DE2458710A1

DE2458710A1 - Verfahren zur bestimmung von folat- verbindungen durch saettigungsanalyse

Info

Publication number: DE2458710A1
Application number: DE19742458710
Authority: DE
Inventors: Russel James Bayly; Virginia Edith May Chambers; Reginald Monks
Original assignee: Radiochemical Centre Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1973-12-11
Filing date: 1974-12-11
Publication date: 1975-07-10
Also published as: FR2288982A1; FR2279749B1; FR2279749A1; AU7624774A; BE823233A; NL7416132A; IL46214A0; US4115065A; FR2288982B1; FR2272393A1; AU7605974A; IL46214A; IL46217A; JPS537830B2; DE2458671B2; GB1458978A; NL7416131A; DE2458671A1; JPS5342434B2; BE823234A

Description

The Radiochemical Centre Limited White Lion Road, Amersham, Buckinghamshire, England

Verfahren zur Bestimmung von FoIat-Verbindungen durch

Sättigungsanalyse

Die Erfindung betrifft Folat-Verbindungen, die Sättigungsanalyse von Folat-Verbindungen durch radioaktive Konkurrenzreaktion sowie neue radioaktiv-markierte Derivate von Folat-Verbindungen.

Folsäure besitzt die Formel

11

COOH

HOGCH CH₂. CH. NH.

C-TY

I! VJ

N_x^NyNK

Natürlich vorkommende Folsäure ist immer ein Gemisch mit anderen verwandten Verbindungen und dieses Gemisch wird hier als Folat-Verbindungen bezeichnet. Die anderen verwandten Verbindungen können die Formel

Χ*

COGH

H \J/ I O ν

NH,

X. OH

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- 2 - 1A-45 860

besitzen, wobei eine punktierte zweite Bindungslinie bedeutet, daß es sich um eine Einfach- oder Doppelbindung handeln kann und wobei die Reste X an den verschiedenen Stellungen in dem Molekül gleich oder verschieden sein können und jeweils H, -Cüz -CHO, oder -CH₂OH bedeuten; m ebenfalls an den verschiedenen Stellungen gleich oder verschieden sein kann und jeweils 0 oder 1 bedeutet (so daß das benachbarte Stickstoffatom jeweils dreiwertig ist) und η 1 bis 13 ist.

Wahlweise können die in 5- und 10-Stellung an den Stickstoffatomen angegebenen Reste X fehlen und durch eine Methylen- oder Methenylgruppe ersetzt sein. Der Ausdruck Polat-Verbindungen um faßt auch die Ester und Salze der oben angegebenen Säuren.

Bei der Durchführung der Sättigungsanalyse mit Hilfe von radioaktiv markierten Verbindungen ist ein wesentlicher Bestandteil eine markierte Version der zu bestimmenden Substanz, die um die bindenden Stellen in quantitativ definierbarer Weise mit der nicht markierten (native) Substanz in Konkurrenz tritt und die nach einem entsprechenden Abtrennverfahren durch Messung der Radioaktivität leicht bestimmt werden kann. Die Verbindungen die bestimmt werden sollen, sind typischerweise organische Verbindungen, die in kleinen oder sehr kleinen Mengen in Körperflüssigkeiten bzw. Geweben vorhanden sind. Diese Verbindungen enthalten häufig nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Phosphor und Schwefel. Das führt zu einer starken Begrenzung der zur Markierung verfügbaren Radionuclide. C14 ist das einzig praktisch anwendbare Kohlenstoffisotop und Tritium das einzige radioaktive Wasserstoffisotop. Weder Sauerstoff noch Stickstoff besitzen Isotopen mit Halbwertszeiten von mehr als 10 min. Phosphor und Schwefel finden sich weniger allgemein in

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1A-45

_ 3 —

den interessierenden Verbindungen, aber auch dann sind die einzig praktisch anwendbaren Radionuclide ?32,ein reiner ß-Strahler mit einer Halbwertszeit von ungefähr 14 Tagen,und S 35 ein anderer reiner ß-Strahler mit einer Halbwertszeit von ungefähr 87 Tagen. Kohlenstoff 14 ist ebenfalls ein reiner ß-Strahler und besitzt den zusätzlichen Nachteil für viele Anwendungen einer geringen spezifischen Aktivität auf Grund seiner sehr langen Halbwertszeit,und Tritium besitzt nur eine sehr schwache ß-Strahlung oder Emission. Zusammenfassend kann man sagen, daß keines dieser Elemente ein für praktische Zwecke geeignetes <f -Strahlen emittierendes Isotop besitzt und die ß-Strahler besitzen verschiedene Nachteile. Das hat dazu geführt, daß man die Verbindungen mit "fremden" Nucliden markiert, für die die folgenden Forderungen bestehen:

1) Sie müssen eine "geeignete" 'Halbwertszeit besitzen. Wenn diese zu kurz ist sind sie nicht anwendbar und wenn sie zu lang ist, besitzen sie eine zu geringe spezifische Radioaktivität, selbst wenn das Nuclid rein ist.

