DE2811257A1

DE2811257A1 - Immunologische bestimmung

Info

Publication number: DE2811257A1
Application number: DE19782811257
Authority: DE
Inventors: Douglas E Hawley; Peter G Tonkes
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1977-03-15
Filing date: 1978-03-15
Publication date: 1978-09-21
Also published as: CA1102789A; NO154814B; ES467831A1; FR2384262A1; AT367203B; NO152955B; ATA182178A; CH641570A5; NO844764L; JPS53115814A; AU519326B2; NL7802845A; FR2384262B1; SE447026B; IT7821256A0; DK152313B; DK152313C; NO780902L; AU3396578A; BE864856A

Description

Immunologische Bestimmung

Die Erfindung bezieht sich auf neue Reagentien zur Bestimmung immunologisch aktiver Materialien, auf Verfahren zu ihrer Hersteilung und auf ihre Verwendung zur Bestimmung in immunologischen Verfahren.

In den letzten Jahren sind zahlreiche analytische Systeme auf der. Grundlage konkurrierender ProteinMndungsanalyse (auch als Sättigungsanalyse bezeichnet) entwickelt worden.

Die Begriffe "Sättigungsanalyse" und " konkurrierende Proteinbindungsanalyse", die gleichbedeutend sind, beziehen sich auf analytische Systeme, die zur Bestimmung immunologisch aktiver Materialien (Liganden) verwendet werden. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen in biologischen Flüssigkeiten werden in der medizinischen und veterinärmedizinischen Diagnose angewandt. Die Diagnose hängt davon ab, ob der Gehalt der bestimmten Substanz normal oder pathologisch ist. Das analytische Prinzip beruht z.B. auf der Konkurrenz zwischen einem Liganden und einem markierten Liganden

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für ein übliches spezifisches bindendes Mittel (Rezeptor), wie durch die folgende Gleichung veranschaulicht:

Markierung
Ligand + Ligand + Rezeptor —»

Markierung Markierung Ligand + Ligand + Ligand + Ligand Gleichung 1

Rezeptor Rezeptor

(D (2) (3) (4)

Die Primärreaktion ist eine Kombination eines Ligandenmoleküls mit einem Rezeptormclekül unter Bildung eines "bimolekularen Ligand/Rezeptor-Komplexes (1). Eine Sekundärreaktion wird durch Addition eines markierten Liganden verursacht, der ähnlich mit Rezeptor unter Bildung eines markierten Liganden/Rezeptor-Komplexes (2) kombiniert. Bei der Sättigungsanalyse sind die Konzentrationen des Rezeptors und des markierten Liganden konstant. Die Rezeptorkonzentration ist so begrenzt, daß der markierte Ligand relativ zum Rezeptor im Überschuß vorliegt. Unter diesen Bedingungen löst die Addition des Liganden eine Konkurrenz zwischen Ligand und markiertem Ligand bei der Bindung an den Rezeptor aus. Polglich setzt eine Erhöhung der Liganderikonzentration die Menge an markiertem Ligand/Rezeptor-Komplex herab. Das Testprinzip beruht auf der Bestimmung des Prozentsatzes des gesamten markierten, an den Rezeptor gebundenen Liganden. Dieser Prozentsatz ist umgekehrt proportional der Menge an dem Reakti ons gemisch von der zu messenden Probe oder von dem beim Test verwendeten Standard zugesetzten Liganden. Die Abnahme der Konzentration.des markierten Ligand/Rezeptor-Komplexes oder die Zunahme der Konzentration des markierten Liganden im Reaktionsgemisch kann zur Bestimmung der Ligandenkonzentration verwendet werden.

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Die Empfindlichkeit der Sättigungsanalyse hängt von der Verwendung eines Rezeptors ab, der eine sehr hohe Affinität zum Liganden und zum markierten Liganden aufweist. Zum anderen nängt die Empfindlichkeit auch von der Verwendung einer Markierung at, die bei sehr geringer Konzentration nachweisbar ist.

Die Spezifität der Sättigungsanalyse hängt von dem Vermögen des Rezeptors ab, ausschließlich den Liganden und den markierten Liganden in einem komplexen Gemisch verschiedener Moleküle zu binden.

Die Sättigungsanalyse ist unter Anwendung zahlreicher unterschiedlicher Techniken eingesetzt worden, wobei die Unterschiede in erster Linie mit der Art der verwendeten Markierung zusammenhängen. Im allgemeinen werden diese Techniken durch die breiten Bezeichnungen "Radioaktivtest¹¹ oder "ITieht-Radioaktivtest" eingeteilt, in Abhängigkeit davon, ob ein radioaktiver Tracer als Markierung verwendet wird oder nicht.

Der Radioaktivtest ist in größerem Umfang angewandt worden als Uicht-Radioaktivtests. Der Radioaktivtest kann weiter als Radioimmuntest oder Radiorezeptortest unterteilt werden, je nach der Art des bei dem Test verwendeten Rezeptors. Beim Radioimmuntest wird ein Antikörper verwendet, der den Liganden und den markierten Liganden spezifisch bindet. Andererseits bezieht sich die Radiorezeptoranalyse auf die Verwendung irgendeines anderen Typs eines biologischen Rezeptors, der den Liganden und den markierten Liganden ähnlich spezifisch bindet.

Bei allen radioaktiven Testtechniken ist es wesentlich, die gebundene Fraktion (1 und 2 in Gleichung 1) von der ungebundenen Fraktion (3 und 4 der Gleichung 1) des Reaktionsgemische physikalisch zu trennen. Ein Index der Ligandenkonzentration kann dann durch Auszählen dieser

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Fraktionen in einem Radioaktiv!tätszähler und durch Vergleich der für unbekannte Proben erhaltenen Zählwerte mit solchen, wie sie für geeignete, dem gleichen Test unterworfene Standard-Ligandenproben erhalten wurden, erhalten werden. Zahlreiche verschiedene und auseinanderstrebende Methoden sind für die Trennung der gebundenen und freien Anteile des Radioaktivtest-Reaktionsgemischs beschrieben worden, wobei Techniken wie z.B. Gelfiltration, Absorption und Ionenaustauschchromatographie, fraktionierte Fällung, Peststoff phase oder Elektrophorese, eingesetzt wurden.

