DE3016144A1

DE3016144A1 - Folsaeurederivate und verfahren zur herstellung

Info

Publication number: DE3016144A1
Application number: DE19803016144
Authority: DE
Inventors: Peter Rocco Farina; James Alex Grattan
Original assignee: Union Carbide Corp
Current assignee: Biochem Immunosystems US Inc
Priority date: 1979-04-30
Filing date: 1980-04-26
Publication date: 1980-11-06
Also published as: US4298735A; FR2455602A1; FR2455602B1; CA1150254A; US4326060A

Description

PATENTANWALT DR. HANS-GÜNTHER EGGERT₁ DIPLOMCHEMIKER

3 KÖLN 51, OBERLÄNDER UFER 90

Beschreibung :

Die Erfindung richtet sich allgemein auf neue Folsäurederivate und ihre Herstellungsverfahren. Ein Aspekt der Erfindung sind radio-jodierbare Folsäurederivate, die zur Verwendung bei radioimmunologischen Analysen und Konkurrenz-Eiweißbindungsanalysen (competition protein binding assays) geeignet sind. Ein anderer Teil der Erfindung stellt die Herstellung von Zusammensetzungen dar, die zur Verwendung als Liganden in Affinitätschromatographie oder als Hapten bei der Antigensynthese geeignet sind.

In den 4oer Jahren wurde die Struktur des Vitamins Folsäure aufgeklärt und selbständig synthetisiert. Dies wurde von R.B. Angier et al beschrieben in Science, 1o3, 667 (1946). Diese Verbindung wird auch bezeichnet als Pteroylglutaminsäure (I) und besteht aus einem Pterin, p-Aminobenzoesäure und Glutamatgruppen:

COOH I

CH COOH

_ η

OH

2-ar?.ino-4-hydroxy-6-methylr-ceridir.
(pterin)

p-Amino

Benzoesäure

L- Glutamat

Pteroinsäure

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- 1ο -

R.L. Blakley bezeichnet in seinem Buch Biochemistry of Folic Acid and Related Pteridines, John Wiley and Sons, NY 1969, Folsäure als notwendigen Co-Faktor bei der biologischen Übertragung einer Kohlenstoffeinheit auf verschiedene Oxydationsstufen. Die Bestimmung von Folsäure und anderen Folar-Cofaktoren oder von Derivaten ist von wesentlicher klinischer Bedeutung für die Diagnose von megaloblastisehen Anämien, nahrungsbedingtem Folatmangel wie er beispielsweise bei Alkoholismus auftritt und für die gesteuerte Dosierung bei der permanenten Chemotherapie von Leukämie.

Die augenblicklich am häufigsten verwendete nicht-mikrobiologischen Analysen der Radio-Analytikverfahren basieren auf einer Konkurrenzproteinbindung (competitive protein binding) zwischen radioaktiv markierten Folatderivaten und einem zweiten unbekannten Serum - Folat-Cofaktor - oder Arzneimitteln. Diese Verfahren basieren auf der Fähigkeit von spezifisch gebundenem Protein und spezifischen Liganden einen reversiblen Bindungs-Liganden-Komplex zu bilden. Es ist gut bekannt, daß man diese Analysen ausführt durch Zugabe einer bestimmten Menge an radioaktiv markierten Liganden zu einer Reihe von Proben, die Proteinbinder und bekannte Mengen eines Standard-Liganden enthalten. Während der Inkubation konkurrieren radioaktiv markierter Ligand und nicht dotierter Ligand an einer begrenzten Zahl von Stellen des Bindungsproteins. Nach der Inkubationszeit wird der gebundene Ligand vom freien Liganden abgetrennt und das Verhältnis von frei zu gebunden ermittelt. Es kann graphisch aufgetragen werden gegen die Dosierung und ergibt eine auswertbare Eichkurve. Eine Serumprobe kann dann nach dem gleichen Verfahren analysiert werden und die unbekannte

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Konzentration wird durch Vergleich mit der Eichkurve bestimmt. Einen erheblichen Fortschritt bei der radioimmunologischen Analyse stellt der in vielen Fällen erfolgte Ersatz von ß-Strahtern wie Tritium und Kohlenstoff-14 durch die leichter bestimmbaren Gammastrahler wie Jod 131 und Jod 125, Selen 75 und Kobald 57 und 6o dar. Unglücklicherweise kann die Einführung von stark radioaktiven Stoffen wie Jod die Bindung des radioaktiven Liganden an einen Binder verändern oder verhindern. Deshalb ist es extrem wichtig ein Vorläufermolekül auszuwählen, das sich schnell jodieren läßt und unter Analysenbedingungen auch konkurrierend reagiert.

Die vorliegende Erfindung richtet sich allgemein auf neue Derivate oder analoge Produkte von Folsäure der Formel (I) und auf abgeleitete Verbindungen wie Folatmetabolite und Folatgegenmittel, die als Pteroyltyrosine charakterisierbar sind. Diese Verbindungen sind etwa in der Größe herstellbar, die denen des Cofaktors von Arzneimittel und Metaboliten oder dergleichen am nächsten kommt aber sind trotzdem leicht jodierbar an entfernten Stellen. Frühere Vorschläge zur Dotierung von Folaten mit Radiojod 125 beruhten auf der Einfügung einer Radiojod annehmenden Gruppe in die Folsäure. Demgegenüber wird nun erfindungsgemäß vorgeschlagen, einen wesentlichen Anteil des Folsäuremoleküls durch einen Radiojod-Akzeptor zu ersetzen. Ein zusätzlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Derivate besteht darin, daß sie in üblicher Weise synthetisierbar sind und in der radio-jodierten Form annähernd stabil sind.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, neue Folsäurederivate aufzuzeigen, wie radioaktiv dotierte Pteroyltyrosine, Pteroyltyramine, Pteroy!histidine und dergleichen.

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Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Derivate oder Analoge von Folaten aufzuzeigen, die leicht und schnell mittels Radiojod dotiert werden können. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Herstellung von Folate enthaltende Zusammensetzungen aufzuzeigen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Folaten aufzuzeigen, bei der die neuen erfindungsgemäßen radio-jodierten Verbindungen in der Konkurrenz-Proteinbindungsanalytik und radioimmunologischen Analyse verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung sind ferner neue Antigene, Enzympaare , Imnunosorbentien und Affinitätsliganden, hergestellt durch Koppeln der neuen Folatderivate mit Proteinen, Enzymen, Polypeptiden, anorganischen Materialien, Polysacchariden oder Kunststoffmaterialien. Die Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst durch die Radiojod enthaltende Zusammensetzung gemäß Anspruch 1.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Abbildung zeigt eine Kurve, die die Dotierung von Folsäure und N -Methyltetrahydrofölsäure wiedergibt, die unter Verwendung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten mit Jod 125 Isotop dotierten Pteroyltyrosin erhalten wurde. Die Details des' Verfahrens sind in Beispiel 7 beschrieben.

In seiner breitesten Form richtet sich die Erfindung auf eine neue Klasse von Folatderivaten, ein Verfahren zu ihrer Herstellung in der radioaktiv dotierten und in der nicht-dotierten Form und ihre Verwendung zur Radioanalyse und z,ur in vivo

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Diagnose sowie zur Herstellung neuer Antigene, Immunosorbentien und polymergebundenen Formen von genetischen Verbindungen.

Die allgemeine Struktur der nicht dotierten Form der Verbindungen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden, wird durch die nachfolgende Formel wiedergegeben:

T Ti α

10 // CH₂-N-C⁷ V-C-X

Il I

In der Formel II bedeuten X den radioaktiv markierbaren Molekülteil der als Empfänger wirkt; R Wasserstoff, eine niedere Alkyl-, Formyl- oder Iminomethylgruppe;

R¹ und R" jeweils eine niedere Alkyl-, Hydroxyl-, Halo-, Amino- oder Acetamidogruppe und

R"' R oder eine Nitrosogruppe, wobei m die Werte 1,3 oder und η 0 oder 1 aufweisen.

Beispielsweise wenn m 4 ist sind die in der Stellung 5 und des Ringes befindlichen Stickstoffatome gesättigt und die Gruppe R kann Wasserstoff oder einer der vorstehenden Substituenten sein. Umgekehrt, wenn der Ring ungesättigt ist, findet sich nur ein Wasserstoff in der 7-Stellung und η ist O.

Die Struktur der erfindungsgemäßen Verbindungen in der undotierten Form kann auch als Pteroyltyrosin charakterisiert werden, das aus drei miteinander verbundenen Molekülteilen besteht: Einer substituierten Pteridingruppe, einer p-Aminobenzoylgruppe und einem radiodotierbaren Akzeptormolekülteil.

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Die zwei Letzteren stellen den Dipeptid-Anteil der allgemeinen Formel dar.