2) Sie sollten ^T -Strahlung einer geeigneten Energie aussenden. Die Zählung bzw. Messung der J^-Strahlung ist schneller und wirtschaftlicher als diejenige der ß-Strahlung.

3) Sie sollten mit einer angemessenen spezifischen Radioaktivität wirtschaftlich verfügbar sein«

4) Sie sollten stabil in eine Reihe von Verbindungen eingebaut werden können.

5) Sie sollten zu einer möglichst geringen Störung des Moleküls führen in das sie eingeführt werden.

Eigentlich die einzigen J-strahlenden Nuclide, die zur Zeit für radioaktive Sättigungsanalysen angewandt werden, sind die beiden Jodisotopen J 125 und J 131. Die Anwendung von Se-75-markierten Derivaten von Steroiden wurde kürzlich in der DT-OS 2 364 741 beschrieben. Wenn sie mit den oben angegebenen Kriterien ver-

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4 - -1A-4586Q

glichen werden, sieht iaan_p daß die Jodisotope geeignet sind, obwohl sie einige Begrenzungen aufweisen. Die 8-Tage-Halbwertszeit von J 131 ist für viele Zwecke zu kurz und selbst die 60 Tage für J 125 sind manchmal unerwünscht kurz. J 125 emittiert eine weiche /"-Strahlung und Röntgenstrahlen, die in einer solchen Weise absorbiert werden, die ihre leichte Zählung erschwert. Se 75 besitzt gewisse Vorteile gegenüber dem häufig angewandten Jodisotop J 125. Ss besitzt eine längere Halbwertszeit (120 Tage) und eine energiereichere J'-Strahlung, die die Zählung erleichtert. Es kann leicht hergestellt werden durch Neutronenbestrahlung von angereichertem Se 74 mit spezifischen Radioaktivitäten, die für viele Zwecke geeignet sind. Wenn höhere spezifische Aktivitäten erforderlich sind, ergibt der Beschüß von As 75 mit Protonen in einem Cyclotron im wesentlichen trägerfreies Se 75.

Die Gehalte an. Folaten in biologischen Proben können bestimmt werden durch Verfahren der Sättigungsanalyse unter Verwendung von mit Tritium markierter Folsäure als radioaktivem Liganden. Die Verwendung von ^-emittierenden Isotopen zur Markierung des radioaktiven Liganden wäre durch Anwendung von Jod-125 und Selen-75 möglich. Obwohl Jod in die p-Aminobenzoatgruppe der Folate eingeführt werden kann, ist das Produkt zur Sättigungsanalyse von Folaten nicht geeignet. Das mit radioaktivem Jod markierte Material kann nicht mit einer ausreichenden spezifischen Aktivität hergestellt werden und tritt daher nicht in ausreichendem Maße mit natürlichen Folatea um die bei der Sättigungsanalyse von Polaten angewandten Proteine in Konkurrenz. Ein anderer Versuch Jod 125 in Folate einzuführen umfaßt den Ersatz des L-Glutamatrestes von Folaten durch eine mit radioaktivem Jod markierte Verbindung wie Jodtyramin-J125 oder Jodtyrosin-J125. Dieser Ersatz kann erreicht werden, indem man entweder Jodtyramin-J125 oder Jodtyrosin-J125 oder einen deren Ester mit Pteroinsäure oder einem Derivat von Pteroinsäure kuppelt oder wahlweise durch Markierung mit radioaktivem Jod eines inaktiven Kon^ugats von Pteroinsäure und einer Gruppe wie lyramin oder Tyrosin. Die Markierung von Folaten kann auch erreicht werden, indem man entweder Jodtyramin~J125 oder Jodtyrosin-J125 direkt an 2.B. FoI-

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- 5 - 1A-45 860'

säure koppelt unter Bildung von Pteroyl-L-glutamyl-godtyrosin-J125.

Im Falle einer Markierung mit Selen-75 ergibt sich die Möglichkeit die p-Aminobenzoylgruppe durch ein Selenophenderivat zu ersetzen oder eine 4-T ο sy !gruppe durch ein Selen-haltiges Nueleophil, z.B. SeCN", H Se" oder CBzSe"". Im ersten Falle sind einige mühsame synthetische Schritte erforderlich, während im letzten Fall eine bestimmende Gruppe bei der Bindung von Folsäure an Proteine, nämlich die Pteridingruppe modifiziert würde. Die Einführung von Selen-75 in das Folatmolekül kann jedoch ähnlich der Einführung von Jod 125 erreicht werden durch Ersatz des 1-G-lutamat—Restes der Folate durch ein Selen-75-markiertes Selenamin oder eine Selenaminosäure, z.B. Selenmethionin -Se 75,Methylselencystein - Se 75 oder 2 - (Methylselenö)~äthylamin- Se 75· Dieser Ersatz kann ähnlich erreicht werden durch die Kupplung eines dieser Selenamine oder der Aminosäuren an Pteroinsäure oder ein Derivat von Pteroinsäure. Wahlweise kann das Halogenatom eines !Conjugates, das gebildet worden ist" aus Pteroinsäure und einer Halogen-substituierten Aminosäure wie ß-Chloralanin oder ß-oder >^V-Chlorglutaminsäure,ersetzt werden durch eine Selen-75-haltige nuBleophile Gruppe, z.B. CH₃Se". Die Markierung von Folaten mit Selen 75 kann auch erreicht v/erden, indem man beispielsweise Selenmethionin - Se 75 direkt an Folsäure kuppelt^^ijildung von Pteroyl-1-glutamyl-selenmethionin - Selen 75.

