフタレン、ｐ−トルイジニルナフタレンスルホン酸、クマリ ン、フィコエリスリン、アロフィコシアニンなどを包含する。 ここで用いる「特異性結合肢」という用語は、特異性結合対（すなわち一方が 化学的もしくは物理的手段により他方の分子に特異的に結合する２種の異なる分 子）のメンバーを意味する。抗原および抗体特異性結合対以外の特異性結合対は 、限定はしないがアビジンおよびビオチン、炭水化物およびレクチン、相補性ヌ クレオチド配列、相補性ペプチド配列、エフェクタおよびリセプタ分子、補酵素 もしくは基質および酵素、酵素抑制剤および酵素、ポリマー酸および塩基、染料 および蛋白質結合剤、 ペプチドおよび特異性蛋白質結合剤（たとえばリボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプチド およびリボヌクレアーゼＳ−蛋白質）などを包含する。さらに結合対は、原結合 肢の類似体、たとえば分析物類似体または組換技術もしくは分子工学により作成 される結合肢であるメンバーをも包含することができる。結合肢が免疫反応体で あれば、これはたとえばモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、組換蛋白 質または組換抗体、キメラ抗体、上記の混合物もしくは断片とすることができる 。 ここで用いる「試験試料」という用語は、分析物を含有する疑いのある物質を 意味する。試験試料は発生源から得られたまま直接に、或いは予備処理して試料 の特性を改変させた後に使用することができる。試験試料は生物原料、たとえば 生理的流体、たとえば血液、唾液、眼レンズ液、脳髄液、汗、尿、腹水液、粘膜 液、滑液、腹腔液、羊水など、並びに発酵ブロス、細胞培養物、さらに化学反応 混合物などから得ることができる。生物的もしくは生理的流体の他に、たとえば 水、食品などの他の液体試料を、環境もしくは食品製造の分析に使用することが できる。さらに、分析物を含有する疑いのある固体物質を試験試料として使用す ることもできる。幾つかの例においては、固 体試験試料を改変して液体媒体を形成させ、或いは分析物を放出させるのが有利 である。試験試料はたとえば血液から血漿を作成し、粘性液を希釈し、液体を濾 過し、液体を蒸留し、液体を濃縮し、干渉成分を失活させ、試薬を添加するなど の過程により使用前に予備処理することができる。 本発明によれば、ここに提供される接合体の製造につき使用される水溶性骨格 ポリマーは、アミン官能性ポリマーからなり、これは典型的には次のアミン官能 基： −ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ₂、−ＮＨ₂および−ＮＨ−Ｒ ［式中、ＲはＣ₁−Ｃ₃アルキル、イソプロピル、 −（ＣＨ₂）₂ＣＯ₂ ^-、−（ＣＨ₂）₂ＳＯ、 −（ＣＨ₂）₂ＮＨ₃ ⁺、 −（ＣＨ₂）₂ＮＨ₂ ⁺（ＣＨ₂）₂ＳＯ₃、 −（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂ＯＨおよび −（ＣＨＯＨ）₄ＣＨ₂ＯＨよりなる群から選択される］ を有してアミン官能性である。アミン官能性ポリマーはさらに上記アミン官能基 の組合せを有することもできる。好ましくはポリマーは約２０，０００〜３００ ，０００、より好ましくは約１００，０００〜２５０，０００、特に好ましくは 約 １５０，０００〜約２００，０００の平均分子量を有する。 シグナル発生基を骨格ポリマーに直接結合させる場合、シグナル発生基は好ま しくはアミン官能性ポリマーに対し共有結合を形成するのに適した反応性基を有 する。この種の反応が可能であるシグナル発生基は、限定はしないがスクシニミ ジル活性エステル、酸ハロゲン化物、スルホニルハロゲン化物、アルデヒド、ヨ ードアセチルもしくはマレイミド基を有するものを包含する。上記官能基を有す るシグナル発生基の例はフルオレセン、カスケードブルー、テキサスレッド（登 録商標）、ｐ−フタロシアニン、シアニン染料、チアゾール、ダンシル、ナフタ レン、ｐ−トルイジニルナフタレンスルホン酸、クマリン、フィコエリスリン、 アロフィコシアニンなどを包含する。 上記したように、シグナル発生基はポリマー骨格に共有結合したシクロデキス トリン分子の疎水性キャビティ内に非共有的に収容することができる。この場合 、シグナル発生基は反応性基を有する必要がない。しかしながら、当業者には了 解されるように、シグナル発生基は使用される特定シクロデキストリン分子によ り収容されうるものである。 上記したように、シグナル消去が複数の染料が単一ポリマー 上にランダム位置する際に生ずる。この消去は単一骨格ポリマーに結合した染料 の個数の最適化により担当減少する。単一骨格ポリマー上に位置する染料の個数 を最適化することにより、個々の染料は消去を受けなくなる。骨格ポリマーにお けるシグナル発生基の最適化により、本発明の接合体は比較的低感度であると共 に比較的安価である検出装置により検出しうるようなシグナルを発生することが できる。さらに、単量体シクロデキストリンを適する条件下で最適化蛍光性ポリ マー接合体の調製物と混合することにより、ポリマーの発生するシグナルはさら に増大する。驚くことにかつ予想外に、本発明の接合体の発生するシグナルは現 在入手しうる接合体のシグナルよりも約３５倍まで増大しうることが認められた 。 蛍光性ポリマーは、骨格ポリマー上に存在するアミン官能基に対し反応性であ る任意の特異性結合肢に結合させることができる。多くの特異性結合肢が本発明 の接合体に使用するのに適しているが、抗体が好適である。 本発明の接合体は、蛍光を利用して特異性結合現象を検出する各種の用途に使 用することができる。この種の用途は限定はしないが画像分析、流れ血球測定、 免疫分析、蛍光性細胞染色、 蛍光性顕微鏡観察などを包含する。 骨格ポリマーへのシグナル発生基の結合は、骨格ポリマーに存在するアミン基 をシグナル発生基に存在する反応性基と反応させて行うことができる。シグナル 発生基をポリマーに結合させるこの過程をポリマーの負荷と称する。しかしなが ら、シグナル発生基でポリマーを単に負荷しても、達成しうる最大量の蛍光を発 生するポリマーを与えない。これは消去をもたらすポリマーの過負荷の結果であ り、或いは消去を受けることなく多数のシグナル発生基を収容しうるポリマーの 負荷不足の結果である。したがって、ポリマーに負荷されるシグナル発生基の個 数を最適化させて、最大量のシグナルを発生しうるポリマーを得ることが好まし い。 アミン官能性ポリマーにおける螢光体の個数の最適化は、一連の負荷最適化を 行った後にどの負荷が最大量のシグナルを発生するポリマーを生成するかどうか を決定して行うことができる。一般に、この過程は、種々異なる濃度のシグナル 発生基を一定量のポリマーと組合せる試験負荷のパネルを形成して行うことがで きる。次いで負荷されたポリマーを未反応の化合物から当業者に知られた各種の 方法、たとえば沈澱、等電点電気泳 動もしくは好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーにより精製することができ る。精製されたポリマーを次いで、負荷濃度が最大量のシグナルを発生するポリ マーを生成するかどうかを決定するシグナル発生能力につき試験することができ る。典型的には最大量のシグナルを示すポリマーは最適に負荷されており、その 負荷された濃度を用いて大量の蛍光性ポリマーを最適に負荷することができる。 特定ポリマーにおけるシグナル発生基の個数を最適化するのに好適な方法は、 先ず最初に所望の水溶性ポリマーの分子量を計算すると共にポリマーに存在する アミン官能基の全モル量を決定して行うことができる。次いで、それぞれ異なる 濃度のシグナル発生基を含有する一連の溶液よりなるパネルを作成する。これら パネル溶液は種々の濃度のシグナル発生基を適する溶剤（たとえばジメチルホル ムアミド（ＤＭＦ）もしくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））に溶解して含 む。種々の濃度はアミン官能性ポリマーに存在するアミン官能基の全モル量に基 づいており、典型的なパネルは次の濃度を含むことができる：選択ポリマーに存 在するアミン官能基の全モル量の５％、１０％、１５％、２０％、４０％、７５ ％、１００％、１４０％および ２００％。好ましくはパネル濃度は消去が十分生ずる程度まで行い、これにより ポリマーが最適負荷される点を明瞭に求める。パネルが設定された後、各パネル メンバーをポリマーの個々の等モル溶液に添加する。 負荷ポリマーの各溶液を次いで未反応ポリマーおよび／またはシグナル発生基 から当業界で周知された技術により精製することができる。上記したようにポリ マーが精製された後、これらをシグナルの発生能力につき分析することができ、 次いで大量のポリマーを得られたデータにより製造することができる。或いは他 の最適化パネルを用いて最適負荷濃度を一層正確に決定することもできる。勿論 、ポリマーを最適化する方法は上記の方法に限定されず、他の方法も用いうるこ とが了解されよう。 高蛍光性ポリマーは、当業界で周知された各種の技術により特異性結合肢に付 着させることができる。蛍光性ポリマーを抗体のＦｃ部分またはその近くに共有 結合させることが本発明の好適特徴である。