DE2724486A1 - Heterogenes spezifisches bindungsverfahren zur bestimmung eines liganden in einem fluessigen medium und mittel zu dessen durchfuehrung - Google Patents

Description

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Patentanmeldung

Anmelder:

Titel:

Technion Research and Development

Foundation Ltd.

Senate House

Technion City, Haifa (Israel)

Heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium und Mittel zu dessen Durchführung

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren und Reagens bzw. Prüfmittel zur Bestimmung des Vorhandenseins kleiner Mengen chemischer Verbindungen. Sie betrifft besonders eine genaue, wirksame und spezifische Analyse für kleine Mengen chemischer Verbindungen beim Menschen, bei Tieren und Pflanzen sowie ein Verfahren zur Durchführung spezifischer Bindungsanalysen .

Es besteht laufend Bedarf an schnellen und genauen quantitativen Bestimmungen von chemischen Substanzen, die in sehr geringen Konzentrationen in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Speichel oder Urin, vorhanden sind. Diese pharmakologischen Mterialien können entweder von natürlich vorkommenden physiologisch aktiven Verbindungen stammen oder von eingenommenen Arzneimitteln und/oder deren Metaboliten. Diese Arzneimittel gehören entweder zur Gruppe der Verbindungen, die medizinisch für therapeutische Zwecke verabreicht werden, oder es können Drogen sein, die mißbräuchlich eingenommen worden sind, wie Narkotika oder andere giftige Substanzen. Von größter Wichtigkeit ist die Bestimmung von bestimmten Verbindungen für diagnostische Zwecke, die ein Anzeichen sein können für eine ordnungsgemäße Funktion oder für einen im Körper ablaufenden Prozeß. Auch im Falle von Vergiftungen kann ein schnelles und einfach durchführbares Verfahren zur Bestimmung des Giftes bzw. Toxins außerordentlich wichtig sein, um das erforderliche Antidot zu bestimmen. Eine der wichtigsten Anforderungen an diese Bestimmung ist offensichtlich die Spezifität der Bestimmung und die Tatsache, daß die

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Bestimmung nicht durch andere Bestandteile der se verwendeten Probe gestört wird. Derzeit ist dies der Hauptnachteil von vielen bekannten Verfahren, wie der Spektrophotometrie im UV- und sichtbaren Bereich, der Fluorometric, Massenspektrophotometrie, chromatographischer Verfahren, bei denen verschiedene Grade von Unspezifität und Störungen dazu führen können, daß diese Verfahren nicht praktisch anwendbar sind. In letzter Zeit ist in einer Spezialausgabe des Journal of Chromatographie Science, 1974, (Band 12, Seiten 209-336) unter dem Titel "Analysis of Drugs of Abuse" eine sehr komprimierte Zusammenfassung des Standes der Technik derartiger Verfahren veröffentlicht worden.

Die Entwicklung analytischer Verfahren, bei denen spezifische Bindungsbestimmungen in den Bereich der Untersuchung von Flüssigkeiten eingeführt wurden, wie Bioflüssigkeiten auf Liganden, wie Mittel, hat zu einer starken Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit geführt. Bei den bekannten Methoden können die folgenden vier spezifischen Bindungsbestimmungen erwähnt werden: radioimmunologische Bestimmung (RIA), BeStimmung/freier Radikale (FRAT),Hämagglutinationshemmung (HI) und Enzym-vervielfältigte immunologische Bestimmungen (enzyme multiplied immunoassay technique) (EMIT). Spezifische Bindungsbestimmungen beruhen auf dem Prinzip der Überwachung spezifischer Bindungsreaktionen, bei denen das Ausmaß der Bindung eine Funktion der Menge eines vorhandenen unbekannten Liganden ist, mit Hilfe einer markierten Komponente.

Im folgenden sind Beispiele angegeben, wie nach bekannten Verfahren eine Droge bzw. ein Arzneimittel, das eine Art eines durch spezifische Bindungsverfahren bestimmbaren Materials ist, bestimmt wird (im folgenden als pharmakologisches Material bezeichnet).

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Bei der radioimmunologischen Bestimmung wird das pharmakologische Material mit einem radioaktiven Isotop, wie z.B. 125 14

J oder C markiert. Nachdem das Gemisch aus nicht markiertem Material, markiertem Material und Antikörper ein Gleichgewicht erreicht hat, wird das an den Antikörper gebundene Material nach einem üblichen Verfahren, z.B. durch Präzipitation bzw. Ausfällung mit Ammoniumsulfat, abgetrennt. Die Menge an freiem und/oder gebundenem markierten Material wird bestimmt durch Messung der Radioaktivität der überstehenden Flüssigkeit oder des Präzipitats. Obwohl dieses Verfahren sehr empfindlich und spezifisch ist, besitzt es den erheblichen Nachteil, daß radioaktive Substanzen angewandt werden müssen, die Erfahrung bei der Handhabung und aufwendige Apparaturen erfordern und bei der Beseitigung Probleme ergeben. Diese speziellen Erfordernisse verbieten die verbreitete und allgemeine Anwendung derartiger Bestimmungen, insbesondere in kleinen Laboratorien.

Bei der Bestimmung mit Hilfe freier Radikale wird ein Spin-markiertes Hapten synthetisiert, indem man ein verhältnismäßig kleines Nitroxidmolekül an das pharmakologische Material bindet. Haptene sind bekanntlich definiert als Substanzen, die bei der Injektion aufgrund ihrer geringen Größe selbst nicht zur Bildung von Antikörpern führen, aber wenn sie an größere Trägermoleküle gebunden sind, die Bildung von Antikörpern, die zu dem freien Hapten spezifisch sind, einleiten können. Substanzen mit freier Umorientierung bzw. Spin-Austausch (free tumbling species) führen zu sehr scharfen Elektronen-Spin-Resonanz-Spektren. Wenn das Spin-markierte Hapten mit dem Antikörper einen Komplex gebildet hat, nimmt die Umorientierungsgeschwindigkeit ab, was zu einer Linienverbreiterung im Elektronen-Spin-Resonanz-Spektrum führt. In Gegenwart des pharmakologischen Materials wird das Spin-markierte Hapten verdrängt und eine Verstärkung des Elektronen-Spin-Resonanz- (ESR)-Signals beobachtet. Die Menge an nicht-

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ΛΌ

gebundenem pharmakologisehen Material ist Intensität des Elektronen-Spin-Resonanz-Pigs. Eine unbekannte Konzentration kann bestimmt werden durch Vergleich der Höhe des ESR-Pigs mit derjenigen von Standards. Der Nachteil dieses Verfahrens sind die aufwendige Ausrüstung, die erforderlich ist und die verhältnismäßig geringe Empfindlichkeit.

Bei der Hemmung der Hämagglutination werden rote Blutkörperchen mit dem Komplex aus pharmakologischem Material und Trägerprotein überzogen. In Abwesenheit des pharmakologischen Materials führen die Antikörper zu einer Agglutination der roten Blutkörperchen. Freies pharmakologisches Material wird , wenn es vorhanden ist, an den Antikörper gebunden . Da der Antikörper verbraucht ist, wird die Hämagglutination verhindert, und die roten Blutkörperchen bilden eine Perle am oberen Ende der kegelförmigen Vertiefung. Die Empfindlichkeit der hämagglutinationshemmung kann in einem weiten Bereich eingestellt werden, da die Hemmung der Agglutination abhängt von der vorhandenen Menge an Antikörper. Obwohl angenommen wird, daß dieses Verfahren zuverlässige Ergebnisse ergibt, besitzt es den Nachteil, daß die Analyse bis zur Vervollständigung verhältnismäßig lange Zeit erfordert und die Interpretation der Ergebnisse weitgehend subjektiv ist.

Bei der Enzym-vervielfachten immunologischen Bestimmung wird das pharmakologisehe Material mit einem aktiven Enzym (z.B. Lysozym) markiert, das imstande ist, die Zellwand von Bakterien aufzubrechen. Moleküle des pharmakologischen Materials, die an die Oberfläche von Lysozym gebunden sind, stören die enzymatische Aktivität nicht. Wenn die Antikörper an diese markierten Materialien gebunden werden, wird das Substrat sterisch daran gehindert, die aktiven

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Stellen des Enzyms zu erreichen, nicht-markiertes Material verdrängt das enzym-markierte Material, was wiederum zu einer Erhöhung der Enzymaktivität führt. Durch Messung der optischen Dichten zu Beginn und nach Abschluß der Analyse kann man die Menge an nicht-markiertem pharmakologischen Material in der Probe ungefähr abschätzen. Durch Verlängerung der Zeit, in der das Enzym einwirken kann, kann die Empfindlichkeit der Bestimmung erhöht werden. Der Nachteil dieses Verfahrens liegt in der verhältnismäßig geringen Empfindlichkeit, den verhältnismäßig hohen Reagenskosten und der Instabilität der enzymatischen Reagentien.

Obwohl jedes der obenerwähnten spezifischen Bindungsverfahren auf bestimmten Gebieten für die Bestimmung kleiner Mengen von pharmakologischen Materialien Vorteile besitzt, geht aus der obigen Zusammenfassung der bekannten Verfahren hervor, daß weiterhin Bedarf besteht an einem einfacheren derartigen Verfahren.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein bequemes, spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung kleiner Mengen unbekannter Substanzen sowie dafür geeignete Reagentien zu entwickeln, wobei das Verfahren sehr empfindlich und sehr spezifisch sein soll und keine radioaktiven Materialien erfordern.

Die Erfindung betrifft ein heterogenes,spezifisches Bindungsverfahren ^r zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, wobei man

(a) das flüssige Medium mit einem Reagens bzw. Prüfmittel zusammenbringt, das einen markierten Bestandteil enthält, umfassend ein Konjugat aus einer Markierungs-Substanz und einer Bindungskomponente, und das mit dem zu bestimmenden Liganden ein Bindungsreaktionssystem bildet, das zu einer gebundenen Phase und einer freien Phase des markierten Bestandteils führt, wobei die Menge an

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markierter Substanz in der gebundenen Phase eine Funktion ist der Menge des in dem flüssigen Medium vorhandenen Liganden;

(b) die gebundene Phase von der freien Phase trennt, und

(c) die Menge an Markierungssubstanz in der gebundenen oder freien Phase bestimmt,

das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Markierungssubstanz ein Metallatom oder -atome verwendet und deren Menge entweder in der gebundenen oder freien Phase bestimmt.

Wie unten ausführlicher diskutiert wird, kann das Reaktionssystem die Form irgendeines der bekannten üblichen heterogenen Verfahren annehmen, wie sie zur Zeit angewandt werden für radioimmunologische Bestimmungen und heterogene enzymimmunologische Bestimmungen.

Das spezifische Bindungsreagens bzw. Prüfmittel kann unterschiedliche Formen besitzen. Im allgemeinen umfassen solche Prüfmittel drei Grundbestandteile und zwar: 1. den nachzuweisenden Liganden, 2. einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden und 3. einen markierten Bestandteil, der üblicherweise eine markierte Form a) des Liganden, b) eines spezifisch bindenden Analogen des Liganden oder c) des spezifischen Bindungspartners ist. Die Bestandteile der Bindungsreaktion werden gleichzeitig oder nacheinander zusammengegeben und innerhalb einer angemessenen Inkubationszeit oder -zeiten wird der markierte Bestandteil an seine entsprechenden konkurrierenden Bindungspartner gebunden, so daß das Ausmaß der Bindung, d.h. das Verhältnis der Menge von markiertem Bestandteil, der an einen Bindungspartner gebunden ist, zu dem nicht-gebundenen eine Funktion ist der Menge des vorhandenen Liganden. Im folgenden sind einige unterschiedliche Bindungsreaktionsschemata angegeben, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen heterogenen Bindung sverfahrens angewandt werden können.

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In den folgenden Diagrammen werden die folgenden Symbole und Abkürzungen verwendet:

Symbol L

Ins.

Definition

nachzuweisender Ligand

Ligand oder spezifisch bindendes Analoges dazu

Bindungspartner für den Liganden

Markierungssubstanz, d.h. Reagens unlösliche Phase

(lim) (exe) Inkubationszeit und anschliessende Trennung

limitiert; in einer Menge vorhanden, die geringer ist als diejenige, die von den gesamten bindenden ^teilen unter den fieaktionsbedingungen während der angewandten Inkubationszeit gebunden werden kann, d.h. der Bestandteil, um den die anderen Bestandteile in Konkurrenz treten, um mit ihm Bindungen einzugehen

Überschuß; in einer Menge vorhanden, die größer ist als diejenige, die imstande isb, von den gesamt-verfügbaren bindenden Stellen unter den fieaktionsbedingungen während der angewandten Inkubationszeit gebunden zu werden

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Heterogene Bindungsreaktionen 1. Konkurrenzbindungsreaktionen

a) L + (E) + B(lim) -^ + unlöslichmachendes Mittel für B oder (Biochem. J. 88,: 137 (1963) und US-PS 3,839 153)

b) L +(D + ins.B(lim)-»

(US-PS 3 505 019, 3 555 143, 3 646 346 und 3 654 090)

c) L + B* + ins. Q (lim)-* (US-PS 3 654 090)

d) L + ins. (y + (US-PS 3 850 752)

2. Aufeinanderfolgende Sättigungsverfahren

a) L + B (exe) -> + (£) (exe) + unlöslichmachendes Mittel

für B oder φ

b) L + ins. B(exc) —» + (E) (exe)

(J. Immunol. 209, 129 (1972) und US-PS IMr. 3 720 760)

c) L + B* (exe) -» + ins. (E)(exe) (Nature 219, 186 (1968)

3. "Sandwich"-Verfahren

L + ins. B(exc)-> + B* (exe) (US-PS 3 720 760)

4. Festphasen-Verdünnungsverfahren

L + (ξ) + ins. (unspezifisch) -=> + B (lim)—^ (US-PS 3 659 104)

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Für eine nähere Diskussion der bei üblichen heterogenen Bestimmungssystemeiwichtigen Parameter, wie eine detailiertere Beschreibung der Bestimmungsanordnungen und alternative Trennverfahren, wird verwiesen auf Principles of Competitive Protein-Binding Assays, Ed. Odell und Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia 1972).

Andere manipulative Schemata,umfassend andere Reihenfolgen des Zusammengebens und andere Bindungsreaktionsanordnungen, können angewandt werden, um heterogene spezifische Bindungsbestimmungen durchzuführen, ohne daß man vom Rahmen der Erfindung abweicht.

Für eine nähere Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens und Prüfmittels wird im folgenden ein System beschrieben, bei dem ein Hapten bestimmt wird, indem man ein Bindemittel für ein derartiges Hapten und dne mit einem Metallatom markierte Form des Haptens ("Metallhapten") zur Verfügung stellt, sodaß Bindungsstellen an diesem Bindemittel durch das Metallhapten besetzt sind, wodurch die spezifische Bindungsreaktion eintreten kann bei Zugabe zu einer Probe, in der dieses Hapten vermutet wird, Abtrennung des nicht-gebundenen Metallhaptens und Bestimmung der Konzentration des darin enthaltenen Metallatoms auf übliche Weise, z.B. durch Atomspektrometrie. Die folgenden Absätze beziehen sich auf dieses Verfahren, das beispielhaft angegeben ist.

Die Bindungsstellen können entweder zu 95 bis 100 % besetzt sein, wobei nur eine kleine Menge der besetzten Bindungsstellen im Gleichgewichtszustand ersetzt wird, oder sie können teilweise besetzt sein, wobei das markierte und das nicht-markierte Hapten,sowohl um die Bindungsstellen, die vorher durch das markierte Hapten besetzt waren, als auch um die größere Anzahl von freien Bindungsstellen konkurrieren.

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In diesem Falle findet der Ersatz bzw. die Verdrängung bei einer geringeren Konzentration des Gemisches statt, und das kann spezielle Trennungsverfahren erforderlich machen.