Ein Vorteil der Markierung mit Selen gegenüber der Markierung mit Jod besteht darin, daß die Modifizierungen der sterischen Konfiguration· des Folsäuremoleküls besser begrenzt werden können. Die Bindung eines radioaktiven Liganden an ein Protein kann daher ähnlicher sein der Bindung der natürlichen Folate.

Die Herstellung der Aminosäure-Analogen von Folsäure zur Untersuchung von Enzymsystemen ist bekannt (z.B. The Journal of Biological Chemistry, Bd. 242, Nr. 7 (1967) Seiten 1466-76). Die für diese Synthese angewandten Verfahren sind bekannt und beste-

10 hen in der Umsetzung von Isobutyl-chlorformiat mit einer N -

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geschützten Pteroinsäure in Gegenwart eines tertiären Amins, wobei die Reaktion unter wasserfreien Bedingungen in trockenen Lösungsmitteln wie Dioxan und Dimethylformamid durchgeführt wird_? um das gemischte Anhydrid zu erhalten. Das gemischte Anhydrid wird anschließend mit dem erforderlichen Aminosäureester in einem wässrigen organischen Medium umgesetzt unter Bildung eines Aminosäure-Konjugats von Pteroinsäure. Wenn diese Reaktionen auf mit Selen 75 markierte Amine oder Aminosäuren, z.B. Selenmethionin, Selenäthionin, Se-Methylselencystein, Seäthylselencystein, 2~(Methylselen)-äthylamin angewandt werden, können die entsprechenden Selen 75 markierten Aminosäure-Analogen von Polsäure hergestellt werden, die als radioaktive Liganden bei der Sättigungsanalyse von JOlaten Verwendung finden können.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Durchführung einer Sättigungsanalyse für eine Folatverbindung, wobei man die Verbindung oder ein Gemisch von Verbindungen, das analysiert werden sollend eine radioaktiv-markierte Version der genannten Verbindungen) in Konkurrenz treten läßt, um die Reaktion mit einem bindenden Reagens für diese Verbindung(en), das in einer Menge vorhanden ist_}die nicht ausreicht, um mit der Gesamtmenge der Verbindung(en) und der markierten Version davon Bindungen einzugehen, die gebundene(n) Verbindung(en) von der (den) nichtgebundenen Verbindung(en) abtrennt und die radioaktive Konzentration der gebundenen und/oder nicht-gebundenen Verbindung(en) mißt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als radioaktivmarkierte Version der Polatverbindung(en) eine mit Selen 75 markierte Version verwendet.

Die Erfindung betrifft auch eine Analyseneinheit zur Durchführung der oben angegebenen Sättigungsanalyse, enthaltend

a) eine Selen 75 markierte Version der zu bestimmenden üOlatverbindung oder des Gemisches von Verbindungen;

b) ein bindendes Reagens, das sich mit der (den) zu analysierenden Verbindung(en) verbindet;

-7-

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c) vorzugsweise eine Menge einer Folatverblndung zur Herstellung von Standards;

d) vorzugsweise Mittel zur Abtrennung der gebundenen Verbindung(en) von der (den) nicht—gebundenen Verbindung(en) und

e/ vorzugsweise mehrere Reagensgläser zur Durchführung der Analyse»

Die markierte Version der zu bestimmenden yerbindung(en) und das bindende Reagens dafür sind vorzugsweise vorher in die Reagensgläser eingebracht und gefriergetrocknet worden.

So kann z.B. im Falle der Bestimmung von Gesamtserumfolät die Analyseeinheit Gläser umfassen, enthaltend das Selen 75 markierte PoIatderivat, ß-Laetοglobulin oder Schweineserum als bindendes Protein, M -Methyltetrahydrofolat oder PoIat als Standards und mit Albumin oder Hämoglobin überzogene Aktivkohle zur Abtrennung der gebundenen von der nicht-gebundenen Verbindung,

Beispiele für Systeme asif die die Sättigungsanalyse für Polate angewandt werden kann, umfassen im Prinzip

1» Bestimmung des G-esamtf olatgehalts im Serum 2„ Bestimmung des G-esamtf olatgehalts von roten Zellen 3. Bestimmung natürlich vorkommender Folate, z.B. von ür-Methyltetrahydrofolat und !"ölsäure.

