NO152955B - Reagens for bestemmelse av et immunologisk aktivt materiale - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et reagens for bestemm-

else av et immunologisk aktivt materiale bestående av en reseptor, som binder det immunologisk aktive materiale, et enzym, et enzymsubstrat og det immunologisk aktive materi-

ale som er merket med en forbindelse som er i stand til å modifisere aktiviteten i enzymet.

I de siste årene er det utviklet mange analytiske systemer basert på kompetetiv protein-bindingsanalyse (også kalt metningsanalyse).

Uttrykkene "metningsanalyse" og "kompetitiv protein-bindingsanalyse" som er synonyme referer til analytiske syste-

mer som anvendes for bestemmelse av immunologiske aktive materialer (ligander). Resultatene av disse bestemmelsene i biologiske væsker anvendes i medisinsk og veterinær-

medisinsk diagnose. Diagnosen avhenger av om mengden av substansen som skal bestemmes er normal eller patologisk.

Det analytiske prinsippet er f.eks. basert på konkurranse

mellom en ligand og en merket ligand som et felles spesi-

fikt bindingsmiddel (reseptor) som illustrert i den følg-

ende reaksjonslikningen:

Den primære reaksjonen er en kombinasjon av et molekyl av

ligand med et molekyl av reseptor som danner et bimoleky-

lært ligand/reseptor-kompleks (1). En ytterligere reaksjon forårsakes ved tilsetning av merket ligand som på liknende måte forbindes med reseptoren under dannelse av et merket ligand/reseptor-kompleks (2). I metningsanalyse er kon-sentrasjonene av reseptoren og den merkede liganden kon-

stant. Reseptorkonsentrasjonen er begrenset slik at den merkede liganden er i overskudd i forhold til reseptoren.

Under disse betingelser forårsaker addisjon av liganden, konkurranse mellom ligand og merket ligand i binding med reseptoren. Derfor senker en økning i ligand konsentrasjonen mengden av merket ligand/reseptor-kompleks. Målings-prinsippet er basert på bestemmelse av andel av totalt merket ligand bundet til reseptoren. Denne andelen er om-vendt proporsjonalt med mengden av ligand som tilsettes reaksjonsblandingen fra prøven som skal måles eller fra standarden som brukes i målingen. Reduksjonen i konsentrasjonen av merket ligand/reseptor-kompleks eller økn-

ingen i konsentrasjonen av merket ligand i reaksjonsblandingen kan brukes for å bestemme umerket ligandkonsentrasjonen.

Følsomheten til metningsanalysen avhenger av bruken av en reseptor som har en meget høy affinitet for den umerkede liganden og merkede ligand. Dertil avhenger følsomheten også av anvendelse av en markør som kan påvises i meget lav konsentrasjon.

Metninganalysens spesifisitet avhenger av reseptorens evne til utelukkende å binde umerkede ligander og merkede ligander, i en kompleks blanding av forskjellige molekyler.

Metningsanalyse er blitt anvendt ved bruk av mange forskjellige teknikker, hvor forskjellene primært avhenger av typen markør som brukes. Generelt klassifiseres disse tek-nikkene som "radioaktiv måling" eller "ikke-radioaktiv måling" avhengig av om en radioaktiv tracer brukes som markør.

Radioaktiv måling har blitt anvendt i større utstrekning

enn ikke-radioaktive målinger. Radioaktiv måling kan vi-

dere klassifiseres som radioaktiv-immuno-måling eller radioaktiv-reseptor-måling avhengig av typen reseptor som benyttes i målingen. I radioaktiv-immuno-måling anvendes et antistoff som spesifikt binder umerket ligand og merket ligand. Alternativt vedrører' radioaktiv-reseptor-analyse bruken av hvilken som helst annen type biologisk reseptor som på lignende måte spesifikt vil binde den umerkede lig-

anden og den merkede liganden.

I alle radioaktive målingsteknikker er det vesentlig å adskille fysikalsk den bundne fraksjon (1 og 2 ifølge ligning 1) fra den ikke-bundne fraksjon (3 og 4 i ligning 1) i reaksjonsblandingen. En indeks på ligandkonsentrasjonen kan deretter oppnås ved å telle disse fraksjonene i et radioaktivt telleverk og sammenligne tellingene som oppnås for de ukjente prøvene med dem som oppnås for egnede stan-dardligand-prøver som underkastes den samme målingen. Mange forskjellige metoder er blitt beskrevet for adskillelse av de bundne og frie fraksjonene i den radioaktive målingsreaksjonsblandingen og disse benytter teknikker som gelfiltrering, absorpsjon og ionebytterkromatografi, frak-sjonert felling, fast fase eller elektroforese.