In einem Medium, das nur Metallhapten und Bindemittel enthält, sind die Bindungsstellen im Gleichgewicht durch das Metallhapten besetzt. Nach Zugabe einer kleinen Menge Hapten zu dem Medium konkurrieren das Hapten und das Metallhapten um die verfügbaren Bindungsstellen. Bei der Bestimmung des Metallgehalts in der abgetrennten Lösung vor der Zugabe des Haptens und nach der Zugabe desHaptens kann die relative Konzentration des Metalls im Gleichgewichtszustand gemessen werden. Bei Anwendung bekannter Haptenmengen kann die Wirkung beim Gleichgewicht leicht aus Messungen des Metallgehalts des Systems,Bindemittel-Metallhapten oder des freien Metallhapten oder beider Komponenten bestimmt werden. Daher ist es bei dem Verfahren erforderlich, zunächst den Metallgehalt in geeichten Standardlösungen, enthaltend Metallhapten, zu bestimmen und dann die abgetrennte Lösung, enthaltend das Hapten, zu untersuchen. Wenn einmal das Metall in den Standards bestimmt worden ist, kann das Verfahren automatisiert werden, um eine spezifische und genaue Analyse bei einer großen Anzahl von Proben zu ermöglichen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt, was auch bevorzugt ist. Für bestimmte Systeme ist eine Inkubation bei 36⁰C erforderlich, sodaß der Temperaturbereich allgemein zwischen 0 und 50°C liegt. Der Fachmann weiß, wie die geeignete Temperatur in Übereinstimmung mit dem jeweiligen spezifischen System, an dem die Bestimmung durchgeführt werden soll, zu wählen ist, wobei Faktoren, wie die Stabilität des Metallhaptens, das Erfordernis einer Inkubation usw., berücksichtigt werden müssen.

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Die Abtrennung der flüssigen Phase von der festen kann nach irgendeinem bekannten Verfahren, wie Filtration, Zentrifugation usw., durchgeführt werden. Diese Stufe ist auch bei radioimmunologischen Bestimmungen erforderlich, und die verschiedenen dort angewandten Mittel können auch erfolgreich für das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden.

Das Verfahren kann sehr bequem durchgeführt werden und überwindet die verschiedenen Nachteile des radioimmunologischen Bestimmungsverfahrens. Gleichzeitig ist das Verfahren sehr spezifisch und empfindlich, und man kann im wesentlichen die gleiche Genauigkeit wie bei radioimmunologischen Bestimmungen erreichen.

Einer der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die leichte Analyse einer Verbindung durch Bestimmung der Metallkomponente. Es sind verschiedene einfache Verfahren zur Metallbestimmung bekannt, wie Emissions-, Absorptionsund Fluoreszens-Spektrometrie, verschiedene elektrochemische Verfahren und Neutronenaktivierung. Insbesondere wird üblicherweise die Bestimmung der Atomabsorption von Metallen angewandt, die jetzt als sehr empfindliches und genaues Verfahren bekannt ist. Eine Tatsache, die die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens bestätigt, sogar zur Bestimmung sehr geringer Mengen unbekannter Verbindungen für einen weiten Anwendungsbereich. Die Empfindlichkeit der Atomabsorptionsspektrometrie wurde kürzlich in einer Zusammenfassung diskutiert (Atomic Absorption Newsletter 11, 37; 1972). Die Einführung von flammlosen Verfahren (z.B. Graphitkammer, durch die der elektrische Strom läuft, Trocknen und Atomisieren der Probe bei Temperaturen bis zu 3 700⁰C), hat die Empfindlichkeit um Größenordnungen erhöht. Daher können besonders zuverlässige Ergebnisse erzielt werden, selbst bei sehr kleinen Anteilen an der zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden Substanz. Zum Beispiel liegt bei der Bestimmung von Co die Nachweisgrenze mit einem üblichen Atomabsorptionsgerät (Modell 403) bei 0,01 /Ug/ml, während mit einer

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Graphitkammer (HGA-2000-Gerät) die Nachweisgrenze 0,00004 /Ug/ml beträgt. In der folgenden Tabelle sind Nachweisgrenzen bei der Atomabsorption für einige Elemente angegeben, die mit der Graphitkammer (HGA-2000) bestimmt wurden.

Tabelle 1	Nachweisgrenze
Element	/ug/ml
	0,00001
Mangan	0,0000025
Silber	0,00008
Silicium	0,00003
Aluminium	0,0000006
Zink	0,00008
Gold	0,00006
Blei

Element	Nachweisgrenze /Ug/ml
Wismut	0,0001
Cadmium	0,000001
Kobalt	0,00004
Eisen	0,00003
Nickel	0,0001
Antimon	0,0002
Thallium	0,00014

Diese Tabelle zeigt nur einen Teil der Elemente und ist hier nur angegeben, um die sehr niedrigen Nachweisgrenzen zu zeigen, die mit einem derartigen Atomabsorptionsgerät erzielt werden können. Damit kann die hohe Nachweisempfindlichkeit durch Atomabsorptionsspektrophotometer dieses Verfahren in den Bereich der Empfindlichkeitsgrenzen der radioiinmunologischen Bestimmungsverfahren bringen, ohne daß die Nachteile auftreten, die mit der Anwendung radioaktiv-markierter Komponenten verbunden sind. Obwohl im Zusammenhang der vorliegenden Beschreibung die Bestimmung des Metalls mit Hilfe von Atomabsorptions- oder Emissionsmessungen angegeben ist, ist es selbstverständlich, daß irgendein anderes bekanntes Verfahren zur Metallbestimmung mit dem gleichen. Erfolg angewandt werden kann. So erwähnt z.B. ein vor kurzem erschienener Bericht über die Anwendung der

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Mikrowellen-Erregungs-Emissions-Spektrometrie (Kawaguchi und Valee, Anal. Chemistry, 47, 1029-1034, 1975) die Bestimmung von Metallen in Metallenzymen im Bereich von 10 bis 10 ^g Metall absolut genommen. Es kann angenommen werden, daß Fortschritte bei der anodischen "Abstreif"-Voltametrie ein anderes, einfaches und billiges Verfahren für Konzentrationsmessungen von Metall in den Systemen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auftreten, ergeben könnte. Die Bestimmung des Metallgehalts durch Atomabsorptions- oder Emissionsspektrophotometrie ist zur Zeit üblich und kann leicht selbst in kleinen Labors durchgeführt werden. Man kann auch die Möglichkeit in Betracht ziehen, ein elektrochemisches Abscheidungsverfahren auf einem Metalldraht anzuwenden, wie z.B. einem Tantaldraht,und die Menge des Materials zu bestimmen durch Einführung einer Probe in das Atomspektrophotometer.

Die jüngste Entwicklung von Mehrkanal-Atomabsorptions-Spektroinetern (Analytica Chim. Acta, 87, 301 (1976)), die imstande sind bis zu neun Elementen gleichzeitig zu analysieren, erweitert die möglichen Anwendungen der Metallhaptene durch die Entwicklung von Multitestsystemen.

Obwohl alle immunochemisch-aktiven Substanzen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, ist es besonders geeignet zur Bestimmung von Substanzen in sehr kleinen Mengen, da eine sehr hohe Empfindlichkeit erreicht werden kann.

Die Durchführung einer Bestimmung erfordert das Hapten, das Metallhapten und das Bindemittel neben einem Gerät für die Metallbestimmung, wie einem Atomabsorptionsspektrophotometer. Das Metallhapten und das Bindemittel (bindende Substanz) sind entweder in fester Form oder in Lösung verfügbar. Wenn sie in fester Form vorliegen, kann irgendein geeignetes Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch

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angewandt werden. Insbesondere bevorzugt für die Analyse biologischer Flüssigkeiten sind wäßrige Lösungen. In diesem Falle ist es günstig, daß man das Bestimmungsgemisch puffert, um es auf einem pH-Wert im Bereih von 5 bis 10,5 und vorzugsweise 6,5 bis 8,5 zu halten. Irgendein geeigneter Puffer kann erfolgreich angewandt werden, vorausgesetzt daß er frei ist von bestimmten Verunreinigungen des in dem Metallhapten enthaltenen Metalls, wodurch die !empfindlichkeit negativ beeinflußt würde, und daß er keine Substanzen enthält, die zu unerwünschten Wechselwirkungen während der Atomabsorptionsspektrophotometrie führen würden. Beispiele für geeignete Puffer sind:

Alkali- und Ammoniumphosphat, z.B. Natrium- und Dinatriumphosphat; Alkali- und Ammoniumeitrat oder -maleat, Äthylentetraessigsäure usw.

Die Substanzen, Haptene, die bestimmt werden können, sind in erster Linie durch ihre Fähigkeit, an die Stellen des Bindemittels gebunden zu werden, begrenzt. Keine bestimmte Begrenzung tritt ein bezüglich des spezifischen Moleküls des zu bestimmenden Haptens. Im allgemeinen liegt das Molekulargewicht zwischen 100 und ungefähr 100 000. Dadurch wird die Anwendung von Makromolekülen eines wesentlich höheren Molekulargewichts jedoch nicht ausgeschlossen. Üblicherweise liegt das Molekulargewicht dieser Haptene im Bereich von 125 bis 5 000.

Entsprechend der bekannten Nomenklatur dieser Haptene kommen u.a. die folgenden Gruppen zur Analyse infrage:

Alkaloide, wie Morphin, Codein, Dihydrocodein, Heroin, Oxi-

morphon, Metopon, Pholcodin usw.; Barbiturate, wie Veronal, Luminal, Seconal, Phenobarbital,

Barbital usw.;

Steroide, Östrogene, wie ß-Östradiol, Östron, Östriol, 170£-

Äthinyl-östradiol usw., Androgene, Progesterone, Adrenocorticohormone usw. Cannabinoide und deren Metaboliten;

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Vitamine, wie Carothin, Riboflavin, Thiamin, Niacin, Ascorbinsäure, Tocopherol, Phytyl-1,4-naphthochinon usw.;

Aminosäuren und Polypeptide;

Zucker, einschließlih Saccharide und Polysaccharide; Tranquilizer, wie Meprobamat, Valium, Oxazepam, Phenotiazine usw..

Neben den obenangegebenen Haptenen können andere vermischte Verbindungen, wie Kokain, Prostaglandin, Antibiotika, wie Penizillin, Chloromycetin, Actinomycetin und Nukleinsäuren und Nukleotide; Insekticide, Fungicide, Bakterieide und Nematocide, wie Malathion, Carbamate usw. ebenfalls mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden. Ganz allgemein können Antigene, Haptene und ihre Antikörper, Hormone, Vitamine, pharmakologische Materialien, wie Arzneimittel und Drogen, Metaboliten und ihre Rezeptoren und bindende Mate rialien mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden.

Das Bindemittel bzw. die bindende Substanz ist im allgemeinen ein hochmolekulares Material, das Stellen besitzt, die feine Strukturen erkennen lassen. Die interessantesten Makromoleküle sind Proteine und Nukleinsäuren, die sich in Zellmembranen, Blut und anderen biologischen Flüssigkeiten finden. Diese Verbindungen umfassen Enzyme, Antikörper, Ribonukleinsäure und Deoxyribonukleinsäure. Die günstigste Gruppe von Proteinen zur Anwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Antikörper. Antikörper werden gebildet durch Einführung einer immunogenen Substanz in den Blutstrom eines Lebewesens. Das Ergebnis der Einführung der immunogenen Sub-

(für)

stanz, Antigen, ist die Bildung von Antikörpern, die so wirken, daß sie das Antigen überziehenund entgiften oder aus der Lösung ausfällen. Das Protein bildet einen Überzug, der so geometrisch angeordnet ist, daß das Antigen in die räumliche Anordnung des Proteins paßt. Das zu bestimmende Material ist auf irgendeine übliche geeignete Weise an das Protein gebunden und das modifizierte Protein in den Blutstrom eingeführt. Die Antikörper, die sich bilden,umfassen Gruppen

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von Antikörpern, die so geformt sind, daß sie miT 'dfem*Itffeas Protein gebundenen Hapten übereinstimmen.

Bevorzugte Bindemittel sind Verbindungen auf der Basis, von Protein, die leicht verfügbar sind. Besonders geeignet sind unlösliche Bindemittel, die das gesamte erfindungsgemäße Verfahren erleichtern. In diesem Falle bestimmt die in dem System vorhandene Haptenmenge die Menge an Metallhapten, das an den Stellen des Bindemittels gebunden wird. Lösliche Bindemittel (Antikörper) werden durch ihre Bindung an einen unlöslichen Träger, wie Cellulose-Glasperlen, synthetische Polymere usw. unlöslich gemacht.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt auch Fälle, in denen das Hapten unlöslich gemacht worden ist und eine gewisse Löslichkeit des Bindemittels vorhanden ist, was zu einem Metall-Bindemittel-Üerivat führt. In diesem Falle ermöglicht die Verteilung des Metall-Bindemittels zwischen dem unlöslich gemachten Hapten und der Lösung die Messung des nicht-markierten Bindemittels.

Eine andere Abwandlung, die auch unter die vorliegende Erfindung fällt, sind Fälle, bei denen ein Teil des Haptens zusammen mit dem Bindemittel, wie im vorigen Falle, löslich ist und dadurch das System Hapten, Metall-Bindemittel und einen Teil ungelöstes Hapten umfaßt. Die Verteilung des Metall-Bindemittels zwischen der flüssigen und festen Phase ermöglicht die genaue Bestimmung des Haptens in Lösung. Für den Fachmann ist es selbstverständlich, daß auch andere Ausführungsformen erfindungsgemäß möglich sind und die obenangegebenen Variationen nicht als Begrenzung zu verstehen sind. Zum Beispiel ist es auch möglich, daß die Antikörper an verschiedene Träger gebunden sein können, wie Polyacrylamide, Copolymere aus Vinylacetate und Acrylsäure, Polyvinylester, modifizierte Cellulose usw. Der Vorteil der Anwendung eines derartigen Trägers besteht darin, daß auf diese Weise der Antikörper leicht von der Lösung abgetrennt und die klare

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Lösung leicht analysiert werden kann. Eine Beschreibung und verschiedene Beispiele für die Kupplung von Metallhaptenen an Protein sind z.B. in Methods of Immunology and Iramunochemistry, Band 1 (Chase and Williams, Academic Press, 1967) angegeben. Die Verfahren sind dort beschrieben für die Herstellung von Konjugaten für die Immunisation. Sie können jedoch auch angewandt werden zur Herstellung von Kupplungsprodukten aus Metallhaptenen und Proteinen.

Ein grundlegendes Erfordernis für das erfindungsgemäße Verfahren sind die Metallhaptene. Aufgrund der wichtigen Rolle, die diese Komponente für das erfindungsgemäße Verfahren spielt, wird im folgenden eine etwas ausführlichere Erklärung der Metall-Hapten-Struktur und metallorganischen Derivate und der Prinzipien ihrer allgemeinen Herstellung angegeben. Um eine bessere Definition für ein Metallhapten zu geben, wird auf zwei allgemeine Gruppen von Verbindungen verwiesen, die Metallatome in ihrer Struktur einbauen können. Hierbei kommen metallorganicche Verbindungen infrage, bei denen eine direkte Bindung besteht zwischen Kohlenstoffatomen der organischen Gruppe und Metallatomen oder die allgemeine Gruppe von Koordinationskomplexen mit einem Metall. Die letzteren können (neben den obenerwähnten metallorganischen Verbindungen) auch die sehr große Vielzahl von Verbindungen umfassen, bei denen eine chemische Verbindung zwischen dem Metallatom und einem anderen Atom, nicht notwendigerweise einem Kohlenstoffatom, auftritt, das in der organischen Gruppe vorhanden ist.

Die organische Gruppe kann praktisch irgendeine Verbindung sein, vorausgesetzt, daß sie eine geeignete funktioneile Gruppe enthält, mit der eine Bindung zu dem Metallatom eintreten kann. Um die Anwendbarkeit und die Möglichkeiten dieses Verfahrens weiter zu erläutern, scheint es günstig zwei allgemeine Versuche zur Herstellung von Metallhaptenen anzugeben. Ein Verfahren besteht darin, daß man ein Metallatom oder -atome direkt in das zu untersuchende Hapten einführt.