Nach der Entwicklung von Radioaktivtesttechniken bei der Sättigungsanalyse wurden Methoden entwickelt, die nichtradioaktive Markierungen anwenden. Verfahren unter Einsatz von Enzymen als Markierung sind aufgezeigt worden. Diese Verfahren können den Vorteil haben, daß physikalische Trennung der gebundenen (1 +2) und freien (3+4) Fraktionen oder Anteile des markierten Liganden beim Testablauf nicht notwendig ist.

Wenn ein Antikörper einen mit einem Enzym markierten Liganden bindet, wird die Aktivität des Enzyms verändert. Der G-rad oder das Ausmaß der Veränderung der Enzymaktivität ist ein Anzeichen für die Konzentration des markierten Liganden in der gebundenen Fraktion und liefert folglich einen Konzentrationsindex des Liganden im Reaktionsgemisch.

Die chemische Struktur des Ligand/Enzym-Komplexes ist extrem schwer zu ermitteln, und dies ist ein Hauptnachteil des Enzymimmuntests. Dies beruht zweifellos auf der großen Vielfalt der Aminosäureseitenketten, die auf der Enzjnnoberfläche zur Komplexbildung mit dem Liganden zur Verfügung stehen. Dies führt zu großen Schwierigkeiten beim Reproduzieren des Ligand/Enzyms bei verschiedenen Herstellungen des Komplexes. Das allgemeine Fehlen der

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Steuerung der Komplexierungsreaktion führt zur Bindung vieler Ligandenmoleküle an ein einziges Enzymmolekül, obgleich es leicht sein kann, daß die Bindung nur einiger weniger dieser Ligandenmoleküle durch Antikörper an der Hemmung der Enzymaktivität beteiligt ist. Daher führen nicht alle Antikörper/markierte Antigen-Wechselwirkungen zu einer Veränderung der Enzymaktivität, wodurch die Empfindlichkeit dieser Technik gemindert wird.

Protein/Protein-Wechselwirkung zwischen verschiedenen Antikörpermolekülen und Antikörper- und Enzymmolekülen ist eine weitere Folge der Vielfalt der Ligandenmoleküle an der Enzymoberfläche. Protein/Protein-Wechselwirkung nimmt ferner zu, wenn der ligand ebenfalls ein Polypeptid ist. Somit induziert das Enzymmolekül eine örtlich begrenzte Mikroumgebung hoher Proteinkonzentration. In solchen Situationen wurde gezeigt, daß Proteinausfällung eintritt, wodurch der Verlust eines der Hauptvorteile"" des Enzymimmuntests verursacht wird, indem nämlich die Trennung von antikörpergebundenen und freien Fraktionen notwendig wird.

Es wurde eine Abwandlung des Enzymimmuntests beschrieben, die diese Probleme teilweise überwindet, indem nämlich der Idgand mit einem Detektormolekül niedrigen Molekulargewichts markiert wird. Bei diesem Test hindert die Antikörperbindung des markierten Iiganden sterisch die Bindung eines Detektormoleküls durch einen anderen, für das Detektormolekül spezifischen Antikörper. Das Ausmaß der Hinderung wird durch die Konkurrenz um die Bindung des freien Liganden/Detektor-Moleküls und des mit dem Detektormolekül markierten Enzyms mit Detektormolekül-Ahtikörper bestimmt. Der Grad der Veränderung der Enzymaktivität, wie er beim normalen Enzymimmuntest bestimmt wird, gibt einen Hinweis auf die Konzentration an freiem Ligand/Detektor-Molekül, was wiederum auf die Konzentration des Liganden im Reaktionsgemisch hinweist.

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Der Vorteil dieser Technik liegt darin, daß ein kleines Molekül anstelle eines Enzyms an den Liganden gebunden ist, was es zuläßt, die chemische Struktur des markierten Liganden zu bestimmen und damit viele der früher beschriebenen Nachteile des Enzymimmuntests zu überwinden. Dieses System überwindet jedoch nur die Nachteile der primären Bindungsreaktion, an der der Ligand und der markierte Ligand beteiligt sind, und überträgt sie auf das Detektorsystem zur Bestimmung des Ausmaßes der antikörpergebundenen und antikörperfreien Anteile des markierten Liganden.

Die Nachteile der Verfahren nach· dem Stand der Technik werden durch die Erfindung überwunden, wonach als Markierung eine Enzymmodifizierung verwendet wird»

Im einzelnen bezieht sich die Erfindung auf ein Reagens zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials, das das immunologisch aktive Material oder einen Rezeptor, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, markiert mit einer Substanz, die den Grad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag, aufweist.

Yfeiter bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials in einer Probe, wobei die Probe mit einem Rezeptor, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, dem mit einer Substanz, das die Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag, markierten immunologisch aktiven Material, einem Enzym und einem Enzymsubstrat zusammengebracht wird, und wobei der Grad oder die Art der anfallenden Enzymaktivität gemessen und mit der mit einem Standard erhaltenen verglichen wird·

Ferner bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials in einer Probe, wobei die Probe mit einem Rezeptor, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, und mit

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einer Substanz, die die Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag, markiert ist, mit dem immunologisch aktiven Material in unl&slich gemachter Form und mit einem Enzym und einem Enzymsubstrat zusammengebracht wird und wobei der Grad oder die Art der Enzymaktivität nach der Abtrennung der Feststoff phase gemessen und mit der mit einem Standard erhaltenen verglichen wird.

Die Begriffe "immunologisch aktives Material" oder "Ligand" in dieser Beschreibung beziehen sich auf irgendeine immunologisch aktive Substanz oder einen Teil von dieser, die bzw. der immunologisch bestimmbar ist* z.B. durch Anwendung der Techniken der Sättigungsanalyse. Yfesentliches Erfordernis ist, daß ein Rezeptor vorliegt, der den Liganden spezifisch bindet. Ist der Rezeptor ein Antikörper, so ist der Ligand ein Hapten oder Antigen, so daß ein spezifischer Antikörper entstehen kann. Ein Ligand wird als Hapten bezeichnet, wenn er Antikörperbildung nur bei Bindung an eine" Verbindung mit Antigeneigenschaften hervorruft. Andererseits wird ein Ligand als Antigen bezeichnet, wenn er Antikörperbildung ohne chemische Abwandlung zeigt. Der Ligand kann im Molekulargewicht stark variieren, von etwa 100 bis 1 000 000. Dieser Molekulargewichtsbereich setzt beim Test keine Grenzen, vorausgesetzt, es steht ein Rezeptor zur Verfugung, der den Liganden spezifisch bindet.