Etter utviklingen av radioaktive målingsteknikker i metningsanalysen, er metoder som anvender ikke-radioaktive markører blitt utviklet. Metoder som anvender enzymer som markør er blitt vist. Disse metodene kan ha den fordel at fysikalsk adskillelse av bundne (1 + 2) og frie (3+4) fraksjoner av merket ligand ikke er nødvendig i måleprose-dyren.

Når antistoffer binder ligand som er merket med et enzym modifiseres aktiviteten til enzymet. Modifikasjonsgraden til enzymaktiviteten indikerer konsentrasjonen av den merkede liganden i den bundne fraksjonen og gir derfor en indeks på ligandkonsentrasjonen i reaksjonsblandingen.

Den kjemiske strukturen til ligandenzymkomplekset er vanskelig å klarlegge, og dette er en vesentlig ulempe ved enzymimmuno-målingen. Dette skyldes utvilsomt det store antall aminosyrekjeder på enzymoverflaten som danner kompleks med liganden. Dette gjør det vanskelig å reprodusere ligand-enzym under gjentatte fremstillinger av komplekset. Den generelle mangel på kontroll over komplekseringsreak-sjonen fører til at mange ligandmolekyler knyttes til et enzymmolekyl, skjønt det antas at binding av bare noen få av disse ligandmolekylene ved antistoffer inngår i inhi-beringen av enzymaktiviteten. Derfor resulterer ikke alle antistoff/merkede antigen-forbindelser i en modifisering av enzymaktiviteten, hvilket derved senker teknikkens sen-sibilitet.

Protein-protein-sammenhengen mellom forskjellige anti-stoffmolekyler og antistoff og enzymmolekyler er en annen følge av antallet ligandmolekyler på enzymoverlfaten. Protein-protein-sammenhengen økes videre hvis liganden også er et polypeptid. Således induserer enzymmolekylet et lo-kalt mikromiljø med høy proteinkonsentrasjon. I slike situasjoner er det vist at proteinfellingen som opptrer, derved forårsaker tap av en av hovedfordelene ved enzym-immunomåling, fordi separasjon av antistoffbundne og frie fraksjoner ble nødvendig.

Det er beskrevet en modifikasjon av enzymatisk 'immunomåling som delvis overvinner disse problemene ved at liganden merkes med et detektormolekyl som har en lav molekylvekt. I denne målingen hindrer antistoff-binding av merket lig-andbinding av et detektor-molekyl ved et annet antistoff som er spesifikt for detektormolekylet. Indeksgraden bestemmes ved konkurranse av binding av det frie ligandde-tektor-molekyl og detektor-molekyl-merket enzym med detektor-irolekyl-antistoff. Modifikasjonsgraden av enzymaktivitet bestemmes i normal enzymatisk immunomåling indikerer konsentrasjon av fritt ligand-detektor-molekyl som likeledes er en indikasjon på ligand-konsentrasjonen i reaksjonsblandingen. Fordelen med denne teknikken er at et lite molekyl fremfor et enzym knyttes til liganden, hvilket derved muliggjør at den kjemiske strukturen til den merkede liganden kan bestemmes og overvinner således mange av de ulemper som knyttet til de forut beskrevne enzymatiske immuno-målinger. Imidlertid overvinner dette systemet bare ulemper ved den primære bindingsreaksjonen som innbefatter liganden og merket ligand og overfører dem til detektorsystemet for bestemmelse av graden av bundet antistoff og fritt antistoff fra fraksjoner i den merkede

liganden.

Ulempene ved de tidligere kjente metoder overvinnes ved foreliggende oppfinnelse hvor et enzym-modifiseringsmiddel brukes som markør.

Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse et reagens av den innledningsvis beskrevne art hvor det merkede immunologiske materiale er et antigen-enzyminhibitor-eller antigen-enzymaktivator-kompleks.

Reagenset kan anvendes i den fremgangsmåte som er gjen-stand for norsk patentansøkning nr. 84.4764.

Uttrykkene "immunologisk aktivt materiale" eller "ligand"

i denne beskrivelsen referer til enhver immunologisk aktiv forbindelse eller del av den som er i stand til å bestemmes immunologisk f.eks. ved å bruke metningsanalyseteknik-ker. Det viktigste kravet er at der er en reseptor som spesifikt vil binde liganden. Når reseptoren er et antistoff vil liganden være et hapten eller et antigen slik at det spesifikke antistoffet kan dannes. En ligand i denne forbindelse er et hapten når det bare vil gi antistoff--dannelse ved tilknytning til antigen. Alternativt er en ligand i den forbindelse et antigen når de vil gi anti-stof f-dannelse uten kjemisk modifisering. Liganden kan variere sterkt i moelkylvekt fra 100 - 1 000 000. Dette molekylvektsområdet er ikke begrensende i målingen såfremt reseptoren er i stand til spesifikt å binde liganden.