このような抗体に対するポリマーの 付着は抗体のＦｃ部分を立体障害させ、これによりたとえば或る種の細胞集団の 表面に存在するＦｃリセプタを結合しないようにする。さらに、部位特異性付着 は抗体の超可変領域を未障害で残して、 所定の標的に結合させることができる。勿論、特異性結合肢を蛍光性ポリマーに 結合させる方法は上記方法のみに限定されず、当業界で周知された他の方法も用 いうることが了解されよう。 蛍光性ポリマーは、抗体のＦｃ領域を酸化し、次いで酸化された抗体を上記種 類のポリマーと反応させて抗体に結合させることができる。好ましくは抗体を約 １．０〜約２０．０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１．０〜約１０．０ｍｇ／ｍ Ｌ、特に好ましくは約２．０〜約５．０ｍｇ／ｍＬの濃度にて酸化する。抗体が これら範囲の外側の濃度で得られる場合は、これを当業者に周知された手段によ り濃縮し或いは適する緩衝液で希釈することができる。好ましくは抗体を約６． ５〜約８．０、より好ましくは約７．０〜約８．０、特に好ましくは約７．５〜 約８．０のｐＨを有する適する緩衝剤中で酸化する。抗体におけるＦｃ領域の酸 化は、当業者に周知された酸化剤を用いて行うことができる。この種の酸化剤は 限定はしないが過沃素酸ナトリウム、二酸化クロム、過マンガン酸カリウム、二 酸化マンガン、臭素などを包含する。酸化剤溶液は典型的には約１００〜約２５ ０ｍＭ、好ましくは約１５０〜約２００ｍＭ、特に好ましくは約１７５〜約２０ ０ｍＭの濃度を有する。抗体の酸化は 約２〜約３０℃の温度で行うことができ、好ましくは酸化は約２〜約８℃にて約 １５分間〜約５時間、好ましくは約１〜約２時間にわたり行われる。抗体が酸化 された後、これを当業界で周知された方法により精製すると共に約３〜約６の範 囲、好ましくは約４〜約５の範囲のｐＨを有する適する緩衝液に入れることがで きる。酸化された抗体は、次いで蛍光性ポリマーに結合させることができる。勿 論、抗体を酸化する方法は上記方法のみに限定されず、当業界で周知された他の 方法をも使用しうることが了解されよう。 たとえば酸化された抗体を蛍光性ポリマーと反応させる場合、ポリマーの濃度 は約１．０〜約２０．０ｍｇ／ｍＬの範囲、好ましくは約２．０〜約５．０ｍｇ ／ｍＬの範囲とし、約４．０〜約７．０の範囲、好ましくは約４．０〜約５．０ の範囲のｐＨを有する適する緩衝液における濃度とすることができる。多くの緩 衝液が適しているが、好適緩衝液は約５０〜２００ｍＭの酢酸ナトリウムと約７ ５〜１５０ｍＭの塩化ナトリウムとを含む酢酸ナトリウム緩衝液である。酸化さ れた抗体に添加するポリマーの量は、抗体の分子量および蛍光性ポリマーの推定 分子量に基づき、抗体に対し約１．０〜約２０当量のポリマ ーの範囲とすることができる。酸化された抗体と蛍光性ポリマーとの間の反応は 約２〜約３０℃、好ましくは約２〜約８℃の温度にて遮光容器内で行うことがで きる。反応を約２〜約４８時間、好ましくは約１２〜約１５時間にわたり進行さ せる。反応の完結後、接合体を反応混合物の未反応成分から当業者に知られた精 製法を用いて精製することができる。 一級もしくは二級アミン官能性の蛍光性ポリマーを特異性結合肢に共有結合さ せる場合は追加工程が好ましい。具体的には、抗体とポリマーとの間の初期反応 の結果としてシッフ塩基が生成し、このシッフ塩基の還元をたとえば約０．２５ 〜２．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度におけるＮａＣＮＢＨ₃のような適する還元剤 を用いて当業界で周知された方法により行うことができる。還元された接合体を 次いで過剰の反応体から、当業界で周知されかつ上記した精製技術により精製す ることができる。勿論、シッフ塩基を還元する方法は上記方法のみに限定されず 、他の方法をも用いうることが了解されよう。 上記したように、シクロデキストリンを用いてここに示した接合体の蛍光を増 大させることができる。接合体の蛍光を増大させる１つの方法は、シクロデキス トリンを組み立てられた接 合体（すなわち高蛍光性ポリマーに共有結合した特異性結合肢）に添加すること である。このようにして使用するシクロデキストリンの場合は、シクロデキスト リン分子もしくは接合体に改変を加えることを必要としない。正確な会合方式は 知られていないが、シクロデキストリンはポリマー骨格に存在するシグナル発生 基と会合し、これは結合したシグナル発生基をシクロデキストリン分子の疎水性 中心に収容して行われると思われる。シクロデキストリンをこのように使用する 場合は、約５〜２００ｍＭの範囲、好ましくは約１０〜２０ｍＭの範囲の濃度で 使用するのが好適である。 ここに記載した接合体により発生するシグナルの増大は、シクロデキストリン を接合体のポリマー骨格に直接結合させて達成することもできる。シクロデキス トリンは、シグナル発生基を共有結合させるポリマー骨格に共有付着させること ができ、或いはそれ自身で骨格ポリマーに共有付着させることができる。後者の 場合、シグナル発生基は共有結合した重合体シクロデキストリン分子に対しゲス ト／ホスト関係にて蛍光性ポリマーと会合することができる。この関係が生じた 後、ポリマーを残余の未収容シグナル発生基から当業界で周知された方法により 精 製することができる。このゲスト／ホスト関係を生ぜしめるには、シクロデキス トリン分子をこのシクロデキストリン分子の二次リムが阻害されず疎水性キャビ ティ中へシグナル発生基を収容しうるよう結合せねばならない。 反応性基を１個だけシクロデキストリン分子の一次リムに選択的に付加するこ とにより、シクロデキストリン分子はその一次リムにより骨格ポリマーに結合す ることができる。かくして二次リムは未阻害となり、疎水性キャビティにゲスト 分子が到達することができる。 アミン官能性ポリマーに対するシクロデキストリン分子の一次リムの共有結合 は、アルデヒド基を１個だけシクロデキストリン分子の一次リムに付加させて行 うことができる。この１個のアルデヒドがシクロデキストリン分子に付加された 後、これを直接にアミン官能性ポリマーに存在するアミン基と反応させることに より、シクロデキストリンをシクロデキストリン一次リムに存在する単一の共有 結合を介しポリマーに結合させることができる。かくしてシクロデキストリンは 、二次リムを未阻害で残し、したがってゲスト分子が到達しうるような形でポリ マーに結合する。 上記したように、シクロデキストリン分子の一次リムにアルデヒド基を１個だ け付加するには当業界で知られた方法を用いて行うこともできる。しかしながら 、これら方法は極めて危険な中間体の生成を伴う。たとえば、アルデヒドはＤｅ ｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨードナン試薬を用いてシクロデキストリンの一次リム に付加することができる［Ｄ．Ｂ．Ｄｅｓｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、４８ 、４１５５〜４１５６（１９８３）］。この反応は、化学量論量のＤｅｓｓ−Ｍ ａｒｔｉｎ試薬とシクロデキストリンとをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶 解して含有する不均質系で行うことができる。６−シクロデキストリン モノア ルデヒドが生成されるが、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬は爆発の危険があり、も はや容易に商用源から入手しえない。モノアルデヒドへの他の経路は、毒性かつ 極めて爆発性のアジド中間体を形成する３〜４工程を伴う。 これに代わるものとして、危険な中間体の生成を伴わず、しかも工業的に容易 に入手しうる材料を用いて行われる６−シクロデキストリン モノアルデヒドの 製造方法がここに見出された。一般に、この方法は２工程法であって反応図式Ｉ に下記す るように行うことができる。 この方法の第１工程は、式１のシクロデキストリンを式２のモノトシレート誘 導体まで変換することである。次いで、式２のトシレート誘導体を酸化して式３ のシクロデキストリン モノアルデヒドを生成せさる。 式１のシクロデキストリンを式２のモノトシレート誘導体まで変換させるには 、幾つかの許容しうる方法がある［またはＬ．Ｄ．Ｍｅｌｔｏｎら、Ｃａｒｂｏ ｈｙｄ．Ｒｅｓ． ，１８，２９−３７´１９７１）またはＲ．Ｃ．ら、Ｊ．Ａｍ ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１２，３３６０−３８６８（１９９０）参照］。式２の モノトシレートが生成された後、これを当業者に周知された方法、好ましくは高 性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により反応混合物から精製することが できる。次いで、溶解しているシクロデキストリン モノトシレートから溶剤を 当業者に周知された方法により除去して、固体モノトシレートを回収することが できる。次いで、固体シクロデキストリン モノトシレートをこの方法の第２工 程に使用することができる。 変換の第２にあたる酸化工程は多くの方法により行うことができる。一般に、 酸化工程はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）媒介反応であって、塩基の添加に より触媒することができる。