Die Erfindung betrifft auch Verbindungen der Formel III

- 8

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wobei eine punktierte zweite Bindungslinie anzeigt, daß die Bindung eine Einfach- oder Doppelbindung sein kann und X=H oder -CH, und m = O oder 1 bedeutet (so daß das benachbarte Stickstoffatom dreiwertig ist) und entweder

4-(CO)-CH - NH »
(CH₂)_pSeQ

ist, wobei q = O oder 1, ρ = 1 oder 2 und Q = C_xH_2x+-] bedeutet, wobei χ eine Zahl von 1 bis 6, vorzugsweise 1 ist und_fwenn q. = ist, η = 1 und Z = H ist und,wenn q =. 1 ist, η eine Zahl von 1 bis 15 und Z = OH bedeutet oder

b) R /CO-0HY-CHY-CH(COOH)NH_7ist, wobei eine der Gruppen T=H und die andere -SeC H₉ ,_Λ bedeutet, wobei χ eine Zahl von 1 bis 6, vorzugsweise 1 und Z = OH ist.sowie Ester und Salze derartiger Säuren.

Die Verbindungen sind mit Selen 75 markierte Versionen von PoIatverbindungen einschließlich der mit Selen 75 markierten Version von Polsäure selbst. Die Verbindungen sind daher geeignet für die Sättigungsanalyse von Polatverbindungen einschließlich Polsäure.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert^ dabei beschreiben die Beispiele 1 bis 3 die Herstellung von drei neuen Selen-75-Derivaten von Verbindungen, die der Polsäure verwandt sind. Die Beispiele 4 bis 13 beschreiben radioaktive Bestimmungsverfahren durch Konkurrenzreaktion von Polatverbindungen,

-9-

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Beispiel 1 Herstellung; von Se-Methyl-L-selenocystein-Se 75

Natrium (24 mg; 1,05 ro Atom) wurden in ein Reaktionsgefäß,enthaltend rotes Se 75 (78,5 mg; 1,0 m. Atom; 295mCi) in 20 ml flüssigen Ammoniak, gegeben. Das Reaktion^gefäß wurde mit einer Vakuumleitung mit mehreren Anschlüssen verbunden und über eine Carbasorb/Aktivkohle-Falle mit der Atmosphäre verbunden. Das Reaktionsgemisch wurde gerührt bis eine rot-braune Lösung von Dinatrium-diselenid entstanden war. Dann wurde ß-Chlor-L-alanin-Natriumsalz (205 mg; 1»41 mMol) zu der lösung gegeben und weiter gerührt bis der Ammoniak verdampft war. Der Rückstand von rohem Selenocystin-Se 75 wurde vorsichtig in 2m Salzsäure gelöst und ein Niederschlag von rotem Selen abzentrifugiert. Der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit wurde mit 4m Ammoniumhydroxid auf 6-7 eingestellt. Der sich abscheidende gelbe Niederschlag wurde abgetrennt, mit Wasser (1 ml) und Äthanol (3 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt L-Selenocystin-Se 75 (136 mg; 0,407 mMol; 236 mOi).

L-Selenocystin-Se 75 (100 mg; 0,3 mMol; 172 mCi) wurden in ein Reaktionsgefäß gegeben, in das 20 ml flüssiger Ammoniak kondensiert wurde. Dann wurde Natrium (32,9 mg; 1,43 m Atom) in das Reaktionsgefäß gegeben und nach der Umsetzung Methyljodid (125 /Ul, 2 mMol) unter Rühren zu der Lösung zugegeben, wobei die blaue Farbe verschwand. Nach weiteren 10 min wurde Ammoniumjodid (164 mg; 1,13 mMol) zugegeben und der Ammoniak dann verdampft. Der Rückstand wurde in Wasser (1 ml) gelöst und erneut mit Aceton ( 8 ml) ausgefällt. Das Produkt wurde abgetrennt, wieder in V/asser ( 1 ml) gelöst und erneut mit Äthanol ( 2 ml) ausgefällt. Nach 1-stündigem Kühlen der wässrig-alkoholischen Lösung wurde das Produkt abzentrifugiert, mit Äthanol ( 1 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt Se-Methyl-L-selenocystein-Se 75 (29 mg; 0,15 .mMol; 44 mCi).

-10-

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Herstellung von N-Pteroyl-Se-methyl-L-selenocystein - Se 75