Liganden kan enten ha polymer- eller ikke-pølymer-struktur. Ved polymer-struktur vil liganden normalt være av biologisk opprinnelse og kan klassifiseres som en nukleinsyre-poly-sakkarid og/eller polypeptid. Alternativt vil liganden når den ikke er polymer generelt ha en molekylvekt mindre enn 2 000 og kan ha ganske forskjellige strukturer, funk-sjonelle grupper og fysiologiske egenskaper.

Ligander av særlig betydning som kan brukes i foreliggende oppfinnelse er aminer, aminosyrer, peptider, proteiner, lipoproteiner, glykoproteiner, steroler, steroider, lipoider, nukleinsyrer, mono- og polysakkarider, alkaloider, vitaminer, droger, narkotika, antibiotika, metabolitter, pesticider, toksiner industrielle biprodukter, smaksmidler, hormoner, enzymer, koenzymer, cellulære eller ekstracellulære komponenter fra vev og isolerte antistoffer fra mennesker eller dyr. Målingen er imidlertid ikke begrenset til bare disse ligandene.

Komponenter som øyeblikkelig egner seg for analyse i systemet er hepatit B-overflate antigen, ferritin, tumor antigener som CEA, a-f øto protein, rheumatoid faktor, C-reaktive proteiner, immunoglobulin klasser IgG, IgM eller IgA, myoglobin, tyroid hormoner inklusive T., og , insulin, steroide hormoner innbefattende testosteron eller estra-diol, misbrukte droger innbefattende narkotiske sovemidler, som morfin, barbiturater, stimulanser som amfetamin, droger for behandling av epilepsi innbefattende difenyl-hydantion og fenobarbital, kretsløps glykocyter som digoksin, vitaminer som vitamin B-^ °<J folinsyre. Videre antistoffer som er øyeblikkelige egnet for analyse i systemet er slike som forekommer ved infeksjon av syfilis,gonoré, brucellosis, rubella og rheumatisme.

Uttrykket "merket immunologisk aktivt materiale" eller "market reseptor" i denne beskrivelse referer til en ligand , analog av en ligand eller en del av den eller til en reseptor som er merket med et enzymmodifiseringsmiddel. En, flere enn en og generelt mindre enn 100 riarkormolekyler kan knyttes til en ligand eller reseptormolekyl. Likeledes kan et, flere enn et og normalt mindre enn 5 ligander eller resentormolekyler knyttes til et markeringsmolekyl. Tilknytnina av ekstra marker'ingsmole-kyl til en ligand eller reseptormolekyl øker generelt målings-følsomhet forutsatt at de ekstra markeringene ikke påvirker bindingen.

Tilknytning av et modifiseringsmolekyl til en ligand eller reseptormolekyl innbefatter dannelsen av intermolekylære bånd som i de fleste tilfeller, men ikke nødvendigvis er av kovalent natur. Tilknytningen kan i noen tilfeller ut-føres i nærvær av et koplingsmiddel ved innføring av en bindingsgruppe mellom markeringen og liganden eller reseptoren.

Det modifiserende molekylet kan knyttes direkte til

liganden eller reseptormolekylet Imidlertid kan det være ønskelig å innføre kjemiske broer av forskjellige lengder mellom modifiseringsmolekylet og liganden eller reseptormolekylene avhengig av den spesifikke målingen som skal utføres. I noen tilfeller kan det også være en fordel å knytte modifiseringsmolekylet og liganden eller reseptormolekylene separat til det samme bærermolekylet, f.eks. et makromolekyl som et polypeptid eller et poly-sakkarid .

Uttrykket "reseptor" i denne beskrivelsen referer til enhver substans som spesifikt kan binde ligand og merket ligand eller en del av denne. Generelt er den anvendte reseptor i målingen et spesifikt antistoff for liganden som dannes i blodet hos virveldyr etter injeksjon av riktig hapten ca antigen. Alternativt kan reseptorer som opptrer i naturen også brukes i målingen. Denne siste gruppen innbefatter, men er ikke begrenset til dette, proteiner, nukleinsyrer og cellulære membraner. Slike reseptorer er blitt brukt i radioaktive måleteknikker for tyroksin, insulin, angiotensin og forskjellige steroidhormoner.