ＤＭＳＯ中で約７５〜約８５℃にてモノトシレート 誘導体を加熱すれば、トシレート誘導体から式３のモノアルデヒドまでゆっくり 変換（約１〜３日間）することが判明した。 ＤＭＳＯ媒介反応に対する塩基の添加はモノトシレートから 式３のモノアルデヒドへの変換を加速する。たとえば微量のＮａＯＨが反応を加 速した。この工程に使用するのに好適な塩基は障害アミン塩基、たとえばジイソ プロピルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミン、トリメチルアミン などを包含する。ジイソプロピルエチルアミン（ａ．ｋ．ａ．ヒューニッヒ塩基 ）が特に好適な障害アミン塩基である。好ましくは、モノトシレートからモノア ルデヒドへの変換は、モノトシレートが約０．５〜約２０％、より好ましくは約 １〜約１５％、特に好ましくは約２〜約１０％の濃度の溶液である際に得られる 。この変換につき使用される障害アミン塩基の量は、溶液におけるモノトシレー トの約０．１〜約１．０モル当量、好ましくは溶液におけるモノトシレートの約 ０．３〜約０．７モル当量とすることができる。このように生成したシクロデキ ストリンモノアルデヒドは、当業界で周知された方法により未反応物質から精製 してアミン官能性ポリマーと反応させことができ、或いは最終反応混合物をアミ ン官能性ポリマーと直接反応させることができる。 当業者に周知された標準的な共有結合化学法を用いれば、ここに示したシクロ デキストリン モノアルデヒドをアミン官能 基を持った化合物に結合させるのは容易である。この種のアミン官能基の例は限 定を意図するものでないが −ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ₂、−ＮＨ₂および−ＮＨ−Ｒを包含し、ここでＲはＣ₁− Ｃ₃アルキル、イソプロピル、 −（ＣＨ₂）₂ＣＯ₂ ^-、−（ＣＨ₂）₂ＳＯ₃ ^-、 −（ＣＨ₂）₂ＮＨ₃ ⁺、 −（ＣＨ₂）₂ＮＨ₂ ⁺（ＣＨ₂）₂ＳＯ₃ ^-、 −（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂ＯＨおよび −（ＣＨＯＨ）₄ＣＨ₂ＯＨよりなる群から選択される。これら基を有してアミン 官能性である化合物の例は、たとえばポリアクリルアミド ヒドラジドのような アミン官能性ポリマー、またはたとえばアミノ化微粒子のようなアミン官能性の 固相を包含する。 一級もしくは二級アミン官能性化合物をシクロデキストリン モノアルデヒド と共有反応させる場合は追加工程が好ましい。具体的には、化合物とモノアルデ ヒドとの間の初期反応が生じた後にシッフ塩基が生成し、このシッフ塩基の還元 を上記したように行うことができる。 シクロデキストリン モノアルデヒドは、アミン官能性ポリ マーまたはシグナル発生基が最適負荷されたアミン官能性ポリマーに結合させる ことができる。シクロデキストリン モノアルデヒドをアミン官能性ポリマーに 付加させれば、その後にポリシクロデキストリン重合体をシグナル発生基により 蛍光性にすることができる。ポリシクロデキストリン重合体を蛍光性にしうる１ つの方法は、アミン官能性ポリマーに対するシグナル発生基の共有付着である。 ポリマーがこのように蛍光性にされる場合、ポリマーには反応に利用しうるアミ ノ官能基を有せねばならないことが了解されよう。 ポリシクロデキストリンを蛍光性にしうる他の方法は、ポリシクロデキストリ ン重合体マーを含有する溶液または特異性結合肢に結合したポリシクロデキスト リンを含有する溶液にシグナル発生基を付加することである。この誘導化方法を 用いれば、シクロデキストリンの収容能力が上記したように保持される。さらに 、収容能力が保持されたまま、過剰のシグナル発生基を上記したように除去する こともできる。 ポリシクロデキストリン／ポリシグナル発生基のポリマーが生成した後、これ を上記したように特異性結合肢に付着させることができる。 上記したように、完成した接合体は各種の用途を有する。本発明の接合体を用 いる好適方法は流れ血球測定の用途であって、蛍光性接合体もしくは複数の蛍光 性接合体を用いて試験試料に含まれる細胞を検出する。流れ血球測定計の例はＢ ｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、 Ｎ．Ｊ．により製作されるフルオレッセンス・アクチベイテッド・セル・ソータ ー（ＦＡＣＳ II）を包含する。一般に、画像形成システムは励起源と検出装置 とを内蔵する。励起源は接合体と会合したシグナル発生基を励起させ、検出装置 は励起されたシグナル発生基の発するシグナルを検出する。 典型的な画像形成システム分析においては、試験試料を蛍光性接合体と共に培 養して試験試料中に存在しうる或る種の細胞を特異的に結合する。この培養は、 試料に含有された特定細胞集団に対する接合体の結合をもたらす時間および温度 にて行われる。接合体と結合した細胞を一般に染色されたと称し、この染色過程 は複数回にわたり順次にまたは同時に種々異なる波長のシグナルを発する複数の 接合体で行うことができる。染色過程が完了した後、試料を流れ血球測定器を用 いて分析することができる。 代案としての本発明による好適具体例においては、試験試料を試験試料中に存 在しうる或る種の細胞を特異的に結合する一次試薬の溶液と共に培養して、一次 複合体を生成させる。存在すれば未結合の試薬を試料から洗浄し、次いで結合し た一次試薬に対し特異性の蛍光性接合体を一次複合体と共に培養する。存在すれ ば、未結合の接合体を次いで一次複合体から除去することができ、次いで細胞に 関連した蛍光を上記のように測定することができる。染色過程は種々異なる細胞 マーカーおよび同じもしくは異なる波長にて蛍光を発する接合体に対し特異性の 一次試薬で複数回反復しうることが了解されよう。勿論、染色過程は順次に或い はバッチ式で行うこともでき、細胞染色に必要な全成分を細胞に関連した蛍光が 測定される前に試料に添加しうることも了解されよう。 代案としての他の具体例において、本発明の接合体および方法はたとえばサン ドイッチ分析のような慣用の固相免疫分析に使用するにも適している。サンドイ ッチ型免疫分析は典型的には、分析物を含有する疑いのある試験試料を、分析物 との結合対を形成する特異性結合肢で被覆された実質的に固体の不活性プラスチ ック、ラテックスもしくはガラスビーズもしくは微粒 子または他の支持物質と接触させることを含む。結合肢で被覆された支持物質を 一般に「捕獲試薬」と称する。分析物が支持物質に結合した後、残余の試験試料 を支持体から除去すると共に、分析物に結合した支持物質を一般にシグナル発生 基で標識された第２結合肢からなる接合体で処理する。接合体は支持体に結合し た分析物に結合し、第１結合肢を有する固体支持体と分析物とそれに結合した接 合体とを未結合の接合体から典型的には１回もしくはそれ以上の洗浄工程により 分離する。シグナル発生基により適する励起を介し発生したシグナルを次いで肉 眼観察し、より好ましくは機器で観察して、試験試料における分析物の存在もし くは量を示すことができる。勿論、この種の分析を行うべく用いる工程の順序お よび数はここに示した本発明を限定するものでない。 たとえばミクロパーチクル・エンザイム・イミュノアッセイ（ＭＥＩＡ）のよ うなサンドイッチ型分析を行うのに適する自動システムが当業界で周知されてい る。ここに示した方法を実施すべく用いうる特に好適かつ市販入手しうる自動機 器は、本出願人から入手しうるＩＭｘ（登録商標）システムである。たとえばア ボットＩＭｘ（登録商標）機器により行われるような ＭＥＩＡの手順は当業界で周知されており、文献［Ｆｉｏｒｅ，Ｍ．ら、Ｃｌｉ ｎ．Ｃｈｅｍ．、３４／９：１７２６−１７３２（１９８８）］に記載されてい る。手順の例は次の通りである。１００μＬの試験試料をＩＭｘ（登録商標）反 応セルの試料ウェルにピペットで入れる。３０〜５０μＬの試料と抗一分析物で 被覆された微粒子懸濁物とを次いで反応セルの培養ウェルにピペットで入れる。 適する培養時間の後、微粒子／分析物の複合体が生ずる。次いで複合体を反応セ ルのガラス繊維捕獲マトリックスにピペットで載せ、たとえば螢光体のようなシ グナル発生基で標識された抗−分析物抗体からなる接合体をも反応セルのガラス 繊維マトリックスにピペットで載せる。微粒子／分析物／接合体の複合体がかく して形成され、これをガラス繊維マトリックスにより捕獲する。適する手段によ りシグナル発生基を励起させ、得られる蛍光があればこれを測定することができ る。この種の蛍光の量は試験試料における分析物の量に正相関する。 以下、限定はしないが実施例により本発明をさらに説明する。実施例を実施す るのに必要な試薬および装置は全て市販入手でき、当業者に周知されている。 実施例１ ポリアクリルアミド ヒドラジド重合体対するフルオレセンの最適負荷濃度の決 定 ポリアクリルアミド ヒドラジド重合体（分子量１８万、１６０ヒドラジド／ ポリマー）をシグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州から入手した。７ 種のポリマー溶液を作成し、これらは全て１０ｍｇのポリマー（５．５５×１０^-5 ミリモル、８．８９×１０^-3ミリモルのヒドラジド）を２．０ｍＬのＰＢＳ（ ｐＨ７．０）（０．