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Dabei entsteht ein Metallhapten, das anschließend, wie später beschrieben, für die Bestimmung angewandt wird.

Das zweite Verfahren besteht in der Herstellung eines metallhaltigen Reagenses, das auch eine funktioneile Gruppe einführt, mit der es an das zu bestimmende Hapten gebunden werden kann. In anderen Worten: Es können spezifische Haptene vorliegen, in die spezifische Metallatome nach üblichen Verfahren eingeführt werden, oder man kann ein allgemeines Reagens oder Reagentien herstellen, wieder mit einer Vielzahl von Metallatomen, und diese können dann an das betreffende Hapten gebunden werden.

Wenn beispielsweise das Hapten eine Carboxylgruppe in der Struktur enthält, kann man ein Metallreagens herstellen, bei dem einer der Liganden, die an das Metallatom gebunden sind, eine weitere funktioneile Amino- oder Hydroxylgruppe enthält^ die dann mit einer Carboxylgruppe des Haptens unter Bildung einer Amidbindung oder einer Esterbindung gebunden werden kann, und auf diese Weise kann das metallhaltige Reagens als Markierung für das Hapten dienen. Hs geht daraus deutlich hervor, daß irgendeine reaktionsfähige funktionelle Gruppe entweder in dem Hapten oder in dem metallhaltigen Reagens angewandt werden kann,und die spezielle Auswahl hängt vollständig von den Strukturen und chemischen Eigenschaften der betreffenden Haptene ab. Weitere spezielle Beispiele zur Illustration dieser Auswahl werden im Rahmen der Beschreibung angegeben.

Um die vielseitige Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter zu zeigen, v/erden im folgenden einige Beispiele angegeben, wie ein Metallhapten hergestellt werden kann, mit Hilfe der verschiedenen Verbindungsgruppen und verschiedene Verfahren zur Einführung von Metallen in die gewünschten Haptene. Zunächst wird auf metallorganische Verbindungen eingegangen, entsprechend der oben angegebenen Definition, nämlich Verbindungen, bei denen eine direkte Kohlen-

/19

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stoff-Metall-Bindung vorhanden ist. Es ist allgemein bekannt, daß man diese metallorganischen Verbindungen in drei Hauptgruppen nach der Art der chemischen Verbindung einteilen kann, die zwischen dem Kohlenstoffatom und dem Metallatom eintritt.

1. Die sogenannten ionischen Bindungen, z.B. die Verbindungen wie Butylnatrium oder ein Grignardreagens, bei denen die Kohlenstoff-Metall-Bindung weitgehend ionisch ist.

2. Die Derivate mit kovalenten ß^-Bindungen, z.B. Derivate von Quecksilber, wie Diarylquecksilber oder Dialkylquecksilber oder Alkylquecksilberchlorid oder Tetraäthylblei, bei denen die Kohlenstoff-Metall-Bindung überwiegend kovalent ist.

3. Die Gruppe von Verbindungen, bei denen eine sogenannte Tf -Bindung vorhanden ist, bei der ein Metallatom aus der Gruppe der Übergangsmetalle, wie z.B. Eisen, Kobalt oder Nickel, mit den 5/VElektronen einer ungesättigten organischen Verbindung reagieren oder in Wechselwirkung treten kann. Neben dem Übergang (donation) von Tf -Elektronen der organischen Gruppe in leere Orbitale des Metallatoms tritt eine sogenannte 'kückgabe'tback-donation) ein, wobei Elektronen aus besetzten Orbitalen der Metallatome mit leeren Orbitalen der organischen Gruppe in Wechselwirkung treten, wodurch eine zusätzliche Bindung entsteht, die die in der Chemie bekannte TT-Symmetrie besitzt. Diese Gruppe von Verbindungen ist einem weiten Bereich von Reaktionen zugänglich.

Von diesen drei Gruppen sind die interessantesten diejenigen, bei denen eine direkte kovalente Bindung oder eine ^-Bindung vorliegt. Die ionischen Metall-Kohlenstoff-Bindungen sind weniger interessant, da in einem dissoziierenden Medium die ionische Metall-Kohlenstoff-Bindung dissoziieren kann und es nicht möglich ist, das Metallatom, an das der Ligand gebunden ist, in der gewünschten Stellung zu halten. Eine kovalente Bindung, wie z.B. eine Quecksilber-Kohlenstoff-Bindung, kann als geeignetes Beispiel angesehen werden. Als Beispiel kann ein Steroid , wie Östradiol oder Östriol angeführt werden, das einen aromatischen Ring enthält. Dieses

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../2O

- 20 -

at

kann leicht durch Umsetzung des Steroids mit Quecksilberacetat merkuriert werden, um ein (oder mehrere) Wasserstoffatom(e) in dem Arylring durch eine Gruppe(oder Gruppen) zu ersetzen, die Quecksilberatome enthalten und dadurch eine Verbindung zu erhalten, in der das Quecksilberatom durch eine stabile Kohlen-Verbindung

stoff-Quecksilber-Bindung eingebaut ist. Diese/kann anschließend als Metallhapten für die gewünschte spezifische Bindungsbestimmung angewandt werden.

Ein anderes Beispiel zeigt die Verwendung einer Verbindung mit ^-artiger Bindung, v/obei eine organische Gruppe, wie eine Allylchlorid-oder Allylalkoholgruppe vorliegt. Durch Umsetzung eines derartigen Allylchlorids mit Metallatomen, wie Palladium oder Nickel oder Platin kann eine /^-Allyl-nickel- oder T/^-Allyl-palladium oder T/^-Allyl-platin-Verbindung entstehen, wobei eine verhältnismäßig feste chemische Bindung zwischen dem Metallatom und dem Elektronensystem der Allylgruppe der organischen Gruppe eintritt. Eine derartige Verbindung kann wiederum angewandt werden als Metallhapten für die spezifische Bindungsbestimmung. Andererseits kann eine geeignet substituierte organische Gruppe mit Verbindungen umgesetzt werden, wie Ferrocen, bei denen das Eisenatom fest an zwei Cyclopentadienylringe gebunden ist. Die organische Gruppe kann mit irgendeinem derartigen sogenannten "Sandwich"-Komplex oder Metallocen umgesetzt werden, bei dem andere Atome als Eisenatome angewandt werden, wie Kobalt oder Nickel oder Mangan,mit geeigneten Liganden unter Durchführung einer typischen organischen Reaktion, z.B. einer Friedel-Crafts-Reaktion, an dem Ferrocen und dadurch Einbau des Ferrocens: In anderen V/orten: Einführung eines Eisenatoms in das Hapten, das bestimmt werden soll.

Eine andere Möglichkeit besteht z.B. darin, ein Ferrocen oder Kobaltocen oder eine ähnliche Struktur anzuwenden, bei der eine Substituentengruppe oder funktionelle Gruppe vorhanden ist, die mit einer organischen funktioneilen Gruppe des Haptens reagieren kann. Wenn z.B. ein Aminoferrocen angewandt und mit einem Carbonsäurederivat des Haptens umgesetzt

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a?

wird, kann eine Amidbindung gebildet und dadurch die Ferrocen gruppe und damit das Eisenatom in das zu bestimmende Hapten eingebaut werden.

Bei Anwendung der obenerwähnten Beispiele auf das Steroid dötrogen, z.B. östradiol, kann man diese Substanz mit Chromhexacarbonyl umsetzen, um eirPVVrenchrom-tricarbonylartigen Komplex zu erhalten, durch den ein Chromatoin in das zu bestimmende Hapten eingeführt werden kann.

Näher auf die weiteren Einzelheiten und Prinzipien der Herstellung der Metallhaptene einzugehen, würde den Rahmen dieser Beschreibung sprengen. Es gibt eine umfangreiche Literatur mit einer großen Anzahl bekannter metallorganischer Derivate , und es ist daher möglich, irgendeine gewünschte Verbindung auf eine gewünschte Weise herzustellen. Der Fachmann ist ohne weiteres in der Lage, die entsprechende Metallhaptene zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens auszuwählen.

Eine allgemeine Formel für die metallorganischen Derivate, die zur Herstellung der Metallhaptene angewandt werden

können, ist M L L Lr; L^ Ll Ul, wobei L die Liganden dar-πι η o Jj cj r s

stellt, die die chemische Bindung zu dem Metallatom (M) eingehen. DieaeBindung kann entweder durch Kohlenstoff-Metall-Wechselwirkung oder durch eine Wechselwirkung des Metallatoms mit einem anderen Atom (oder Atom*) als Kohlenstoff gebildet werden. Im ersten Falle wird die Verbindung im allgemeinen als raetallorganische Verbindung bezeichnet, während im letzteren Falle die Verbindung als Metallkoordinationskomplex bezeichnet wird. Die Liganden L bis L können alle gleich oder verschieden oder Gemische aus gleichen und unterschiedlichen sein. Die Indices η bis s geben die Anzahl von Atomen oder Liganden pro Formeleinheit an, wobei m irgendeine ganze Zahl von 1 bis 10 und vorzugsweise 1 bis 4 sein kann. Es ist natürlich auch möglich, daß das Metall M für zwei oder mehrere Elemente stehen kann, und das ist der Fall, wenn m mindestens zwei ist. Die Indices η bis s können irgendeinen Zahlen-

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ta

272U86

wert von O bis 12 besitzen, vorausgesetzt, daß die Summe der Indices (n+o+p+q+r+s) der Koordinationszahl des Metallatoms (M) entspricht, wenn m gleich 1 ist. Wenn m größer ist als 1, ist es erforderlich, die Summe (n+o+p+q+r+s) für jedes Metallatom M getrennt zu berechnen, sodaß diese Summe in jedem Falle der Koordinationszahl des betreffenden Metallatoms M entspricht.

Das Metall kan irgendein metallisches Element oder eine Kombination von metallischen Elementen sein und vorzugsweise ein Übergangsmetall der Gruppen IB, HB, IHB, IVB, VB, VIB, VIIB und VIII des Periodensystems. Besonders günstig sind die sogenannten Edelmetalle der Gruppe VIII, wie Ru, Rh, Pd, Ir und Pt. Zum Beispiel besitzt das Platin eine besondere Stellung in der Chemie der organischen Metallkomplexe aufgrund der Vielzahl von Verbindungen, die dieses Element bilden kann. Aufgrund der Tatsache, daß Pt in mehreren Oxidationsstufen von 0 bis +4 vorliegen kann, ist die Anzahl von Platin-organischen Verbindungen sehr hoch, sodaß jeder gewünschte Komplex ins Auge gefaßt und praktisch angewandt werden kann. Andere Elemente, die metallartige Eigenschaften besitzen, wie As, B, Sb, Se, Si, Sn, Te, Ge sowie die Lanthaniden, können ebenfalls zur Herstellung von Metallhaptenen angewandt werden.

Zu den wichtigsten organischen Gruppen, die in den Koordinationskomplexen vorliegen, gehören u.a. die folgenden:

Pyridin, Äthylen-diamin, Diäthylendiamin, Dimethy1-glyoxim, Dipyridyl, Phenantrolin, Acetylacetonat, Äthylen-diamintetraessigsäure usw..

Diese Gruppen sind über eine funktionelle Gruppe R, die nicht an der Koordination des Metalls beteiligt ist, sondern nur zur Bildung einer chemischen Bindung mit dem Hapten dient, verbunden. Die Auswahl des entsprechenden Metallhaptens, das als Komponente in dem erfindungsgemäßen System angewandt wird, hängt von einigen Eigenschaften, wie der er-

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../23

27 2A Aßß

forderlichen spezifischen Aktivität und der Einfachheit der Metallbestimmung ab.

Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Analyseneinheit angewandt werden, bestehend aus:

(a) einer vorgegebenen Menge eines Metallhaptens, das entsprechend dem zu bestimmenden Hapten ausgewählt ist;
(bj einer bestimmten Menge des in dem System anzuwendenden

Bindemittels bzw. der bindenden Substanz oder
(bp) einer bekannten Menge eines Antikörpers in unlöslicher Form.

Soweit erforderlich kann die Analyseneinheit auch den Puffer und die notwendigen Hilfsmittel zur Herstellung von Verdünnungsreihen der zu untersuchenden Probe für eine
quantitative Bestimmung enthalten, wie Reagensgläser,
Pipetten und Kolben mit Verdünnungsflüssigkeiten.

Eine der wichtigsten Eigenschaften des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die praktxsch unbegrenzte Anwendbarkeit durch die Möglichkeit, die Metall-markierten Haptene
für die jeweils gewünschte spezifische Bindungsbestimmung
genau geeignet herzustellen.

Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert:

../Beispiele

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50

Die in den Beispielen angev/andten Abkürzungen und Symbole sind im folgenden angegeben!

THF IR NMR TLC ac ac

Atom— absorptionsspdc troskopie

Ovalbumin Rinderserum—albumin Dimethylformamid

Die Ferrocenygruppe CA\ FeC-FL

Dicyclohexylcarbodiimid

Phosphat-Puffer -Salzlösun

N-Hydroxysuccinimid : OS p

Tetrahydrofuran Infrarot

Kernmagnetische Resonanz

Dünnschichtchromatographie

Acetylacetonat— Ligand

CH₃-C - CIl =

CH

Cr(acac), = Tris-acetylacetonatechromium

Cym = Die Cymantrenyl gruppe [CO]₃MnC₅H₄-

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(acac)_ Cr(acac)-NH = Monoamino - tris-acetylacetor.at — chromium

272AA86

= Östron

E_ = Östradiol

OH

E₃ = Östriol

.-0H

I I

E₁(OX)-COOH = Östron -oxim - 0 - carboxymethyl

E (HS)-COOH = Östradiol - 17P-hemisuccinat

.COOH E-(HS)- =Östriol - 16*4 lT^-bis-hemisuccinat OCO(CH₂)₂ COOH

:ooh

C00H

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E₁ - NH₂ = 1,3,5 -Üstratrien - 3 - o£ - 17 - amino

(Ej)-NOH = Östron-oxim

CM₃

Pg - OH = 11α - Hydroxyprogesteron

O^

Pg(HS) - COOH = 11α - Hydroxyprogesteron-hemisuccinat

Δ - THC = Δ - Tetrahydrocannabinol

OM

Δ - THC - COOH = 7 - Nor - 1 - carboxy - Δ - tetrahydrocannabinul

CO₁H

7098 51/082 0

1A-49 41Σ

Beispiel 1 Mit Elsen markiertes Rinderserum-Albumin

a) 0,14 ml (1,0 mMol) Triethylamin und 0,13 ml (1,0 mMol) Isobutylchlorformiat wurden unter Rühren zu einer gekühlten Lösung (-15⁰C) von Ferrocenylcarbonsäure, Fc-COOH (235 mg, 1,0 mMol) in 3 el trockenem Dimethylformamid (DMF) gegeben. Nach 20 min langem Rühren bei -15°C und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch unter Rühren zu einer gekühlten (O⁰C) Lösung von 400 mg (0,006 mMol) BSA in 60 ml Wasser enthaltend 2,6 g Natriumcarbonat getropft · Nach vollständiger Zugabe wurde 22 h bei 4°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min mit 16 000 UpM bei O⁰C zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gegen Boratpuffer, pH 8,5 (3x2 1), dlalysiert und dann gegen destilliertes Wasser (4x2 1). Beim Lyophillsieren des Dialysats erhielt man 380 mg BSA - (COFc)_nKonJugat. Die Anzahl der Ferrocenylgruppen Fc pro Mol BSA wurde bestimmt durch klassiche UV-Differential Analyse und es zeigte sich, daß sie ungefähr n*/11 war.

Un die gleiche Bestimmung durch Atomabsorption durchzuführen, wjrde zunächst eine Eichkurve gebildet durch Lösen einer bekannten Menge FcCOOH in einer Lösung von 0,1 NaOH (Vorratlösung) und anschließende Herstellung geeigneter Verdünnungen in dem erwarteten Meßbereich. Eine abgewogene Menge BSA (COFc )_n-KonJugat wurde dann in einem abgemessenen Volumen 0,1 η NaOH-Lösung gelöst und die Lösung durch Atomabsorption mit Hilfe eines Perkln Eimer Geräts Modell 404 AS bei einer Wellenlänge von 250,6 mn, Spalt 3, plus 53/32,5, (autozero) an BSA gemessen. Die Interpolation der bei dieser Messung erhaltenen ASS-Signale in die Elchkurve ergab n=i6 Ferrocenylgruppen pro Mol BSA In dem wie oben hergestellten BSA-(COFc)_n-KonJugat. Diese Bestimmung kann als genauer angesehen werden als die UV-Differential Analyse, da bei dem AAS der Eisengehalt in dem Molekül direkt gemessen wird.