I tilfelle liganden er et antistoff kan reseptoren være antigenet som brukes for å indusere dette antistoffet i et vertsdyr. I en annen utførelsesform kan reseptoren være et antistoff mot antistoffet som skal bestemmes.

Det er ikke mulig å fastlegge med bestemthet reseptorens virkemåte, som ved binding av den merket liganden reduserer virkningen mellom enzym og modifiseringsmiddel. Den antatte forklaring er at enzymets affinitet til modifiseringsmiddelet nedsettes som en følge av en størrelses-forandring og netto ladning hos reseptor/ligand -modifiT seringskompleks sammenliknet med den for ligand -modifiseringen alene.

Uttrykket "modifiseringsmiddel" i denne beskrivelsen referer til enhver substans som er i stand til å innvirke på et enzym slik at graden eller typen av enzymaktivitet modifiseres. Denne modifiseringen kan resultere i en inhibering, akti-vering eller spesifisrtetsforandring eller enhver annen egen-skap hos enzymet som er påviselig enten direkte eller indirekte ved en forandring i enzymaktiviteten eller i måten av aktivitet, f.eks. en forandring i reaksjonsbe tingelser som ko-faktor behov eller pH-optimum , i kinetiske egenskaper eller i aktiveringsenergi. Modifiseringsmiddelet kan variere i størrelse fra et lite molekyl til et makromolekyl, og dets innvirkning på et enzymmolekyl kan enten være rever-sibelt eller irreversibelt avhengig av om den inter-molekylære assosiasjon er av ionisk eller kovalent natur.

Målings ømfindtlighet er bl.a. avhengig av reseptorens affinitet overfor liganden og modifiseringsmiddelets evne til å fremkalle en forandring i grad eller type av enzymaktivitet. Fortrinnsvis er modifikasjonen av graden eller typen av enzymaktivitet oppnåelig med en minimal konsentrasjon av modifiseringsmiddelet. Jo nærmere denne konsentrasjonen ligger enzymets på molekylær basis, jo større vil måleømfindtligheten være.

Fortrinnsvis vil modifiseringsmiddel være en enzyminhibitor som ved innvirkning på et enzym vil inhibere dets aktiv Virkningsmåten av inhibitoren kan være kompetetiv, ikke-kompetetiv, allosterisk eller en kombinasjon av to eller flere av disse måtene. Fortrinnsvis bør inhibitoren ha en inhiberingskonstant (nødvendig inhibitorkonsentrasjon for 50% inhibering av enzymsystemet) under lO<->"^ mol pr.

liter avhengig av den foreliggende måling. Særlig fore-

-15 -5

trukket er inhiberingskonstanten mellom 10 og 10

Ethvert enzym kan brukes i målingen forutsatt at det eksi-sterer et modifiseringsmiddel som spesifikt vil modifisere enzymaktivitet på den ovenfor beskrevne måte. Aktuelle enzymer er stabile, lett tilgjengelige ved lave omkostninger og har sterk katalytisk evne og et enkelt målesystem. Fortrinnsvis er den katalytiske evne (molekylprodukt som dannes pr. enzymmolekyl pr. et minutt) over 100 avhengig av det spesifikke forsøk som utføres. Fortrinnsvis er overføringstallet så høyt som mulig og minst 200.

Enzymmodifiseringssystemet som er spesielt egnet for den foreliggende oppfinnelse er dihydrofolat reduktase/meto^-treksat, dihydrofolat reduktas/4-aminopteridin, dihydrofolat reduktase/andre spesifikke inhibitorer for dette enzymet, &-glukoronidase/4-deoksy-5-5imino-qlutarsyre eller deri-vater derav, biotin inneholdende enzymer/avidin som kar-boksylase/avidin, chymotrypsin/TPCK (TPCK = tosyl-L-fenyl-alanin-klormetylketon med formel

Y-cystationase/propargylglysin, alanin racemase/ trifluoralanin, tryptofanase/trifluoralanin, tryp-tofan syntetase/trifluoralanin, Ø-cystationase/ trifluoralanin, pyruvat-glutamat transaminase/trifluoralanin, melkesyre oksydase/2-hydroksy-3-butyn-syre, monoamin oksydase/N,N-dimetyl propargylamin og diamin-oksydase/H2N-CH2-C=CCH2-NH2.

Bestemmelse av enzymaktivitet kan utføres ved å regulere direkte eller indirekte substratforbruket eller produk-sjonen av produkt ved passende pH og temperatur ved anvendelse av påvisningssysterner som innbefatter kolorimetri, spektrofotometri, fluorspektrofotometri, gasiometri, termo-metri (varmeutvikling), scintillasjonstelling.