Der Ligand kann strukturell entweder polymer oder nicht-polymer sein. Ist er polymer, wird er gewöhnlich biologischen Ursprungs sein und als Nucleinsäurepolysaccharid und/oder -polypeptid zu klassifizieren sein. Ist der Ligand andererseits nicht-polymer, hat er im allgemeinen ein Molekulargewicht von weniger als 2 000 und kann zahlreiche Strukturen, Funktionalitäten und physiologische Eigenschaften aufweisen.

Besonders wichtige erfindungsgemäß verwendbare Liganden sind Amine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipoproteine,

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Glycoproteine, Sterine, Steroide, Lipoide, nucleinsäuren, Mono- und Polysaccharide, Alkaloide, Vitamine, Drogen, Narkotika, Antibiotika, Stoffwechselprodukte, Pesticide, Toxine, Industrieverunreinigungen, Geschmacks- und Aromamittel, Hormone, Enzyme, Coenzyme, zelluläre oder extrazelluläre Gewebekomponenten und aus Menschen oder Tieren isolierte Antikörper. Der Test ist jedoch nicht auf nur diese Liganden beschränkt.

Komponenten mit unmittelbarer Möglichkeit zur Analyse mit dem System sind Hepatitis B-Oberflächen-Antigen, Ferritin, Tumor-Antigene, wie CEA, c^-Fetoprotein, Rheumatoid-Faktor, C-reaktive Proteine, Immunoglobulin-Klassen IgG, IgM oder IgA, Myoglobin, Thyroidhormone einschließlich T~ und T., Insulin, Steroidhormone, einschließli-ch Testosteron oder Östradiol, mißbrauchsgefährdete Arzneimittel, wie narkotisierende Analgetika, wie Morphin, Barbiturate, Stimulantien, wie Amphetamin, Arzneimittel zur Behandlung von Epilepsie, einschließlich Diphenylhydantoin und Phenobarbital, Herzglykozyten, wie Digoxin, Vitamine, wie Vitamin B₁₂ und Folsäure. Weiter sind Antikörper, die der Analyse mit dem System unmittelbar zugänglich sind, solche, die mit einer Infektion durch Syphilis, Gonorrhöe, Brucellose, Rubella und Rheumatismus verbunden sind.

Der Begriff "markiertes immunologisch aktives Material" oder "markierter Rezeptor" in der vorliegenden Beschreibung bezieht sich auf einen Liganden, ein Analogon eines Liganden oder dessen Teil oder einen Rezeptor, der mit einem Enzymabwandler markiert ist. Ein, mehr als ein und im allgemeinen weniger als 100 Markierungsmolekülfe)können an einem Liganden oder einem Rezeptormolekül befestigt sein. Ähnlich können ein, mehr als ein und gewöhnlich weniger als 5 Liganden- oder Rezeptor-Molekül(e) an einem Markierungsmolekül befestigt sein. Die Verknüpfung gesonder-

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ter Markierungsmoleküle mit einem Liganden- oder Rezeptor-Molekül erhöht im allgemeinen die Empfindlichkeit des Tests, vorausgesetzt, die Sondermarkierungen beeinträchtigen nicht die Bindung.

Die Verknüpfung eines modifizierenden Moleküls mit einem Liganden- oder Rezeptor-Molekül beinhaltet die Ausbildung intermolekularer Bindungen, die meist, aber nicht notwendigerweise, von covalenter Natur sind. Die Verknüpfung kann zuweilen in Gegenwart eines Kupplungsmittels durch Einschub einer verbindenden Gruppe zwischen der Markierung und dem Liganden oder dem Rezeptor erfolgen.

Das modifizierende Molekül kann direkt an den Liganden oder das Rezeptor-Molekül gebunden werden. Es kann jedoch wünschenswert sein, chemische Brücken unterschiedlicher Länge zwischen dem modifizierenden Molekül und den Liganden- oder Rezeptor-Molekülen einzubauen, in Abhängigkeit von dem jeweils speziell ins Auge gefaßten Test. Manchmal kann es sogar vorteilhaft sein, das modifizierende Molekül und die Liganden- oder Rezeptor-Moleküle getrennt an dasselbe Trägermolekül zu binden, z.B. ein Makromolekül, wie ein PoIypeptid oder ein Polysaceharid.

Der hier gebrauchte Ausdruck "Rezeptor" bezieht sich auf jede Substanz, die einen Liganden oder einen markierten Liganden oder einen Teil hiervon spezifisch zu binden vermag. Im allgemeinen ist der beim Test verwendete Rezeptor ein spezifischer Antikörper zu dem im Blut von Vertebraten nach Injektion eines geeigneten Haptens oder Antigens gebildeten Liganden. Andererseits können bei dem Test auch natürlich vorkommende Rezeptoren eingesetzt werden. Diese letztere Gruppe umfaßt, ohne hierauf zu beschränken, Proteine, Hucleinsäurenund Zellmembranen. Solche Rezeptoren wurden bei Radioaktivtest-Techniken für Thyroxin, Insulin, Angiotensin und verschiedene Steroidhormone verwendet.

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Für den Pall, daß der ügand ein Antikörper ist, kann der Rezeptor das zum Induzieren des Antikörpers in einem Wirtstier verwendete Antigen sein. Bei einer anderen Ausführungsform kann der Rezeptor ein Antikörper gegen den zu bestimmenden Antikörper sein.

Es ist unmöglich, mit Gewißheit die Art der Rezeptorwirkung zu bestimmen, die bei Bindung des markierten Liganden die Wechselwirkung zwischen Enzym und modifizierendem Molekül herabsetzt. Die plausibelste Erklärung ist die, daß die Affinität des Enzyms für das modifizierende Molekül als Folge einer Änderung in Größe und ladung des Komplexes Rezeptor/ Ligandenabwandler im Vergleich zum Ligandenabwandler alleine herabgesetzt ist.