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■\k-L\O 412

b) Eine Lösung von 15 mg (0,03 mMol) Diferrocenylcarboniumfluorborat, (Fc)₂CH⁺BF^ , in 2 ml Methanol wurde zu einer gekühlten (O⁰C) Lösung von 80 mg (0,0012 mMol) BSA in 10 ml Wasser, enthaltend 0,6 g Natriumbicarbonat gegeben. Obwohl sich die Farbe schnell von dunkelblau nach gelb änderte, wurde das Gemisch weitere 15 h bei 0⁰C gerührt. Die Lösung wurde dann bei 0⁰C mit 16 000 UpM 30 min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gegen Boratpuffer, pH 8,5 (3x0,5 1), und dann gegen Wasser (5x0,5 1) dialysiert. Beim Lyophilisieren des Dialysats erhielt man 67 mg BSA-/Ch(FcJ₂^_n-Konjugat. Dieses Konjugat zeigte eine gut definierte Bande bei der Elektrophorese, die sich von derjenigen des nicht konjugierten BSA-Ausgangsmaterials unterschied.

Atomabsorptionsmessungen nach dem oben unter a) beschrieben verfahren zeigten n=11 in dem BAS-/5H(Fc)₂_7_n-Konjugat entsprechend 22 Ferrocenylgruppen pro Mol BSA.

Beispiel 2

Anwendung von eisenmarkiertem BSA zur Bestimmung der Antikörperkonzentration durch Atomabsorption

Die quantitative Ausfällung (Präclpltation) der Kombination Antikörper- Antigen, die üblicherweise als Präcipitinreaktion bezeichnet wird, ist ein verbreitet angewandtes immunologisches Verfahren zur Bestimmung der Antikörper-Konzentratlon. Die folgende Beschreibung einer Reihe von Präcipitinreaktionen zeigt die Anwendung von metallmarkierten Antigenen für die quantitative Bestimmung der Antikörperkonzentration.

Kaninchen-Antiserum gegen Rinderserum-Albumin (Anti-BSA) (0,5 ml einer 1:16 Verdünnung ) wurde mit der Antigenlösung (0,5 ml eines Bereichs von Lösungen von 1mg/ml bis 4x10 mg/ml) vermischt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Jede Probe wurde dann auf einem Vortex Mischer vermischt und 24 h bei 4°C Inkubiert. Nach 30 min langem Zentrifugieren bei 0°C mit 4 000 UpM wurde die überstehen-

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- 29 -

- 29 - Ιζ

de Flüssigkeit abdekantiert und die Niederschläge zweimal mit Borat-Salz-Puffer, pH 8,5, gewaschen. Die Niederschläge bzw. Präcipitate wurden dann getrocknet und jeweils in 1,0 ml einer Lösung von 0,1η NaOH gelöst.

Das oben angegebene Verfahren wurde mit jedem der folgenden Antigene durchgeführt.

(I) BSA; (H)BSA-(CO-Fc)₁₆; (III) BSA-ZCh(Fc)_2-Z₁₁

Jede der oben angegebenen Lösungen wurde nach zwei Verfahren gemessen:

a) mit einem Zeiss UV Spektrophotometer zur Bestimmung der Absorption bei 287 nm und dadurch Berechnung der ausgefällten Proteinmenge durch Interpolation in eine Eichkurve, die hergestellt worden war mit einer Lösung von BSAJn 0,1n NaOH;

b) unter Verwendung des AAS-Gerätes mit der Graphitkammer (HGA-70) Modifikation eines Perkin Eimer Modells 403 AAS:

Injektion von 20 ml Probe bei Programm 7, T₁=30 s, T₂=OO s, T₃=3O s.

Empfindlichstes Schreibers 1, Einstellung des Schreibers (Recorder settings) 0,5 A, 5mV Papiergeschwindigkeit 600/h.

Die Eichkurve wurde hergestellt mit Lösungen von Fc-COOH in 0,1n NaOH unter den gleichen Arbeitsbedingungen des Geräts.

Beispiel 3

Mit Quecksilber markiertes Östradiol-hemisuccinat-hapten

a) Eine Tetrahydrofuranlösung von Östradiol-hemisucclnat, E₂(HS)-COOH (300 mg, 0,775 mMol), p-Aminophenylquecksilberchlorid (277 mg, 0,775 mMol) und DCC, (Dicyclohexyldiimid) (160 mg, 0,80 mMol) wurde 36 h bei Raumtemperatur gerührt.

7098S1/082Ü

- 30 -

1A-49 41?

Das Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung des gelblichen Niederschlags filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Man erhielt 618 mg eines festen Rückstandes.

Nach Reinigung von 150 mg des obigen Rückstands durch Säulenchromatographie über Silicagel und Eluieren mit Chloroform/ Äthylacetat (3:1) erhielt man das quecksilbermarkierte Amid, E₂(HS)-CONH-CgH₄-HgCl, in reiner Form mit den folgenden Daten:

NMR(d₈-THF)^(ppm) 7,3-7,9(4H, aromatisches AA¹BB«System), 6,5-7,2(3H, aromatisch), 2,7(4H, -CH₂-CH -), O,95(3H, anguläres CH) ²

b) Ein alternatives Verfahren für die Synthese des Amids E₂(HS)-CONH-C₆H₄-HgCl war das folgende:

200 mg (0,55 mMol) östradiol-hemisuccinat in 2 ml trockenem Dimethylformamid wurden mit 0,1 ml Triethylamin und 0,16 ml Isobutylchlorformiat bei -12°C vermischt und 20 min bei dieser Temperatur gerührt. Nach weiterem 1stündigem Rühren bei O⁰C wurde das Reaktionsgemisch auf einmal zu einer Lösung von p-Aminophenylquecksilberchlorid in trockenem DMF (2 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 48 h bei Raumtemperatur gerührt und dann auf Eis gegossen. Der weiße Niederschlag wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet. Man erhielt 275 mg. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie wie unter a) beschrieben gereinigt.

Beispiel 3a

Anwendung des quecksilbermarkierten östradiol-hemisuccinats E₂(HS)-CONH-CgH₄-HgCl zur Bestimmung der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung mit Hilfe von AAS

Stufe I - Eichkurve

Es wurde eine Vorratslösung von E₂(HS)-CONH-CgH₄-HgCl hergestellt durch Lösen von ungefähr 5 mg des Metallhaptens in DMF (5 ml).

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- 31 -

1A-49 412

Die Arbeitslösung (enthaltend 15 % DMF) wurde jeden Tag frisch zubereitet durch Herstellung der entsprechenden Verdünnungen der Vorratslösung mit 0,1m Phosphat-Puffer-Salzlösung (PBS),

pH 7,3. Diese Arbeitslösung wurde angewandt zur Bildung einer Eichkurve mit einem Perkin-Elmer-Atomabsorptions-Spektrophotomer, Modell 403, mit einer Graphitkammer, Modell HG-70, und einem Deuteriumhintergrund-Korrektor unter den folgenden experimentellen Bedingungen: Programm 3: Trocknungszeit (100⁰C) 60 s; Verkohlungszeit (charring time) keine; Atomisierungszeit (2100°C) 20 s; Ansprechen desSchreibers 1; Spalt 4; Lampenstrom 12 mA; Trägergas Argon; Injektionsvolumen 30 /ul.

Die Daten für einen typischen Eichversuch sind: Vorratslösung: 5,3 mg E₂(HS)-CONH-C₆H₄-HgCl in 5 ml DMF Arbeitslösung: 0,2 ml Vorratslösung + 0,55 ml DMF + PBS auf 5 ml. Das ergibt eine 6,22x10"^ Lösung enthaltend 12,47 /Ug Hg pro ml.

Eine weitere 1:7 Verdünnung ergibt die Arbeitslösung mit einer Konzentration von 1,55 /Ug Hg pro ml. Anteile dieser Lösung wurden in zunehmenden Volumina zu einer 15 %igen DMF-PBS-Lösung gegeben wie in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle 3A-1

Ansatz- Arbeits- 15 % DMF/PBS Molkonzen- Hg Konzen- Peak^ _M lösung / ,\ tration tration Höhe ^1Nr* (/ul) ^K/^UX) (mx10-⁷) (/Ug/ml) (mm)

1 5 115 3,23 0,064 57

2 15 105 9,70 0,192 121

3 20 100 12,9 0,256 146

4 30 90 1*9,4 0,384 204

^v 'Mittelwert aus doppelten Messungen (Standard-Abweichung τ + 5 56)

709851/0820 - 32 -

ΐΑ-ί*9 412

Wenn man die mittlere Peak-Höhe (mm) gegen die Konzentration (/Ug Hg/ml) aufträgt, erhält man eine lineare Kurve entsprechend der Gleichung Y = 456,7x + 29,69 mit einem Korrelationskoeffizienten f = 0,9991.

Die Eichkurve wurde zu Beginn jedes Arbeitstages gebildet, um die Geräteinstellungen und die Stabilität der Arbeitslösungen zu überprüfen.

Stufe II - Herstellung von Antisera und JT-Globulinen

Das Hapten E₂(HSi)-COOH wurde nach dem gemischten Anhydridverfahren mit Hilfe von Isobutylchlorformiat in DMF an BSA gekuppelt. Der Grad der Konjugation wurde bestimmt durch UV Differentialanalyse. Kaninchen wurden immunisiert durch mehrfache subkutane Injektion entlang von Flanke, Nacken und Rumpf mit einer Emulsion von vollständigen Freund's Adjuvants und dem E₂(HS)-COOH-BSA-Konjugat. Vor der Immunisierung wurde Blut entnommen (für normales Serum) und in wöchentlichen Intervallen nach der Immunisierung. Zusätzliche Injektionen wurden in sechswöchigen Intervallen verabreicht. Die Sera von den Blutentnahmen zwischen den einzelnen Zusatzinjektionen wurden zusammengegeben. Immunoglobuline wurden aus den zusammengegebenen Antisera und normalen Sera,hergestellt durch Precipitation in Ammoniumsulfat und anschließende Dialyse gegen 0,01m PBS, pH 7,3. Die /^-Globulinlösungen wurden in 1ml Anteile in kleine Glasgefäße gegeben und bei -20⁰C aufbewahrt und die ι
darf vor der Anwendung aufgetaut.

und bei -20⁰C aufbewahrt und die einzelnen Anteile je nach BeStufe III - Herstellung von auf einer Matrix enthaltenen Anti-E₂(HS)-COOH-Antikörpern

1,0 g mit Cyanobromid aktivierte Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) wurde 15 min mit 200 ml einer Lösung von 10~⁵m HCl (pH 3) gequollen und gewaschen. Dieses Gel wurde dann in einem Reagenzglas mit Anti-E₂(HS)-COOH-Antiserum (hergestellt aus 6ml Antiserum in einer 0,1m Lösung von Phosphatpuffer, pH 7,3,

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1A-/.9 412

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dialysiert gegen 3x1 1 einer Lösung von O,1m NaHCO, und 0,5m NaCl, pH 8,2) vermischt und 2 h leicht gestürzt. Das Gel wurde dann nacheinander gewaschen und zentrifugiert mit einer Lösung von 0,1m Acetatpuffer, dann mit einer Lösung von 0,1m Boratpuffer (jeweils 1m NaCl) bis keine UV-Absorption bei 280 nm mehr beobachtet wurde. Die feste Phase wurde dann erneut in 10 ml 1m Äthanolaminlösung, pH 8, suspendiert und 2 h über das Ende gestürzt, um restliche aktive Gruppen zu desaktivieren. Dieses Verfahren wurde über einige Waschzyklen wiederholt und schließlich der Feststoff erneut in 6 ml einer*1m Phosphatpufferlösung, pH 7,3, suspendiert. Die Menge an gebundenem Protein wurde berechnet durch Substraktion der Menge an nicht gebundenem Protein, das bei den Waschvorgängen entfernt worden war (gemessen bei 280 nm) von der in der ursprünglichen Lösung vorhandenen Menge·

Stufe IV - Titration der auf Sepharose enthaltenen Anti-E₂(HS)-COOH-Antikörper

Zunehmende Mengen von E^HSj-CONH-CgH^-HgCl-Lösung wurden zu einem konstanten Volumen (30 /ul) der auf Sepharose enthaltenen Anti-E₂(HS)-COOH-Antikörper (hergestellt entsprechend Stufe III) in Polyäthylenflaschen gegeben und das Gesamtvolumen mit 15 96 DMF/PBS Puffer auf 120 /ul gebracht. Nach 90 min langer Inkubation bei Raumtemperatur in einem mechanischen Schüttler wurden die Flaschen 10 min mit 300 UpM zentrifugiert. Gleiche Anteile (30 /Ul) wurden dann von der überstehenden Flüssigkeit mit einer Eppendorf-Spritze entnommen und in die Graphitkammer eines AA-Spektrometers eingespritzt. Die Konzentration des gefundenen Quecksilbers ist ein Maß für den freien Anteil an E₂(HS)-CONH-CgH^HgCl, das nicht Antikörper gebunden ist, die auf der Sepharose immobilisiert sind und der gebundene Anteil kann durch Differenzbildung erhalten werden.

Die Ergebnisse eines derartigen Versuchs sind in der folgenden Tabelle angegeben.

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1A-4C 412

Nr. zugesetztes Volumen des Hg-raarkierten Haptens (a) (/Ul)

Mol-Konz. Gesamtkonz. Peakd.Hg.mar-Hg (b) Höhe d. kierten / / \) überste-Haptens v/ 6/ / henden (mx10-7) Flüssig

keit (c) (mm)

Konz, gebunan frei- den em Hg (/um/ml)

1	5	3,23	0,064	12	0,012	81,2
2	10	6,46	0,128	23	0,041	67,9
3	15	9,7	0,192	40	0,085	55,7
4	20	12,9	0,256	60	0,119	53,5
5	25	16,2	0,320	73	0,171	46,5
6	30	19,4	0,384	86	0,204	46,8

(a) Es wurde immer ein konstantes Volumen von 30 /ul Antikörper-Sepharose-Suspension angewandt

(b) Gesamtes Endvolumen: 120 /ul

(c) lineare Steigung der Eichkurve: { = 384,3x + 7,4 (x = /Ug Hg/ml) (regression equation)

Beispiel 4

Hg-markiertes östron-oxim-O-carboxymethyl-hapten

Östron-oxim-O-carboxymethyl, E₁(OX)-COOH, (200 mg, 0,583 mMol), p-Aminophenylquecksilberchlorid (191 mg), DDC (121 mg, 0,587 mMol) in 6 ml frisch destilliertem Tetrahydrofuran wurde 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung des Niederschlags filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft, wobei man 345 mg eines festen Rückstands erhielt. Beim Chromatographieren über Kieselsäure und Eluieren mit Chloroform/ Methanol (99:1) erhielt man 100 mg reines Amid;

E₁(OX)-CONH-C₆H₄HgCl mit folgenden Werten:

NMR-Spektrum (dg-THF),i (ppm) 7,4-7,8(4H, aromatisch, AA¹BB¹-System), 6,5-7,3(3H, aromatisch), 4,6(2H, -OCH₂-), O,9(3H, an-

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Das gleiche Amid E₁(OX)-CONH-C₆H^HgCl wurde hergestellt nach dem gemischten Anhydridverfahren mit Hilfe von Isobutyl-chlorformiat wie in Beispiel 3b beschrieben.