１Ｎ燐酸ナトリウム、０．１ＮＮａＣｌ）に溶解して含有し た。ＤＭＦにおける５′，６′−カルボキシフルオレセンＮ−ヒドロキシスクシ ンイミド活性エステル（シグナル発生基、モレキュラ・プローブス社、ユージン 、オレゴン州から入手）の６．０ｍｇ／ｍＬ保存溶液を作成し、次の濃度でポリ マー溶液に添加した：ポリアクリルアミド ヒドラジド重合体に存在する反応性 ヒドラジドの全モル量に対し５％、１０％、１５％、２５％、３５％、７５％お よび９０％。フルオレセンの量およびフルオレセンを溶解させるべく用いたＤＭ Ｆの量を第１表に示す。 次いで、各量のシグナル発生基をポリマーの溶液に添加した。 シグナル発生基の溶液をポリマーに添加している間、ポリマー溶液を攪拌すると 共に、得られた溶液を暗所内で室温にて約１２時間にわたり攪拌した。 混合時間の後、７種の溶液のそれぞれをセファデックス（登録商標）１００〜 ３００μメッシュのゲル（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州から 入手）を用いて１．８ｃｍ×３０ｃｍカラムで精製した。ポリフルオレセン重合 体を蒸留水によりカラムから溶出させ、４．０ｍＬずつのフラクションをポリマ ーが溶出する際に集めた。 各溶液からの各フラクションの純度を、順相薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ ）により溶出剤として９０／１０のＣＨＣｌ₃／ＣＨ₃ＯＨを用いて測定した。Ｔ ＬＣによると、回収された始めの方のフラクションは低分子量の化合物を含有し 、次いで高分子量の化合物を含有するフラクションが存在していた。高分子量の 化合物を含有するフラクションを、携帯用の長波長紫外線ランプで検証しながら 、フラクションが０．０５〜０．１より大のＲｆ値を示し始めるまで合した。 合したフラクションを分子量３万切捨て膜が装着されたアミコン（登録商標） センチプレプ−３０濃縮器（アミコン社、ダ ンバース、メーン州）を用いて４．８７ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。濃縮器を３０ ００ｒｐｍにて３時間にわたり遠心分離した。 濃縮されたフラクションを次いでセファデックス（登録商標）Ｇ−２５ゲルに より１．８ｃｍ×３０ｃｍカラムで再精製すると共に、上記のように溶出させた 。得られたフラクションを純度を検査しながら合し、次いで上記のように濃縮し た。 この手順により、種々異なる濃度のシグナル発生基で負荷された精製ポリフル オレセン重合体の７種の溶液を得た。次いで、これらポリマー溶液を蛍光分光光 度計にて蛍光発生能につき試験した。蛍光試験の結果を第１表に示し、これは個 々の負荷濃度に関連した試験負荷濃度と蛍光値とを示す。第１表が示すように、 ９０％負荷濃度に達するまで蛍光増加が存在する。９０％の試験負荷にて消去が 生じ始め、蛍光値が低下する。したがって、７５％の試験負荷が最適であり、こ れを用いて大量のポリアクリルアミド ヒドラジド ポリフルオレセンを製造し た。 実施例２ 最適ポリアクリルアミド ヒドラジド ポリフルオレセン重合体の合成 ポリアクリルアミド ヒドラジド重合体（分子量１８万、１６０ヒドラジド／ ポリマー）をシグマ・ケミカル社から入手した。このポリマー（５０．０ｍｇ、 ２．８×１０^-4ミリモルのポリマー、４．４×１０^-2ミリモルのヒドラジド）を 、磁気誘導攪拌しながら１０．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に約７時間かけて 溶解させた。５００μＬのＤＭＦに溶解させた １５．２ｍｇ（３．３×１０^-2ミリモル）の５′，６′−カルボキシフルオレセ ンＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル（モレキュラ・プローブス社から 入手）をポリマーの攪拌溶液に添加した。得られた反応溶液を暗所内で室温にて 約１２時間にわたり攪拌した。 混合の後、反応溶液をセファデックス（登録商標）１００〜３００μメッシュ 寸法のＧ−２５カラム（２．５ｃｍ×５０ｃｍ）に入れ、蒸留水／脱イオン水で 溶出させた。反応混合物が２．０ｍＬ／ｍｉｎにてカラムを流過する際、約４０ ０滴（即ち約１４ｍＬ）ずつのフラクションを集めた。各フラクションの純度を 順相ＴＬＣにより９０／１０のＣＨＣｌ₃／ＣＨ₃ＯＨを溶出剤として分析した。 ＴＬＣによると、集めた始めの方のフラクションが高分子量の化合物を含有する と共に、その後のフラクションが比較的低い分子量の化合物を多く含有していた 。高分子量の化合物を含有するフラクションを、携帯用の長波長紫外線ランプに より検証しながに、フラクションが０．０５〜０．１より大のＲｆ値を示し始め るまで合した。合したフラクションを、分子量３万切捨てを有するセンチプレプ −３０濃縮器により１０．０ｍＬの容積まで濃縮した。合した フラクションを含有するセンチプレプ−３０濃縮器を３０００ｒｐｍの速度で約 ３時間にわたり１５〜３０℃の温度で遠心分離した。 次いで、濃縮したフラクションを上記のようにセファデックス（登録商標）Ｇ −２５カラム（２．５ｃｍ×５０ｃｍ）により再精製した。得られたフラクショ ンの純度を検査し、上記したＴＬＣの結果および携帯用長波長赤外線ランプ試験 の結果に基づいて合した。許容しうるフラクションを合し、次いでポリマー保存 物をアミコン（登録商標）センチプレプ−３０濃縮器により上記したように再濃 縮した。 ポリマー保存物の濃度を測定する分析は、５個の２ｍＬ試料を抜き取ると共に 回転蒸発装置により各試料から溶剤を減圧除去して行った。残留水を各試料から ドライアイス／イソプロパノール トラップが装着された高減圧装置により除去 した。次いで得られた赤色粉末の試料を秤量して、ポリマーの濃度をｍｇ／ｍＬ として決定した。 どの程度多量のフルオレセンが実際にポリマー上に負荷されたかを推定するた め、カルボキシフルオレセン重合体およびカルボキシフルオレセン標準（いずれ もｐＨ８．０のＰＢＳ中に 調製した）につき標準曲線を作成した。これら曲線は、標準およびポリマーの数 種の異なる濃度における吸光度（λ＝４９０ｎｍ）を測定して作成した。これら 曲線の勾配（ε）は単一分子種（例えば遊離クマリンもしくは単一の蛍光性ポリ マー）のモル吸光度を示すので、これら勾配の比を用いてポリマーに結合したク マリンの個数を決定した。同一の条件下で、１，４５９，０００モル^-1のｅをポ リマーにつき決定すると共に、３６，５００モル^-1のｅを遊離カルボキシ フル オレセンにつき決定した。かくして、ポリマーに対するカルボキシ フルオレセ ンの置換は４０／ポリマーであると決定された。 蛍光当量もポリマーにつき測定し、これにはポリマーの蛍光発生を遊離フルオ レセンの蛍光発生と比較した。ポリマーの蛍光当量は、４９０ｎｍの励起λおよ び５２０ｎｍの発光λに基づき１４カルボキシ フルオレセン／ポリマーである と決定された。 実施例３ ポリアクリルアミド ヒドラジド ポリカスケードブルー重合体の合成 ポリアクリルアミド ヒドラジドにカスケードブルーを負荷 させるための最適負荷比率を、実施例１に説明したように決定した。最適な試験 負荷比率は可使ヒドラジドの７２％であると判明した。カスケードブルーを用い て最適蛍光性ポリマーを作成するため、カスケードブホルー アシルアジド（モ レキュラ・プローブス社から入手）をポリアクリルアミド ヒドラジドと次の手 順により反応させた。 ポリアクリルアミド ヒドラジド重合体（分子量１８万、１６０ヒドラジド／ ポリマー）をシグマ・ケミカル社から入手した。このポリマー（２０．０ｍｇ） １．１×１０^-4ミリモルのポリマー、１．８×１０^-2ミリモルのヒドラジド）を 磁気誘導攪拌により４．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に約７時間かけて溶解さ せた。次いで１２．０ｍｇ（１．３×１３^-2ミリモル）のカスケードブルー ア シルアジド（モレキュラ・プローブス社、ユージン、オレゴン州から入手）を４ ００μＬのＤＭＳＯに溶解させた後、ポリマーの攪拌溶液に添加した。得られた 反応溶液を暗所内で室温にて１２時間攪拌した。 混合の後、反応溶液をセファデックス（登録商標）１００〜３００μメッシュ 寸法のＧ−２５カラム（２．５ｃｍ×５０ｃｍ）に入れ、蒸留水／脱イオン水で 溶出させた。反応混合物 が２．０ｍＬ／ｍｉｎにてカラムを流過する際、約４００滴（即ち約１４ｍＬ） ずつのフラクションを集めた。各フラクションの純度を、順相ＴＬＣにより９０ ／１０のＣＨＣｌ₃／ＣＨ₃ＯＨを溶出剤として用いることにより分析した。実施 例２におけると同様に、高分子量の化合物を含有するフラクションを携帯用長波 長紫外線ランプにより検証しながら、フラクションが０．０５〜０．１より大の Ｒｆ値を示し始めるまで合した。合したフラクションを、分子量３万切捨てを有 するアミコン（登録商標）センチプレプ−３０濃縮器を用いて１０．０ｍＬの容 積まで濃縮した。合したフラクションを含有する濃縮器を３０００ｒｐｍの速度 で約３時間にわたり約１５〜３０℃の温度にて遠心分離した。 次いで、濃縮されたフラクションを上記と同様にセファデックス（登録商標） Ｇ−２５カラム（２．５ｃｍ×５０ｃｍ）により再精製した。得られたフラクシ ョンの純度を検査し、ＴＬＣおよび携帯用長波長赤外線ランプ試験の上記した結 果に基づいて合した。