Der Begriff "modifizierende Substanz", oder "Abwandler" in der vorliegenden Beschreibung bezieht sich auf Jede Substanz, die mit einem Enzym so in Wechselwirkung zu treten vermag, daß das Ausmaß bzw. der Grad oder die Art der Enzymaktivität modifiziert oder abgewandelt wird. Diese Modifizierung kann zu einer Hemmung, Aktivierung oder einer Veränderung der Spezifität oder irgendeiner anderen Eigenschaft des Enzyms führen, das entweder direkt oder indirekt durch eine Änderung der Enzymaktivität oder in der Art der Aktivität nachweisbar ist, z.B. einer Änderung der Reaktionsbedingungen wie Cofaktor-Anforderungen oder pH-Optimum, der kinetischen Eigenschaften oder der Aktivierungsenergie. Die modifizierende Substanz kann in der Größe zwischen einem kleinen Molekül und einem Makromolekül liegen, und ihre Wechselwirkung mit einem Enzymmolekül kann entweder reversibel oder irreversibel sein, in Abhängigkeit davon, ob die intermolekulare Assoziation ionisch oder von covalenter Natur ist.

Die Empfindlichkeit des Tests hängt u.a. ab von der Affinität des Rezeptors für den Liganden und der Fähigkeit der modifizierenden Substanz, eine Änderung im Grad oder der Art

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der Enzymaktivität hervorzurufen. Vorzugsweise erfolgt eine Modifizierung des Ausmaßes oder der Art der Enzymaktivität mit einer Minimalkonzentration an modifizierender Substanz. Je näher diese Konzentration bei der des Enzyms auf molekularer Basis liegt, um so größer ist die Empfindlichkeit des Tests.

Vorzugsweise ist die modifizierende Substanz ein Enzymhemmstoff, der bei Wechselwirkung mit einem Enzym dessen Aktivität hemmt. Die Wirkungsweise des Hemmstoffs kann kompetitiv, nicht-kompetitiv, unkompetitiv und/oder allosterisch sein. Vorzugsweise sollte der Hemmstoff oder Inhibitor eine Hemmkonstante (Hemmstoffkonzentration, die für 50 %ige Hemmung des Enzymsystems notwendig ist) unter 10""^ Mol/l, je nach dem durchgeführten Test, haben. Insbesondere bevorzugt liegt die Hemmkonstante zwischen 10 ^ und 10 .

Bei dem Test kann jedes Enzym verwendet werden, vorausgesetzt, es gibt ein modifizierendes Mittel, das die Enzymaktivität in der oben beschriebenen Weise spezifisch modifiziert. Enzyme der Wahl sind stabil, leicht mit geringen Kosten erhältlich und haben eine hohe Wechselzahl und ein einfach durchgeführtes Testsystem. Vorzugsweise liegt die Wechselzahl (pro Enzymmolekül in 1 min gebildete Produktmoleküle) über 100, je nach dem speziell durchgeführten Test. Insbesondere bevorzugt liegt die Wechselzahl so hoch wie möglich und wenigstens bei 200.

Enzymmodifizierende Systeme, die erfindungsgemäß besonders brauchbar sind, sind Dihydrofolat-Reduktase/Methotrexat, Dihydrofolat-Reduktase/4-Aminopterin, Dihydrofolat-Reduktase/andere spezifische Inhibitoren dieses Enzyms, ß-GlucuronidaseA-Desoxy-S-amino-zuckersäure und deren Derivate, biotinhaltige Enzyme/Avidin, wie Carboxylase/Avidin, Chymotrypsin/TPCK CH₀-Ph

CH₅ —(( J^-SO₂-HH-C-C-CH₂Cl

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y-Cystathionase/Propargylglycin, Alanin-Racemase/Trifluoralanin, Tryptophanase/Trifluoralanin, Tryptophan Synthetase/Trifluoralanin, ß-Cystathionase/Trifluoralanin, Pyruvat-Glutamat-Transaminase/Trifluoralanin, Milchsäure-0xidase/2-Hydroxy-3-t>utinsäure, Monoamin-Oxidase/N,N-Dimethyl-propargyl-ainin und Diamin-Oxida-

Die Bestimmung der Enzymaktivität kann durch direkte oder indirekte Aufzeichnung des Substratverbrauchs oder der Produktbildung bei geeignetem pH und geeigneter Temperatur unter Anwendung von Nachweissystemen wie der Kolorimetrie, Spektropho tome trie, Pluoreszenz-Spektrophotometrie, Gaseometrie, Thermometrie (Wärmetönung), Szintillationszählung, erfolgen.

Um die Empfindlichkeit des Systems zu steigern, können Biolumineszenz- und Enzymzyklus-Techniken angewandt werden, z.B. die Techniken, wie sie beschrieben wurden von J. Lee et al. in Liquid Scintillation Counting: Recent Developments, Stanley P.E. und Scoggins, B.A., Academic Press, New York p. 403 und Lowry O.H. et al. in J. Biol. Chem. 236, S. 2746-2755.

Bei einer Ausführungsform der Erfindung kann ein markierter Ligand zur Bestimmung der Anwesenheit eines Liganden in einer unbekannten Probe durch gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Zugabe des markierten Liganden und der unbekannten Probe zu einem wässrigen Medium bei geeignetem pH und mit einem Gehalt an für den Liganden und den markierten Liganden spezifischem Rezeptor verwendet werden. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird die Verteilung des an den Liganden und den markierten Liganden gebundenen Rezeptors durch Zusatz von Enzym und Substraten bestimmt. Der Rezep-

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tor, der für den Liganden spezifisch ist, bindet auch den markierten Liganden und setzt damit die Wechselwirkung zwischen dem modifizierenden Mittel und dem Enzym herab und vermindert 30 die Abwandlung der Enzymaktivität. Der Zusatz des liganden bei dem Test führt zur Konkurrenz mit dem markierten Liganden bei der Bindung an den Rezeptor und setzt dadurch die Konzentration an freiem Liganden in der Probe herab. Die Wechselwirkung zwischen Ligand/modifizierendem Mittel und Enzym nimmt zu und die Enzymaktivität wird wiederum beeinträchtigt. Die" Veränderung der Enzymaktivität ist daher eine Funktion der Ligandenkonzentration in der Probe und wird durch ungebundenen markierten Liganden verursacht. Folglich ist der Unterschied zwischen der erhaltenen Enzymaktivität und der in Abwesenheit des Liganden erhaltenen Aktivität ein Hinweis auf die Konzentration des Liganden in der unbekannten Probe.