Beispiel 5

Mit Quecksilber markierte Östradiol-haptene

Dieses Beispiel umfaßt die folgenden Stufen:

Stufe I

Eine Lösung von 1,0 g (3,67 mMol) Östradiol und 1,1 g (3,45 mMol) Quecksilberacetat in 20 ml Methanol wurde 2,5 h unter Rückfluß erhitzt und dann 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von weiteren Quecksilberacetat (1,1 g, 3,45 mMol) wurde das Reaktionsgemisch 2 h unter Rückfluß erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Trennung der festen und flüssigen Phasen a) bzw. b) filtriert. Jede Phase wurde folgendermaßen getrennt aufgearbeitet:

a) Die feste Phase wurde in 10 ml eines Gemisches aus Methanol/ Chloroform/Methylenchlorid (1:1:1) gelöst mit einer Lösung von 400 mg Lithiumchlorid in 3 ml Methanol vermischt und 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum (Wasserpumpe) abgedampft und der Rückstand in 25 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser (3 x 50 ml) zur Entfernung anorganischer Chloride extrahiert, über MgSO^ getrocknet und das Lösungsmittel entfernt, wobei man 0,6 g eines festen Produktes erhielt. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) zeigte das Vorhandensein drei neuer Verbindungen, Chlorquecksilberöstradiolderivate neben einer kleinen Menge nicht umgesetztem Östradiol.

flüssige

b) Die ^hase wurde mit 400 mg Lithiumchlorid vermischt und

bei Raumtemperatur 20 h gerührt. Ein anorganischer weißer Niederschlag wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen, mit Wasser

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1A-^o 412

gewaschen und über MgSO^ getrocknet. Das organische Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Man erhielt einen Feststoff, bei dem sich bei der Bünnschichtchromatographiß zeigte, daß er die gleiche Zusammensetzung besaß wie das nach a) erhaltene Produkt.

Stufe II

Die Abtrennung der Chlorquecksilberöstradiolderivate wurde erreicht durch Acylierung der Hydroxylfunktionen, Chromatographie über Kieselsäure, um die reinen Komponenten zu erhalten und Hydrolyse der Acetate, um die reinen Chlorquecksilberöstradiolderivate zu erhalten. Ein typisches Verfahren war: das unter a) oder b) in Stufe I erhaltene Gemisch (0,6 g) wurde in 3 ml Essigsäureanhydrid und 15 ml trockenem Pyridin 2 h unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch unter magnetischem Rühren zu 200 ml eiskaltem Wasser getropft. Der weiße Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 0,59 g eines glasartigen Rückstandes. Beim Chromatographieren über Kieselsäure, Eluieren mit Benzol und dann mit Benzol/ Chloroform erhielt man zunächst Östradiolacetat (88 mg), dann 2-Chlorquecksilberöstradioldiacetat (190 mg), später 4-Chlorquecksilberöstradioldiacetat und schließlich 2,4-(Bis-chlorquecksilberöstradioldiacetat). Die drei Chlorquecksilberdiacetatderivate konnten durch ihr typisches NMR-Spektrum identifiziert werden, insbesondere durch die Benzylringprotonen zur Bestimmung der Stellung und des Grad aer Substitution.

Stufe III

Die Hydrolyse Jedes der abgetrennten Chlorquecksilberdiacetate ergab das entsprechende Chlorquecksilberöstradiol, nämlich 2-Chlorquecksilberöstradiol, 4-Chlorquecksilberöstradiol und 2,4-(Bis-chlorquecksilber)-östradiol.

Ein typischer Hydrolyseversuch war:

- 37 -

709851 /0820

iA-'-49 412

Eine Lösung von 65 mg 4-ChlorquecksilberÖstradioldiacetat in 5 Gew.-96 Kaiiumhydroxid in Methanol (20 ml) und Lithiumchlorid (12 mg) wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdampfen des Methanols/d.m Vakuum (Wasserpumpe) wurde der Rückstand mit 50 ml Wasser vermischt, etwas Lithiumchlorid zugegeben und das Gemisch mit Chloroform (2 χ 25 ml) und dann mit Äthylacetat ( 3 x 20 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über MgSO^ getrocknet und eingedampft. Man erhielt: 48 mg 4-Chlorquecksilberöstradiol.

C H Analyse; berechnet für C₁₈H₂₃O₂HgCl: 42,60 4,57 %

gefunden: 42,60 4,85 %

NMR-Spektrum(d₈-THF):$ (ppm) 6,7-7,3(2H aromatisch, AB-System)

O,9(3H, Singulett, anguläres CH,). Stufe IV

Ein weiterer Nachweis der Struktur der Chlorquecksilberderivate wurde erhalten durch Umwandlung in die jeweiligen Jodöstradiolderivate:

Das unter a) erhaltene Chlorquecksilberöstradiolgemisch (0,6 g) wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und unter Rühren bei Raumtemperatur 0,3 g Jod zugegeben. Nach 20 h langem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung des roten Niederschlags filtriert und das Chloroformextrat mit einer wäßrigen Kaliumjodidlösung extrahiert, bis das freie Jod entfernt war« Die Chloroformphase wurde dann über MgSQ, getrocknet und eingedampft, wobei man 454 mg eines festen Rückstandsr:.erhielt. Dieser wurde über eine Silicagelsäule chromatographiert, mit Tetrachlorkohlenstoff und Tetrachlorkohlenstoff^Diäthyläther-Gemischen eluiert. Die folgenden Verbindungen wurden in der Reihenfolge des Eluirens in reiner Form erhalten:

(I) 2,4-Dioodöstradiol (42 mg), NMR (CCl₄) ξ (ppm) 7,7 (1H,aromatisch), 0,9 (3H, angular CH,);

- 38 -

709851 /0820

1A-49 412 - YS- if ψ

(II) 2-Jodöstradiol (31 mg), NMR (CCl₄) <f (ppm) 7,5 (1H, aromatisch), 6,5 (1H, aromatisch), 0,9 (3H, angular CH^);

(Ill)4-Jodöstradiol (60 mg), NMR (CCl₄) <f (ppm) 6,6-7,3 (2H, aromatisch, AM-System), 0,8 (3H, angular CH,).

Der Rest des eluierten Materials aus der Säule bestand aus Gemischen der obigen drei Verbindungen.

Beispiel 5A

Mit Quecksilber markierte Östriol-haptene

Das in Beispiel 5 für Östradiol beschriebene Verfahren wurde auch auf Östriol angewandt und zwar folgendermaßen:

0,635 g (2 mMol) Quecksilberacetat wurden zu einer Lösung von 0,575 g (2 mMol) östriol in 20 ml Methanol gegeben. Das Gemisch wurde 4 h unter Rückfluß erhitzt und dann 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Bei Zugabe von 20 ml CHCl, und 20 ml CH₂Cl₂ zu dem Reaktionsgemisch entstand eine klare Lösung, die dann mit 0,2g LiCl in 3 ml Methanol behandelt wurde. Nach 12 h langem Rühren bei Raumtemperatur wurde das organische Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand (1,26 g) mit Wasser (3 x 25 ml) gewaschen. Die vereinigten wäßrigen Waschlösungen wurden mit Äthylacetat ( 3 x 25 ml) extrahiert, um etwaige gelöste Östriolderivate zu entfernen. Der nach Eindampfen der vereinigten Äthylacetatauszüge erhaltene Rückstand wurde mit dem festen Rückstand zusammengegeben, der wie oben erhalten worden war und das Gemisch wurde wie in den Stufen II und III des Beispiels 5 behandelt, um die Chlarquecksilberöstriolderivate zu trennen. Wenn andererseits die Jodöstrolderivate erwünscht sind, wird der wie oben erhaltene feste Rückstand in THF gelöst und mit einer Lösung von 0,5 g Jod in 50 ml CHCI3 titriert, bis/Öie Jodfarbe in dem Resktionsgemisch stabil bleibt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand, der ein Gemisch aus 2-JodÖstriol,

709851/0820 - 39 -

1Λ-49 412

-VT-U-S

4-Jodöstriol und 2,4-Dijodöstriol war über eine Silicagelsäule chromatographiert, wobei man reines 2,4-Dijodöstriol (0,1 g) und ein Gemisch von 2-Jod- und 4-Jodöstriol (0,32 g) erhielt. . Die beiden Monojodöstrolderivate konnten gegebenenfalls durch wiederholte Chromatographie getrennt werden. Das NMR-Spektrum der drei Verbindungen war im Bereich der aromatischen Protonen identisch mit dem für die Östradiolderivate nach Beispiel 5 erhaltenen.

Die beiden in Beispiel 5 und 5A angegebenen Verfahren stellen einen sehr einfachen Weg dar zur Herstellung von reinen radioaktiven Jodderivaten von Östradiol und Östriol.

Beispiel 6

Mit Eisen markiertes Östradiol-hemisuccinat-hapten E₂(HS)-CONH-CH₂Fc

Stufe I - Synthese von Östradiol-iyß-succinat-N-succinimid-ester

E₂(HS)-COO

O^—'

DCC (58 mg, 0,28 mMol) wurde zu einer eiskalten Lösung von Östradiol-iyß-hemisuccinat, E₂(HS)-COOH, (93 mg, 0,25 mMol) und N-Hydroxysuccinamid, NHS (30 mg, 0,25 mMol) in 4 ml trockenem, frisch destilliertem Tetrahydrofuran gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei O⁰C und dann bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Dicyclohexylharnstoffs wurde das THF-Filtrat zur Trockne eingedampft, wobei man 120 mg eines weißen F^etstoffs erhielt. Durch IR- und NMR-Spektroskopie zeigte es sich, daß es der erwartete aktive Ester

E₂(HS)-COO

0^;
war.

709851/0820 - 4o -

IA-49 412

^h 272U86

Dieser wurde ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe angewandt.

S+ufe II Q

Eine Lösung von 120 mg des aktiven Esters E₂(HS)-COOI^ J

(ungefähr 0,25 mMol) und 55 mg (0,25 mMol) Ferrocenylmethylamin Fc-CH₂NH₂ in 4 ml trocknem, frisch destillierten THF wurde 20 h bei Raumtemperatur magnetisch gerührt. Das Gemisch wurde zur Entfernung von ausgefallenen Substanzen filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft, wobei ein weißer Feststoff entstand. Dieser wurde in 10 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 2 χ 10 ml Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO^ getrocknet und eingedampft, wobei man 160 mg eines festen Rückstands erhielt. Dieser wurde durch Säulenchromatographie über 7 g 10 %iges desaktiviertes basisches Aluminiumoxid chromatographiert. Beim Eluieren mit Benzol-Chloroform (4:1) erhielt man 55 mg (40 %) einer reinen Verbindung, Fp. 14O-143°C. Durch IR- und NMR- und hoch aufgelöstes Massenspektrum zeigte es sich, daß es das Amid E₂(HS)-CONH-CH₂-Fc war.

IR(CHCl₃)^ (cm"¹): 1720 (vs): 1660 (vs): 1170 (s):

1100 (s) : 1000 (m).

NMR(CDCl₃) £ (ppm): 7,3-6,8 (aromatisch 3H): 4,3(Ferrocenyl 9H)

0,8 (angular Methyl 3H).

Molekularion (hoch aufgelöstes Massenspektrum, m/e) 569,223s analysiert für C^H^gO

Beispiel 6A

Anwendung von eisenmarkiertem Östradiol-hemisuccinat, E₂(HS)-CONH-CH₂Fc zur Bestimmung der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung durch AAS

709851/0820

1A-49 412

272U86

Stufe I - Eichkurven

Es wurde ähnlich wie in Beispiel 3AStufe I beschrieben gearbeitet. Das markierte Hapten E₂(HS)-CONH-CH₂Fc wurde zur Herstellung einer Vorratslösung,enthaltend 1 mg/ml, in DMF gelöst. Es wurden Verdünnungen mit Pufferlösungen hergestellt (0,05m Natriumcitratpuffer, pH 7,3 oder 0,01m Kaliumphosphatpuffer, pH 7,3), um die Arbeits-Standard-Lösungen, enthaltend 15 % DMF, zu erhalten. Die Eichkurven wurden folgendermaßen hergestellt:

a) nach dem Verfahren der Standardzugabe: 90 /ul der Vorratslösung wurden auf ein Volumen von 10 ml verdünnt und dann 30 /ul Anteile in das AAS eingespritzt, um den Arbeitsbereich von 50 bis 300 ng Fe/ml zu erhalten;

b) durch übliche Verdünnungsverfahren, wobei 30, 60, 90 und 120/ul einer entsprechend konzentrierten Lösung mit Pufferlösung auf ein Gesamtvolumen von 120 /Ul gebracht wurden. Jede Standard-Konzentration wurde doppelt hergestellt und jede AA-Messung doppelt oder dreifach durchgeführt, mit Hilfe eines Perkin-Elmer-Geräts, Modell 403, mit Graphitkammer (Modell HG-70) und Deuterium-Hintergrundkorrektor. Die Versuchsbedingungen waren: Programm 7; Trocknungszeit (100⁰C) 40 s; Verkohlungszeit (1100⁰C) 90 s; Atomisierungszeit (2400⁰C) 10s; Spalte 3, Lampenstrom 20 mA; Trägergas Argon; Ansprechen des Schreibers 1; 0,25 A, 20 mV; Papiergeschwindigkeit 2 cm/min. Die folgenden Daten wurden für das Verfahren der Standardzugabe für zwei typische Eichversuche erhalten einer mit Lösungen, die in dreifach destilliertem Wasser mit 15 96 DMF (Tabelle 6A-1) erhalten worden waren und der zweite mit Verdünnungen in 0,01m PBS mit 15 % DMF (Tabelle 6A-2).

Tabelle:

- 42 709851/0820

- u-a

Tabelle 6A-1

k-0

272^486

Nr. molare Konz.

an Fc-markiertem Hapten (m χ 10~⁷)

Fe-Konzentration

(ng/ml)

Höhe des Peaks

(mm)

(a)

Mittelwert aus 2 Versuchen A und B (mm)

IA IB 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B

(b)

1,98

1,98

3,95

3,95 5,93 5,93 7,90

7,90

0 0

11,0

11,0

22,1

22,1 33,2 33,2 44,2 44,2

17,6 ± 1,5 16,0 + 0 39,7 ± 2,5 39,3 ± 1,1

61,0 ± 2,6

59,0 ± 1,7

80,5 ± 2,1

81,3 + 3,0

101,0 ± 1,4

100,3 ± 2,5

16,8

39, S

60,0

80,9

100_;6

(a)Mittel aus drei Messungen + S.D. (Standard-Abweichung) (b) Blindprobe: dreifach destilliertes Wasser mit 15 % DMF

Beim Auftragen der mittleren Peak-Höhe der doppelten Versuche (mm) gegen die Konzentration (ng Fe/ml) erhielt man eine Gleichung mit linearer Steigung Y si 1,889x + 17,80 und einem Korelationskoeffizienten r = 0,9997.

Tabelle:

709851/0820

272U86

T a b el 1 e 6A-2

Nr.	molare Konz. an Fc-markier- tem Hapten	Fe-Konzen- tration	Höhe des Peaks^a	^ Mittelwert aus 2 Ver suchen A
	(m χ 10~7)	(ng/ml)	(mm)	und B (mm)
IA	0(b)	0	41,0 ± 1,7	41,0
IB	0	0	41,0 ± 1,0
2A	1,98	11,0	65,0 ± 2,0	65,3
2B	1,98	11,0	65,5 ± 2,1
3A	3,95	22,1	78,7 ± lf5	80,1
3B	3,95	22,1	81,5 ± 2,1
4A	5,93	33,2	102,0 ± 3,0	99,8
4B	5,93	33,2	97,5 ± 4,9
5Λ	7,90	44,2	113,5 ± 4,9	119,5
5B	7,90	44 2	125,5 ± 3,5

(a) Mittel aus drei Messungen + S.D. (Standard-Abweichung)

(b) Blindprobe: 0,1m PBS mit 15 96 DMF

Beim Auftragen der mittleren Peak-Höhe der doppelten Versuche (mm) gegen die Konzentration (ng Fe/ml) erhielt man eine Gleichung mit linearer Steigung Y = 1,731x +42,88 und einem Korelationskoeffizienten r = 0,9977.