許容しうるフラクションを合し、次いでポリマー保存物を 上記と同様にアミコン（登録商標）センチプレプ−３０濃縮器により再濃縮した 。 ポリマー保存物の濃度の分析は、５個の２ｍＬ試料を抜き取ると共に回転蒸発 装置を用いて各試料から溶剤を減圧除去することにより行った。残留水を各試料 からドライアイス／イソプロパノール トラップが装着された高減圧装置により 除去した。得られた青色粉末の試料を次いで秤量して、ポリマーの濃度をｍｇ／ ｍＬとして決定した。 実施例２に示したと同様に、ポリマーに負荷されたカスケードブルー分子の推 定数を決定した。ただしカスケードブルーはλ＝３６５ｎｍにて吸光するので、 λ＝３６５ｎｍを用いて標準曲線を作成した。同一の条件下で４６０，０００モ ル¹のｅを蛍光性ポリマーにつき決定すると共に、１９，２００モル^-1のｅをカ スケードブルー標準につき決定した。ポリマーに負荷された染料の個数は２４／ ポリマーであると決定された。 実施例４ ポリアクリルアミド ヒドラジド ポリアミノメチルクマリンの合成 以下の手順を用いて、ポリマー当り約２２個のアミノメチルクマリンの蛍光当 量を有する蛍光性ポリマーを作成した。 この実施例に用いたポリアクリルアミド ヒドラジド重合体 （分子量１８万、１６０ヒドラジド／ポリマー）はシグマ・ケミカル社から入手 し、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸スクシニミジルエステルはモレ キュラ・プローブス社から入手した。 ポリマー（１００ｍｇ）５．６×１０^-4ミリモル、８．８×１０^-2ミリモルの ヒドラジド）を磁気誘導攪拌により１０．０ｍＬのＰＢＳ（ｐ１１７．０）に約 ７時間かけて溶解させた。アミノメチルクマリンＮ−ヒドロキシスクシンイミド （１４．６８ｍｇ即ち７．１×１０^-2ミリモルを６００μＬのＤＭＦに溶解）を 溶解ポリマーの攪拌溶液に添加し、得られた溶液を暗所内で室温にて１２時間攪 拌した。 上記溶液をセファデックス（登録商標）１００〜３００μメッシュ寸法のＧ− ２５カラム（２．５ｃｍ×５０ｃｍ）に負荷させ、ポリマーを蒸留水／脱イオン 水で溶出することにより最初の精製を行った。約１４ｍＬずつのフラクションを 集め、順相ＴＬＣで９０／１０のＣＨＣｌ₃／ＣＨ₃ＯＨを溶出剤として用いるこ とにより純度を分析した。先の実施例と同様に、初めに出る高分子量の発色性フ ラクションを、これらフラクションが携帯用長波長ＵＶランプで検証して０．０ ５〜０．１より 大のＲｆ値を示し始めるまで合した。合したフラクションを、分子量３万切捨て を有するセンチプレプ−３０濃縮器（アミコン（登録商標））に添加し、３００ ０ｒｐｍで３時間にわたり遠心分離することにより２０．０ｍＬの容積まで濃縮 した。 濃縮されたフラクションをセファデックス（登録商標）Ｇ−２５カラム（２． ５ｃｍ×５０ｃｍ）により再精製し、得られたフラクションを上記と同様にＴＬ Ｃにより純度を検査した。許容しうるフラクションを合し、次いで合したフラク ションを上記と同様に再濃縮した。 濃縮されたフラクションの濃度を次いで測 定し、分析を続けてポリマーに結合したアミノメチルクマリンの個数を決定した 。濃縮したフラクションの濃度を決定するため濃縮フラクションの試料（４×２ ｍＬ）を採取し、溶剤を回転蒸発装置により減圧除去した。残留水をドライアイ ス／イソプロパノール トラップが装着された高減圧装置により除去した。乾燥 した試料を次いで秤量し、ポリマーの濃度（ｍｇ／ｍＬ）を決定した。 実施例２に示した方法を用い、ポリマーに負荷されたアミノメチルクマリン分 子の個数を決定した。ただしアミノメチルクマリンはλ＝３２５ｎｍにて吸光す るので、λ＝３２５ｎｍを 用いて標準曲線を作成した。同一の条件下で９１，８８２モル^-1のｅを蛍光性ポ リマーにつき決定すると共に、８０３．５モル^-1のｅをアミノメチルクマリン標 準につき決定した。かくして、ポリマーに負荷された染料の個数は１１４／ポリ マーであると決定された。 ポリマーの蛍光発生を遊離クマリンの蛍光発生と比較することにより、蛍光当 量をもポリマーにつき決定した。ポリマーの蛍光当量は、３２５の励起λおよび ４５０の発光λに基づき２２．４のアミノメチル クマリン／ポリマーであると 決定された。 実施例５ ポリアクリルアミド ヒドラジド ポリヒドロキシメチルクマリンの合成 次の手順を用いて、ポリマー当り約４０個のヒドロキシクマリンの蛍光当量を 有する蛍光性ポリマーを作成した。 この実施例に用いたポリアクリルアミド ヒドラジド重合体（分子量１８万、 １６０ヒドラジド／ポリマー）はシグマ・ケミカル社から入手し、７−ヒドロキ シ−４−メチルクマリン−３−酢酸スクシニミジルエステルはモレキュラ・プロ ーブス社 から入手した。 ポリマー（５０ｍｇ）２．８×１０^-4リモル、４．４×１０^-2ミリモルのヒド ラジド）を磁気誘導攪拌により１０．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に約７時間 かけて溶解させた。ヒドロキシクマリンＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６．９ ｍｇ即ち２．１×１０^-2ミリモルを５００μＬのＤＭＦに溶解）を溶解ポリマー の攪拌溶液に添加し、得られた溶液を暗所内で室温にて１２時間攪拌した。 セファデックス（登録商標）１００〜３００μメッシュ寸法のＧ−２５カラム （２．５ｃｍ×５０ｃｍ）に負荷させ、ポリマーを蒸留水／脱イオン水で溶出さ せることにより初期精製を行った。約１４ｍＬずつのフラクションを集め、順相 ＴＬＣにより溶出剤として９０／１０のＣＨＣｌ₃／ＣＨ₃ＯＨを用いて純度を評 価した。先の実施例と同様に、初めに出る高分子量の発色性フラクションを、こ 携帯用長波長ＵＶランプで検証しながら、０．０５〜０．１より大のＲｆ値を示 し始めるまで合した。合したフラクションを、分子量３万切捨てを有するセンチ プレプ−３０濃縮器（アミコン（登録商標））に添加し、３０００ｒｐｍで３時 間にわたり遠心分離することにより ２０．０ｍＬの容積まで濃縮した。 濃縮されたフラクションをセファデックス（登録商標）Ｇ−２５カラム（２． ５ｃｍ×５０ｃｍ）により再精製し、得られたフラクションを上記と同様にＴＬ Ｃにより純度を検査した。許容しうるフラクションを合し、合したフラクション を上記と同様に再濃縮した。 次いで濃縮フラクションの濃度を測定し、分析を続けてポリマーに結合したア ミノメチルクマリンの個数を決定した。濃縮フラクションの濃度を決定するため 、濃縮フラクションの試料（４×２ｍＬ）を採取し、溶剤を回転蒸発装置により 減圧除去した。残留水をドライアイス／イソプロパノール トラップが装着され た高減圧装置により除去した。乾燥した試料を次いで秤量し、ポリマーの濃度（ ｍｇ／ｍＬ）を測定した。 実施例４に示した方法を用い、ポリマーに負荷されたアミノメチルクマリン分 子の推定数を決定した。同一の条件下で、２０９，８２０モル^-1のεを蛍光性ポ リマーにつき決定し、２１５８モル^-1のεをヒドロキシメチルクマリン標準につ き決定した。ポリマーに負荷された染料の個数は１００／ポリマーであると決定 された。 ポリマーの蛍光発生を遊離クマリンの蛍光発生と比較することにより、蛍光当 量をもポリマーにつき決定した。ポリマーの蛍光当量は、３２５の励起λおよび ４５０の発光λに基づき４０のヒドロキシメチルクマリン／ポリマーであると決 定された。 実施例６ ＩｇＧに対するポリアクリルアミド ヒドラジド ポリフルオレセンの付着 最初に、マウス モノクローナル抗体の炭水化物領域を次の手順により過沃素 酸ナトリウムで酸化した。 抗−ダンシル抗体（１．０ｍＬのＴＥＡ緩衝液における２．０５ｍｇ、５０ｍ Ｍのトリエタノールアミン、１６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）をコハク色の 小瓶に入れた。次いで過沃素酸ナトリウム（ＴＥＡ緩衝液における１００μＬの ２００ｍＭ溶液）を小瓶に添加し、得られた混合物を２〜８℃にて１時間にわた り静的培養した。次いで反応混合物をセファデックス（登録商標）Ｇ−２５カラ ム（１ｃｍ×４５ｃｍ）１００〜３００μメッシュ寸法）に毎分１〜２ｍＬの流 速にて流し、ｐＨ５．５の酢酸塩緩衝液（０．１Ｍの酢酸ナトリウム、 ０．１ＭのＮａＣｌ）で溶出させた。カラムを溶出させる際、カラムからの溶出 液をＡ₂₈₀にて監視し、１ｍＬずつのフラクションを集めた。溶出プロフィルは ２つのピークを示し、０．３より高いＡ₂₈₀を有する第１ピークからのフラクシ ョンを合した。合したフラクションを次いで、分子量３万切捨て膜が装着された アミコン（登録商標）セントリコン−３０マイクロ濃縮器により２．３５ｍｇ／ ｍＬ（０．８ｍＬ）まで濃縮して、１．８８ｍｇの精製された酸化抗体を得た。 この精製された抗体を２〜８℃に保ち、酸化の直後に使用した。 抗体に接合させるべく使用したポリマーの量は、抗体の分子量（１８万）とボ リマーの分子量（ポリマーに対するフルオレセン置換を紫外分析すると推定２１ ．８万）とから計算した。この実施例においては、実施例２からの４．５ｍｇの 蛍光性ポリマーを１．０ｍＬのｐＨ４．５の酢酸塩緩衝液（０．１Ｍの酢酸ナト リウム、０．