Einer der Hauptvorteile dieses Verfahrens liegt darin, daß eine Trennung gebundener und freier Anteile bei der Arbeitsweise unnötig ist. Dies schließt jedoch die Anwendung einer solchen Trennstufe bei dem Test nach der Inkubation von Ligand und markiertem Ligand mit dem Rezeptor und vor der Abschätzung der Enzymaktivität nicht aus. Eine Trennung der Anteile oder Fraktionen kann zuweilen wünschenswert sein, um Substanzen in der Probe zu entfernen, die den Enzymtest stören können. Die Trennung kann unter Anwendung irgendeiner der vielen für den Radioimmuntest beschriebenen Techniken, einschließlich Gelfiltration, Adsorption und Ionenaustauscher omat ographi e, fraktionierter Fällung, fester Phase und Elektrophorese, durchgeführt werden. Dieser Test ist natürlich nicht auf die Bestimmung von Haptenen und Antigenen als Ligand beschränkt, sondern kann auch zur Identifizierung und Messung von Antikörpern als Ligand angepaßt werden.

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Dies kann z.B. durch Markieren des Antikörpers mit einem Enzym modifizierenden Mittel und Messen des Grades der Veränderung der Enzymaktivität nach Inkubation des markierten Antikörpers und des Antikörpers der Probe mit einer begrenzten Konzentration an Antigen oder Hapten geschehen. Die Abwandlung oder Veränderung der Enzymaktivität hängt mit der Konzentration des Antikörpers der Probe zusammen. Wenn nötig, können die gebundenen und freien Anteile vor Zugabe des Enzyms und des Substrats getrennt werden.

Die Erfindung ermöglicht auch zur Bestimmung eines Liganden die Verwendung eines markierten Rezeptors anstelle eines markierten Liganden. Ein Ligand in der* unbekannten Probe reagiert mit überschüssigem Rezeptor, der mit einem enzymmodifizierenden Mittel markiert ist, und nach der Inkubation wird überschüssiger unlöslich gemachter Festphasenligand zugesetzt und reagiert mit dem übrigen freien markierten Rezeptor. Nach Abtrennung der festen Phase wird die Veränderung der Enzymaktivität, die mit dem löslichen Liganden verbunden ist, gemessen und auf die Ligandenkonzentration bezogen.

Die erfindungsgemäßen Reagentien können auch in einer "Sandwichⁿ-Technik verwendet werden, vorausgesetzt, der Ligand besitzt wenigstens zwei Verknüpfungsstellen. Der Ligand reagiert mit überschüssigem Festphasen-Rezeptor, und nach der Inkubation mit anschließendem Waschen wird der Pestphasen-Rezept or /Ligand mit überschüssigem Rezeptor, der mit einem enzymmodifizierenden Mittel markiert ist, umgesetzt. Freier markierter Rezeptor wird durch Waschen entfernt, und das Ausmaß der Enzymabwandlung in den abgetrennten Fraktionen wird bestimmt. Dies ergibt dann einen Index der Ligandenkonz entrati on.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

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Beispiel 1 ^ Herstellung von "Amino-digoxin"

Zu einer Suspension von 156 mg (0,2 mMol) Digoxin in 5 ml absolutem Äthanol vnirden 10 ml 0,2 m Natriumine taper j odat unter Rühren gegeben. Das Gemisch wurde nach 10 min homogen, und dann bildete sich langsam ein Niederschlag. Nach 2 h wurden 5 ml Wasser und 5 ml Äthanol zugesetzt. 122 μΐ (2,2 mMol) Äthylenglykol wurden nach weiteren 30 min zugesetzt, und ein dichter weißer Niederschlag begann sich sofort zu bilden. Nach 80 min Rühren wurden 133 ul (2,0 mMol) Äthylendiamin zugesetzt, und der sich ergebende pH von 11,0 wurde auf 9,5 mit 0,1 m HCl eingestellt, und das Reaktionsgemisch konnte 18 h bei Raumtemperatur stehen. Der pH veränderte sich während dieser Zeit nicht.

151,4 mg (4,0 mMol) Natriumborhydrid wurden dann zugegeben, und das Gemisch wurde 3,5 h gerührt. Der pH. wurde dann von 10,5 auf 6,5 mit 1 m Ameisensäure (etwa 3 ml) eingestellt, und ein Dünns chi cht ehromat ogramm dieses Gemischs zeigte einen einzigen Hauptfleck mit einem Rf-Wert von 0,15 (Kieselgel auf Aluminium, entwickelt in Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1). Digoxin hatte einen Rf-Wert von 0,7 bei Entwicklung im gleichen System.

Die lösungsmittel wurden unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer mit einem Wasserbad bei 60 nahezu bis zur Trockne abgedampft. Die letzten wenigen ml Wasser wurden durch Zugabe von 95 %igem Äthanol (3 x 20 ml) und Wiederholen des vorstehenden Abdampfens entfernt.

Der anfallende blaßgelbe Peststoff wurde dreimal mit absolutem Äthanol extrahiert, und diese vereinigten Extrakte wurden auf etwa 4 ml aufkonzentriert und zentrifugiert, um eine kleine Menge Salz abzutrennen, die verworfen wurde. Die blaßgelbe überstehende Lösung wurde unter einem Strom trocknen Stickstoffs bis zur Trockne eingedampft, um ein

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gelbes Öl zu erhalten, das den gleichen Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie wie das oben beschriebene Reaktionsgemisch zeigte. Das Produkt erwies sich als eine freie Aminogruppe enthaltend, indem es mit Pluram (4-Phenylspiro-/fluran-2(3H),1·-phthalan7-5,3'-dion) zu einer intensiv fluoreszierenden Verbindung umgesetzt wurde. Das Produkt zeigte ein Spektrum in konzentrierter Schwefelsäure, das dem von Digoxin ähnlich war, mit Absorptionspeaks bei 385 und 495 nm (πιμ). Das Produkt zeigte auch eine starke Affinität zu Antiseren (Kaninchen), die für Digoxin spezifisch sind. Die wahrscheinlichste Struktur des isolierten Produkts ist wie folgt:

HO

M₄K- CHjCII, __kC

Beispiel 2 Herstellung Methotrexat-Aminodigoxin-Konjugat

11 mg Methotrexat wurden in 5 ml H₂O gelöst und auf pH 6,5 eingestellt. 10 mg "Aminodigoxin" wurden in dieser Lösung gelöst, und das Volumen wurde mit H₂O auf 20 ml eingestellt. Der pH wurde erneut auf 6,5 eingestellt und 484 mg N-Äthyl-Nⁿ-(3-dimethylamino)propyl-carbodiimid-Hydrochlorid, gelöst in 5 ml HpO, wurden zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Der pH wurde für 24 h bei Raumtemperatur bei 6,2 gehalten. Das Konjugat wurde an einer Kieselgelsäule unter Verwendung von 3 %igem Ammoniumeitrat als Solvens gereinigt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zeigten das zweifache Vermögen, Antiseren (Kaninchen), die für Digoxin spezifisch sind, stark zu binden und auch das Enzym Dihydrofolat-Reduktase (pühnerleber) stark zu hemmen.

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Die wai.rscheinlicb.ste Struktur des Methotrexat-Aminodigoxin-Konjugats ist folgende:

ICK- ι 1 CH- -, K-CH₂CIl₂ __K/JL__^ ^j f %Nj f

Beispiel 3 Enzym-Iiihibitor-Immuntest für Digoxin 100 μΐ Serum—wurden 15 min bei 30⁰C mit 100 μΐ Antidigoxin-Antikörper-Lösung, 100 μΐ NADPH-Lösung, 100 μΐ 2-Mercaptoäthanol-Iiösung und 550 μΐ Natriumphosphatpuffer pH 7,5 inkubiert. 100 μΐ Methotrexat-Digoxin-Konjjugat des Beispiels

2 (70^g/ml) wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde 15 min inkubiert, worauf 100 μΐ Dihydrofolat-Reduktase-Iiösung zugesetzt wurden. Das eingesetzte Dihydrofolat-Reduktase-Präparat wurde aus Hühnerleber nach der Methode von Kaufman, B.T., & Gardiner, R.C, Journal of Biological Chemistry, Bd. 211, S. 1319 (1966) isoliert. Das Gemisch wurde weitere

3 min inkubiert und die Enzymaktivität durch Zugabe von 100 μΐ Dihydrofolat-Lösung bestimmt und bei 340 nm mit einem Varian-Schreiber-Spektrophotometer aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.

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Tabelle I

Reaktionskomponenten	Digoxin (Proben- konzen- tration ng/ml	Antidig- oxin- Anti- körper	Metho- trexat- Digoxin- Konjugat (ng in Testprobe)	Enzym- test- Kompo- nenten	Enzym-Aktivität	% Hem mung
0 0 0 5 10	fehlt fehlt vor handen vor handen vor handen	0 7 7 7 7	vor handen vor handen vor handen vor handen vor handen	OD/min	0 33 3 16 23
0,150 0,100 0,145 0,125 0,115

Die Reaktionskomponenten wurden in der oben· beschriebenen Reihenfolge zugesetzt.

OD=optische Dichte

Die obigen Ergebnisse lassen erkennen, daß einige wenige ng Digoxin in Serum in dem beschriebenen System bestimmt werden können.

Beispiel 4

Herstellung eines Konjugats aus Methotrexat und mensehlichem Serumalbumin

45 mg Methotrexat wurden in 1,0 ml N,N-Dimethylformamid gelöst, und 25 mg N-Hydroxysuccinimid wurden zugesetzt.

41 mg ITjF-Dicyclohexylcarbodiimid wurden gelöst, und das Gemisch wurde 13h bei Raumtemperatur gehalten. Das unlösliche Harnstoff-Nebenprodukt wurde abfiltriert, und 100 μΐ des Filtrats wurden zu einer Lösung gegeben, die 5 mg menschliches Serumalbumin in 800 μΐ 0,1 m Natriumphosphat-

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puffer vom pH 7,5 und 100 μΐ Dioxan enthielt^. Dieses Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gehalten und dann auf eine Sephadex G-25-Säule gebracht, die mit 0,1 m Natriumphosphatpuffer vom pH 7,5 ins Gleichgewicht gebracht wax. Die Säule wurde mit diesem Puffer entwickelt, und es wurden zwei Methotrexat enthaltende Elutionspeäks erhalten, von denen der erste das Konjugat aus Methotrexat und menschlichem Serumalbumin enthielt.

Beispiel 5 Enzym-Inhibitor-Immuntest für menschliches Serumalbumin

100 ul verdünntes Serum wurden bei 30⁰C 15 min mit 100 ul Antihuman-S erumalbumin-Antikörper (Kaninchen ) -Lö sung, 100 ul NADPH-Lösung, 100 μΐ 2-Mercaptoäthanol-Lösung und 550 μΐ Natriumphosphatpuffer vom pH T,5 inkubiert. 100 ul Methotrexat-Humanserumalbumin-Konjugat (8 pg/ml) wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde 15 min inkubiert, worauf 100 ul Dihydrofolat-Reduktase-Lösung zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde weitere 3 min inkubiert und die Enzymaktivität durch-Zugabe von 100 ul Dihydrofolat-Lösung bestimmt und bei 340 nm mit einem Varian-Schreiber-Spektrophotometer aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II wiedergegeben»

Tabelle II

Reaktionskomponenten	Human- serum- albumin (Proben- konz.. Ug/ml)	Anti- human- serum- albumin- Anti- körper	Metho trexat- Humanse- rumalbu- min-Kon- jugat (Wi in _% Testprobe)	Enzym- test- Eompo- nenten	Enzym-Aktivität	% Hem mung
0 0	fehlt fehlt	0 0,8	vor handen vor handen	OD/min	0 45
0,123 0,068

809 8 38/0 888

0	vor handen	0,8	vor handen	0,105	16
5	vor handen	0,8	vor handen	0,092	25
10	vor handen	0,8	vor handen	0,085	31

Die obigen Ergebnisse zeigendeutlich, daß einige wenige ug menschliches Serumalbumin in dem beschriebenen System bestimmt werden können.