For å øke systemets ømfindtlighet er det mulig å bruke bioluminescens og enzymcykliseringsteknikker, f.eks. de teknikker som er beskrevet av J. Lee et al in Ligiud Scintillation Couting: Recent Developments, Stanley P.E. and Scoggins, B.A., Academic Press, New York p. 403 og Lowry O.H. et al in J. Biol. Chem 236, p. 2746-2755.

I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse kan en merket ligand brukes for bestemmelsen av tilstedeværelsen av en ligand i en ukjent prøve ved den simultane eller etterfølgende tilsetning av den merkede ligand og den ukjente prøven til et vandig medium ved egnet pH som inneholder en spesifikk reseptor for den umerkede liganden og den merkede liganden. Etter en passende inkuberingstid bestemmes fordelingen av reseptoren bundet til umerket ligand og merket ligand ved tilsetning av enzym og subst-rater. Reseptoren som er spesifikk for liganden binder også den merkede liganden og reduserer derved innvirkn-ingen mellom modifiseringsmiddelet og enzymet og nedsetter derved modifiseringen av enzymaktiviteten. Tilsetning av umerket ligand til prøven resulterer i konkurranse med den merkede liganden i binding med reseptor og øker derved konsentrasjonen av fri merket ligand i målingen. Innvirkning mellom ligandmodifiseringsmiddel og enzym økes og enzymaktiviteten blir igjen påvirket. Modifiseringen av enzymaktiviteten er derfor en funksjon av ligandkonsentrasjonen i målingen og bevirkes av ubundet merket ligand. Følgelig er forskjellen mellom den resulterende enzymaktiviteten og kontrollen, et mål for konsentrasjonen av liganden i den ukjente prøven.

En av hovedfordelene ved denne metoden er at adskillelsen av bundne og frie fraksjoner er unødvendige i fremgangs-måten. Dette utelukker imidlertid ikke anvendelsen av et slikt separasjonstrinn i målingen etter inkuberingen av umerket ligand og merket ligand med reseptor og før stad-festelsen av enzymaktiviteten. Separasjon av fraksjoner kan være ønskelig i noen tilfeller for å fjerne substan-sene i prøven som kan innvirke på enzymmålingen. Adskillelsen kan oppnås ved å bruke hvilken som helst av de mange beskrevne teknikker for radioaktiv-immunomåling som omfat-ter gelfiltrering, adsorpsjon og elektroforese.

Denne målingen er selvfølgelig ikke begrenset til bestemmelse av haptener og antigener som liganden, men kan også tilpasses for identifisering og måling av antistoffer som

liganden.

Dette kan f.eks. utføres ved å merke antistoffet med et enzymmodifiseringsmiddel og måle graden av enzymaktivitet modifisering etter inkubering av merket antistoff og prøveantistoff med en begrensende konsentrasjon av antigen eller hapten. Modifiseringen av enzymaktivitet vedrører prøveantistoffkonsentrasjon. Om nødvendig kan de bundne og frie fraksjoner adskilles før tilsetning av enzymet og substratet.

Oppfinnelsen muliggjør også bestemmelse av en ligand anvendelsen av en merket reseptor fremfor en merket ligand. Ligand i den ukjente prøven reagerer med overskudd-reseptor merket med et enzymmodifiseringsmiddel, og etter inkubering tilsettes overskudd fast fase insolubilisert ligand og reagerer med den fri gjenværende merkede reseptor. Etter separasjon av den faste fasen måles modifiseringen av enzymaktivitet som er knyttet til den løselige liganden og avhenger av ligandekonsentrasjonen.

Reagensene i den forliggende oppfinnelse kan også brukes i en "sandwich"-teknikk forutsatt at liganden har minst to bindingssteder. Ligand reagerer med overskudd fast fase reseptor og etter inkubering fulgt av vask omsettes den faste fase reseptor bundne ligand med overskudd reseptor markert med en enzym-modifiseringsmiddel. Fri merket reseptor fjernes ved vask og graden av enzym-modifisering i de adskilte fraksjoner bestemmes. Dette gir så en indeks for ligandkonsentrasjonen.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av " amino- digoksin"

En suspensjon av 156 mg (0,2 mmol) digoksin i 5 ml absolutt

etanol ble tilsatt 10 ml 0,2 M natriummetaperiodat under røring. Blandingen ble homogen etter 10 minutter og så ble fellingen langsomt dannet. Etter 2 timer ble 5 ml vann pluss 5 ml etanol tilsatt. 122 jul (2,2 mmol) etylenglykol ble tilsatt etter ytterligere 30 minutter og et tett nytt presipitat begynte straks å dannes. Etter 80 minutters røring ble 133 ul (2,0 mmol) etylendiamin tilsatt og den resulterende pH på 11,0 ble jusert til 9,5 med 0,1 M HC1

og reaksjonsblandingen fikk stå ved en temperatur i 18

timer. pH forandret seg ikke i dette tidsrommet.