Isobutyl-chlorformiat (13,5 Wl) und Iriäthylamin (13,5 /al) wurden unter wasserfreien Bedingungen zu N -Irifluoracetylpteroinsäure (22 mg ;im Vakuum getrocknet) in 'trockenem Dimethylformamid (0,5 ml) bei 5⁰C zugegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoff zur Reaktion gebracht und innerhalb von 30 min auf Raumtemperatur gebracht, wobei das gemischte Anhydrid entstand. Weitere 2 ml Dimethylformamid wurden zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und anschließend Se-Methyl-L~selenocystein-Se~75-Natrium-Salz (14 mg; 18,4 mOi) in Wasser (1,5 ml). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann weitere 24 h stehengelassen. Ss wurde dann lyophilisiert und der Rückstand 30 min mit 0,1m Natriumhydroxid ( 3 ml) auf 60⁰C erwärmt, um die Trifluoracetylgruppe zu entfernen. Die Hydrolyse wurde in der Dunkelheit unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Die Lösung wurde abgekühlt und mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 gebracht, wobei ein Niederschlag entstand. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit Wasser ( 2 ml) gewaschen und nach dem Lösen in verdünnter Ammoniumhydroxid-Lösung (0,25 ml; 0,05m) durch Dünnschicht-Chromatographie (Avicel I¹ 1 mm Cellulose; Eluiermittel 5%iges wässriges Ammoniumbicarbonat) gereinigt. Die Chromatographie wurde in der Dunkelheit durchgeführt. Die Platte wurde autoradiographisch untersucht und die Komponente mit einem Rf-Wert von ungefähr 0,19 entfernt und in 0,1m Ammoniumhydroxid extrahiert, wobei man eine Lösung von N-Pteroyl-Se-methyl-L-selenocystein-Se 75, mit

2,4mCiX _ 259,286 nm (pH 11,0 Phosphat Puffer) erhielt. ' max

Beispiel 2 Herstellung von N-Pteroyl-L-selenomethionln-Se 75

Isobutyl-chlorformiat (13,5 jul) und Triäthylamin (13,5 /Ul) wurden unter wasserfreien Bedingungen zu N -Irifluoracetylpteroinsäure (22 mg;im Yakuum getrocknet) in trockenem Dimethylformamid (1 ml) bei 5⁰C zugegeben. Man ließ das Gemisch unter Stickstoff-

-11-

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- 11 - 1A-45 860

atmosphäre reagieren und innerhalb von 30 min auf Raumtemperatur kommen, "wobei das gemischte Anhydrid entstand. Es wurden weitere 2 ml Dimethylformamid zu dem Reaktionsgemisch gegeben und anschließend L-Selenomethionin-Se-75--Natriuinsalz (3,5 mg; 2OmOi) in "Wasser (1 ml)· Das Reaktionsgemisch wurde über lacht bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde dann lyophilisiert und der Rückstand 4-0 min mit 0,1m Natriumhydroxid ( 3 ml) auf 60⁰C erwärmt, um die [Drifluoracetylgruppe zu entfernen. Die Hydrolyse wurde in der Dunkelheit unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Ein geringer gelber Niederschlag, der entstanden worden war, wurde durch Zugabe von 0,1m Natriumhydroxid wieder gelöst. Die Lösung wurde auf ungefähr 5⁰C abgekühlt und mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 gebracht, wobei ein gelber derschlag entstand. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit Wasser "( 2 ml) gewaschen und dann 10 min mit 1,0m Ammoniumhydroxid ( 2 ml) gerührt. Der verbleibende gelbe Feststoff wurde abgetrennt, mit Wasser ( 2 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt N-Pteroyl-L-selenomethionin-Se 75 mit 1,75mCi, X _mQY259, 281nra (pH 11,0 Phosphatpuffer).

Beispiel 3 Herstellung von 2-(Methylseleno)-äthylamin-Se 75

Natrium (9,2mg; 0,4 m Vfcom) wurden in ein Reaktionsgefäß gegeben, enthaltend rotes Selen~Se-75(28,8 mg; 0,366 mAtom,. 3,8mCi) in 25 ml flüssigem Ammoniak. Das Reaktionsgefäß war mit einer Vakuumleitung mit mehreren Anschlüssen verbunden und über eine Carbasorb/Aktivkohle-Falle mit der Atmosphäre verbunden· Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr 10 min gerührt bis eine braune Lösung von Dinatrium-diselenid erhalten worden war. Dann wurde Methyl3odid (65,2 mg; 0,46 mMol) unter Rühren zu der Lösung zugegeben, wobei man eine farblose Lösung von Dimethyl-diselenid erhielt. Nach ungefähr 3 min wurde eine weitere Menge Natrium (11 mg) in das Reaktionsgefäß gegeben bis eine permanente blauschwarze Färbung entstand, die eine vollständige Spaltung der Diselenid-Bindungunter Bildung von Natriummethyl-selenid anzeigt. Dann wurde 2-Bromäthylamin-hydrobrou.iu (83 mg; 0,4 mMol)

-12-

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zu dem Reaktions gemisch gegeben, das gerührt wurde bis der gesamte Ammoniak verdampft war. Der Rückstand wurde im Vakuum getrocknet, in Äthanol gelöst und durch präparative Dünnschicht-Chromatographie (Avicel F 1 mm Cellulose; Eluiermittel: Butanol, Wasser, Essigsäure (15:25:60) gereinigt. Die Platte wurde autoradiographisch untersucht und die Hauptkomporiente entsprechend der schnellstlaufenden Komponente auf einer analytischen Platte mit einem Rf-Wert von 0,81 entfernt und in Äthanol extrahiert. Man erhielt 1,4 mCi von 2-(Methylseleno)-äthylamin-Se 75,