１ＭのＮａＣｌ）で再編成して、ポリアクリルアミド ヒドラジド ポリフルオレセンの４．５ｍｇ／ｍＬ溶液を生成させた。次いで、この溶液を 酸化された抗−ダンシル抗体の２．３５ｍｇ／ｍＬ溶液０．８ｍＬに添加して接 合混合物を生成させ、これを約２〜８℃の温度にて１晩にわた りおだやかに振とうした。 蛍光性ポリマーに対する抗体の接合が完了した後、接合混合物をセファクリル （登録商標）Ｓ−３００ゲル（ファルマシアＬＫＢ社、ソレンツナ、スエーデン 国）の１ｃｍ×４５ｃｍカラムに流した。接合した抗体をカラムからｐＨ８．０ のＰＢＳにより毎分１〜２ｍＬの流速で溶出させた。カラムからの溶出液を３ｍ Ｌずつのフラクションで集めた。さらに溶出液をＡ₂₈₀で監視し、溶出プロフィ ルは２つのピークがカラムから溶出したことを示した。０．３より大のＡ₂₈₀を 有する第１ピークからのフラクションを集めて合わせた。 実施例７ シクロデキストリンからの６−β−シクロデキストリンモノアルデヒドの合成 β−シクロデキストリンのモノトシレート誘導体を文献［Ｐｅｔｔｅｒ、Ｒ． Ｃ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１２、３３６０−３８６８、１９９ ０］の方法により作成した。このモノトシレート誘導体を調製用逆相ＨＰＬＣに より４０．０ｍＬ／分におけるレイニン・ダイナマックス（登録商標）ラジアル ・コンプレッション・カラムでの濃度勾配分離を 用いて精製した。この分離に用いた濃度勾配は次の通りである：９０／１０のＨ₂ Ｏ／ＣＨ₃ＯＨ、３０分間に続き、０／１００のＨ₂Ｏ／ＣＨ₃ＯＨへの直線的濃 度勾配で、全部で３５分。モノトシレートは、この濃度勾配の際、２３０ｎｍの λにおける紫外検出によると２０．７分に溶出した。溶剤を減圧下で除去し、固 体を高減圧下に１晩置いて残留水を除去した。 得られたモノトシレート（１．０ｇ、０．７７ミリモル）を次いで２０．０ｍ ＬのＤＭＳＯに溶解させた。ヒューニッヒ塩基（ジイソプロピルエチルアミン、 モノトシレートの０．５当量、０．０６０ｇ、０．３８ミリモル、）を次いでモ ノトシレート／ＤＭＳＯ溶液に添加し、得られた反応混合物を７０〜８０℃の温 度にて約７２時間にわたり加熱した。加熱の際、反応混合物を窒素下に置いた。 加熱終了後、反応混合物を室温まで冷却し、粗生成物を２００ｍＬのアセトンで 沈澱させた。次いで反応混合物を０℃まで冷却し、得られた固体を減圧濾過によ り単離した。 単離した固体を、０℃まで冷却した際に再結晶するのに充分な量の室温アセト ンに再懸濁させた。得られた沈殿物を再び減圧濾過により回収した。再懸濁およ び回収手順は２回反復した。 最終的な６−β−シクロデキストリン モノアルデヒド生成物は次の特性を有 した： ＰＤＭＳ測定値：１１５５．５ 計算値：１１５５．９（Ｍ＋Ｎａ⁺）； ＥＳＩＭＳ測定値：１１３３．９ 計算値：１１３４．０（Ｍ＋Ｈ⁺）；¹ Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）ｄ₆−ＤＭＳＯ δ ９．７（ｓ、１Ｈ）、５．７ ５（広幅ｍ、１４Ｈ）、４．８５（ｍ、７Ｈ）、４．４８（ｍ、６Ｈ）、３．６ （ｍ、１４Ｈ）、３．４（広幅ｍ、７Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（１２５．６ ＭＨｚ ）トシレートピークを除いてはｄ₆−ＤＭＳＯにおける粗製反応混合物。 ｄ₆−ＤＭＳＯ δ １９８．２、１２０１．９、８７．５、８２．５、８１． ７、８１．５、７３．０、７２．７、７２．４、７２．０、６８．９、５９．９ 、５９．６；ＴＬＣ（１０：８：３のｎ−ブタノール／エタノール／水と１２： ３：４のブタノン／メタノール／酢酸との１／１混合物）；Ｒｆ ０．５；ＩＲ （ｃｍ^-1）。 実施例８ ポリアクリルアミド ヒドラジド ポリシクロデキストリン重合体の合成 実施例５に記したように６−β−シクロデキストリン モノアルデヒドを合成 した。ポリアクリルアミド ヒドラジド重合体（分子量１８万、１６０ヒドラジ ド／ポリマー）はシグマ・ケミカル社から入手した。このポリマー（５．０ｍｇ 、２．２８×１０^-5ミリモルのポリマー、３．６５×１０^-3ミリモルのヒドラジ ド）を１．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解させた。５．０ｍｇの６−β− シクロデキストリン モノアルデヒド（４．４４×１０^-3ミリモル）を１５０ｍ ＬのＤＭＳＯに溶解させてなる他の溶液を、次いで先の攪拌ポリマー溶液に添加 した。次いで、得られた溶液を７０℃に２時間加熱した。加熱の後、溶液を室温 まで冷却し、次いでこれをセファデックス（登録商標）Ｇ−２５ゲル濾過カラム に流した。ＰＢＳ（ｐＨ７．０）を用いてポリシクロデキストリン ポリアクリ ルアミド ヒドラジド重合体をカラムから溶出させた。ポリマーがカラムから溶 出する際、１．０ｍＬずつのフラクションを集め、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ ２８、３５０〜３８６（１９５６年３月）に開示されたフェノール／硫酸法によ り炭水化物含有量につき分析した。得られたデータを用いて、高重合β−シクロ デキストリンのフラクションにつきゲル濾過プロフィルを作成した。次いで、こ のゲル濾過プロフィルをβ−シクロデキストリン単量体のゲル濾過プロフィルと 比較した。この比較は、高重合β−シクロデキストリンの大部分がフラクション ７〜１１で溶出したのに対し、β−シクロデキストリン単量体の大部分はフラク ション９〜１６で溶出したことを示した。フラクション７〜１０を合し、分子量 ３万切捨て膜が装着されたアミコン（登録商標）ミクロ濃縮器により濃縮した。 濃縮物をｐＨ７．０のＰＢＳで希釈し、３回再濃縮してβ−シクロデキストリン モノアルデヒド単量体を除去した。濾液にβ−シクロデキストリン モノアル デヒド単量体がないことを炭水化物分析のフェノール／硫酸法により確認した。 実施例９ ボリリシン ポリシクロデキストリン重合体の合成 ６−β−シクロデキストリン モノアルデヒドを実施例５で記したように合成 した。ポリリシン重合体（分子量１３．８万、 １０００リシン／ポリマー、５．０ｍｇ、３．６×１０^-5ミリモルのポリマー、 ３．６×１０^-2ミリモルのアミン）を２．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解 させた。４０．８ｍｇ（３．６×１０^-2ミリモル）の６−β−シクロデキストリ ンモノアルデヒドを５００ｍＬのＤＭＳＯに溶解してなる他の溶液を、次いで先 の攪拌ポリマー溶液に添加した。次いで、得られた溶液を室温にて３時間攪拌し た。３時間の混合の後、１．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解されたＮａＣ ＮＢＨ₃（３．６ミリモル）の溶液を反応混合物に添加した。室温にて２時間混 合した後、混合物をセファデックス（登録商標）Ｇ−２５ゲル濾過カラムに流し た。ＰＢＳ（ｐＨ７．０）を用いてカラムを溶出し、１．０ｍＬずつのフラクシ ョンを集めた。これらフラクションをフェノール／硫酸法により炭水化物含有量 につき分析した。得られたデータを用いて、得られたβ−シクロデキストリン重 合体につきゲル濾過プロフィルを作成した。次いで、このゲル濾過プロフィルを β−シクロデキストリン単量体のゲル濾過プロフィルと比較した。β−シクロデ キストリン重合体を含有するフラクションを合し、分子量３万切捨て膜が装着さ れたアミコン（登録商標）ミクロ濃縮器を用いて濃縮 した。濃縮物を希釈し（ｐＨ７．０の０．１Ｎ燐酸ナトリウム、０．１ＮのＮａ Ｃｌによる）、次いで３回即ちもはやβ−シクロデキストリン単量体が炭水化物 分析のフェノール／硫酸法により濾液中に検出されなくなるまで再濃縮した。 実施例１０ アミノ化固相に対するシクロデキストリン モノアルデヒドの付着 実施例７を化学量論的に改変して、シクロデキストリン モノアルデヒドをア ミノ化固相に結合させることができる。さらに、固相を誘導化させる際に実施例 ７をさらに改変し、これにはシクロデキストリン モノアルデヒド単量体を誘導 化された固相から実施例７で用いたサイズ排除分離でなくデカント、洗浄もしく は遠心分離により分離した。 実施例１１ 抗体に対するポリアクリルアミド ヒドラジド ポリシクロデキストリンの付着 ポリアクリルアミド ヒドラジド ポリシクロデキストリン重合体を実施例４ で確立したと同じ手法により抗体に結合させた。 実施例１２ 特異性結合肢に結合するポリシクロデキストリン重合体の疎水性キャビティへの シグナル発生基の導入 ポリアクリルアミド ヒドラジド ポリシクロデキストリンを実施例６に示し たように作成した。ｐＨ７．０のＰＢＳにおけるフルオレセンの１０^-10 Ｍ〜 １０^-6Ｍ溶液を、実施例６から得られたポリマーの１０^-10Ｍ〜１０^-6Ｍ溶液に 添加した。次いで、この溶液を室温にて約２時間にわたり混合した。混合の後、 溶液をｐＨ７．０のＰＢＳを用いセファデックス（登録商標）Ｇ−２５ゲル濾過 カラムに流し、１〜２ｍＬ／分の流速にてカラムから蛍光性接合体を溶出させた 。接合体がカラムから溶出する際、１〜４ｍＬずつのフラクションを集めた。さ らに、溶出液のＡ₂₈₀を接合体がカラムから溶出する際に測定し、カラムから溶 出した０．