Es wird nochmals ausdrücklich klargestellt, daß die radiodotierbare Akzeptorkomponente erfindungsgemäß nicht eine an die Folsäure angebrachte Akzeptorgruppe darstellt, sondern durch Ersatz des L-Glutamatanteils der Säure durch einen solchen Molekülanteil eingebracht wird. Daraus folgt, daß die Gruppe X in der allgemeinen Forme], nicht die L-Glutamatgruppe ist und der dotierbare aromatische oder heterocyclische Ring von der p-Aminobenzoesäuregruppe durch eine gerade Kette von nicht mehr als 5 Atomen getrennt ist. Die Kette kann auch andere Atome als Kohlenstoff enthalten und substituiert sein und auch Seitenketten aufweisen, die keine nachteilige Wirkung auf die Reaktivität in der Konkurrenzbindungsanalyse und bei der radio-immunologischen Analytik aufweisen.

Die radio-dotierbare Empfängergruppe, die bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung vorhanden ist, kann eine einfache Aminosäure oder eine des-Carboxyaminosäure sein, die einen leicht radio-jodierbareh aromatischen Ring und eine primäre aliphatische Aminogruppe zur Bindung mit dem Rest des Moleküls durch eine Amidbindung aufweist. Beispiele für den Molekülteil X der allgemeinen Formel II sind die nachfolgend angegebenen Verbindungen:

H .N.

■NH-CH-COOT tyrosine (Z=H)

-NH-CH₂-CH₂ histamine

J! N

tyramine

CH₂-

-NH-CH-COOZ 5-hydroxytryptophan (Z=H)₁

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H -NH-CH-COOZ

-NH-CH-COOZ
histidin' (Z=H), ² (4'-hydroxyphenyl) glycin (Z=H) ,

und dergleichen, wobei Z Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe ist.

Vorzugsweise weist die erfindungsgemäße Zusammensetzung einen Molekülteil oder eine Gruppe X auf, die bis zu 24 Kohlenstoffatome aufweist, ganz besonders bevorzugt sind Gruppen, die bis zu 12 Kohlenstoffatomen aufweisen. Wie sich aus den vorstehenden Formeln ergibt, kann X selbstverständlich Stickstoff oder Sauerstoff oder andere Substituenten enthalten, die keine gegenteilige Wirkung auf die Verwendung der Verbindungen zur Konkurrenzproteinbindungsanalyse und zur radio-immunoanalytischen Verwendung haben.

Variationen im Pteridinteil der Moleküle können dazu dienen die Wirkung der anschließenden radioaktiven Markierung in einer Konkurrenzproteinbindungsanalyse (competitive protein binding assay) oder radioimmunologischen Analyse (radioimmuno-assay) zu verändern, um Spezifität zu erreichen für primäre Metaboliten von Folsäure, Folatantagonisten,verwendet als Arzneimittel, und ihre Metaboliten. Beispielsweise sind radioaktiv markierte Verbindungen,in

denen R = CH, oder CHO, R' = OH und R" = NH₉, wie N⁵-Methyl-

- 125 - 5

tetrahydropteroyltyrosin-/ J / und N -Formyltetra-

-125 - ~ hydropteroyltyrosin-^ J_/erfindungsgemäß markiert für

Konkurrenzbindungsanalysen und immunologische Analysen speziell für N⁵-Methyl- und N -Formyltetrahydrofolat. In glei-

eher Weise sind Verbindungen, bei denen R und N -H nicht

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vorhanden sind, R¹ = R" = NH₂ ist und R"¹ = CH₃ ist und X jeden brauchbaren radio-jodierbaren Empfänger darstellt (wie beispielsweise 4-Amino-4-deoxy-N -methylpteroyl—£2-(4*- hydroxyphenyl)-glycin/) brauchbare Markierungen für die Konkurrenzproteinbindungsanalyse und immunologische Bestimmung von Methotrexat.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann Pteroyltyrosin hergestellt werden durch Kondensation einer geschützten Pteroinsäure mit L-Tyrosinmethylester (L-TME) und anschließender alkalischer Hydrolyse zur Abspaltung der Ester und der schützenden Gruppe. Der Reaktionsablauf kann durch die nachfolgenden Formeln beschrieben werden:

(CF.C)_o0

CH₂-NK- ^hGOOH

OH

CF₃

/L₀

Cl ■ . OH

Ti 1 V

UK-CH-CCCH. ^> -^2-> ^-> CtI.

^ Ii ^ 2

• «n I

HOOC-CE-gH.

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Weil die Kondensation ausgeführt werden soll zwischen der Carboxylgruppe der Pteroinsäure und der Aminogruppe von L-TME muß der reaktive in 1o-Stellung befindliche Stickstoff der Pteroinsäure geschützt werden, daß er nicht mit sich selbst bei der Kupplungsreaktion reagiert. Als schützende Gruppe wurde die N-Trifluoroacetylgruppe (N-TFA) verwendet, die dann leicht wieder durch basische Hydrolyse entfernbar ist. Die für die Hydrolyse des Esters erforderlichen Bedingungen (o,1 N NaOH, Dampfbad, 45 Minuten unter Stickstoff) sind mehr als ausreichend zur Entfernung der N-TFA Gruppe. N -Trifluoracetylpteroxnsäure wurde hergestellt durch Umsetzung von Pteroinsäure mit reinem Trifluoracetanhydrid. Die 2-Aminogruppe der Pteroinsäure erfordert keinen Schutz bei der Umsetzung, weil sie relativ wenig reaktiv ist.

Die Kondensation von N -Trifluoracetylpteroinsäure mit L-TME erfolgt über gemischte Anhydride. Die Säure mit Isobutylchloroformat in einem nicht-reagierenden Lösungsmittel (Dimethylformamid) behandelt, das eine tertiäre Aminbase (Triäthylamin) enthielt, um das gemischte Anhydrid zu erhalten. Dieser Stoff wurde dann mit L-Tyrosinmethylester umgesetzt. Die anschließende Hydrolyse wurde mit verdünntem Alkalihydroxid (o,1 N NaOH) ausgeführt und eine sorgfältige Chromatographie mit einer Ionenaustauscherkolonne ergab nach dem Ansäuern Pteroyl-L-tyrosin.

Ein zweites Verfahren zur Synthese von Pteroyltyrosin basiert auf der Kondensation eines 6-Formylpterins mit einem p-Aminobenzoesäureester oder Amid und Reduktion der gebildeten Schiff'sehen Base zum N °-Sekundäramin.

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Das erfindungsgemäße Pteroylterosin wurde durch Veränderung der zuvor beschriebenen Wege über Aldehyde hergestellt, wie es sich aus den nachfolgenden Formeln ergibt:

H_Nv ^N^ ^N

·■

NH

CHO

JfNV- ^0H TFA/Eisessig^

COOCH.

OH

HOAc

. O\ /r

N CH₂-Kh-

ο σ

Il I

OH

0.IN NaOH . H

+ 2

CH₂-NH

O CH,-/' ' H I 2 \=

OH

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Die aus 6-Formylpterin und p-Aminobenzoyl-L-tyrosinmethylester (H-PABA-L-TME) gebildete Schiffsche Base wurde hergestellt in einer 1:1-Mischung von Trifluoroessigsäure und Eisessig (HOAc) bei Raumtemperatur. Die Lösungsmittel wurden dann im Vakuum entfernt und der Rückstand in Eisessig suspendiert. Zur Reduktion der Schiffchen Base wurde Dimethylaminboran hinzugefügt und der Pteroyltyrosinmethylester erhalten. Durch basische Hydrolyse der Estergruppe entsteht Pteroyl-L-tyrosin.

Die Verwendung von Trifluoressigsäure als Lösungsmittel bei der ersten Kondensation stellt ein neues Verfahrensmerkmal dar. Trifluoressigsäure ist ein gutes Lösungsmittel für Pteridinderivate und bei Anwesenheit großer Mengen dieses Lösungsmittels ist es möglich, die Kondensation des im allgemeinen völlig unlöslichen 6-Formylpterin mit p-Aminobenzyltyrosinmethylester in homogener Lösungsphase mit relativ großen gelösten Mengen auszuführen. Die Iminbildung (Schiffk:he Base) ist eine durch Säure katalysierte Umsetzung, aber in Gegenwart einer zu starken Säure verhindert die vollständige Protonisierung des Amins die Kondensation mit dem Aldehyd. Trifluoressigsäure ist eine sehr starke Säure und würde üblicherweise ein schlechtes Mittel zur Iminbildung sein. Wegen der geringen Basizität des Amins, (eines Anilins) ist ' die Protonisierung nicht vollständig und die Reaktion tritt schnell und vollständig in einer Mischung aus 5o % Trifluoressigsäure und 5o % Eisessig als Lösungsmittel für die vorstehend beschriebene Kondensationsreaktion.

Unter der Voraussetzung, daß das 6-Formylpterin löslich ist, können reine Trifluoressigsäure und andere starke Säuren in Mischung mit Lösungsmitteln wie Trichloressigsäure -

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- 2ο -

Methylenchlorid, Trichloressigsäure/Essigsäure, Methansulfonsäure/Essigsäure und anderen für die Kondensationsreaktion verwendet werden.