Kupplung von N -Trifluoracetylpteroinsäure mit 2-(Methylseleno)-äthylamin-Se 75

Isobutyl-chlorformiat (11 mI) und Triäthylamin (10 /ul) wurden unter wasserfreien Bedingungen zu N -!Drifluoracetylpteroinsäure (20 mg; 0,049 mMol; im Vakuum getrocknet)· in trockenem Dimethylformamid (0,4 ml) bei 10⁰C zugegeben. Die Lösung wurde 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde weiter Triäthylaiain (20 /al) zugegeben und die Lösung in eine: Kolben, enthaltend 2-(Methylseleno)-äthylamin-Se 75( 16mg; 0,12 mMol;■1,2mCi) gegeben« Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann der Dünnschicht-Chromatographie (Merck Kieselgel 601*254; Eluiermittel: Methanol) unterworfen. Das gewünschte Produkt wurde durch autoradiographische Untersuchung und UV-P-luorescenz festgestellt. Die Komponente mit einem Rf-Wert von 0,63 wurde entfernt und in Methanol extrahiert. Man erhielt 120 /uCi einer methanolischen Lösung von 2-(Methylseleno)-äthyl-

/ -IQ

amin-Se-75-Κοηjugate von Έ -Trifluoracetylpteroinsäure, λ max 257, 286 nm (pH 11,0 Phosphatpuffer). Dieses Produkt kann umgewandelt werden in N-Pteroyl-2-(methylseleno)-äthylamin-Se durch Hydrolyse, wie sie allgemein in den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist.

Beispiel 4

.^^ , Bestimmungsverfahren für ffolate unter Verwendung von

Se 75-markiertem Pferoyl-L-methylselenocystein

Standardlösungen von Ή -Methyltetrahydrofolat, enthaltend

-13--

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0, 0,25, 0,5, 1, 2 und 4 ng in Phosphat-Albumin-Puffer (200 al) wurden in Bestimmungsreagensgläser pipettiert. Zu den Reagensgläsern für die "Gesamf-Bestimmung und "Blindprobe" wurde ebenfalls Puffer gegeben (400 bzw. 300 al). In jedes Reagensglas wurde Pteroyl-L-methylselenocystein Se 75 (0,5 ng, spezifische Aktivität ca. 0,24 Gi/mMol) in 10O /Ul-Puffer gegeben. Unmittelbar darauf wurde ß-Lactoglobulin (100/Ug) in 100 /Ul-Puffer zu allen Gläsern gegeben außer zu der Blindprobe. Uach 60 min langer Inkubation bei Raumtemperatur wurde eine Suspension von mit Albumin-überzogener Aktivkohle in Puffer (200 ul) bei 4°C zu allen Proben gegeben außer den Gesamtproben. Die Gläser wurden zentrifugiert (2000 g 10 min ) und die überstehende Flüssigkeit 300 s in einem KE8312 ß-Jf- Zähler gezählt.

Die Ergebnisse sind angegeben in Werten zur prozentualen Bindung = 1

100 χ Zählungen minus Zählungen für die Blindprobe Gesamtzählungen - Hintergrund

5
Gewicht von E -Methyltetrahydrofolat Prozentsatz des gebun-

(ng) denen markierten Polats

0 94 0,25 81,8 0,25 78,0 0,5 81,4

1 78,3

1 . 78,6

2 51,3 2 58,0 4 44,4 4 34,1

-14-

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- 14 - 1A-45

Beispiel 5 Bestimmung; von ffolat mit Hilfe von, ffolsänre-Standards

Es wurde entsprechend Beispiel 4 gearbeitet mit der Ausnahme, daß Folsäure als Standard anstelle von K" -Methyltetrahydrofolat Verwendet wurde. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Prozentsatz des gebundenen markierten Polats

Gewicht folsäure (ng)	25
O	25
o,	5
o,	5
0,
o,
1
1
2
2
4

95,5 86,1 85,6 67,7 82,5 45,5 41,4 28,1 32,6 10,4

Beispiel 6

Bestimmung von PoIaten mit Hilfe von Se 75-marlciertem Pteroyl-L-selenomethionin

Es wurde entsprechend Beispiel 4 gearbeitet mit der Ausnahme, daß Se 75-Pteroyl-L-selenomethionin (0,5 ng,spez.Akt.ca.2,25 Ci/mMol) als Markierung anstelle von Se 75 Pteroyl-L-methylselenocystein verwendet wurde.

Gewicht von IT -Methyltetrahydrofolat Prozentsatz des gebun-

(ng) denen markierten Folat's

0 49,9 0,25 39,3 0,25 36,1 0,5 . 35,9 O_S5 ■ 37,3

1 32,6

1 33,0

2 25,9 4 25,4

⁴ 509828/0927 ²⁴'¹

• - 15 - 1A-45

Beispiel 7

Es wurde entsprechend Beispiel 6 gearbeitet mit der Ausnahme, daß eine Lösung von Schweineserum (55 #1) in Puffer (45 pl) anstelle von ß-Lactoglobulin als bindendes Protein verwendet urde.