Stufe II - Titrierung von aus Sepharose enthaltenem Anti-E₂(HS)-COOH

Um die Bestimmung durchzuführen, wurden verschiedene Faktoren untersucht mit Hilfe von Antisera, die wie in Beispiel 3A, Stufe 2 erhalten worden waren und der mit Sepharose immobilisierten Antikörper, die entsprechend Beispiel 3A, Stufe 3, erhalten worden waren.

709851/0820 ..

- 44 -

-SO

Zur Bestimmung der unspezifischen Absorption durch die Sepharose wurde ein Sepharose-Präparat hergestellt entsprechend dem Verfahren des Beispiels 3A, Stufe III, mit der Ausnahme, daß K-Globuline von normalem Kaninchenserum (NRS) anstelle der Anti-E₂(HS)-COOH-Antikörper verwendet wurden.

Ein konstantes Volumen (60 /Ul) der Suspension der an Sepharose gebundenen Antikörper (oder NRS- JT - Globuline) wurde mit Hilfe eines Vortex-Mischers mit entsprechenden Volumina bekannter Konzentration E₂(HS)-CONHCH₂Fc vermischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, wobei alle 10 min wiederholt mit dem Vortex-Mischer gemischt wurde. Das Gemisch wurde dann 1 min mit 3 000 UpM zentrifugiert. Anteile (30 /ul) der überstehenden Flüssigkeit wurden mit einer Eppendorf-Pipette entnommen und in die Graphitkammer eines AA-Gerätes eingespritzt.

Die Ergebnisse einschließlich der Eich-Standards mit und ohne Sepharose-Suspensionen sind in Tabelle 6A-3 zusammengefaßt. In dieser Tabelle sind die Peak-Höhen angegeben nach entsprechender Substraktion der Blindsignale, so daß die Eichkurve durch den Ursprung geht (intersects the origin).

T a b el 1 e 6A-3

Nr.	molare Konz. des Fe-mar- kierten Hap- tens 7 (m χ 10"')	17,9	Fe-Konzen- tration (ng/ml)	NRS-/- Globuli- ne (/Ul)	Anti-Ep(HS)- CO2H- f-Glo- buline (/ul)	Peak-Höhe (mm)
Blindprobe -	17,9	-	_	_	0
1	35,8	100	-	-	32
2	35,8	100	60	-	33
3	53,7	200	-	-	60
4	9,16	200	60	-	58
5	18,3	300	-	-	87
6	27,5	51	-	60	9,5
7	36,6	102	-	60	12,5
8	45,8	154	-	60	16,0
9	55,1	205	-	60	22,5
10	256	-	60	35,0
11	307709851	I /0S20	60	46,5

1Λ-49

272U86

Durch Auftragen der oben angegebenen Daten auf eine Kurve ist es möglich, die molare Konzentration der Antikörperstellen (5,01 χ 10~ m) auf der Sepharose und die Bindungskonstante (K_ =3,44 χ 10 πΓ ) des markierten Haptens zu berechnen.

Stufe III - Hemmungs- und Kreuzreaktions-Versuche mit E₂(HS)-CONH-CH₂-Fc

Ein festgelegtes Volumen (30 /ul) einer Lösung von mit Eisen markiertem östradiol-hemisuccinat E₂(HS)-CONH-CH₂F₀ mit einer geeigneten Konzentration (ausgewählt entsprechend den in Stufe II erhaltenen Ergebnissen) wurde mit einem konstanten Volumen (30 /Ul) von Lösungen verschiedener Konzentra ^onn?cn% markiertem Hapten östradiol-hemisuccinat (oder Östron-17-(0-carboxymethyl)oxim, E₁(Ox)-COQH^ vermischt. Dieses Gemisch wurde zu einem konstanten Volumen (60 /Ul) der an Sepharose gebundenen Antikörper gegeben, 1min mit dem Vortex-Mischer gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Mischen wurde in Zeitabständen von 10 min wiederholt. Das Bestimmungsgemisch wurde dann 1 min mit 3000 UpM zentrifS^^^^nteile (30 /Ul) wurden mit einer Eppendorf-Pipette entnommen und in das Graphitrohr des AA-Gerätes eingespritzt. Die folgenden Vergleiche wurden nach dem gleichen Verfahren bestimmt, um die Spezifität festzustellen: a) eine Suspension von an Sepharose gebundenen Antikörpern ohne Zugabe des metallmarkierten Haptens; b) Gemische von metallmarkierten und nicht-markierten Haptenen ohne Zugabe der an Sepharose gebundenen Antikörper; c) Gemische von metallmarkierten und nicht-markierten Haptenen unter Zugabe von Sepharose gebundenen jf -Globulinen von normalem Kaninchenserum.

Die mit den beiden Haptenen erhaltenen Hemmwerte sind in Tabelle 6A-4 angegeben.

- 46 709851/0820

1A-A9 412

- SZ

fa bell

6A-4

⁷I

Hemmung von E₂(HS)-CONH-CH₂Fc (27,5 x 10~'m)

[E₂(HS)-COOH]

Hemmung

[E₁(OX)-COOH]
(MxIO"⁷)

Hemmung

3,6 i	8,5
7,2	17,5
15,0	21,5
36,0	43,5
72,0	48,0
150,0	56,0
300,0	63,5

3,75	0,5
7,5	3,0
15,0	6,5
37,5	9,5
75,0	25,5
150.0	50,5

Beispiel 7

Eisenmarkiertes östriol-bis-hemisuccinat-hapten E (HS}

Stufe I

,CONH-CH₂Fc CONH-CH₂Fc

Nachdem in Beispiel 6, Stufe I beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Östriol-I6e(., 17ß-bishemisuccinat (496 mg, 1 mMol), N-Hydroxysuccinimid (230 mg, 2 mMol) und DCC (450 mg, 2,2 mMol) erhielt man den aktiven Bis-ester,

550 mg (81%)

Fp. ·

90-95°C

Stufe II

Der oben erhaltene aktive Bis-ester (130 mg, 0,19 mMol) und Ferrocenylmethylamin (81 mg, 0,38 mMol) wurden nach dem in Beispiel 6, Stufe II, angegebenen Verfahren umgesetzt. Nach Reinigung durch Säulenchromatographie und anschließende präparative Dünnschichtchromatographie erhielt man 60 mg (^ 30 %) des Bisamids

709851/0820

- 47 -

E,(HSj 3 2_χ

1A-49 41?.

272AA86

CO NH CH-Fc

CO NH CH₂Fc

ί R(CHCl₃); ^(cm"¹): 1730 (vs) : 1615 (vs) : 1500 (s)

1170 (s) : 1110 (m) : 1000 (m)

NMR(CDCl₅) *(ppm): 7,3-6,7 (aromatisch 3H); 4,26 (Bis-ferrocenyl),

18H); 0,8 (angulär^£Methyl, 3H).

Beispiel 8

Elsenmarkiertes 1 ^,S-Östratrien^-ol-^-amin-Hapten E₁-NHCO-CH₂CH₂CO-Fc

Stufe I - Synthese von 4-Keto-4-feΓΓocenyl-butanoat-N-succinimidester

4-Keto-4-ierrocenyl-buttersäure (hergestellt durch Friedel-Crafts-Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid auf Ferrocen) (286 mg),

(1 mMol) und N-Hydroxysuccinimid (115 mg, 1 mMol) wurden entsprechend dem in Beispiel 6, Stufe I, beschriebenen Verfahren umgesetzt. Man erhielt 300 mg (78 %) des aktiven Esters

Jl

CJl₁-Fc C-H,, - CO - CH, - CH- - COO-5 b 5 4 2 2 \

IR(QICl₃) V(Cm"¹): 1815 ; 1790 ; 1745 ; 1715 ; 1660 ; 1180 ; 1070.

NMR(CDCl₃) 6(ppm) : 4,88(C₅H₄₁ZH) ; 4,SO(C₅H₄,2H) ;

4,25(C₅H₅,5H) ; 3,08(-CH₂-Ql₂-.4H) ;

~ 2,87 (Succinimid-Ring, 4H)

Diese Verbindung kann als Reagens für die Metallmarkierung von Haptenen dienen, die funktioneile Aminogruppen besitzen wie in Stufe III unten angegeben.

- 48 -709851/0820

1A-/. ο /₊12

-4er-St* 272ΛΛ86

Stufe II -Synthese von 1,3,5-östratrien-3ol-17-amino E₁-NH₂

Kobalt-chlorid-hexahydrat, CoCl₂.6H₂O (670 mg, 2m8 mMol) wurde zu einer Lösung von östronoxim (390 mg, 1J37 mMol) in 80 ml Methanol gegeben und die Lösung bei Raumtemperatur gerührt bis sie homogen war. Dann wurden 580 mg Natriumborhydrid innerhalb von 20 min zugegeben. Während dieser Zugabe wurde die Lösung schwarz und es trat eine heftige WasserstoffentvÄcklung ein. Nach weiterem 1stündigem Rühren bei Raumtemperatur änderte das Gemisch seine Farbe nach gelblich-braun. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft und der entstehende Rückstand mit einigen Anteilen von warmem Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Auszüge wurden im Vakuum eingedampft, wobei man 359 mg des Amins E₁-NH₂ als weiße kristalline Substanz erhielt, Fp. 190-193°C. Oberhalb von 193°C wurde das Material wieder kristallin und schmolz dann unter Zersetzung bei 235 bis 238⁰C.

es NMR(CDjOD),£ (ppm): 7,25-6,6(3H, aromatisch); 0,7(3H, angular CH,).

Stufe III - Synthese von E₁-NHGO-CH₂CH₂COFc Sine Lösung von E₁-NH₂ (entsprechend Stufe Ilhergestellt), (50 mg, 0,18 mMol) in 3 ml frisch destilliertem Dioxan wurde zu einer magnetisch gerührten Lösung des in Stufe I erhaltenen aktiven Esters ^50 mg, 0,13 mMol) in 3 ml Dioxan gegeben· Es wurde weitere 30 min bei Raumtemperatur gerühtt und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Auszüge wurden mit Wasser gewaschen, über MgSO. getrocknet und eingedampft. Man erhielt 86 mg eines bräunlichen Rückstands. Dieser wurde durch präparative DünnschichtChromatographie gereinigt. Man erhielt 31 mg (45 %) Amid E₁-NH-CO-CH₂-CH₂-COFc, Fp. 228-230⁰C.

IR(CHCl₃),} (cm"¹): i660(s): 1190(m): 1100(m); 1005(m) NMR(CDCl₃) S (ppm): 7,O-6,6(3H, aromatisch); 4,7-4,2(9H, Ferro-

cenyl); 0,7(3H, angular CH₃).

709851/0820

- 49 -

1A-49 412

Beispiel 9

Chrommarkiertes Östradiol-hemisuccinat-Hapten E₂(HS)-CONH-(acac)Cr(acac)₂

Eine Lösung von Monoamino-tris-acetylacetonatchrom (acac)₂-Cr (acac)-NH₂ (hergestellt nach Collman und Yamada, J.Org.Chem., 28, 3017(1963), (400 mg, 1,1 mMol), Östradiol-hemisuccinat, E₂(HS)-COOH (350 mg, 0,95 mMol), DCC (210 mg, 1,05 mMol) in Methylenchlorid (30 ml) wurde 18 h bei Raumtemperatur magnetisch gerührt. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Harnstoffes wurde das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde erneut in einer kleinen Menge Benzol gelöst und die nach Zugabe von Petroläther ausfallende kleine Menge Harnstoff abfiltriert. Nach Entfernung der Lösungsmittel wurde der Rückstand einige Male mit Aceton extrahiert. Die vereinigten Acetonauszüge wurden eingedampft. Man erhielt 376 mg (58 %) des hohen Amids, das durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt wurde. Man erhielt 100 mg (15 %) des gewünschten reinen Amids E₂(HS J-CONH-(acac) Cr(acac)₂.

I.R. (CHCl₂) ^ (cm"¹): 1740 (s): 1670 (s): 1580(vs):

1520(vs): 1370(vs): 1280 (m): 1020 (m): 920 (m).

Beispiel 10

Kupfer- und palladiummarkiertes Östradiol-hemisuccinat-Hapten

(E₂(HS) - CO NH-(CH₂)₄ - CH ) M (M = Cu, Pd)

N)

)2

N:o₂-)

Eine Lösung des NHS-aktiven Esters von Östradiol-hemisuccinat, der entsprechend Beispiel 6, Stufe I, hergestellt worden war (300 mg, 0,63 mMol) in 8 ml THS wurde zu 8 ml gesättiger wäßriger NaHCO^-Lösung, enthaltend 223 mg (0,63 mMol) Bis-lysinat-Kupfer gegeben (hergestellt nach Brubaker und Busch, Inorg.Chem., 5, 2110 (1966). Es entstand ein zweiphasiges flüssiges System, wobei die blaue wäßrige Lösung die untere Schicht bildete.

709851/0820 - 50 -

1Λ-49 412

272U86

Nach 2 h langem magnetischen Rühren des Reaktionsgemisches ging dLe blaue Farbe in die obere Phase (THF) über. Das Gemisch wurde in einen Scheidetrichter gegeben und die blaue THF-Schicht gesammelt und zur Trockne eingedampft. Der blaß-blaue Rückstand wurde mit Äthylacetat extrahiert, um nicht umgesetztes Steroid zu entfernen. Der verbleibende Feststoff erwies sich bei der Dünnschichtchromatographie als eine reine Substanz und das IR-Spektrum stimmte mit dem erwarteten Produkt überein, bei dem die endständige N^-Gruppe der Lysingruppe mit dem aktiven Ester reagiert hatte unter Bildung der Feptid-Bindung von

/NH₂-) (E₂(HS) - CO-NH - (CH₂)₄ - CH ) Cu.

Nach ähnlichen Verfahren war es möglich das entsprechende Palladium-Analoge herzustellen.

Beispiel 11

Kobaltmarkiertes Östradiol-Hapten

Stufe I

Das N-Carbobenzoxyderivat von Aspartinsäure wurde nach dem Verfahren von Le Quense and Young, J. Chem., Soc, 1954 (1951) in das Anhydrid umgewandelt.

Stufe II

Das nach der oben angegebenen Stufe I erhaltene Anhydrid (0,76 g) und 0,83 g östradiol wurden 4 h in 10 ml Pyridin unter Rückfluß erhitzt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der Rückstand einige Male mit CHCl, extrahiert, um nicht umgesetztes östradiol zu entfernen. Der verbleibende Feststoff wurde in einer sehr kleinen Menge DMF gelöst und erneut mit Aceton ausgefällt. Man erhielt 1,0 g eines Feststoffes, der durch das NMR- und IR-Spektrum identifiziert wurde als

- 51 709851/0820

1A-49

-51

272U86

Q COOH

ti / _Λ

ο - C - αι_ - cn O

² \ U

NH-C-OCH_C,IL

ZOb

Stufe III

Durch Hydrogenolyse der in Stufe II erhaltenen Verbindung mit einem Palladiumkatalysator wurde die Carbobenzoxygruppe entfernt und man erhielt die mit Östradiol substituierte Aspartinsäure

COOH 0 - CO CH₂ -CH

Stufe IV

Dieses Aminosäurederivat kann mit geeigneten Metallderivaten umgesetzt werden, um Aminosäurekomplexe zu erhalten.

Zum Beispiel führt die Umsetzung von Carbonato-bis-äthylen-diaminkobaltchlorid (Co e^CCOCl mit der oben angegebenen Aminosäure zu einem Ersatz der CO^-Gruppen und Bildung des Komplexes

(R - CH ^,Co en₂) ^NH2

Ähnliche Verfahren wurden mit anderen geeigneten Aminosäuren wie Cystein-oder Glutaminsäure durchgeführt.

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272U86

Beispiel 12 Synthese von Eisen-markiertem Cannabinoid-

Hetallhapten

Stufe ι - Herstellung eines aktiven Esterderivats von 1-Carboxy- Δ^ό-ΤΗΟ

1-Carboxy- Δ⁶-ΤΗΟ (74 mg, 0,22 mMol) und N-Hydroxysuccinimid (30 mg, 0,22 mMol) in trockenem, frisch destilliertem THF (5 ml) v/urden 3 Stunden unter Rühren und Kühlen mit einer Lösung von 50 mg (0,24 ml) DCC in 3 ml THF vermischt. Nach 15 Stunden langem Stehen bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung des ausgefallenen Dicyclohexylharnstoffs filtriert und das Filtrat ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe verwendet.