Vor dem Reduktionsschritt muß die Trifluoressigsäure oder andere starke Säure von der Schifffchen Base abgetrennt werden. Die Reduktion von Iminen mittels Dimethylaminboran wird im allgemeinen in Eisessig vorgenommen. Starke Säuren wie Trifluoressigsäure reagieren im allgemeinen schnell mit Aminoboranen und müssen deshalb bei der Reduktion abwesend sein. Andererseits reagiert Essigsäure nicht mit Dimethylaminoboran oder zumindestens nicht konkurrierend mit der schnellen Iminreduktionsreaktion (Halbwertszeit von Minuten). Ameisensäure und andere Aminoborane können ebenfalls für die Reduktionsstufe verwendet werden. Erfindungsgemäß werden jedoch die Aminoborane bevorzugt wegen ihrer Milde, Einfachheit und schnellen Wirksamkeit.

Ein Vorteil der Wahl von 6-Formylpterin anstelle von

2
N -Acetyl-6-formylpterin für die Synthese von Pteroyltyrosin und Folat^Änalogen dieses Types besteht darin, daß eine

2 Behandlung mit Basen zur Entfernung einer N -Schutzgruppe nicht erforderlich ist. Deshalb stellt der erfindungsgemäße vorstehend beschriebene Syntheseweg eine Möglichkeit der direkten Herstellung einer Verbindung dar, bei der eine

2
freie N -Stickstoffbindung (Amingruppe) und eine Estergruppe im radioaktiv-dotierbaren Molekülteil entstehen. Wenn

2
andererseits eine N -Acylgruppe im Endprodukt gewünscht ist,

2 geht man einfacher Weise von einem N -acylierten 6-Formylpterinderivat aus. Weiterhin ist es möglich, die freie Säureform von Pteroylaminosäurederivaten direkt zu erhalten, wenn man von der freien Säureform des p-Aminobenzyolpeptids ausgeht (beispielsweise von p-Aminobenzoy!tyrosin oder

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p-Aminobenzoylhystidin usw.) Pteroyltyrosin wurde demgemäß hergestellt aus 6-Formylpterin und p-Aminobenzoyltyrosin und dabei die sonst als letztes erforderliche Esterhydrolyse mittels Basen des Kupplungsproduktes vermieden. Deshalb sind die in Beispiel 1f wiedergegebenen Bedingungen für die Reaktion (2) nicht optimal und das dabei erhaltene Produkt war weniger rein als das Kupplungsprodukt des Esters, das anschließend hydrolysiert wurde. Trotzdem ist das durch Kuppeln mit p-Aminobenzoyltyrosin erhaltene Pteroyltyrosin radiojodierbar und nach Reinigung mittels Gel" Chromatographie in seiner Wirkungsweise bei der Verwendung zur Folat-Konkurrenz-Proteinbindungsanalyse wie das das hergestellt wurde durch Hydrolyse des Esters.

Wie bereits geschildert, weisen die nach den bekannten Verfahren hergestellten radio-jodierten (Jod 125 Isotop) Folate eine Verlängerung der Folsäure durch das covalente Kuppeln des Radiojodakzeptors an einer der zwei Glutamyl-Carboxylgruppen auf. Zusätzlich zum'begrifflich anderen Aufbau weisen die bekannten mit Radiojod 125 dotierbaren Folate sehr nachteilhafte Syntheseprobleme auf, die bei den erfindungsgemäßen Verbindungen und ihrer Herstellung nicht vorhanden sind. Insbesondere haben alle bekannten mit Radiojod 125 dotierbaren Folate nur eine radio-jodierbare Gruppe, die sich am Glutamat befindet. Weil der Glutamylrest aber zwei reaktive Carboxylgruppen aufweist, entsteht bei der Synthese der gewünschten verlängerten Folsäureverbindungen notwendigerweise eine statistische Mischung aus di-substituierten und zwei möglichen monosubstituierten Verbindungen, oder eine aufwendige Schutz und Wiederabspaltungschemie mit verschiedenen Reaktionsschritten ist erforderlich, um eine der Carboxylgruppen zu blockieren und dadurch das Kuppeln an der einen erwünschten Stelle zu erreichen.

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Im Gegensatz zu den bekannten mit Jod 125 radioaktiv dotierten Folaten stellen die erfindungsgemäßen Pteroyltyrosine und seine mit Radiojod 125 dotierten Derivate neuartig strukturierte radioaktiv dotierte Folate dar, bei denen ein Teil des Folsäuremoleküls, nämlich die Glutamatgruppe durch eine radio-jodierbare Gruppe ersetzt ist. Dieses veränderte Strukturbild und die entsprechenden Verfahren ermöglichen es erfindungsgemäß die Molekulargröße so nah als möglich an den gewünschten Analysenzweck anzunähern. Diese Anpassung ist einzigartig, weil bei derartigen Molekülmodifikationen stets das Risiko besteht, daß Strukturmerkmale beseitigt werden, die wichtig oder sogar notwendig für die Proteinbindung sind, obwohl man bestrebt ist, annähernd die molekularen Dimensionen einzuhalten, um ein gutes Bindungsvermögen zu sichern. Diese neue Technik wurde erläutert mit Pteroyltyrosin, das mit dem Jodisotop 125 radioaktiv dotiert ist, bei einer Folatkonkurrenz-Proteinbindungsanalyse im für klinische Anwendung wichtigen Konzentrationsbereich. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen leicht auf direktem Wege synthetisierbar sind und dabei die den bekannten Synthesen von mit Jod 125 radio-dotierbaren Folaten innewohnenden Schwierigkeiten vermieden werden.

Das im allgemeinen die erfindungsgemäßen Verbindungen leicht und schnell radio-jodierbar sind, wird gezeigt durch die Radio-Jodierung von Pteroyltyrosin zur Bindung der nachstehenden Formel:

12S₁

C-NH-CH-COOH

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Üblicherweise beträgt die Jodaufnahme etwa 9o % beim Dotieren von 2,5 bis 5,ο μg Pteroyltyrosin mit 1 mCi von Jod 125. Die Raktionsmischung wurde fraktioniert mittels einer kurzen Gelfiltrationskolonne und mehrere Fraktionen bei mehreren Maxima des Hauptradiojodierten-Peaks des Gelchromatogrammes wurden zur Verwendung in der Radio-Analytik zusammengefasst.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in ihrer radiojodierten Form geeignet als radio-aktiv markierte Körper in der Konkurrenz- Proteinbindungsanalyse und immunologischen Analysen zu fungieren. Schließlich erlauben die gewählten Substituenten die Synthese von radioaktiv dotierbaren Verbindungen zur Bestimmung und Quantifizierung von Spezien wie Folsäure, Methotrexat (einem Krebs-Chemotherapeutikum in Form eines Folatantagonits) und Hauptmetaboliten und/oder wichtige umlaufende Formen von Folsäure und Methotrexat und anderen potentiellen Folatantagonisten. Es wurde gefunden, daß mit Jod 125 jodiertes Pteroyltyrosin ein effektiv wirksames radio-dotierbares Produkt ist für empfindliche Wettbewerbsproteinbindungsradioanalysen von Folsäure im Konzentrationsbereich von 0 bis 2o ng/ml. Weiterhin kann gezeigt werden, daß die Veränderung von Analysenparametern wie Puffer, pH-Wert und Natur des Proteinbinders ausgenutzt werden können zur Modulation der Analysensignale der zwei wichtigsten hauptumlaufenden Formen von Folaten: von Folsäure und N-5-Methyltetrahydrofolsäure (N -Methyl THF). Bei hohen pH-Werten stimmen die Eichkurven für Folsäure und N -Methyl-THF, ermittelt unter Verwendung von mit Jod 125 radioaktiv dotiertem Pteroyltyrosin besser überein als bei niederen pH-Werten.

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Radiojodierung von biologischen Verbindungen hat häufig markante chemische Instabilität und anschließende Zersetzung der Radiodotierung zur Folge. Dieses Problem tritt häufig dann bei der Radiodotierung auf, wenn die zu jodierenden Verbindungen empfindlich gegenüber Sauerstoff, Licht oder extremen pH-Werten sind, das bekanntlich bei Folsäure und einigen Derivaten der Fall ist. Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die bemerkenswerte Stabilität der mit Jod 125 Isotop radiojodierten Pteroyltyrosine, die keine Zersetzung unter Analysenbedingungen während einer Zehn-Wochen-Periode zeigen, während sie in 5o %iger wässriger Propylenglykollösung gelagert sind.

Die Radiojodierung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch ein oder mehrere der bekannten Methoden erfolgen und wird in den Beispielen noch erläutert. Alternative Verfahren zur Radiojodierung der erfindungsgemäßen Moleküle sind beispielsweise die Lactoperoxidase, elektrolytische und Jod-Monochlorverfahren, die in manchen Fällen Vorteile bieten und dann angewandt werden. Sie sind bevorzugt, wenn beispielsweise die Ausgangsprodukte gegenüber organischen Oxydantien empfindlich sind. Die Radiojodierung der X-Gruppen der erfindungsgemäßen Verbindungen kann mit den Isotopen Jod 125, Jod 131 und Jod 123 erfolgen.

Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die der Gruppe X in der allgemeinen Formel innewohnende Reaktivität bezüglich elektrophiler aromatischer Substitution (z.B. Radiojodierung) ausgenutzt und erlaubt einfache covalente Immobilisierung auf unlöslichen Trägermaterialien. Beispielsweise kann diazotiertes Poly(p-aminostyrol) schnell reagieren mit den erfindungsgemäßen Komponenten und Azoverbundene Produkte bilden, wie es in Beispiel 9 wieder-

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gegeben ist. In einigen Fällen weist die Gruppe X bei Verbindungen der allgemeinen Formel II zusätzliche Funktionalität auf, beispielsweise eine Carbonsäure, wenn "X eine Aminosäure ist, wobei dann die erfindungsgemäßen Verbindungen mit Makromolekülen verbunden werden können, wie es in Beispiel Io beschrieben ist. Unlöslich gemachte (immobilisierte) Formen der neuen erfindungsgemäßen Verbindungen sind brauchbar als Sorptionsmittel (affinity sorbents) zur Trennung und Reinigung von Enzymen, Antikörpern, Bindungsproteinen und anderen Molekülen, die komplexe mit Folsäure, Methotrexat und abgeleiteten Metaboliten, Analogen und ihren Derivaten bilden.

Die Erfindung wird nun anhand der Beispiel noch näher beschrieben.

Beispiel 1 Herstellung von Pteroyltyrosin aus 6-Formylpterin

a) N-Carbobenzoxy-p-aminobenzoesäure (Z-PABA-OH)

In einem Dreihalsrundkolben mit 5oo ml Inhalt wurden 3oo ml Wasser gegeben, zusammen mit 33,55 g (o,4 Mol) Natriumbicarbonat und 19,33 g (o,14 Mol) p-Aminobenzoesäure (PABS). Die resultierende Lösung wurde mechanisch gerührt und 25,ο ml (3o,o g, o,18 Mol) von Carbobenzoxychlorid tropfenweise während einer Stunde zugefügt. Nachdem die gesamte Menge eingebracht war, hatte sich eine dicke weiße Suspension gebildet, die über Nacht nachgerührt wurde. Die Suspension wurde abgesaugt und das Filtrat A und der gewonnene Feststoff B der Weiterverarbeitung zugeführt. Das Filtrat A wurde mit konzentrierter Salzsäure auf pH 1 eingestellt und der gebildete weiße Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen bis das Filtrat neutral war. Dieser Niederschlag wurde aufgelöst in 1N NaOH und mit 1oo ml Äther au,sgeschüt-

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tet. Die Ätherschicht wurde erneut extrahiert mit 60 ml 1N NaOH und die wässrigen Phasen wurden vereinigt. Durch Ansäuern der vereinigten basischen Schichten auf einen pH-Wert von 1 wurde ein voluminöser weißer Niederschlag erhalten, der auf einem Filter gesammelt und mit Wasser gewaschen wurde bis zur Neutralität des Filtrats. Durch Auflösen in 2oo ml Äthylacetat wurde der Hauptanteil des Wassers entfernt, nachdem sich einige ml Wasser schnell abgesetzt hatten. Die Lösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und die farblose Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft. Die Ausbeute betrug 6,o5 g N-Carbobenzoxy-paminobenzoesäure in Form eines weißen Pulvers.

Zusätzlich wird noch Material aus dem ursprünglichen Filterkuchen (B) in vergleichbarer Weise gewonnen. Zuerst durch Auflösen in 1N NaOH, waschen mit Äther und Ansäuern der wässrigen Schicht bis zu pH 1 mit konzentrierter HCl. Der resultierende weiße Niederschlag wurde auf einem Filter gesammelt und mit Wasser gewaschen, von Wasser befreit und zur Trockne gebracht, wie vorstehend bereits beschrieben. Die Ausbeute betrug 2o,16 g eines weißen Feststoffes. Dieser wurde weiter gereinigt durch Umkristallisieren in Azeton/Cyclohexan, Nach dreimaligem Umkristallisieren betrug die Gesamtausbeute 16,85 g kristalline N-Carbobenzoxy-paminobenzoesäure mit einem Schmelzpunkt von 217,ο bis 218,ο C.

Gesamtausbeute 22,9o g (60 %).

Berechnete Analyse für C₁₅H₁₃NO₄IC, 66,41; H, 4.83; N, 5.16.

Gefunden: C, 66.26; H, 4.64; N, 5.16.

nmr (DMSO, d_g; & ): 5.25 (s, 2H, Benzyl CH₃); 7.45 (s, 5H,

Cbz aromatisch); 7.87 (Schwerpunkt für A₃B₃ "Quartett", 4H,

PABS aromatisch); 1o.17 (s, 1H, COOH).

ir (KBr, μ): 5.9ο, 5.99 (Doublet, Urethan und Säure).

UV (Methanol) : (\. _m=lv258 nm (24,5oo) .

Iu el X

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3Q16H4 - η -

b) N-Carbobenzoxy-p-aminobenzoyl-L-tyrosinmethy!ester (Z-PABA-TME)

N-Carbobenzoxy-o-aminobenzoesäure (9,6o g, o,o35 Mol) wurden in 175 ml Tetrahydrofuran in einem 5oo ml fassenden Rundkolben aufgelöst. Der Kolben wies einen Magnetrührer auf. Die Lösung wurde mittels eines Eiswasserbades auf -1o°C abgekühlt. N-Methylmorpholin (4,12 ml, o,o37 Mol) wurden auf einmal zugegeben und kurz darauf 4,8 ml (5,o5 g, o,o37 Mol) Iso-butylpyroformiat zugefügt. Eine weiße milchige Suspension bildete sich und es wurden 5 min nachgerührt. Zu der Suspension wurden bei -1o C tropfenweise unter Rühren hinzugefügt eine Lösung von L-Tyrosinmethylester (7,6o g, o,o39 Mol) in 25 ml Dimethylsulfoxid und 75 ml Tetrahydrofuran während einer Zeitspanne von 15 min. Nach vollständiger Zugabe wurde die Reaktionsmischung bei -1o°C für zwei bis drei Stunden gerührt. Anschließend wurde das Erwärmen auf Raumtemperatur zugelassen und über Nacht weiter gerührt. Die Mischung wurde dann filtriert und der Niederschlag mit Tetrahydrofuran gewaschen und die kombinierten Filtrate unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei leichtem Erwärmen auf 3o bis 35 C konzentriert. Der Rückstand, eine viskose gelbe DMSO-Lösung wurde¹ mit 1oo ml Wasser und 2oo ml Äthylacetat behandelt. Nach dem Ausschütteln trennt sich eine wässrige Schicht von der organischen Schicht ab und die organische Schicht wurde anschließend mehrmals mit jeweils 1oo ml extrahiert. Die organische, Äthylacetat enthaltende Schicht wurde über Magnesiunsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne in einem Rotationsverdampfer gebracht. Der Rückstand wurde umkristallisiert aus Äthylacetat und Cyclohexan. Die Ausbeute an N-Carbobenzoxyp-aminobenzoyl-L-tyrosinmethylester (Z-PABA-L-TME) betrug 5,88 g (37 %) mit einem Schmelzpunkt von 171,5 bis 172°C, (a)_D ²⁵ -67,2°C (c=1,o, Methanol).

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Berechnete Analysenwerte für ^C25^H24^N2°6^{: C}' ⁶⁶·⁹⁵? ^H' 5.39; N, 6.24.

Gefunden: C, 66,72; H, 5,25; N, 6,26.

nmr (Aceton, D_g; S ): 3,o8 (asymmetrisch d, J = 8Hz, 2H, Tyr CH₂);

3.67 (s, 3H, CH₃); 4.85 (m, 1H, Tyr CH); 5.18 (s, 2H, Cbz CH₃); 6,95 (Schwerpunkt für A₃B₃ "Quartett", 4H, Tyr aromatisch); 7,38 (s, 3H, Cbz aromatisch); 7.73 (Schwerpunkt für A₃B₃ "Quartett", 4H, PABA aromatisch).

ir (KBr Tablette, μ): 5,8 - 5,9 (breit; Amid, Ester und Urethan).

UV (Methanol); Λ ²^⁵ ™ (3o,7oo).

max

c) p-Aminobenzoyl-L-tyrosinmethy!ester (H-PABA-L-TME)

In einen 2oo ml Rundkolben mit einem Magnetrührer und einem Gaseinlassrohr wurden 2,38 g (5,3ImMoIe von Z-PABA-L-TME) und 60 ml Methanol eingebracht. Zu der Lösung wurden 265 mg von 5 % Palladium auf Kohlenstoff hinzugefügt, die zuvor zweimal mit 3 ml Methanol gewaschen worden war. Wasserstoff wurde durch die gerührte Suspension für die Dauer einer Stunde hindurch geleitet und dann zusätzlich 265 mg gewaschenen Katalysators hinzugefügt und die Wasserstoffdurchleitung für weitere zwei Stunden fortgesetzt. Am Ende dieser Zeit waren keine Spuren von CO₃ im austretenden Gas mittels gesättigter Bariumhydroxidlösung nachweisbar. Der Katalysator wurde durch Filtrieren entfernt unter Verwendung eines Standardsuperzellfilters (JM) und gewaschen mit einem großen Überschuss von heißem siedendem Methanol. Das Filtrat wurde in einem Rotationsverdampfer zur Trockne gebracht und ein kristalliner Rückstand erhalten (1,58 g, 95 % pro Ausbeute). Umkristallisation mittels 2oo ml Chloroform, das eine kleine Menge von Äthylacetat (5 bis 1o ml)

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enthält, ergab 1,44 g (86 %) p-Aminobenzoyl-L-tyrosinmethylester in Form hellbrauner Nadeln mit einem Schnelzpunkt von 169,5 bis 17o,5°C.