Beispiel S Synthese von Methotrexat-Aminoäthylmorphin-Kon.iugat

a) Synthese von 0 -Aminoäthylmorphin

Iii 10 ml frisch von Lithiumaluminiumhydrid (LAH) destillierten Tetrahydrofurans (THP) wurden 4-00 mg LAH unter Stickstoff suspendiert. Eine Lösung von 4-00. mg Morphin und 400 mg Chloracetonitril in 4 ml frisch destilliertem THP wurde über 5 min zugesetzt, worauf 1 h rückflußgekocht wurde. Das -Gemisch konnte sich abkühlen, und 0,6 ml Wasser wurden zugesetzt, dann 0,6 ml 10 gewichtsprozentiges Natriumhydroxid und 2 ml Wasser. Nach dem Filtrieren des Gemische wurden die Salze mit THF gewaschen, die THF-Anteile wurden vereinigt, mit Magnesiumsulfat unter Stickstoff getrocknet, filtriert und das Piltrat eingedampft, um 380 mg 0 -Aminoäthylmorphin zu ergeben.

b) Synthese von"N-t-Butoxycarbonyl-y-(0 -aminoäthylmorphin)-glutaminsäure-oc-benzylester

Ein Gemisch von 0 -Aminoäthylmorphin (50 mg, wie oben hergestellt), N-t-BOC-glutaminsäure-otf-benzylester (34 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (25 mg) in Methylenchlorid (5 ml) wurde 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Äthylacetat verdünnt und mit verdünnter Natriumcarbonatlösung gewaschen. Die Äthylacetatlösung wurde dann zweimal mit

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0,1 η Salzsäure extrahiert, und die vereinigten sauren Extrakte wurden mit genügend 10 gewichtsprozentiger Natriumhydroxidlösung behandelt, um den pH auf 8,0 einzustellen. Die Lösung wurde zweimal mit Äthylacetat extrahiert, und die vereinigten Äthylacetatextrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (wasserfreies Natriumsulfat) und abgedampft, um ein farbloses Öl (36 mg) zu ergeben.

_c) Synthese von Glutaminsäure-y-(O^-amidoäthylmorphin)-oc-benzylester-trifluoracetat

Eine Lösung von N-t-BOC-glutaminsäure-morphin-Derivat (36 mg, hergestellt wie oben beschrieben) in Methylenchlorid (3 ml) wurde bei Raumtemperatur gerührt, und Trifluoressigsäure (1 ml) wurde zugesetzt» Das Gemisch wurde 15 min gerührt und dann zur Trockne eingeengt. Der Rückstand war ein farbloses Glas (40 mg)/

d) Synthese von Methotrexat-y-(O^-amidoäthylmorphin)-^- benzylester

Eine Lösung von 4-Amino-4-desoxy-N -methylpteroinsäure (37 mg) in 3 ml Dirnethylsulfoxid (DMSO), bei Raumtemperatur gerührt, wurde mit Triäthylamin (28 ul) und i-Butylchlorformiat (25 ul) behandelt, und das Gemisch wurde 3o min gerührt. Es wurde dann zu einem Gemisch des Morphinderivats (75 mg» hergestellt wie unter c) beschrieben) und Triäthylamin (28 μΐ) in DMSO (2 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 1 h bei 60° gerührt. Das gekühlte Gemisch wurde mit Wasser verdünnt und zweimal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte wurden mit Wasser gewaschen und dann zweimal mit 0,1 η Salzsäure extrahiert. Die vereinigten sauren Extrakte wurden mit genügend 10 gewichtsprozentigem Natriumhydroxid behandelt, um den pH auf 8,0 zu erhöhen. Das Gemisch wurde dreimal mit Äthylacetat extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden mit

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Salzlösung gewaschen, (über wasserfreiem Natriumsulfat) getrocknet und eingeengt, um ein gelbes Öl (15 mg) zu liefern. Dieses wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Entwicklung mit Chloroform/ Methanol, 4:1, gereinigt. Die gewünschte Verbindung wurde in Form eines gelben !Feststoffs erhalten (4- mg).

e) Synthese von Methotrexat-y-(0 -amidoäthylmorphin)

Das wie unter d) beschrieben hergestellte Produkt (4 mg) wurde mit 0,1 η ITatriumhydroxidlösung (5 ml) gemischt, und das Gemisch wurde 8 h bei Raumtemperatur gerührt, was zu einer klaren gelben Lösung führte.

Sie wurde mit 0,1 η Salzsäure (5 ml) versetzt, und das Gemisch wurde mit Hatriumorthophosphatpuffer (0,05 m, pH 7,4) auf 25 ml aufgefüllt, um eine Lösung -der gewünschten Verbindung zu ergeben, die sich zur Verwendung beim Enzymtest eignet.

Beispiel 7 Enzym-Inhibitor-Immuntest für Morphin

Ein Gemisch von 10 μΐ Morphinlösung geeigneter Konzentration, 5P μΐ Methotrexat-y-(Q -aTPidoäthylmorphin)-Lösung (4 ng/25 ml), 50 μΐ Antimorphin-Antikörper-Lösung, 10 μΐ NADPH-Lösung, 10 μΐ 2-Mercaptoäthanol-Lösung, 50 μΐ Kaliumchloridlösung, 150 μΐ Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) mit ÄDTA und 10 μΐ Dihydrofolat-Reduktase (E. casei)-Lösung wurde 20 min bei 37° inkubiert. Die Enzymaktivität in dem Gemisch wurde nach Zusatz von 10 μΐ Dihydrofolat-Lösung bestimmt, indem die Änderung der Extinktion der Lösung bei 340 nm unter Verwendung eines Centrifichem-Centrifugalanalysators aufgezeichnet wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III wiedergegeben:

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Satelle III

Reakti onskonrp onent en	Morphin pg/Probe	Antimor- phin-An- tikörper	Morphin- Metho- trexat- Konjjugat	Enzym test- Kompo nenten	En,zym-Aktivität	%-Hem- mung
0 0 0 0,04 0,40 4,0 20 40	fehlt fehlt vor handen vor handen vor handen vor handen vor handen vor handen	fehlt 3x10"⁸ m 3x10"⁸ m 3x1O"⁸ m 3x10"^S m 3x10~⁸ m 3x10"⁸ m 3x10"⁸ m	vor handen vor handen vor handen vor- •handen vor handen vor handen vor handen vor handen	OD/min	0 76 29 36 40 46 54 60
0,54 0,14 0,41 0,37 0,35 0,31 0,27 0,23

Die obige Tabelle zeigt, daß mit zunehmender Konzentration an Korphin die Aktivität der Dihydrofolat-Reduktase abnimmt. So konnten Morphinlösungen mit vier μg/ml bis 4 mg/ml Morphin getestet werden, wobei nur 10 μΐ Lösung zur Verfugung standen. Dies soll jedoch nicht bedeuten, daß dies der erforderliche Bereich ist, sondern nur die erfolgreiche Anwendung demonstrieren.