Stufe II- Umsetzung des aktiven Esters von 1-Carboxy- Δ -THC mit Aminomethylferrocen

Aminomethylferrocen, C₅H₅FeC₅H₄CH₂NH₂, (47 mg, 0,22 mMol) wurde zu einer THF-Lösung des aktiven Esters von 1-Carboxy- Δ THC, der entsprechend Stufe I erhalten worden war, gegeben. Das Gemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur und dann 3 Stunden bei 6O⁰C gerührt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde der feste Rückstand in 10 ml Diäthyläther gelöst und zweimal mit 10 ml Wasser gewaschen. Wach dem Trocknen der organischen Phase über MgSO. und Abdampfen des Lösungsmittels verblieben 15Ö g

durch

eines rohen Gemisches. Trennung präparative Dünnschichtchromatographie und Eluieren mit Chloroform-Äthylacetat (1:1) ergab 45 mg (45 %) des reinen,gelben, kristallinen Amids, Fp. 73-76°, C₅H₅FeC₅H₄CH₂NH-CO-(Δ⁶-THC).

I.R. (CHCl₃) ^(^cm~¹) ^{: 1}720 (v); 1660 (m); 1625 (vs); 1580 (m)

1180-1280 (brs) 1105 (m); 1000 (m); 910(vs).

NMR(CDCl,) /(ppm) : 6,86 (vinylisches H); 6,27 (aromatische- 2H;

4,20 (Ferrocenyl 9H); 3,4 (br,-CH₂-N)

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rs

272U86

Beispiel 13 Synthese von Mangan-markiertem Barbiturat-

Metallhapten

) μ Ιί,ιΙ-SO

la-' ls-2- β-3

Eine Lösung von 0,144 g (0,7 mMol) Natriumbarbital,13-1» imd 0,214 g (0,7 mMol) Cymantrenylsulfonylchlorid, 13-2, in 40 ml Methanol wurde 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt und 36 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand mit dreimal 10 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten CHCl^-Auszüge wurden eingedampft und der Rückstand über eine präparative Dünnschichtchromatographieplatte (Aluminiumoxid) gereinigt. Beim Eluieren mit Chloroform-Methanol (9:1) erhielt man das gewünschte Produkt, 13-3, als obersten Streifen (R^aO,9) (60 mg)

IR(CHCl₃) ^(cm"¹): 2050(vs); 1950(vs) (typisches Metallcarbonyl) NMR(CDCl₃)<£(ppm) : 4,9 und 5,6 (Cyclopentadienyl 4H); 0,9 (Triplett

(2CH,-Gruppen); 2,0 (Quadruplett) (2CH₂-Gruppen)

Beispiel 14 Synthese von Chrom-markiertem Barbiturat-

Metallhapten

(1740(vs); 1690(vs) (Barbituratcarbonyl)?

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../54

co

272U86

Stufe I - Synthese von i-Carboxymethyl-S^-diäthyl-barbitursäure und 1,3-Bis(carboxymethyl)-5,5-diäthyl-barbitursäure -

Eine Lösung von Natriumbarbital (4,63 g, 22,5 mMol) und Methylchiοracetat (3,69 g, 40,0 mMol) in 50 ml Methanol und 10 ml Dimethylsulfoxid wurde 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Methanol wurde im Vakuum abgedampft und die verbleibende Lösung mit 50 ml Wasser verdünnt, wobei sich ein gummiartiges Produkt abschied. Nach Abdekantieren der wäßrigen Schicht wurde der gummiartige Rückstand mit mehreren Anteilen 1n NaOH verrieben. Nach Zusammengeben der alkalischen Schichten wurde der unlösliche Rückstand (0,92 g) getrocknet und es zeigte sich durch das IR-und NMR-Spektrum, daß es der Dimethylester der disubstituierten 1,3-Bis(carboxymethyl)-5,5-diäthyl-barbitursäure war. (NMR(CDCl₃) Ä(ppm) 4,85 (Singulett,-N-CH₂-); 3,8(Singulett, -OCH,); 2,1 (Quartett,-CH₂ der Äthylgruppen); 0,9(Triplett, CH₃ der Äthylgruppen).

Die alkalischenWaschflüssigkeiten wurden angesäuert und mit Methylenchlorid extrahiert. Der nach Abdampfen des CH₂Cl₂ verbleibende Rückstand wurde über eine Silicagelsäule chromatographiert, um den monosubstituierten Ester i-Carboxymethyl-5,5-diäthylbarbitursäure zu erhalten. Das NMR-Spektrum war das gleiche wie für den Diester, mit Ausnahme des Integrationsmusters (das mit der Monosubstitution übereinstimmte) und der zusätzlichen Absorption bei «f 10,5 für das -NH-Proton.

Die beiden Verbindungen, der Diester und der Monoester wurden zu der freien Carbonsäure hydrolysiert, indem man sie 3 bis 4 Stunden in 20-%iger HCl-Lösung unter Rückfluß erhitzte und auf übliche Weise aufarbeitete. Das IR- und NMR-Spektrum bestätigten die Strukturen der freien (Carboxymethyl)-Derivate.

../55 709851/0820

Stufe II - Synthese der aktiven Ester mit N-Hydroxysuccinimid und Umsetzung mit (acac)₂Cr(acac)-NH₂

(A) N-Hydroxysuccinimid (0,46 g, 3,98 mMol) und DCC (1,1 6» 5,4 mMol) wurden zu einer THF-Lösung des Bis-(carboxymethyl)-Derivats, das in Stufe I durch Hydrolyse von 0,61 g (1,8 mMol) des Diesters erhalten worden war, gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt zur Entfernung von ausgefallenem Harnstoffderivat filtriert und das Lösungsmittel von dem Filtrat abgedampft. Der rohe Rückstand (λ/0,25 mMol) v/urde in Methylenchlorid gelöst,und nach Zugabe von (acac)^ Cr(acac)NHp (0,14 g, 0,38 mMol) wurde das Reaktionsgemisch 36 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Der bei der Reaktion entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und der nach Abdampfen des Lösungsmittels von dem Filtrat erhaltene Rückstand durch Chromatographie über eine Silicagelsäule gereinigt. Man erhielt 30 mg des reinen Produktes, 14-1, (einzelner Punkt bei Dünnschichtchromatographie und IR(CHCl,) N (cm"¹) 1740, 1690, 1580, 1450, 1380.

facac)₂Cr(acac)-NHCO-CH₂ yi N CH₂CO-NH-(acac)Cr(acac)

(B) Das oben unter (A) beschriebene Verfahren wurde mit dem Mono-carboxymethylderivat (0,13 g, 0,5 mMol) wiederholt, mit der Ausnahme, daß die endgültige chromatographische Reinigung mit Hilfe einer Florisilsäule * (60-100 mesh) durchgeführt wurde. Man erhielt 50 mg reines Produkt 14-2 (einzelner Punkt im Dunnschichtchromatogramm und IR(CHCl₃), V(cm"¹) 1740, 1640, 1580, 1520, 1380;)

♦0,15-0,25 mm

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- 96 -

272U86

^1+tV

Beispiel 15 Synthese von Platin -markiertem Üstronhapten

I5--I 15-2-

üine Lösung von Tetrakis-(triphenylphosphin)-platin^ 15-2, (0,25 g, 0,2 mMol) und 16-Brom-östronacetat, 15-1 (0,1 g, 0,26 mKol) in 8 ml Benzol wurde 2 Stunden unter Stickstoff atmosphäre unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde dann mit einem Stickstoffstrom entfernt, der Rückstand mit mehreren Anteilen (6x20 ml) heißem Petroläther gewaschen, um freies Triphenylphosphin zu entfernen. Der Rückstand wurde dann in Methanol gelöst, filtriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde zweimal aus Methylenchlorid/ Hexan umkristallisiert. Man erhielt 70 mg (32 %) farblose Kristalle, die unter Zersetzung bei 265-267 C schmolzen und im Dünnschichtchromatogramm einen einzigen Punkt zeigten (R_fM3,57, SLicagel, 2 % MeOH in CHCl₃). IR(KBr-Tablette), ^(cm~¹), 690(vs), 740 (v_s), 1000(m), 1090(vs), 1I65(m),1190(m), 1210(s), 1A35(vs), I485(vs), 1745(vs), 1765 (s), 2910(s) 3O5O(s).

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../57

₂Cl₂), <ί(ppm) : 7,3 breit, (C₆H₅J₃P und steroid-aromatische Protonen); 2,25 (Singulett, CH₃CO), 1,15 (Singulett, angxiläiBsCH,) und breite Resonanz 3,0 und 0,5 aliphatische Steroidprotonen.

Beispiel 16 Synthese von Mangan-markietem Ustron-Hap"ten

£ COXO

Eine Lösung von 16-Brom-östronacetat, 16-1 (55 mg, 0,014 mMol) und Hatriumcymantrenylsulfinat, 16-2, (55 mg, 0,019 mMol) in DMF (1 ml) wurde 4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen und Zugabe von 5 ml Wasser wurde das Reaktionsgemisch mit 3x10 ml Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde über MgSO. getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt. Man erhielt 23 mg der Östron-sulfon-Verbindung i6-3_t Fp. 170-175°. IR(CHCl₃), (cm"¹) 3020(w), 2940(m), 2020(w), 2020(vs), 1970(vs) (terminale Metallcarbonyle), 1755(s), I675(m). NMR(CDCl,), cT (ppm) 7,4 und 6,8 (aromatischer Ring 3H); 5,5 und 4,9 (Cyclopentadienyl-protonen, 4H); 2,8-0,6 komplexe Resonanz der aliphatischen Steroidprotonen. Das Massenspektrum mit hoher Auflösung zeigte als Haupt-Peak das molekulare Ion mit einem Verlust von drei Metallcarbonylen. Berechnet für C₂₅H₂₇O₅MnS(M^CO), 494,5; gebunden 494,0960.

../58* 709851/0820

Beispiel 17

272U86

Synthese von Platin-markiertem Östriolhapten

OCH»,

/7-3

Stufe I - Synthese von Chlorinethyl-trimethoxyöstriol

Eine Lösung von Trimethoxy-Östriol, 17-1 (0,1 g, 0,29 mMol) und 3 Tropfen Methyl-chlormethyläther in 1 ml Eisessig wurde 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Temperatur wurde dann auf 60°C erhöht und in Intervallen von 3 Stunden 2 mal Anteile von 3 Tropfen zugegeben. Das gekühlte Reaktionsgemisch wurde mit 40 ml Wasser verdünnt und der weiße Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Exsikkator über getrocknet. Beim Reinigen durch präparative Dünnschichtchromatographie (Silicagel, 2 % Methanol in Chloroform) ergab ein Produkt (40 mg, 33 %), das durch NMR-Spektroskopie als Gemisch der beiden Isomeren 2-Chlormethyl- und 4-Chlormethyltrimethoxyöstriol, 17-2 identifiziert wurde.

Stufe II - Umsetzung von 17-2 mit Tetrakis(triphenylphosphin)-platin

Eine Lösung des in Stufe I erhaltenen chlormethylierten Gemisches (40 mg, 0,1 mMol) und £"(C5H₅)^Ρ_7^ Pt (85 mg, 0,068 mMol) in Benzol (7 ml) wurde 3 Stunden unter Stickstoff unter Rückfluß erhitzt. Beim Aufarbeiten nach dem in Beispiel15 ange-

709851/0820

../59

gebenen Verfahren erhielt man eine Verbindung, die durch zweimalige aufeinanderfolgende präparative DUnnschichtchromato- graphie (Silicagel, 2 % Methanol in Chloroform) gereinigt wurde. Man erhielt 40 mg (67 %) der Platinverbindung 17-3, Fp. 135-14O°C.

IR(CHCl₃), >y)(cm~¹), 1100(s), 1120(vs), 1170(vs), 1315(m), 1385(m), 1440(vs), i490(m), i600(s), verschiedene schwache Banden zwisehen 1680-1990, 2880(s) und 2940(s).

NMR(CDCl₃) £ (ppm), 7,45 (breites Multiplett (C₆H₅KP Protonen und aromatische Steroid-Protonen), 3,80 (breites Singulett), 3,50 (Singulett) und 3,35 (Singulett) für 3 Methoxy-CH^-gruppen; 3,0-1,O(aliphatische Steroidprotonen); 0,90 (Singulett) und 0,75 (Singulett). Die angulären Methylgruppen der beiden Isomeren, 17-3.

Beispiel 18

Synthese von Gold-rnarkiertem Östradiolhemisuccinat-Hapten

709851/0820

Stufe I

Der entsprechend. Beispiel 6, Stufe I, aus E₂(HS)-COOH (0,186 g, 0,5 mMol), NHS (0,075 g, 0,65 mMol) und DCC (0,146 g, 0,71 mMol) erhaltene aktive Ester von östradiolhemisuccinat wurde umgesetzt mit 5-Aminotetrazol (0,1 g, 1,0 mMol) in 5 ml DMt¹. Nach 15 Stunden langem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch ein 2-phasigen Äthylacetat-Wasser-System (50 ml:10 ml) extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde abgetrennt, über MgSO- getrocknet und das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde aus Methanol umkristallisiert, wobei ein weißes Produkt zurückblieb (0,06 g, 22 %), Fp. ~195°C. Das IR- und NMR-Spektrum zeigte, daß es das Tetrazol-substituierte Amid 18-1 war. IR(KBr), Ό (cm""¹): 173O(sh), 1710(s), 163O(s), 1580(m). NMi(CD OD), tf(ppm) war im wesentlichen identisch mit demjenigen der Verbindung E₂(HS)-COOH, außer der Abwesenheit der COOH-Resonanz.

Stufe II

Eine Lösung von Triphenylphosphin-goldacetat, 18-2 (0,06 g, 0,11 mMol) in 5 ml Methanol wurde mit einer Lösung von 18-1 (entsprechend Stufe I hergestellt) (0,052 g, 0,12 mMol) in 5 ml Methanol vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und nach Entfernung des Methanols wurde der Rückstand mit 3x10 ml Tetrahydrofuran extrahiert. Die vereinigten THF-Auszüge wurden filtriert und Diäthyläther zugegeben bis sich ein Feststoff abschied. Dieser wurde abfiltriert und aus THF-Diäthyläther umkristallisiert. Man erhielt das Goldderivat 18-3 in Form weißer Kristalle (0,035 g, 35 %). Das NMR-Spektrum (DMSO-dg) zeigte die Triphenylphosphinresonanz mit Mittelpunkt bei £ 7,7; die aromatische Protonen der Steroidgruppe bei

709851/0820 --/⁶¹

272U86

ο ο

II Η

(f 7,0 und 6,55; die -C-CH₂-CH₂-C-PrOtonen mit Mittelpunkt bei <$2,7; die anguläre Methylgruppe bei ^ 0,68 und die breite Resonanz der aliphatischen Protonen der Steroidgruppe zwischen (S 3,0-0,9.

Beispiel 19

Synthese von Mangan-markiertem 1,3,5-üstratrien-3-ol-17-amino-Haptenen

Stufe 1 - Synthese des Cymantrenoyl-N-succinimid-JCsters 19-2

Eine Lösung von Cymantrenylcarbonsäure, Cyin-COOH, (0,25 g) und N-Hydroxysuccinimid (0,12 g) in THF wurde mit 0,23 g DCC 2 Stunden bei O⁰C unter Stickstoff behandelt. Es wurde weitere 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, zur Entfernung des ausgefallenen Harnstoffs filtriert und das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde durch das IR- und NMR-Spektrum identifiziert als der aktive Ester 19-2. Dieser wurde für die nächste Stufe ohne weitere Reinigung verwendet.