(a)_D ²⁵-76,4° (C=1,o, Methanol).

Berechnete Analysedaten für C₁₇H₁₈N₃O₄ : C, 64,49; H, 5,77; N, 8,91.

Gefunden: C, 64,80; H, 5,63; N, 9,08.

nmr (DMSO) dg/): 2,98 (asym. d, J = 8 Hz, 2H, Tyr CH₃); 3,56 (s, 3H, CH₃); 4,55 (m, 1H, Tyr CH); 5,63 (s, 2H, Cbz CH₃); 6,3 - 7,8 (8 Resonanzen, 8H, Paar von aromatischem A₃B₃ "Quartett"); 8,62 (d, J = 8 Hz, 1H, Amid NH).

ir (KBr, μ): 5,79 (Ester); 6,19 (Amid) UV (Methanol); ? _mav 281 nm (21,1oo).

ι *■ III α. Χ

d) p-Aminobenzoyl-L-tyrosin (H-PABA-L-Tyr-OH)

Eine Probe von H-PABA-L-TME (1,o6 g, 3,3TmMoIe) wurde in 15o ml o,1N NaOH unter Rühren aufgelöst. Nach 1,5 Stunden wurde die Lösung mit 5o ml Äthylacetat extrahiert und die organische Schicht abgetrennt. Die wässrige Schicht wurde mit konzentrierter HCl angesäuert auf pH-Wert 5 bis 6 und mit Äthylacetat (4x5o ml) extrahiert. Die Gesamtmengen an Äthylacetat wurden vereinigt und drei Mal mit je 5o ml Wasser gewaschen und in einem Rotationsverdampfer zur Trockne gebracht. Es entstanden o,41 g eines braunen Schaumes. Die original wässrige Schicht wurde zusätzlich angesäuert auf pH 3,4 bis 3,8 und ebenfalls mit Äthylacetat extrahiert (2x2o ml und 1x3o ml). Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt und vier Mal mit 3o ml Wasser gewaschen. Durch Eindampfen der organischen Schicht in einem Rotationsverdampfer wurden o,32 g eines farblosen Schaumes erhalten. Die beiden Rückstände der Konzentrationen im Rotationsverdampfer wurden vereinigt und aus Äthylacetat umkristallisiert. Es entstanden 28o,8 mg feiner Prismen mit einem

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- 3ο -

Schmelzpunkt von 178,5 bis 18o°C.

(a) -59,4° (c=1,o, Methanol). Das nmr-Spektrum des Stoffes zeigte die Anwesenheit von Äthylacetat an, obwohl die Probe bei Raumtemperatur im Vakuum (o,1 mm Hg) für mehrere Stunden getrocknet worden war. Offenbar kristallisiert das Dipeptid mit Äthylacetat als Kristallflüssigkeit. Ungefähr o,5 Mole Äthylacetat pro Mol H-PABA-L-Tyr-OH waren im Kristall nach dem Trocknen enthalten.

nmr (DMSO, d_g; J ); 1,17 (t, J = 7Hz, Äthyl CH₃ von Äthylacetat;

1,98 (s, CH₃CO von Äthylacetat); 3,ο (asym. d, J = 7 Hz, 2H, Tyr CH₂);

4,o5 (q, J = 7 Hz, CH₃ von Äthylacetat); 4,55 (m, 1H, Tyr CH); 6,4-7,8 (8 Resonanzen, 8 H, Paar von Aromaten A₃B₃ "Quartett"); 8,o7 (d, J = 8 Hz, 1H, Amid NH, austauschbar).

UV (Methanol): ^ _m^ 278 ran (25,9oo).

max

e) Pteroyl-L-tyrosinmethylester (Pt-L-TME)

Ein 5o ml Rundkolben mit einem Magnetrührer wurde verwendet und 12o,5 mg (ο,63 mMol) von 6-Formylpterin wurden eingebracht. Dieses Material wurde hergestellt nach dem Verfahren von Viscontini und anderen (M. Viscontini, R. Provenzale, S. Ohlgart und J. Mallevialle, Helv.Chim.Acta, 53, 12o2 (197o) und (M. Viscontini und J. Bieri, Helv.Chim.Acta, 54, 2291 (1971). Ferner wurden hinzugefügt 49o,2 mg (156 mMole, 2,47 Äquivalente) von H-PABA-L-TME und 4 ml Eisessig. Unter Rühren wurde H-PABA-L-TME gelöst, aber das gelbe Aldehyd verblieb in Suspension. Der Kolben wurde mit Argon gefüllt und anschließend 3 bis 4 ml Trifluoressigsäure langsam hinzugefügt, .eine vollständige Auflösung der suspendierten Feststoffe zu erreichen. Das Rühren wurde anschließend für weitere 3o Minuten fortgesetzt. Das meiste Lösungsmittel wurde dann durch leichtes Erwärmen von der dunkelbraunen Lösung

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abgetrieben (4o C) unter Verwendung eines RotationsVerdampfers. Der feuchte braune Rückstand wurde im Hochvakuum (o_fo5 mm Hg) bei Raumtemperatur zur Trockne gebracht und der Kolben mit Aluminiumfolie abgeschirmt,um Licht auszuschließen. Es entstand ein brauner Schaum oder eine glasige Masse. Zum Aufheben des Vakuums wurde Argon in den Kolben eingeleitet. Mit 4 ml Eisessig wurde durch intensives Schütteln und Rühren (unter Argonatmosphäre) der Rückstand von den Wänden abgelöst und eine leicht gelb-braune Suspension erhalten. Zur gerührten Suspension wurden 37,2 mg (ο,631 mMole, 1 Äquivalent) Dimethylaminboran hinzugegeben. Die Farbe änderte sich sofort nach orange-braun und nahezu der gesamte Feststoff ging in Lösung. Nach einer Stunde wurden 8 bis 1o ml Eisessig hinzugefügt, um den Hals und die Wände der Flaschen abzuspülen. Die Reaktionsmischung wurde unter leichtem Erwärmen (4o C) in einem Rotationsverdampfer zu einem viskosen Rückstand eingeengt. Zum Rückstand wurden zwei Mal 25 ml Toluol hinzugefügt und durchgemischt und dies dann im Vakuum unter leichtem Erwärmen abgetrieben, um den Eisessig als Azeotrop mit Toluol zu entfernen. Anschließend wurde der Rückstand des verdampften Toluols im Hochvakuum bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet. Zu dem erhaltenen braunen Schaum wurden in den Kolben 3o ml Äthylacetat hinzugefügt und der Schaum mittels eines Spachtels von den Kolbenwänden abgelöst, um eine Suspension zu bilden. Diese wurde über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Mittels Zentrifugieren wurden unlösliche gelb-orange Feststoffe von der überstehenden gelben Lösung abgetrennt. Der tablettierte Rückstand wurde erneut in Äthylacetat suspendiert und zentrifugiert, insgesamt das Verfahren drei Mal wiederholt bis das Äthylacetat am Ende farblos war. Dann wurde der tablettierte Feststoff erneut in einer kleinen Menge von Äthylacetat suspendiert und auf einer Glasfritte unter Druck in Argonatmosphäre mit mehreren kleinen Mengen von Äthylacetat gewaschen, anschließend im

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3016UÄ

Argonstrom der gesammelte Filterkuchen unter Druck während einer Stunde getrocknet.

Ausbeute: 174, mg (56 %) gelb-gefärbtes Pulver, identifiziert als Pteroyl-L-tyrosinmethylester. Schmelzpunkt: 23o bis 35o°C (langsame Zersetzung). nmr (DMSO, dg,- S ): 3,59 (s; 3H, Ester CH_e) ; 4,48 (breit s, 3H, C-9 CH₂ und Tyr CH); 6,6 - 7,6 (6 Linien Multiplett, 8H, überlappendes Paar Aromaten A₃B₃ "Quartett"); 8,3o (d, J=8 Hz, Amid NH, austauschbar); 8,65 (s, 1H, C-7 H).