151,4 mg (4,0 mmol) natriumborhydrid ble så tilsatt og blandingen rørt i 3 1/2 time. pH ble så justert fra 10,5

til 6,5 med IM maur syre (ca. 3 ml) og tynnsjiktkromatografi av :denne blandingen viste en enkel hovedflekk med en Rf lik 0,15 (kisel-

gel på aluminium utviklet i butanol:iseddik:vann/4:1:1).

Digoksin hadde en Rf 0,7 ved utvikling i samme system.

Løsningsmidlene ble avdampet nesten til tørrhet på en rotasjonsfordamper under vakuum ved anvendelse av et vann-

bad på 60°C. De siste få ml vann ble fjernet ved til-

setning av 95% etnol (3 x 2 0 ml) og gjentakelse av inndamp-

ningen som ovenfor.

Det resulterende blekgule faste stoff ble ekstrahert tre

ganger med absolutt etanol og disse kombinerte ekstraktene konsentrert i ca. 4 ml og sentrifugert for å adskille en liten mengde salt som ble kastet. Den blekgule superna-tantløsning ble inndampet til tørrhet under en strøm av tørt nitrogen og ga en gul olje som viste samme Rf på tynnsjiktkromatografi som reaksjonsblandingen som er beskrevet ovenfor. Produktet ble vist å inneholde en fri aminogruppe ved å omsette den med "Fluram" (4-fenylspiro[fluran-2(3H),1'-ftalan]-3,3'-

dion) under dannelse av en sterkt fluorescerende forbindelse.

Produktet hadde et spektrum i konsentrert svovelsyre i likhet med oligoksinets med absorpsjonstopper ved 385 og 495 myu. Produktet hadde også en sterk affinitet for spesifikk antisera (kanin) for digoksin. Den antatte struktur for det isolerte produktet er den følgende:

EKSEMPEL 2

Fremstilling av metotreksat - aminodigoksin- konjugat

11 mg metotreksat ble oppløst i 5 ml 1^0 og justert til

pH 6,5. 10 mg "aminodigoksin" ble oppløst i denne løsningen og volumet justert til 20 ml med ^O. pH ble rejustert til 6,5 og 484 mg N-etyl,N"-(3-dimetylamino) propyl-karbodiimid-hydroklorid oppløst i 5 ml H20 ble satt til reaksjonsblandingen. pH ble holdt på 6,2 i 24 timer ved romtemperatur. Konjugatet ble renset på en kiselgelkolonne ved anvendelse av 3% ammoniumsitrat som løsningsmiddel. Fraksjoner som inneholdt det ønskede produkt ble slått sammen og vist å

ha samme dobbelte evne til å binde sterke antisera (kanin) spesifikke for digoksin og inhiberte også sterkt enzymet dihydrofolatredukstase (kyllinglever). Den antatte struktur for metotreksat-aminodigoksin-konjugatet er den følgende:

EKSEMPEL 3

Enzyminhibitor- immunomåling for digoksin

100 ul serum ble inkubert ved 30°C i 15 minutter med 100 ul antidigoksin antistoffløsning, 100 ul NADPH-løsning, 100 ul 2-merka<p>toetanol-løsning og 550 p. 1 natriumfosfat-fcuffer pH 7,5. 100 ul metotreksatdigoksin-konjugat for eksempel 2 (70 ug pr. ml) ble tilsatt og blandingen inkubert i 15 minutter hvoretter 100 pl dihydrofolat-reduktaseløsningen ble tilsatt. Dihydrofolatreduktase-fremstillingen som ble anvendt ble isolert fra kylling-lever ved metoden til Kaufman, B.T., & Gardiner, R.C., Journal of Biological Chemistry, Vol. 211, P 1319 (1966). Blandingen ble inkubert ytterligere 3 minutter og enzymaktiviteten bestemt ved tilsetning av 100 pl dihydrofolat-

løsning og målt ved 340 nm i et variant spektrofotometer. Resultatene er vist i tabellen.

Reaktantene ble tilsatt i den ovenfor beskrevne rekkefølge. OD = optisk densitet.

Det fremgår av de ovenstående resultater at noen få ng-digoksin i serum kan bestemmes i det beskrevne systemet.