Gewicht von N -Methyltetrahydrofolat Prozentsatz des gebun-

(ng) denen markierten Folats

0 36,4 0,25 21,3 0,5 - 17,2 0,5 ' 17,1

1 20,7

1 18,5

2 19,3 2 17,2 4 15,5 4 15,6

Beispiel 8

Es wurde entsprechend Beispiel 4 gearbeitet mit der Ausnahme, daß eine Lösung (100 ul) enthaltend 55 #1 Schweineserum und /Ul Puffer anstelle von ß-Lactoglobulin als bindendes Protein verwendet wurde.

Gewicht von N -Methyltetrahydrofolat Prosentsatz des gebun-(ng) denen markierten IPolats

0 89,3

0,25 61,4

0,25 52,0

0,5 43,3

0,5 48,1

1 41,2

1 . 38,9 2. 40,9

2 39 3 ₄ 509828/0927 ^₅

1Α-45

Beispiel 9

Es wurde entsprechend Beispiel 8 gearbeitet mit der Ausnahme, daß Folsäure anstelle von I -Methyltetrahydrofolat als Standard verwendet wurde.

Gewicht an (ng)	. Folsäure
0
	25
o,	25
0,	VJl
0,	5
1
1
2
2
4
4
Beispiel 1	0

Prozentsatz der an Schweineserum gebundenen markierten Folsäure

92,7

67,1

68,7

60,9

43

26,2

31,3

28,0

28,3

9 2,6

Es wurde entsprechend Beispiel 6 gearbeitet mit der Ausnahme, daß Folsäure anstelle von IT -Methyltetrahydrofolat als Standard verwendet wurde.

Prozentsatz des gebundenen markierten ]?olats

Gewicht an (ng)	Folsäure
0
o,	25
o,	25
0,	VJl
o,	VJl
1
1
2
2
4
4

59,1 38,1 37,2 34

30,7 19

22,6

14,2

13,2

5,8

50 98 28/0927

-17-

- 17 - 1A-45 860

Beispiel 11 ·

Es wurde entsprechend Beispiel 10 gearbeitet mit der Ausnahme, daß eine lösung enthaltend 55 /Ul Schweineserum und 45 /Ul Puffer anstelle von ß-lactoglobulin als bindendes Protein verwendet wurde.

Prozentsatz des gebundenen markierten Folats

Gewicht an	Polsaure
(ng)
O
ο,	25
0,	25
0,	5
ο,	5
1
1
2
2

35,7 20,3 21,1

18,4 20,9 16,8 17,3 13,0 13,9

4^ 12,6

4 15,2

Beispiel 12 Radioimmunoloeclsches Bestimmun^sverfahren für Folsäure unter Verwendung von Se 75--markiertem Pteroyl-L-methylselenocystein

Es wurden Standard-Lösungen von Polsäure, enthaltend 0, 0,25 0,5, 1, 2 und 4 ng in Phosphat-Albumin-Puffer (200 ul) in Un-"uersuchungsgläser pipettiert. Es wurde auch Puffer zu der "G-esamtbestimmung" und "Blindprobe"(400 bzw. 300 ul) zugegeben. ' Unmittelbar anschließend wurden in alle Gläser mit Ausnahme der Blindprobe 100 ul Puffer,enthaltend 2 jal eines Kaninchen-Antifolsäure-Antiserums mit einem Titer von 1/15000, das gegen ein Konjugat von Polsäure mit Serumalbumin gebildet worden war, gegeben, lach 60 min langer Inkubation bei Raumtemperatur wurde eine Suspension von mit Albumin überzogener Aktivkohle in Puffer (200yua) bei 4⁰C zu allen Gläsern außer der Gesamtprobe zugegeben. Die Gläser wurden zentrifugiert (2000 g 10 min) und

die überstehende Flüssigkeit 300 s gezählt. . In jedes Glas wurde Se 75 -Pteroylmethyl-L-selenocystein

(0,5 ng, sp. Akt. ca 0,24 Ci/m,Mol) in 100 ul Puffer ""¹⁸~ gegeben.

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- 18 - 1A-45 860

Gewicht der Folsäure	Prozentsatz des an Antiserum ge
(ng)	bundenen markierten Polats
O	97,6
0,25	72,4
0,25	90,9
0,5	52,5
0,5	70,3
1	50,1
1	35,3
2	20,1
2	29,6
4	20,1
4	12,8
Beispiel 13
Radioimmunologisches Bestimmungsverfahren für Polsäure unter
Verwendung von Se 75-markiertem Pteroyl-L-selenomethionin

Es wurde entsprechend Beispiel 12 gearbeitet mit der Ausnahme, daß das Se 75-Pteroyl-I/-selenomethio.nin (0,5 ng, spez.Akt.ca. 2,25 Ci/mMol) anstelle von Se-75~Pteroyl-L-methylselenocystein als Markierung verwendet wurde«