Massenspektrum (Feld Desorption): m/e 489 (I00 %), 314, 2o7, 192.

f) Pteroyl-L-tyrosin (Pt-L-Tyr-OH)
1) Hydrolyse von Pt-L-TME

In einem 5o ml Rundkolben wurden 122,ο mg (o,25 mMole) Pteroyl-L-tyrosinmethylester unter Argon mit 1o ml o,1 N NaOH versetzt. Die Natronlauge war vorher durch Durchleiten von Argon entgast worden. Der Kolben wurde dann verschlossen und 1o Minuten geschüttelt, um den Feststoff aufzulösen. Eine dunkel-gelb-braune leicht trübe Lösung wurde erhalten. Nach weiteren 35 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung abfiltriert durch ein gemischtes Zelluloseestermilliporenfilter (1,2 μ nominelle Porenweite). Das klare braune Filtrat wurde mit 1,o N HCl angesäuert und der pH-Wert auf 2 eingestellt. Dabei entsteht ein voluminöser gelatine-brauner Niederschlag. Die Suspension wurde in der Kälte (4-5°C) für 15 Minuten bei 14.000 Upm zentrifugiert und die überstehende Lösung abdekantiert. Der tablettierte Rückstand wurde mit 1 N HCl (2x2o ml) gewaschen,

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3Q16U4

dann mit (2x2o ml) destilliertem Wasser nachgewaschen, anschließend mit absolutem Alkohol (2x2o ml) und Äthyläther (2x2o ml) durch Aufsuspendieren und erneutes Zentrifugieren weiter gereinigt. Der gewaschene Feststoff wurde im Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet und- es wurden 61,1 mg (52 %) eines tief-braunen Feststoffes erhalten, identifiziert als Pteroyl-L-tyrosin.

UV (o,1 N NaOH): Λ _mav 249 (25,5oo), 283 (21,7oo), 362 nm

IUaX

(7,8oo); angesäuert auf pH 1,8 mit Konc. HCl: Λ 224 (29,5oo), 256 (25,2oo), 28o nm (18,2oo). nmr (DMSO, dg,- £): 4,46 (m, 3H, C-9 CH₂ und Tyr CH); 6,6-7,6 (6 Resonanzen, 8H, überlappendes Paar von Aromaten A₂B₂ "Quartett"); 8,13 (d, J = 8Hz, 1H, Amid, NH, auswechselbar); 8,64 (s, 1H, C-7 H).

Massenspektrum (Feld Desorption): m/e 475 (M ), 457, 429, 415, 413, 313, 312, 3oo, 293, 282, 268.

2) Kondensation von 6-Formylpterin mit H-PABA-L-Tyr-OH

Ein 25 ml Rundkolben mit Magnetrührer wurde in Folie eingehüllt, um Licht auszuschließen und mit Argon gefüllt. Eine Probe von 6-Formylpterin (1o9,o mg, o,57 mMole) wurde in den Kolben eingebracht und in 1,o ml Trifluoressigsäure gelöst. Nach 15 Minuten rühren war der gesamte Aldehyd gelöst in Form einer gelben Lösung. H-PABA-L-Tyr-OH (216,ο mg, o,72 mMole, 1,26 Äquivalente) wurden auf einmal zugegeben und zur Vermeidung von Ausfällungen noch 1,o ml Trifluoressigsäure hinzugefügt. Für weitere 15 Minuten war ein ständiges Schütteln und Rühren erforderlich, um vollständige Auflösung zu erreichen. Die dunkel-braune Lösung wurde zusätzlich noch 4o Minuten nachgerührt.

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Dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgetrieben und ein dickes braunes öl, das noch Trifluoressigsäure enthält, als Rückstand gewonnen. Nach Zugabe von 7 ml Eisessig zu dem öl entstand eine Suspension eines leicht gelben Feststoffes in einer dunkel-braunen überstehenden Flüssigkeit. Der Kolbeninhalt wurde zur Trockne mittels eines Rotationsverdamfers gebracht bei Temperaturen von 45 bis 5o C. Der gelb-braune Rückstand wurde in 2 ml Eisessig erneut suspendiert und 26,2 mg (o,28 mMole) Pyridinboran hinzugefügt. Nach 3o Minuten wurde die Essigsäure im Rotationsverdampfer bei 49°C abgetrieben und ein braun-gelber Rückstand erhalten. Der Rückstand wurde in 1o ml entgastem Äthylacetat suspendiert, unter Argon abfiltriert und im Argonstrom während 3o Minuten getrocknet.

Ausbeute: 224,3mg rohes Pt-L-Tyr-OH. Das.nmr-Spektrum dieses Stoffes wies Resonanzen auf, die übereinstimmen mit den reineren Proben, die durch Hydrolyse von Pt-L-TME erhalten wurden. Die nicht identifizierbaren Resonanzen des Spektrums ließen den Schluss zu, daß der Reinheitsgrad nur 3o bis 5o % betrug. Eine Probe dieses Materials (2oo mg) wurde der weiteren Reinigung unterzogen durch Auflösen in 1o ml o,1 N NaOH und Ausfällen durch Ansäuern mit 1,o N HCl auf pH-Wert 2,5. Der durch Zentrifugieren abgetrennte Rückstand wurde mehrmals mit absolutem Alkohol und mehrmals mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 1oo mg eines braunen Feststoffes. Die direkte Radio-Jodierung des Stoffes ergab einen isolierbaren Anteil, der durch Konkurrenz Proteinbindungsanalyse als Jod 125 Isotop enthaltendes Pteroyl-L-tyrosin identifiziert wurde.

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Beispiel 2 Herstellung von Pteroyl-L-histidin (Pt-L-His-QH)

Durch das Verfahren nach Beispiel 1b stellt man N-Carbobenzoxy-p-aminobenzoyl-L-histidinmethylester (Z-PABA-L-His-OMe) her aus einem Teil Histidinmethylester und einem Teil N-Carbobenzoxy-p-aminobenzoesäure. Durch katalytische Hydrierung von N-Carbobenzoxy-p-aminobenzoyl-L-histidinmethylester nach dem in Beispiel 1c beschriebenen Verfahren erhält man in hoher Ausbeute p-Aminobenzoyl-L-histidinmethylester (H-PABA-L-His-OMe). Dieser kann dann einer reduktiven Aminierung mit 6-Formylpterin nach dem Verfahren von Beispiel 1e unterworfen werden zur Herstellung von Pteroyl-L-histidinmethylester (Pt-L-His-OMe). Durch anschließende basische Hydrolyse dieses Esters nach dem Verfahren des Beispiels 1f ergibt als Endprodukt Pteroyl-L-histidin.

Beispiel 3 Herstellung von Pteroyltyramin

Pteroyltyramin wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 1 mit der Abwandlung, daß Tyramin anstelle von Tyrosinmethylester verwendet wird- Die basische Hydrolyse am Ende gemäß Beispiel 1f ist überflüssig, denn Tyramin enthält keinen Carbonsäureester.

OH

Pteroyltyramin

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3Q161U

Beispiel 4 Herstellung von Pteroyltyrosin aus Pteroinsäure

a) Syntese von N -Trifluoracetylpteroinsäure

13o mg Pteroinsäure werden mit Trifluoressigsäureanhydrid für 6 Stunden am Rückfluss erhitzt, um die Säure vollständig aufzulösen. Die Lösung wird dann unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit 1 ml Wasser verrieben. Es entsteht ein gelber Feststoff. Das amorphe Material wurde drei Mal mit je 5 ml Wasser gewaschen, jeweils zentrifugiert und im Vakuum über Nacht getrocknet.

b) Pteroyltyrosin

N °-Trifluoracetylpteroinsäure (87,5 mg) und Triäthylamin (o,o34 ml) wurden in Ν,Ν-Dimethylformamid (2 ml) aufgelöst. Zu der Mischung wurden o,o45 ml Iso-butylchlorformiat hinzugegeben und die Lösung unter Stickstoff bei 3o C für die Zeit von 45 Minuten gerührt. Danach wurden weitere o,o9o ml Triäthylamin hinzugegeben und anschließend 124 mg L-Tyrosinmethylester. Es wurde bei 3o C für 24 Stunden nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann in 36 ml o,1 N NaOH eingebracht und im Dampfbad erwärmt, während 45 Minuten unter Stickstoff. Nach Kühlung in einem Eisbad wurde die Lösung mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2 eingestellt und es bildete sich ein gelatinöser Niederschlag. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und drei Mal mit kleinen Mengen an Wasser gewaschen. Das Gel wurde anschließend aufgelöst, in 1,oM Ammoniumbicarbonat (5o ml) und dann mit 5oo ml Wasser verdünnt. Daran anschließend erfolgte eine Chromatographie auf einer Kolonne gefüllt mit DEAE-Zellulose (1,5x25 cm). Die Kolonne wurde mit o,5M Ammoniumbicarbonat eluiert und nach 8oo ml Eluat Durchsatz die dann erscheinenden Fraktionen gesammelt. Die Ammoniumbicarbonatlösung des Derivates

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wurde unter vermindertem Druck eingedampft und dies unter erneuter Zugabe von Wasser solange wiederholt, bis die Salze abgedampft waren. Der Rückstand wurde in Wasser aufgelöst und mit HCl angesäuert (pH 2,5). Der erhaltene Niederschlag wurde zentrifugiert, gewaschen mit Wasser, Äthanol und Äther und dann im Vakuum getrocknet.

Massenspektrum (Feld Desorption): m/e 475 (M⁺), 458, 457, 429, 413, 3o9, 3oo, 293.