３より大のＡ₂₈₀値を有する第１ピークのフラクションを合した。 実施例１３ 市販の蛍光性接合体とポリアクリルアミド ヒドラジドポリフルオレセン接合体 との比較 この実施例においては流れ血球測定法を用いて、現在入手し うる市販の接合体とここで得られた接合体とから発生した各信号の比較を行った 。この比較は、リンパ球表面マーカーＣＤ２、ＣＤ３およびＬＥＵ４につき特異 性である接合体の間で行った。市販入手しうる接合体は細胞表面マーカーにつき 直接特異性であるＦＩＴＣ接合体、または細胞表面マーカーの１種につき特異性 であるビオチン一次試薬に特異性のアビジンＦＩＴＣ接合体のいずれかとした。 ビオチン一次試薬およびＣＤ２−ＦＩＴＣの全てはコールター社（Ｈｉａｌｅａ ｈ）フロリダ州）から市販入手し得、アビジンＦＩＴＣ接合体はベクトン・ディ キンソン社から入手しうる。ポリアクリルアミド ヒドラジド ポリフルオレセ ン接合体（ＰＡＨ−Ｆ）は、実施例２および実施例６に示した方法にしたがって 作成した。この実施例で使用した他の試薬は、０．１％のナトリウムアジドおよ び１．０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を上記処方物に加えたｐＨ７．０の ＰＢＳおよび塩化アンモニウム溶解（ｌｙｓｉｎｇ）溶液を包含した。溶解溶液 は次のように作成した： 成分 量（ｇ） ＮＨ₄Ｃｌ ８．２６ ＫＨＣＯ₃ １．０ ＮａＥＤＴＡ ０．０３７ 上記各成分を１．０Ｌの蒸留水に溶解させ、得られた溶液をＨｅｐｅｓ緩衝液 （シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州から市販）により７．３のｐ Ｈに調整した。使用前に溶解溶液を４１℃まで加温した。手法 下表２に示した試験管１〜５はこの実施例のための対照試験管であり、改変Ｐ ＢＳのみを含有する試験管１を除き、改変ＰＢＳ緩衝液における表示した一次も しくは二次試薬を含有した。一次試薬、または接合体が細胞表面マーカーにつき 直接特異性である場合（試験管６）には二次試薬を、下表２に示した量にて試験 管６〜１５に添加した。次いで２００μＬの新鮮な全血を６〜１５と表示した試 験管のそれぞれに入れた後、各試験管の内容物をおだやかに回動させつつ暗所内 で室温にて１５分間にわたり培養した。培養の後、試験管６を除く全ての試験管 を３ｍＬの改変ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄した試験管を次いで５００×重力に て３分間にわたり遠心分離し、これら試験管からの上澄液を吸引し、細胞ペレッ トを改変ＰＢＳに再懸濁させた。 二次試薬（第２表に示す）を、再懸濁されたペレットを含有 する各試験管に添加した後に回動させると共に上記のように培養した。培養の後 、試験管を次の手法により塩化アンモニウム溶解溶液で処理した。 １． ３．０ｍＬの溶解溶液を各試験管に添加した。 ２． 各試験管を使い捨てピペットで充分混合した。 ３． 各試験管を室温にて７分間培養した。 ４． 試験管を２０００ｒｐｍにて３分間にわたり遠心分離した。 ５． 各試験管に１００μＬ残るよう、上澄液を吸引した。 ６． 試験管を回動させてペレットを再懸濁させた。 ７． ０．１％のナトリウムアジドと１．０％のＢＳＡとを含有する３．０ｍ ＬのＰＢＳを次いで再懸濁ペレットに添加した。 ８． 工程４〜７を反復した。 ９． ０．１％のナトリウムアジドと１．０％のＢＳＡとを含有する０．５ｍ ＬのＰＢＳを次いで再懸濁ペレットに添加した。 さらに、試験管Ｎｏ．６は上記の手法により塩化アンモニウム溶解溶液で処理 した。 各試験管の内容物を、ベクトン・ジキンソン社から入手しうるＦａｃｓｃａｎ II蛍光活性化細胞ソーターにより分析した。計器の設定はリンパ球、単核細胞 および顆粒球が見えるよう前進側分散パラメータ（ｆｏｒｗａｒｄ ｖｅｒｓｅ ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）で可視化すべく最適化さ せた。「クイックＣａｌ」ビーズ［フロー・サイトメトリー・スタンダーズ社、 ダーハム、Ｎ．Ｃ．から入手］を添付ソフトウェアー プログラムにより指示さ れたように用いて検量線を作成した。ヒストグラムにおける蛍光イベント％を、 ３個の光分散ゲートを用いて各試験管につき決定した。ＭＥＳＦ値を「クイック Ｃａｌ」ソフトウェアーの与えた方程式により計算した。結果 試験管６〜１５から得られた結果を第３表に示す。先ず、ＰＡＨ−Ｆ ＩｇＧ 接合体の分子量は約３０万であると共にＦＩＴＣ ＩｇＧ接合体の分子量は約１ ５万であるため、分子量基準で１μｇのＰＡＨ−Ｆ接合体は約２μｇのＦＩＴＣ 接合体に等しい。第３表におけるデータにより実証されるように、本発明の高蛍 光性接合体は、市販の接合体よりも約３５倍強いシグ ナルを発生することができる。さらに、ＰＡＨ−Ｆ接合体の結合特異性はＦＩＴ Ｃ接合体のそれに匹敵する。ＦＩＴＣ接合体およびＰＡＨ−Ｆ接合体につき顆粒 球および単核細胞に関連するシグナルは相対的に同等であり、したがってＰＡＨ −Ｆ接合体がＦＩＴＣ接合体と少なくとも同程度に特異性であるこの証明として 役立つ。 実施例１４ β−シクロデキストリンによるフルオレセン重合体の蛍光増大 ２ロットのポリアクリルアミド ヒドラジド ポリフルオレセンを実施例２に 示した方法により作成した。第１ロットは、ポリアクリルアミド ヒドラジド重 合体（分子量１８万、１６０ヒドラジド／ポリマー）に、１０％の目標負荷比率 に相当する５′，６′−カルボキシフルオレセンＮ−ヒドロキシスクシンイミド 活性エステルを負荷させた。第２ロットは、ポリアクリルアミド ヒドラジド重 合体（分子量１８万、１６０ヒドラジド／ポリマー）に、７５％の目標負荷比率 に相当する５′，６′−カルボキシフルオレセンＮ−ヒドロキシスクシンイミド 活性エステルを負荷させた。 次いで２ロットのポリマーに負荷されたフルオレセンの実個数を、ポリマーの 蛍光とカルボキシフルオレセンの蛍光とを上記のように比較して決定した。測定 されたフルオレセンの個数は実施例２におけるように紫外分光測定法により決定 した。このデータから、各ポリマーに関する消去の程度を決定した。たとえば、 ロット１についてはポリマー当りのフルオレセンの個数は１１であると決定され 、観察されたフルオレセンの個数は ５．５であった。したがってポリマー ロット１におけるフルオレセンは約５０ ％消去された。 次いでβ−シクロデキストリンをポリマーの溶液に添加して、β−シクロデキ ストリンが０．０１Ｍの濃度で存在するようにした。シクロデキストリンを添加 した後、ポリマー上に観察されたフルオレセンの個数を再決定した。２ロットの 蛍光性ポリマーに対するβ−シクロデキストリンの添加により、観察されたフル オレセンの個数は増大した。この実施例の結果を第４表に示し、ここでＡはモル 吸光率であり、Ｂはフルオレセン数／ポリマーであり、Ｃは観察されたフルオレ センの個数であり、Ｄはβ−シクロデキストリンを添加した後に観察されたフル オレセンの個数であり、Ｅは０．０１Ｍのβ−シクロデキストリンにより示され た増大の量である。 実施例１５ ポリフルオレセンとポリフルオレセンβ−シクロデキストリン アルデヒド コ ポリマーとの比較 ポリアクリルアミド ヒドラジド ポリフルオレセンを実施例２におけるよう に合成した。３．０ｍＬ量の最適化されたポリアクリルアミド ヒドラジド ポ リフルオレユセイン重合体保存物を、０．１ＮのＮａＣｌを含むｐＨ５．５の０ ．１Ｎ燐酸塩緩衝液で０．７ｍｇ／ｍＬまで希釈した。３．０ｍＬの希釈ポリマ ーを抜取ってその後の対照用とし、さらに実施例７で作成した３．０ｍｇのβ− シクロデキストリン アルデヒドを残余の希釈ポリマー溶液に添加した。固体β −シクロデキストリン アルデヒドをポリマー溶液に溶解させ、新たに生成した 溶液を室温にて１晩培養した。培養の後、対照およびポリマー／β−シクロデキ ストリン溶液を別々の１×４５ｃｍセファデックス（登録商標）Ｇ−２５サイズ 排除カラムで精製した。溶出速度はｐＨ７．０の０．１Ｎ燐酸塩、０．１ＮＮａ Ｃｌ緩衝液を溶出緩衝剤として用い、試験管１本当り４５滴とした。初期ポリマ ー濃度は０．２６ｍｇ／ｍＬと推定された。正確な容積読値、並びに対照および ポリマー／β−シクロデキストリン 試験管の１〜１０希釈に基づき、０．０２６ｍｇ／ｍＬ、すなわち１．４４×１ ０^-7Ｍのポリマー濃度が得られた。 対照（非シクロデキストリン誘導ポリアクリルアミド ヒドラジド ポリフル オレセン）と実験（シクロデキストリン アルデヒド誘導ポリアクリルアミド ヒドラジド ポリフルオレセン）との蛍光強度間の比較を行った。具体的には、 これら２種の溶液を４８８ｎｍにて励起し、蛍光を５２５ｎｍにて測定した。２ 種の溶液に関する蛍光結果を下表４に示す。 相対蛍光強度１３８：１０８の蛍光比が対照に対する実験につき観察された。 したがって、実験ポリマーの蛍光は対照ポリマーの１．３倍であった。これは実 験ポリマーではシグナルが３０％増加したことに対応し、ポリマー当量当り２０ 個のフルオレセンであると翻訳され、これはポリマー当量当り１５個の フルオレセン（第３表、ロット２、Ｃ欄に示す）と対比される。