Prozentsatz des gebundenen markierten JTolats

Gewicht • (	der Polsäure ng)
0
0	,25
0	,25
0	,5
0	,5
	1
	1
	2
	2
	4
	4

42,2 25,7 27,6 22,1

19
20,8

21,9

16,7 15,5 16
13,7

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-X9-

Claims

Paten tansprüche

1, Verfahren zur Bestimmung einer Folatverbindung oder eines Gemisches von Verbindungen durch Sättigungsanalyse, wobei man die zu bestimmende Verbindung und eine radioaktiv-markierte Version dieser Verbindung(en), um die Reaktion mit einem bindenden Reagens für die Verbindung(en), das in einer solchen Menge vorhanden ist die nicht ausreicht, um mit der (den) gesamten vorhandenen Verbindung(en) und der markierten Version davon eine Bindung einzugehen in Konkurrenz treten läßt, die gebundene(n) Verbindung(en) von der (den) nicht-gebundenen Verbindungen) abtrennt und die radioaktive Konzentration eines oder beider Teile mißt, dadurch gekennzeichnet , daß man als radioaktiv-markierte Version der .3?olatverbindung(.en)

eine mit Selen 75-markierte verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konkurrenzreaktion in Form einer Proteinbindungs-Konkurrenzreaktion durchführt, wobei die Folatverbindung Folsäure und das bindende Protein ß-Laetoglobulin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als radioaktiv-markierte Version der Folatverbindung(en) eine solche der allgemeinen Formel III verwendet

— 2 —

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- Jt - 1A-45 860 -

•20·

wobei eine punktierte zweite Bindungslinie anzeigt, daß die

Bindung eine Einfach- oder Doppelbindung sein kann und X=H oder -CH-, und m = 0 oder 1 bedeutet (so daß das benachbarte Stickstoffatom dreiwertig ist) und entweder

<-(CO) -CH - NH ■>

(ÖH₂)_pSeQ

ist, wobei q = 0 oder 1, ρ = 1 oder 2 und Q = O₁H₂V₊I bedeutet, wobei χ eine Zahl von 1 bis 6, vorzugsweise 1. ist und wenn q = ist, η = 1 und Z=H ist und₍wenn q = 1 ist, η eine Zahl von 1 bis 13 und Z = OH bedeutet oder

b) R~/Ü0-CHY-CffiT-CH(C00H)FH_7ist, wobei eine der Gruppen Y=H und die andere -SeC H₂ ^ bedeutet, wobei χ eine Zahl von 1 bis 6, vorzugsweise 1, und Z = OH ist sowie Ester und Salze derartiger Säuren.

4. Analyseneinheit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 3, umfassend

a) eine mit Selen 75 markierte Tersion der zu bestimmenden Folatverbindung(en) und

b:)i ein bindendes Reagens das mit der (den) zu bestimmenden lOlatverbindung(en) eine Bindung eingeht»

5. Analyseneinheit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich

c) eine Menge der Folatverbindung zur Herstellung'von Standards;

d) Mittel zur Abtrennung' der'gebundenen Terbindung(en) von der (den) zu nicht-gebundenen VerbindungCen.) und .

e) mehrere Reagensgläser zur Durchführung der Analyse enthält.

•3

M.., ·■> 7/8 /tiB2,7". ■:: -U, ^

1A-45 860 .

6. Analyseneintaelt "naeta Anspructa 5> dadurch g e k e η η ζ e i c ta η e t , daß die zu analysierende PoIatverbindung Folsäure und das spezifische Reagens ß-Iactoglobulin ist.

7« Analyseneintaeit nach"Anspructa 4 bis 6, dadurch g e kennzeichnet, daß die radioaktiv-markierte Yersion der Verbindung eine solche der allgemeinen Formel III ist.

8. (Verbindung der allgemeinen Formel III

_n öl· LUC

tr\

wobei eine punktierte zweite Bindungslinie anzeigt, daß die Bindung eine Einfach- oder Doppelbindung sein kann und X=H oder -GH₇ und m = 0 oder 1 bedeutet ( so daß das benachbarte Stickstoffatom dreiwertig ist) und entweder

a) R

£(CO) -CII -HH }·

(CH₂)_pSeQ-

ist, wobei 1=0 oder 1, ρ = 1 oder 2 und Q = G^-Hg_x+1 bedeutet, wobei χ eine Zahl von 1 bio 6, vorzugsweise 1 ist und wenn q = ist, η = 1 und Z=H ist und wenn q = 1 ist, η eine Zahl von 1 bis 13 und Z =■ OH bedeutet oder

b) R /Ü0-GIDr-CHI-CH(C00H)NH_7ist, wobei eine der Gruppen Y = H und die andere -SeG R₀ ^,_Λ bedeutet, wobei χ eine Zahl von 1 bis

-Λ. £_.Λ_~Γ I

6, vorzugsweise 1 und Z = OH ist sowie Ester und Salze derartiger Säuren.

9. IT-Pteroyl-Se-methyl-L-selenocystein-Se 75 _ λ _

10. N-Pteroyl-L-selenomethionin - Se 75

11. K^r-Pteroyl-2-(Methylselen)~äthylamin Se 75.

6243 . ■

ORIGINAL INSPECTED

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