UV(0,5 N NaOH): λ 252, 281, 364 nra; (o,5 N HCl) /\ _mav

ΓΠ3.Χ ITl α. Χ

218, 246 (sh), 282 (sh), 3o2 nm.

Beispiel 5 Jodierung von Pteroyltyrosin

Zu einer Mischung von 1,o Millicurie von Natriumjodid des Jod Isotops 125 in 2,5 μ 1 Lösung, 25 μ 1 von o,o5 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 und 2,5 μg von Pteroyltyrosin in 25 μ 1 Puffer wurden in einer Einweg-1,5 ml Mikroküvette 5o μg Chloramin T hinzugefügt. Das Chloramin T (N-Chlor-ptoluolsulfinamid - Natrxumsalztrihydrat) war mit 2o μ 1 o,o5M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 versetzt. Genau nach 2o Sekunden wurden zur Beendigung der Umsetzung 1oo μg Natriummetabisulfit gelöst in 2o μ 1 o,o5M Kaliumphosphatpuffer hinzugefügt.

Die Reaktionsmischung wurde in eine Chromatographiekolonne (1 χ 2o cm Sephadex G25, fine, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) eingebracht und die Kolonne mit destilliertem Wasser befeuchtet und ins Gleichgewicht gebracht mit o,1M Kaliumphosphatpufferlösung pH 7,5. Die Kolonne wurde eluiert mit O,1M Kaliumphosphatpuffer und jeweils 3 ml Fraktionen gesammelt. Das Produkt der Peak-Fraktionen 32-34 wurde gesammelt, verdünnt 1:1 mit Propylenglykol und unterhalb 0 C gelagert.

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3016H4

Beispiel 6 Jodierung von Eteroyl-L-(5-hydroxytryptophan)

Pteroyl-L-(5-hydroxytryptophan) wird hergestellt nach dem Verfahren des Beispiels 1 unter Verwendung von L-5-Hydroxytryptophanmethylester anstelle von L-Tyrosinmethylester. Es wird jodiert und gereinigt durch die im Beispiel 5 angegebene Methode. Als Endprodukt entsteht mit Jod Isotop 125 jodiertes Pteroyl-L-(5-hydroxytryptophan) .

Beispiel 7 Konkurrenz-Proteinbihdüngsanalyse für Folsäure und N -Methyl-

tetrahydrofölsäure

Die neuen erfindungsgemäßen radio-jodierten Folatderivate, spezielle Pteroyltyrosin - 125 Jod - sind verwendbar als radio-aktiv dotierte Verbindungen in der Konkurrenz-Proteinbindungsradioanalyse von Folatelementarbestandteilen im menschlischen Blutserum. Die Verwendung des Centria Analysensystems der Union Carbide Corporation in diesem Beispiel dient nur zur Illustration und andere dem Fachmann in der klinischen Diagnose bekannte Verfahren, sowohl automatisierte als auch manuelle können im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung benutzt werden.

Das Zentrier system ist ein dreimodulares Gerät, bei dem die Reagentien auf eine mit mehreren Vertiefungen versehene Übertragungsscheibe pipettiert und zentrifugal mit Standard- oder Patientenproben gemischt werden. Nach einer geeigneten Inkubationszeit werden die Komponenten durch zentrifugales EIuieren in gebundene und freie Fraktionen getrennt und die gebundenen Fraktionen ausgezählt, (drei zur gleichen Zeit).

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Durch Datenverarbeitung in einem Mikroprozessor ergibt sich eine selektive ebenso wie eine Rohauszählung in Prozent gebundenem Anteil oder bei konventionellen Geräten erfolgt die Auswertung über eine Eichkurve, die mit entsprechenden Substanzen erstellt wurde.

Folsäure- und N -Methyltetrahydrofolsäurestandards im Bereich von O bis 2o Nanogramm/Milliliter werden hergestellt in o,o5M Natriumborat, pH 9,3 mit o,1 % menschlichem Serumalbumin. Der Vollmilchbinder wurde hergestellt nach dem von Rothenberg und anderen beschriebenen Verfahren (S. Rothenberg, M. DaCosta und Z. Rosenberg, New Eng.J.Med., 286, 1335 (1972)) und gelöst in Natriumborat, pH 9,3 enthaltend o,1 % menschliches Serumalbumin.

Genauer gesagt, aliquote Mengen von Folatstandards oder unbekannten Proben (jeweils 15 Mikroliter) können nach zentrifu-

125

galem Übergang und Mischen mit Pteroyltyrosin ( J) (5o Mikroliter, 2O.OOO cpm) mit 85 Mikroliter Wasser miteinander konkurrieren mit einer begrenzten Anzahl von Bindungsstellen in 2oo Mikroliter Lösung des gesamten Milch-Folatbinders. Die Bindungsreaktion kann etwa wie folgend beschrieben werden:

125

Pteroyltyrosin ( J) + Folatserum + Binder >

125

(Binder-Folat)+(Binder-pteroyltyrosin ( J) +

Folat + Pteroyltyrosin.(¹²⁵J).

Nach 1o Minuten Inkubationszeit wurde die Reaktionsmischung zentrifugal überführt in eine DEAE Sephadex A-25 Kolonne (1,9 χ 1o,16 cm) zur Abtrennung des komplexgebundenen Folats von freiem Folat. Dazu wurden 1,4.ml Eluationspufferlösung (o,o5M Natriumborat, pH 9,3) pro Probe verwendet mit folgendem Ergebnis: ι

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3016H4

- 4ο -

Im Eluat:

125 (Binder-Folat)+(Binder-Pteroy!tyrosin-( J))

In der Kolonne:

Folat + Pteroyltyrosin (¹²⁵J).

Dann wurde ein Gammazähler zum Auszählen aller Proben verwendet, der so konstruiert ist, daß nur die Eluatbodenanteile der Teströhrchen in den Zähler reichen und der drei von 36 Positionen auf einmal in einer Minute zählen kann. Das aufeinanderfolgende Auszählen der Proben erfordert etwa 12 Minuten. Ein Kleinrechner mit Ausdruckmöglxchkeit ist vorgesehen, um die Daten nach Erstellen eines Zyklus auszudrucken. Eine Eichkurve (logit-log plot) der Auszählung für -

Folsäure und N
wiedergegeben.

Folsäure und N -Methyltetrahydrofolsäure ist in der Figur

Beispiel 8 Enzymatische Hydrolyse von Pteroyltyrosin

2 ml einer Lösung von Pteroyltyrosin (o,75 mMole/ml) in o,o25M Tris-HCl enthaltend 2 inM Zinkchlorid, pH 7-,3 wurden mit 1o ml destilliertem Wasser verdünnt. Ein Teil dieser Lösung (2 ml) wurde in eine 1 cm Küvette gegeben und eine zweite mit 2 ml destilliertem Wasser gefüllt. Zu jeder der beiden Küvetten wurden 5o Mikroliter einer Lösung von 1oo Mikroliter Carboxypeptidase A in Suspension (Aldrich Chemical, Muster o6o637), verdünnt mit o,9 ml 1o %igen Lithiumchlorids hinzugefügt.

Das zeitliche Fortschreiten der Reaktion wurde durch UV-Spektroskopie während einer Periode von 2 Stunden bei Raumtemperatur beobachtet. Ein Ansteigen und eine Verschiebung der Maxima von 28o:277 nm und ein markantes Abfallen der Ab-

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sorption bei 22o nm wurden beobachtet. Die beiden isosbestischen Punkte bei 242 und 282 nm waren sichtbar. Das endgültige Spektrum war dem von Pteroinsäure gleich.

Beispiel 9

Herstellung eines Affinitätschromatographiemediums zur Reinigung von Folatbindüngsproteinen unter Kreuzreaktion mit Pteroyl-L-Tyrosin

Poly(p-aminostyrol) (2 g) wurden gequollen in einer Mischung von Dimethylsulfoxid/3N HCl (1:1, 15 ml) und auf O⁰C in einem Eisbad gekühlt. Die Mischung wird leicht gerührt während festes Natriumnitrit (54 mg, o,64 mMole) in mehreren kleinen Teilmengen während 5 Minuten hinzugefügt wird. Nachdem die letzte Menge an Natriumnitrit der Reaktionsmischung zugefügt ist, erfolgt ein Filtrieren in der Kälte (0 bis 5°C) und schnelles dreimaliges Waschen mit je 25 ml kaltem Dimethylsulfoxid/H₂0 (1:1). Das feuchte Harz wird dann schnell zu einer Lösung von Pteroyl-L-tyrosin (1oo mg, o,21 mMole) in 1o ml Dimethylsufloxid/o,5 N NaOH (1:1) hinzugefügt. Der pH-Wert wird erneut eingestellt auf 1o bis 11 mit kalter 4N NaOH und dieser pH wird eingehalten während die Reaktion fortschreiten kann unter leichtem Rühren in der Dunkelheit bei Temperaturen von 0 bis 6°C. Die Mischung kann sich dann während einer Stunde auf Raumtemperatur erwärmen, wird mit 1N NaOH auf pH 5 eingestellt und bei Raumtemperatur für eine weitere halbe Stunde gerührt.