EKSEMPEL 4

Fremstilling av metotreksat- human serum- albuminkonjugat

45 mg metotreksat ble opnlrtst i 1,0 ml N,N-dimetylformamid og 2 5 mg N-hydreksysuccinimid ble tilsatt. 41 mg N,N-dicykloheksyl-ka.rbodiimid ble oppløst og blandingen holdt ved romtemperatur i 13 timer. Det uløselige urea-bi<p>roduktet ble fjernet ved filtrering og 100 pl av filtratet ble satt til en løsning som inneholdt 5 mg humant serum albumin i 800 ul 0,IM natriumfosf at^ uffer oH 7,5 pluss 100 ul dioksan. Denne reaksjonsblandingen ble holdt ved romtemperatur i 3 0 minutter og så satt nå en Sephadex G-25-kolonne som var ekvilibrert med 0,IM natriumfosfat-fcuffer pH 7,5. Kolonnen ble utviklet med denne bufferen og to elueringstODper som inneholdt metotreksat erholdtes hvorav den første inneholdt metotreksat-humant serumalbumin-konjugat.

EKSEMPEL 5

Engyminhibitor- immunomåling for human serumalbumin

100 ul fortynnet serum ble inkubert ved 30°C i 15 minutter med 100 ul antihuman serumalbumin-antistoff (kanin)-oppløs-ning, 100 ul NADPH-oppløsning, 100 ul 2-merkaptoetanol-oppløsning og 550 ul natriumfosfat- buffer pH 7,5. 100 ul metotreksathuman serumalbumin-konjugat (8 pg pr. ml) ble tilsatt og blandingen inkubert i 15 minutter hvoretter 100 pl dihydrofolat-reduktase-oppløsning ble tilsatt. Blandingen ble inkubert i ytterligere 3 minutter og enzymaktiviteten bestemt ved tilsetning av 100 pl dihydrofolat-oppløsning og målt ved 340 nm på et variant spektrofotometer. Resultatene er vist i tabell II.

Det fremgår av de ovenstående resultater at noen få pg human serumalbumin kan bestemmes i det beskrevne systemet.

EKSEMPEL 6

Syntese av metotreksat-aminoetylmorfin-konjugat

a) Syntese av O^-arainoetylmorfin

I 10 ml tetrahydrof uran (THF) nettoop destillert over

litiumaluminiumhydrid (LAH) ble 400 mg LAH oppslemmet under nitrogen. En løsning av 400 mg morfin og 400 mg kloraceto-nitril i 4 ml friskt destillert THF ble tilsatt i løpet av 5 minutter etterfulgt av tilbakeløpskoking•i 1 time. Blandingen fikk kjøles og 0,6 ml vann ble tilsatt etterfulgt av 0,6 ml 10 vekt-% natriumhydroksyd og 2 ml vann. Etter filtrering av blandingen ble saltene vasket med THE, THF-fraksjonene slått sammen, tørket over magnesiumsulfat under nitrogen, filtrert og filtratet inndampet hvilket ga 380 mg O^-aminoetylmorfin. b) Syntese av N-t-butoksykarboksyl-y-(0 3-aminoetylmorfin) glutaminsyre-tx-benzylester.

En blanding av 0 3-aminoetylmorfin (50 mg fremstilt som ovenfor), N-t-BOC-glutaminsyre-a-benzyl-ester (34 mg) og dicykloheksylkarbodimid (25 mg) i diklormetan (5 ml) ble rørt 4 timer ved romtemperatur. Blandingen ble fortynnet med etylacetat og vasket med fortynnet natriumkarbonatløs-ning. Etylacetatløsningen ble så ekstrahert to ganger med 0,1 N saltsyre og de kombinerte sure ekstraktene ble behandlet med tilstrekkelig 10 vekt-% natriumhydroksyd-løsning til å justere pH til 8,0. Løsningen ble ekstrahert to ganger med etylacetat og det kombinerte etylacetatet ble vasket med koksaltløsning, tørket (trtrt natriumfosfat) og inndamnet til det ga en farcreløs olje (36 mg) . c) Syntese av glutaminsyre-a-(0 3-amidoetylmorfin)-a-benzyl-ester-trifluoreddiksyresalt.

En løsning av N-t-BO'--glutaminsyre-morfinderivat (36 mg, fremstilt som ovenfor) i diklormetan (3 ml) ble rørt ved

<*>BOC = butyloksykarbonyl

romtemperatur og trifluoreddiksyre (1 ml) ble tilsatt. Blandingen ble rørt 15 minutter og så inndampet til tørr-het. Resten var et fargeløst glass (40 mg). d) Syntese av metotreksat-y-(O^-aminoetylmorfin)-a-benzyl-ester.