Beispiel 8 Synthese von Ferritin-Methotrexat-Konjugat

Eine lösung von Perritin aus menschlicher Leber (1,3 mg) in Natriumphosphatpuffer (0,05 m, pH 8,0, 5 ml) und 1 ml Dimethylformamid (DI-EF) wurde bei Raumtemperatur gerührt, und 100 μΐ einer Lösung, erhalten durch Behandeln von Methotrexat (23 mg) in DMF (2 ml) mit Triäthylamin (21 μΐ)

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und i-Butylchlorformiat (15 ul) bei Raumtemperatur für 30 min, wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und dann gegen 2x2 1 Natriumorthophosphatpuffer (0,05 m, pH 7,4, 0,1 man Natriumchlorid und mit 0,05 Gewichtsprozent Natriumazid) 24 h dialysiert. Die Lösung wurde dann durch eine Sephadex G-25-Säule geführt, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, und die Ferritin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mit dem Puffer auf 10 ml aufgefüllt.

Die anfallende Lösung eignet sich zur Verwendung bei einem Enzym-Immuntest zur Bestimmung von Perritin.

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Claims

DR.A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER REINER F.MEYER

DlPL-ING. (1934-1974) OIPL-CHEM. DIPL-ING.

8000 MÜNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STBASSE

TELEFON: (089) 472947 TELEX: 524624 tEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT

1. März 1978 RAN 4093/24

F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel / Schweiz

Patentansprüche

1.J Reagens zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials, enthaltend das immunologisch aktive Material oder einen Rezeptor, der das immunologisch aktive Katerial spezifisch zu binden vermag, markiert mit einer Substanz, die den G-rad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag.

Reagens nach Anspruch 1, dessen immunologisch aktives Material mit einer Substanz markiert ist, die den Grad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag.

Reagens nach Anspruch 1, dessen Rezeptor, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, mit einer Substanz markiert ist, die den Grad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag.

Reagens nach Anspruch 3, dessen Rezeptor ein für das zu bestimmende immunologisch aktive Material spezifischer Antikörper ist.

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ORIGINAL INSPECTED

5. Reagens nach, einem der Ansprüche 1 Ms 3» dessen zum Modifizieren der Aktivität eines Enzyms befähigte Substanz ein Enzymhemmstoff ist.

6. Reagens nach Anspruch 5, dessen Enzymhemmstoff eine Hemmlconstante unter 10"*^ Mol/l aufweist.

7. Reagens nach Anspruch 6, dessen Enzymhemmstoff eine Hemmkonstante zwischen 10 und 10 Mol/l aufweist.

8. Reagens nach Anspruch 7» dessen Hemmstoff Methotrexat und dessen Enzym Dihydrofolat-Reduktase ist.

9. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dessen zum Modifizieren der Aktivität eines Enzyms befähigte Substanz ein Enzym-Aktivator ist.

10. Reagens nach einem der Ansprüche 1, bis 9, dessen immunologisch aktives Material Digoxin ist.

11. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9·, dessen immunologisch aktives Material menschliches Serumalbumin ist.

12. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9» dessen immunologisch aktives Material Morphin ist.

13· Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dessen immunologisch aktives Material Ferritin ist.

14. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dessen immunologisch aktives Material oder dessen Rezeptor, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, an die Substanz, die den Grad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag, kovalent gebunden ist.

15. Konjjugat von Digoxin und Methotrexat.

16. Konjugat von menschlichem Serumalbumin und Methotrexat.

17. Konjugat von Morphin und Methotrexat.

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18. Konjugat von Ferritin und Methotrexat. *

19. Verfahren zur Herstellung eines Reagens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein immunologisch aktives Material oder ein Rezepter, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, mit einer Substanz, die den Grad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag, in Gegenwart eines Kupplungsmittels umgesetzt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß als Kupplungsmittel ein Carbodiimid verwendet wird.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß als Kupplungsmittel i-Butylehlorformiat verwendet wird.

22. Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einem Rezeptor, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, mit dem immunologisch aktiven Material, das mit einer Substanz, die den Grad und die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag, markiert ist, und mit einem Enzym und einem Enzymsubstrat zusammengebracht wird, wobei der Grad oder die Art der erhaltenen Enzymaktivität gemessen und mit der mit einem Standard erhaltenen verglichen wird.

23. Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einem Rezeptor, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag und mit einer Substanz, die den Grad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag, markiert ist, mit dem immunologisch aktiven Material in unlöslich gemachter Form und mit einem Enzym und einem Enzymsubstrat

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zusammengebracht wird, wobei der Grad oder die Art der Enzymaktivität nach der Abtrennung der festen Phase gemessen und mit der mit einem Standard erhaltenen verglichen wird«

24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß als zum Modifizieren der Aktivität eines Enzyms befähigte Substanz ein Enzymhemmstoff verwendet wird.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor ein Antikörper ist.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß als Hemmstoff ein Hemmstoff des Enzyms Dihydrofolat-Reduktase verwendet wird.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß als Hemmstoff' Methotrexat und als Enzym Dihydrofolat-Reduktase verwendet wird.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologisch aktives Material ein Hapten verwendet wird.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß als Hapten Digoxin und als Rezeptor ein Antikörper zu Digoxin verwendet wird.

30. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß als Hapten Morphin und als Rezeptor ein Antikörper zu Morphin verwendet wird.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologisch aktives Material ein Protein verwendet wird.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß als Protein menschliches Serumalbumin und als Rezeptor ein Antikörper zu menschlichem Serumalbumin verwendet wird.

33. Verwendung eines Reagens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials.

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