Die Mischung wird dann filtriert und das Harz gewaschen mit großen Mengen an DMSO/Wasser (1:1), dann der Wasserdampfdestillation unterworfen bis kein weiteres Eluieren von Pteroyl-L-tyrosin durch Radioanalyse nachweisbar ist. Das

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wasserfeuchte Harz wird dann mit Methanol und Methylenchlorid gewaschen, anschließend im Vakuum das. Methylerichlorid abgetrieben und trocken in der Kälte,abgeschirmt von Licht, gelagert.

Beispiel 1o Verbindung von Pteröyl-L-tyrosin mit Rinderserumalbumin zu

einem neuen Folatantigen

Eine Lösung von Pteroyl-L-tyrosin (1oo mg, o,2ImMoIe) und Tri-n-butylamin (45 mg, o,24 mMole) in Dimethylsulfoxid DMSO (15 ml) wird auf 5 bis 6°C gekühlt und unter Rühren wird Iso-butyl-chlorformiat (33 mg, o,24 mMole) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird bei 5 bis 6 C 15 Minuten gerührt und dann das ganze unter Rühren zu einer kalten Lösung (5°C), bestehend aus Rinderserumalbumin (1,o g, 1,4 χ 1o mMole), gelöst in 1o ml destilliertem Wasser und eingestellt auf pH 9,ο mit 5 % (W/V) Kaliumcarbonat. Die Reaktionsmischung wird bei pH 9,ο gehalten mittels 5 %iger Kaliumcarbonatlösung unter Rühren bei 5°C während 4 Stunden und anschließendem Nachrühren bei Raumtemperatur während einer Stunde. Die Mischung/Lösung wird dann, falls erforderlich, durch ein Milliporenfilter (gemischter Zelluloseester, o,5 μ) filtriert und dann dialysiert gegen die 2-fache Menge an destilliertem Wasser, die täglich gewechselt wird, während 5 Tagen. Die Verbindungslösung ist lyophilisiert in Form eines flockigen Pulvers.

Die Erfindung wurde anhand von Beispielen beschrieben, sie ist jedoch darauf nicht beschränkt und verschiedene Veränderungen sind möglich, ohne daß dabei der allgemeine Erfindungsgedanke und der Schutzbereich verlassen werden.

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Claims

PATENTANWALT DR. HANS-GUNTHER EGGERT₁ DIPLOMCHEMIKER

S KÖLN 51, OBERLÄNDER UFER 90

Köln, den 21. April 198o 18

Union Carbide Corporation, 27o Park Avenue, New York, N.Y. 1oo17 (U.S.A.)

Folsäurederivate und Verfahren zur Herstellung.

Patentansprüche :

1. Radio-Jod enthaltende Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verbindung der Formel

R¹

C-X

in der R Wasserstoff, eine niedere Alkyl-, Formyl- oder Iminbmethylgruppe,

R¹ und R" jeweils eine niedere Alkyl-, Hydroxyl-, Halo-, Amino- oder Acetamidogruppe,

R"¹ R oder eine Nitrosogruppe ist; X ist eine Aminosäure- oder Des-carboxy-aminosäuregruppe mit einem jodierten aromatischen oder heterocyclischen Ring, die mit dem übrigen Rest des Moleküls durch ein Amin mit nicht mehr als 5 Atomen in der Kette, die den Ring vom Molekül trennt, verbunden ist und wobei m 1, 3 oder 4 und η O oder 1 sind, enthält.

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. .ORIGlNALiNSPECTED

2. Radio-Jod enthaltende Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Jod das J 125-Isotop ist.

3. Radio-Jod enthaltende Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Jod das J 131-Isotop ist.

4. Radio-Jod enthaltende Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Jod das J 123-Isotop ist.

5. Radio-Jod enthaltende Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine radio-jodierte Gruppe der Formel :

CH₂-/

-NH-CH-COOz"

in der Z Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten, ist.

6. Radio-Jod enthaltende Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine radio-jodierte Gruppe der Formel

-NH-CH₂-CH₂-"

ist.

7. Radio-Jod enthaltende Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine radio-jodierte Gruppe der Formel H

-NH-CH-COOZ

in der Z Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeutet, ist.

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3016U.4

8. Radio-Jod enthaltende Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine radiojodierte Gruppe der Formel

- NH-CH₂-GH₂J! N

ist»

ο Radio-Jod enthaltende Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine radio-jodierte Gruppe der Formel

=HH-GH~COOZ

in der Z Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten, ist»

1o= Radio-Jod enthaltende Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X

-NH-CH-COOZ

in der Z Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten, ist ο

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11. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung _r die eine Verbindung der Formel

-C-X

I «-IX #

R¹

in der R "Wasserstoff, eine niedere Alkyl-, Formyl-, oder Iminomethylgruppe,

R¹ und R" jeweils eine niedere Alkyl-, Hydroxyl-, Halo-, Amino- oder Acetamidogruppe,

R"¹ R oder eine Nitrosogruppe ist und wobei m 1, 3, oder 4 und η O oder 1 sind,

X ist eine Aminosäure- oder Des-carboxyaminosäuregruppe mit einem aromatischen oder heterocyclischen Ring, die mit dem übrigen Rest des Moleküls durch ein Amin

die mit nicht mehr als 5 Atomen in der Kette,/den Ring vom Molekül trennt, verbunden ist, enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Pteroinsäure der vorstehenden Formel, in der X eine OH-Gruppe ist, mit einem Schutzmittel in Berührung bringt und das N-Atom in 1o-Stellung schützt,

b) die nach Schritt a) geschützte Pteroinsäure mit einem Säurehalogenid unter basischen Bedingungen in Berührung bringt und ein gemischtes Anhydrid bildet,

c) das gemischte Anhydrid mit HX kondensiert, wobei X die vorstehend angegebene Definition aufweist und

d) das Produkt des Schrittes c) unter basischen Bedingungen hydrolysiert.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schutzmittel Trifluoressigsäureanhydrid verwendet,

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13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säurehalogenid ein Alkanoyl-Halogenid verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkanoylhalogenid Iso-butyl-chlorformiat verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Stufe a) Pteroinsäure verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Stufe b) als HX L-Tyrosin-methylester verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Stufe b) als HX Histamin verwendet.

18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Stufe b) als HX Tyramin verwendet.

19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Stufe b) als HX 5-Hydroxytryptophan-methylester verwendet.

20. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Stufe b) als HX Histidin-methylester verwendet.

21. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Stufe b) als HX 2(4'-Hydroxyphenyl)-glycokolmethylester verwendet.

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22. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel

in der R Wasserstoff, eine niedere Alkyl-, Formyl-, oder Iminomethylgruppe,

R¹ oder R" jeweils eine niedere Alkyl-, Hydroxyl-, Halo-, Amino- oder Acetamidogruppe,

R"¹ R oder eine Nitrosogruppe ist und wobei m 1, 3, oder 4 und η O oder 1 sind,

X ist eine Aminosäure- oder Des-carboxyaminosäuregruppe mit einem aromatischen oder heterocyclischen Ring, die mit dem übrigen Rest des Moleküls durch ein Amin

die mit nxcht mehr als 5 Atomen in der Kette,/den Ring vom Molekül trennt, verbunden ist, enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) in Gegenwart von Trifluoressigsäure und Eisessig ein 6-Formyl-pterin der Formel

in der R¹ und R", m und η die in den vorstehenden Ansprüchen gegebenen Definitionen haben, mit

C-X

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3016UA

wobei X die vorstehend genannte Bedeutung hat, umsetzt, b)'das Lösungsmittel entfernt und das Reaktionsprodukt

der Stufe a) in Eisessig suspendiert und c) der Suspension Dimethylamin-boran zufügt und das Reaktionsprodukt abtrennt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man für den Schritt a) 6-Formylpterin verwendet.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß X eine L-Tyrosin-methy!estergruppe ist.

25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Histamingruppe ist.

26. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Tyramingruppe ist.

27. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß X eine 5-Hydroxytryptophangruppe ist.

28. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Histidingruppe ist.

29. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß X eine 2 (4'-Hydroxyphenyl)-glycokoBgruppe ist.

30. Verwendung der radio-jodhaltigen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Protein-Bindungsuntersuchung von Folsäure, ihre Metaboliten oder Derivate enthaltendenProben.

31. Verwendung der radio-jodhaltigen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur radioimmunologischen Analyse von Folsäure, ihre Metaboliten oder Derivate enthaltende!Proben.

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32. Reagenz zur Verwendung bei Festphasen-radio-immunologischen Analysen von Folsäure, ihrer Metabolite oder Derivate, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus einer Suspension einer immuno-chemischen Zusammensetzung mit einem gesättigten Gehalt der radioaktiv markierten Zusammensetzung nach Anspruch 1 gemischt mit einer Vormischung aus Anti-Folat-Antikörper, die semipolar über ein zwischenliegendes Silan-Kupplungsmittel mit suspendierbaren Teilchen aus porösem Glas verbunden sind.

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