この例における 向上は、非共役結合のβ−シクロデキストリンでなく、共有結合のβ−シクロデ キストリンに基づいている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 少なくとも１種の最適化された高蛍光性ポリマーに共有結合した特異性結 合肢を含み、前記高蛍光性ポリマーが骨格ポリマーと、この骨格ポリマーに共有 結合した蛍光性化合物とからなることを特徴とする高蛍光性接合体。 ２． 前記特異性結合肢が抗体である請求の範囲第１項に記載の接合体。 ３． 前記骨格ポリマーがアミン官能性ポリマーの残基を含む請求の範囲第１項 に記載の接合体。 ４． 前記アミン官能性ポリマーが： （ａ） −ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ₂、 （ｂ） −ＮＨ₂、 （ｃ） −ＮＨ−Ｒ ［式中、ＲはＣ₁−Ｃ₃アルキル、イソプロピル、 −（ＣＨ₂）₂ＣＯ₂ ^-、−（ＣＨ₂）₂ＳＯ₃ ^-、 −（ＣＨ₂）₂ＮＨ₃ ⁺、 −（ＣＨ₂）₂ＮＨ₂ ⁺（ＣＨ₂）₂ＳＯ₃ ^-、 −（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂ＯＨおよび −（ＣＨＯＨ）₄ＣＨ₂ＯＨよりなる群から選択される］ および （ｄ）その組合せ よりなる群から選択されるアミン官能基の残基を有する請求の範囲第３項に記載 の接合体。 ５． 前記アミン官能性ポリマーがポリアクリルアミドヒドラジド、ポリヒドラ ジド、ポリリシンおよびその組合せよりなる群から選択されるポリマーの残基で ある請求の範囲第３項に記載の接合体。 ６． 前記蛍光性化合物がフルオレセン、カスケードブルー、クマリン、テキサ スレッド（登録商標）およびフィコエリスリンよりなる群から選択される請求の 範囲第１項に記載の接合体。 ７． α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキスト リンおよびその組合せよりなる群から選択される化合物が前記シグナル発生基と 錯生成する請求の範囲第１項に記載の接合体。 ８． 少なくとも１種の最適化された高蛍光性ポリマーに共有結合した特異性結 合肢を含み、前記高蛍光性ポリマーが骨格ポリマーと、α−シクロデキストリン 、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンおよびその組合せよりなる 群から選択されて前記骨格ポリマーに共有結合したスペーサ化合物と、前記骨格 ポリマーに共有結合しまたは前記スペーサ化合物内に収容された蛍光性化合物と からなることを特徴とする高蛍光性接合体。 ９． 特異性結合肢が抗体である請求の範囲第８項に記載の接合体。 １０． 前記骨格ボリマーがアミン官能性ポリマーの残基を含む請求の範囲第９ 項に記載の接合体。 １１． 前記アミン官能性ポリマーが： （ａ） −ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ₂、 （ｂ） −ＮＨ₂、 （ｃ） −ＮＨ−Ｒ ［式中、ＲはＣ₁−Ｃ₃アルキル、イソプロピル、 −（ＣＨ₂）₂ＣＯ₂、−（Ｃ₂Ｈ）₂ＳＯ₃ ^-、 −（ＣＨ₂）₂ＮＨ₃ ⁺、 −（ＣＨ₂）₂ＮＨ₂ ⁺（ＣＨ₂）₂ＳＯ₃ ^-、 −（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂ＯＨおよび −（ＣＨＯＨ）₄ＣＨ₂ＯＨよりなる群から選択される］ および （ｄ）その組合せ よりなる群から選択されるアミン官能基の残基を有する請求の範囲第１０項に記 載の接合体。 １２． 前記アミン官能性ポリマーがポリアクリルアミド ヒドラジド、ポリヒ ドラジド、ポリリシンおよびその組合せよりなる群から選択されるポリマーの残 基である請求の範囲第１０項に記載の接合体。 １３． 前記蛍光性化合物がフルオレセン、カスケードブルー、クマリン、テキ サスレッド（登録商標）およびフィコエリスリンよりなる群から選択される請求 の範囲第８項に記載の接合体。 １４． 試験試料における分析物の存在および／または量を決定するに際し： ａ． 前記試験試料を、少なくとも１種の最適化された高蛍光性ポリマーに共 有結合した特異性結合肢を含む高蛍光性接合体であって、前記高蛍光性ポリマー は骨格ポリマーとこの骨格ポリマーに共有結合した蛍光性化合物とからなる高蛍 光性接合体と接触させて混合物を生成させることにより、接合体／分析物複合体 を生成させ； ｂ． 前記接合体／分析物複合体を前記混合物から分離し； ｃ． 測定可能なシグナルを検出する ことを特徴とする分析物の存在および／または量の決定方法。 １５． 前記特異性結合肢が抗体である請求の範囲第１４項に記載の方法。 １６． 前記骨格ポリマーがアミン官能性ポリマーの残基を含む請求の範囲第１ ４項に記載の方法。 １７． 前記アミン官能性ポリマーが： （ａ） −ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ₂、 （ｂ） −ＮＨ₂、 （ｃ） −ＮＨ−Ｒ ［式中、ＲはＣ₁−Ｃ₃アルキル、イソプロピル、 −（ＣＨ₂）₂ＣＯ₂ ^-、−（ＣＨ₂）₂ＳＯ₃ ^-、 −（ＣＨ₂）₂ＮＨ₃ ⁺、 −（ＣＨ₂）₂ＮＨ₂ ⁺（ＣＨ₂）₂ＳＯ₃ ^-、 −（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂ＯＨおよび −（ＣＨＯＨ）₄ＣＨ₂ＯＨよりなる群から選択される］ および （ｄ）その組合せ よりなる群から選択されるアミン官能基の残基を有する請求の範囲第１６項に記 載の方法。 １８． 前記アミン官能性ポリマーがポリアクリルアミド ヒドラジド、ポリヒ ドラジド、ポリリシンおよびその組合せよりなる群から選択されるポリマーの残 基である請求の範囲第１６項に記載の方法。 １９． 前記蛍光性化合物がフルオレセン、カスケードブルー、クマリン、テキ サスレッド（登録商標）およびフィコエリスリンよりなる群から選択される請求 の範囲第１４項に記載の方法。 ２０． α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキス トリンおよびその組合せよりなる群から選択される化合物が前記シグナル発生基 と錯生成する請求の範囲第１４項に記載の方法。 ２１． 試験試料における分析物の存在および／または量を決定するに際し： ａ． 前記試験試料を、少なくとも１種の最適化された高蛍光性ポリマーに共 有結合した特異性結合を含む高蛍光性接合体であって、前記高蛍光性ポリマーは 骨格ポリマーとα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロ デキストリンおよびその組合せよりなる群から選択される前記骨格ポリマーに共 有結合したスペーサ化合物と前記骨格ポリマーに共有結合しまたは前記スペーサ 化合物内に収容された蛍光性化合物とからなる高蛍光性接合体と接触させて混合 物を生成させることにより接合体／分析物複合体を生成させ； ｂ． 前記接合体／分析物複合体を前記混合物から分離し； ｃ． 測定可能なシグナルを検出する ことを特徴とする分析物の存在および／または量の決定方法。 ２２． 前記特異性結合肢が抗体である請求の範囲第２１項に 記載の方法。 ２３． 前記骨格ポリマーがアミン官能性ポリマーの残基を含む請求の範囲第２ １項に記載の方法。 ２４． 前記アミン官能性ポリマーが： （ａ） −ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ₂、 （ｂ） −ＮＨ₂、 （ｃ） −ＮＨ−Ｒ ［式中、ＲはＣ₁−Ｃ₃アルキル、イソプロピル、 （ＣＨ₂）₂ＣＯ₂ ^-、（ＣＨ₂）₂ＳＯ₃ ^-、 （ＣＨ₂）₂ＮＨ₃ ⁺、 （ＣＨ₂）₂ＮＨ₂ ⁺（ＣＨ₂）₂ＳＯ₃ ^-、 （ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂ＯＨおよび −（ＣＨＯＨ）₄ＣＨ₂ＯＨよりなる群から選択される］ および （ｄ）その組合せ よりなる群から選択されるアミン官能基の残基を有する請求の 範囲第２３項に記載の方法。 ２５． 前記アミン官能性ポリマーがポリアクリルアミド ヒドラジド、ポリヒ ドラジド、ポリリシンおよびその組合せよりなる群から選択されるポリマーの残 基である請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２６． 前記蛍光性化合物がフルオレセン、カスケードブルー、クマリン、テキ サスレッド（登録商標）およびフィコエリスリンよりなる群から選択される請求 の範囲第２１項に記載の方法。 ２７． （ａ）式 ［式中、Ｘは であり、 ｎは５、６もしくは７である］ のシクロデキストリン分子を、式 ［式中、Ｘおよびｎは上記の意味を有する］ のモノトシレート誘導体に変換し； （ｂ）工程（ａ）のモノトシレート誘導体を、式 ［式中、Ｘおよびｎは上記の意味を有する］ の６−シクロデキストリン モノアルデヒドに変換することを特徴とする６−シ クロデキストリン モノアルデヒドの製造方 法。 ２８． 前記６−シクロデキストリン モノアルデヒドへの前記モノトシレート 誘導体の変換を、ジメチルスルホキシドおよび塩基によって行う請求の範囲第２ ７項に記載の方法。 ２９． 前記塩基をジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ−メチ ルモルホリン、トリメチルアミンおよびＮａＯＨよりなる群から選択する請求の 範囲第２８項に記載の方法。