En løsning av 4-amino-4-deoksy-N"'"0-metylpteronsyre (37 mg) i 3 ml dimetylsulfoksyd (DMSO) ble under røring ved romtemperatur behandlet med trietylamin (28 pl) og i-butylklorformat (25 pl) og blandingen ble rørt 30 minutter. Den ble så satt til en blanding av morfinderivatet (75 mg fremstilt som beskrevet under c) og trietylamin (28 pl) i DMSO (2 ml) og blandingen ble rørt ved 6 0° i en time. Den av-kjølte blandingen ble fortynnet med vann og ekstrahert to ganger med etylacetat. De kombinerte etylacetat-ekstrakter ble vasket med vann og så ekstrahert to ganger med 0,1N saltsyre. De samlede sure ekstraktene ble behandlet med tilstrekkelig 10 vekt-% natriumhydroksyd til å heve pH til 8,0. Blandingen ble ekstrahert tre ganger med etylacetat og de samlede ekstraktene vasket med koksaltløsning, tørket (tørt natriumsulfat) og inndamnet hvilket ga en gul olje (15 mg). Denne ble renset ved preparativ tynnskiktskroma-tografi (TLC) på kiselgel med systemet kloroform/metanol, 4:1. Den ønskede forbindelsen erholdtes som et gult fast s~toff (4 mg) . e) Syntese av metotreksat-y-(O 3-amidoetylmorfin).

Produktet fremstilt som beskrevet id (4 mg) ble blandet

med 0,IN natriumhydroksyd-løsning (5 ml) og blandingen ble rørt ved romtemperatur i 8 timer hvilket resulterte i en klar gul løsning.

Denne ble tilsatt 0,IN saltsyre (5 ml) og blandingen fylt opp til 25 ml med natriumorthofosfat-buffer (0,05 M, pH 7,4) hvilket ga en løsning av den ønskede forbindelse som var egnet for bruk i enzymmålingen.

EKSEMPEL 7

Enzyminhibitor-immunomåling for morfin

En blanding av 10 ul morfinløsning i passende konsentrasjon, 50 ul metotreksat-y-(0 3-amidoetylmorfin)-løsning (4 ng/ 25 ml), 50 ul antimorfin-antistoffløsning, 10 ul NADPH-løsning,

10 ul 2-merkaptoetanol-løsning, 50 ul kaliumklorid-løsning, 150 ul tris-HCl-buffer-løsning (pK 7,5) inneholdende EDTA og 10 ul dihydrofolatreduktase (E.casei) løsning ble inkubert 20 minutter ved 37°. Enzymaktiviteten i blandingen ble bestemt etter tilsetningen av 10 pl dihydrofolat-løsning ved måling av forandringen i ekstinksjon av løsningen ved 340 nm ved bruk av en "Centrifichem" sentrifugalanalyse. Resultatene er vist i tabell III

Den ovenstående tabell viser at med økende konsentrasjon av morfin avtar aktiviteten til dihydrofolat-reduktase. Slike løsninger av morfin som inneholder fra 4 pg nr. ml til 4 mg pr. ml morfin kunne bestemmes selv hvor bare 10 pl løsning var tilgjengelig. Dette betyr imidlertid ikke at dette er det krevede området, men snarere at den kan anvendes med hell.

EKSEMPEL 8

Syntese av ferritin-metotreksat-konjugat.

En løsning av humant leverferritin (1,3 mg) i natriumfosfat buffer (0,05 M, pH 8,0, 5 ml) og 1 ml dimetylformamid (DMF) ble rørt ved romtemperatur og 100 pl av en løsning oppnådd ved å behandle metotreksat (23 mg) i DMF (2 ml)

med trietylamin (21 pl) og i-butylklorformat (15 pl) ved romtemperatur i 30 minutter ble tilsatt. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 2 timer og så dialysert mot 2x2 liter natriumorthofosfat-buffer (0,05 M, pH 7,4 inneholdende natriumklorid 0,IM og natriumazid 0,05 vekt-%) i 24 timer. Løsningen ble så sendt gjennom en kolonne av Sephadex G-25 innstilt med den samme buffer og de ferritinholdige fraksjoner slått sammen og fylt opp til 10 ml med buffer.

Den resulterende løsning er egnet for bruk i en enzyminnumo-måling for bestemmelsen av ferritin.

Claims (1)

1. Reagens for bestemmelse av et immunologisk aktivt materiale bestående av en reseptor, som binder det immunologisk aktive materiale, et enzym, et enzymsubstrat og det immunologisk aktive materiale som er merket med en forbindelse som er i stand til å modifisere aktiviteten i enzymet,

   karakterisert ved at det merkede immunologiske materiale er et antigen-enzyminhibitor- eller antigen-enzymaktivator-kompleks.