../62

709851 /0820

Stufe II - Umsetzung von 19-2 mit 1,3,5-Östratrien-3-ol-17-amin E₁-NH₂

Der oben in Stufe I erhaltene aktive Ester wurde umgesetzt mit einer Lösung von E₁-NHp (0,27 g, 1,0 mMol) in
10 ml I¹HF unterStickstoff. Nach 15-stündigem Rühren bei
Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand mit einem 2-Phasen-System von Äthylacetat und Wasser extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde abgetrennt, über MgSO, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Beim Reinigen durch präparative Dünnschichtchromatographie erhielt man 0,26 g (53 %)der reinen Verbindung, Fp. 120-121⁰C. Das IR- und NMR-Spektrum sowie das Massenspektrum zeigten, daß es das Cymantrenylderivat 19-4 war. Das IR-Spektrum zeigte die

typischen Metallcarbonylabsorptionen bei 2050 und 1920 cm
und die Amidbanden bei 1680 und 1540 cm . Das NMR-Spektrum (CDCl-, ) 0 (ppm) zeigte die aromatischen Ostrogenprotonen bei 7,16 und 6,60, die Protonen des Cyclopentadienylringes bei 5,33 und 4,75, die anguläre CH,-Gruppe bei 0,7 und die aliphatischen Steroidresonanzen zwischen 3,0-0,9. Das Massenspektrum mit hoher Auflösung zeigte das Molekularion bei
m/e 501,1327 (berechnet 501,4) und den Haupt-Peak (M-3C0)
bei m/e 417,1783.

Stufe III - Synthese des 4-0xo-4-cymantrenyl-butanoat-N-succinimidesteis, 19-3

Der aktive N-Succinimidester 19-3 wurde nach dem oben in Stufe I beschriebenen Verfahren hergestellt aus 4-0xo-4-cymantrenylbuttersäure (0,29 g, 0,7 mMol), N-Hydroxysuecinimid (0,08 g, 0,7 mMol) und DCC (0,18 g, 0,77 mMol) in THF.

Stufe IV - Umsetzung von 19-3 mit 1,3,5-Östradien-3-ol-17-amin E„ -Ia-I₀

../63
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Der oben in Stufe III erhaltene aktive Ester wurde nach dem in Stufe II beschriebenen Verfahren umgesetzt mit U^-NHp. Das in 33-%iger Ausbeute erhaltene Endprodukt 19-5 zeigte im IR-Spektrum (CHCl,) die Metallcarbonylbanden bei 2015 und 1950 cm" und die Amidbanden bei 1670 und 1500 cm"¹. NI'iR-Spektrum(CDC1,) cf(ppm): 7,2 und 6,6 (aromatische Protonen); 5,5 und 4,9 (Cyclopentadienyl-

0 0

Protonen); 2,8(-C-(CH₂)₂-C-Protonen); 0,66 (anguläres CH,) 2,5-0,9 (aliphatische Steroidprotonen).

Beispiel 20

Synthese von Kobalt-markiertem 1,3,5-Östratrien-3-ol-17-amino-Hapten

HH-CO

Stufe I - Synthese von Kobalticenium-carboxylat-N-succinimidester, 20-2

Eine Lösung von DCC (0,206 g, 1,0 mMol) in 10 ml frisch destilliertem Acetonitril wurde bei O⁰C zu einer Lösung von Cobalticeniumcarbonsäure-hexafluorphosphat (0,378 g, 1,0 mMol) und N-Hydroxysuccinimid (0,115 g, 1,0 mMol) in 15 ml Acetonitril gegeben. Nach 2 Stunden langem Rühren bei O⁰C ließ man die Lösung auf Raumtemperatur kommen, und es wurde weitere 24 Stunden gerührt. Nach Abfiltrieren des aus-

../64

709851/0820

272ΛΑ86

gefallenen Harnstoffs wurde das Lösungsmittel abgedampft. Man erhielt 0,47 g des aktiven Esters, 20-2. IR (KBr) ^(cm~¹): 3100, 2895, 2810, 1820, 1790(s), 175O(s), 1470, 1425, 1410, ' 1380, 1270(s), 1200(s), 1100(s), 1010, 900, 830(s). NMR-(Aceton-d^) zeigt die Absorption des ungesättigten Cyclopentadienyls bei cf6,2 (Singulett) und der substituierten Cyclopentadienylprotonen bei 6,3 <S (Triplett) und 6,65 cT (Triplett).

Stufe II - Umsetzung von 20-2 mit Ji₁-NH₂

Eine Lösung des aktiven Esters 20-2 (0,47 g)» die entsprechend Stufe I hergestellt worden war, und Ji₁ -NH₂ (0,273 g) in 15 ml Acetonitril wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abfiltrieren wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand (0,693 g) in möglichst wenig Aceton gelöst. Die Acetonlösung wurde 2 Stunden im Kühlschrank aufbewahrt und zur Entfernung ausgefallener Verunreinigungen filtriert. Das Acetonfiltrat wurde mit V/asser verdünnt und der gelbe Niederschlag abfiltriert, mit einigen Anteilen Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 0,46 g des Kobalticenium-östrogenderivats 20-3.

IR(KBr), (cm~¹) : 3250, 3100, 2920(s), 2850, 1775, 1700(s),

1625(s), 1500, 1420, 1390, 1270, 1250(s), 1220(s), 1160, 1100, 840(s).

NI4R(Aceton-d^) (ppm): 5,95 (Singulett, unsubstituierter

C^-Ring); 7,2-6,15 (aromatische Steroidprotonen und die beiden Tripletts des substituierten Cyclopentadienylringes); 0,9 (anguläres CH,), 2,8-1,0 (aliphatische Steroidprotonen).

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Beispiel 21 Immunologisches Bestimmungsverfahren mit

Hilfe einer Sephadex-Säule und einem Kobalt-markierten Metallhapten

Eines der üblicherweise zur Trennung der "gebundenen"

und "freien" Haptene bei dem Antikörper-Antigen-Gleichge-

vangewandten Standardverrahren wichts-SystemN xst die Gelfiltration mit Adsorbentien vom Sephadex-Typ, einem Handelsprodukt der Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden. Die folgende Beschreibung der Ergebnisse zeigt, wie ein derartiges Verfahren mit Metallhaptenreagentien angewandt werden kann und als Grundlage dienen kann zur Optimierung einer Metallimmunologischen-BeStimmung, bei der eine derartige Trennung erforderlich ist.

Stufe I - Herstellung der Säulen und Reagentien

(A) Kleine Säulen mit Sephadex G-10 wurden in Kolben von 3 ml Kunststoffspritzen hergestellt, die am Boden poröse Polyäthylenscheiben enthielten. Das Sephadex G-10 konnte über Nacht in Wasser quellen. Nach Entfernung der feinen Anteile durch wiederholte Suspension in erüonisiertem Wasser wurde das überstehende Wasser so vollständig wie möglich entfernt und das Sephadexgel dreimal in 0,01m Phosphatpuffer, pH 7»5, suspendiert. Das Sephadex konnte sich 2 Stunden absetzen, der überstehende Puffer wurde entfernt und ein gleiches Volumen frischer Puffer zugegeben, um eine 50-%ige Suspension zu erhalten. Während die Suspension heftig gerührt wurde, wurden 2 ml der Aufschlämmung in jeden Spritzenkolben pipettiert. Nachdem überschüssiger Puffer abgezogen worden war, (1 ml) wurde die Austrittsöffnung der Spritze mit einer Kappe verschlossen und die Säulen, enthaltend 1 ml Sephadex-G-10-Gel, waren für die Verwendung fertig.

../66

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272U86

(B) i^ine Vorratslösung (93,35 /Ug Co/ml) des mit Kobaltmarkierten üstrogen-Haptens 20-3, das entsprechend Beispiel hergestellt worden war, wurde in 40 % DMF - dreifach destil-. liertem V/asser,zu dem 0,2 % (Vol.) superreiner Saltetersäure zugegeben worden waren, zubereitet. Verdünnte Standards (im Bereich von 0 bis 0,4 /Ug Co/ml) v/urden in Duplikaten in 15 % DMb'/U,01m Phosphatpuffer hergestellt und jede AA-Messung doppelt durchgeführt, um die .Wichkurven zu erhalten.

(C) Das angewandte Anti-Ostradiol-heuiisuccinat-Antiserum R-27, Pool VII, besaß eine Konzentration von 4,2x10 ^m Antikörper-Bindungsstellen. Zum Vergleich v/urde normales Kaninchenserum, R-49, bei den Versuchen angewandt.

Stufe II - BeStimmungsverfahren

Vier Säulen, die entsprechend Stufe I (A) hergestellt worden waren, wurden mit den Ziffern 1 bis 4 nummeriert und dem Index a oder b, um die Duplikate der gleichen Säulen anzugeben, z.B. 1a, 1b; 2a, 2b; usw.. Die Säulen 1,3 und 4 dienten zum Vergleich und die Säule 2 für die Bestimmung. Die Vorratslösung aus Stufe I (B) wurde verdünnt, um eine Arbeitslösung des Metallhaptens (2,43 /Ug Co/ml) zu erhalten. Die aufeinanderfolgende Zugabe der Keagentien ist in Tabelle 21-1 zusammengestellt:

folgt Tabelle 21-1

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272ΑΛ86

Tabelle 21-1

Säulen-Nr.

Reihenfolge der Zugabe
der Reagentien 12 3 4

abababab

Metallhaptenlösung (ml) 0.24 0.24 ü.24 0.24 -

Pufferlösung (ml) - - - - 0.24 0.24 0.24 0.24 (2) Pufferlösung (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Antiserumlösung (ml) - - 0.2 0.2 - - 0.2 0.2 (3){

Pufferlösung (ml) 0.2 0.2 - - 0.2 0.2

(4) Pufferlösung (ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

(1) Jfiin konstantes Volumen (0,24 ml) der Metallhapten-Arbeitslösung wurde zu den Säulen 1 und 2 gegeben (0,24 ml, entsprechend einem absoluten Wert von 0,58 ,ug Co) und das gleiche Volumen (0,24 ml) der Pufferlösung wurde zu den Säulen 3 und 4 gegeben. Die Säulen konnten ablaufen,und die aus jeder Säule auslaufende Flüssigkeit wurde in Polyäthylen-Reagensröhrchen gesammelt, und es zeigte sich bei Untersuchung auf Co durch AA, dai3 kein Kobalt vorhanden war.

(2) In der nächsten Stufe wurde die Auslaßöffnung der Säulen mit einer Kappe verschlossen, 1 ml Puffer zu jeder Säule zugegeben,und nach Vermischen des Gels mit einem Vortexhischer konnten die Säulen ablaufen,und die auslaufenden Flüssigkeiten wurden, wie oben, gesammelt und durch AA auf Co untersucht. Die aus den Säulen 1 und 2 ausgelaufenen flüssigkeiten ergaben im Mittel 0,12 ,ug Co,und in den ausgetretenen Flüssigkeiten aus den Säulen 3 und 4 fand sich keines.

709851/0820 "^/6Q

(3) Zu jeder Säule wurde ein Volumen von 0,2 ml Antiserum zu den Säulen 2 und 4₍bzw. Pufferlösung zu den Säulen 1 und 3 gegeben. Die abgezogenen Flüssigkeiten aus allen Säulen zeigten durch AAkeinen Kobaltgehalt.

(4) Die Säulen wurden 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und zweimal 1 ml Puffer zu jeder Säule zugegeben und die Flüssigkeiten getrennt gesammelt. Bei AA-Untersuchung auf Co zeigten die aus den Säulen ausgetretenen Flüssigkeiten die unspezifische Entfernung weiterer 0,13 /Ug Co von den nach Stufe(2) in der Säule verbliebenen 0,46 yug Co. Die Flüssigkeit von der Bestimmung aus der Säule 2, der das Antiserum zugesetzt worden war, zeigte einen Gehalt von 0,43 /Ug Co, entsprechend einer 94-%igen Rückgewinnung des ursprünglich auf die Säule aufgebrachten Metallhaptens. Die aus den Säulen 3 und 4 austretenden Flüssigkeiten zeigten, wie erwartet, kein Co.

Bei einem weiteren Vergleichsversuch, bei dem die zu der Säule 2 zugesetzte Antikörperlösung ersetzt wurde durch Ύ-Globuline von normalem Kaninchenserum, betrug die unspezifische Elution von Metallhapten in beiden Säulen 1 und zwischen 0,16 und 0,25 /Ug Co.

Das oben beschriebene Sephadex-Säulen-Verfahren entsprach dem in der Literatur angegeben (Clin.Chem., 21, 1805 (1975)) für ein radioimmunologisches Bestimmungsverfahren von Östriol. Es ist selbstverständlich, daß die in diesem Beispiel 21 angegebenen Arbeitsbedingungen von dem Fachmann optimiert werden können, um die nicht-spezifische Elution von Hapten zu verringern und die für jedes einzelne zu bestimmende Hapten günstigsten Arbeitsparameter festzulegen.

Beispiel 22 Immunologische Bestimmung durch Ammonium-

sulfat-Präzipitation mit einem kobaltmarkierten Metallhapten

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IS

■272U86

Ein verhältnismäßig einfaches und billiges Verfahren zur Trennung der "gebundenen" und "freien" Haptene bei dem Antikürper-Hapten-Gleichgewichtssystem ist die Proteinausfällung durch Zugabe einer konzentrierten Lösung eines Salzes, wie Ammonium- oder Natriumsulfat. Dabei wird die "gebundene" Komponente ausgefällt und die "freie" Komponente bleibt in Lösung, und die Menge des markierten Haptens kann entweder in dem Niederschlag (Präzipitat) oder der überstehenden Flüssigkeit bestimmt werden. Die folgende Beschreibung der Ergebnisse zeigt ein nicht-optimiertes Beispiel für eine Anwendung eines derartigen Verfahrens unter Verwendung von Metallhapten-Heagentien. Die Optimierung der Arbeitsbedingungen kann leicht für jedes einzelne Hapten entwickelt werden.

Stufe I - Herstellung der Reagentien

Eine Vorratslösung von Kobalt-markiertem Östrogen 20-3 wurde wie in Beispiel 20, Stufe I₁ (B) hergestellt mit einer Konzentration von 93,35 /Ug Co/ml. Die Arbeitslösung (1,86 /Ug Co/ml) für Eichstandards wurde hergestellt unter Verwendung von 100 /Ul Vorratslösung, 10 /ul superreiner Salpetersäure (65 %) und mit 0,01m Phosphatlösung auf ein Volumen von 5 ml gebracht. Die Arbeitslösung (0,187 /ug Co/ml) für die Antikörper-Hapten-Reaktionen v/urde hergestellt unter Verwendung von 50 /Ul der Vorratslösung, 3,73 ml DMF, 50 /ul superreiner Salpetersäure (65 %) und ErgänzungmLt 0,01rn Phosphatpuffer auf 25 ml.

Das angewandte Anti-östradiol-hemisuccinat-Antiserum, R-27, Pool VIII, besaß eine Konzentration von 7,84x10~^m Antikörperstellen. Zum Vergleich wurde normales Kaninchenserum NRS R-49 angewandt.

Die Ausfällösung wurde hergestellt aus 7,6 g Ammoniumsulfat, 12 ml Wasser und 1,5 ml Dimethylformamid.

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Stufe II - Verfahren zur Bestimmung der Arbeitsbedingungen

1. 20 Halbmikro-Polyäthylen-Röhrchen wurden 1a, 1b,

2a, 2b bis zu 10a, 10b nummeriert, um jeweils Duplikate zu erhalten.

2. Ein festes Volumen (100 /Ul) der Hetallhaptenarbeitslösung (0,187 /Ug Co/ml) wurde in jedes der Röhrchen 1 bis 9 pipettiert. In die Röhrchen 10 wurden 100 /ul Phosphatpuffer anstelle des Metallhaptens pipettiert.

3. Anteile von 10, 20, 30 und 50 ,ul NRS wurden zu den Röhrchen 1,2,3 bzw. 4 gegeben und dienten als Vergleich für die nicht-spezifische Adsorption.

4. Anteile von 10, 20, 30, 40 und 50 ,ul Antiserum wurden in die Röhrchen 5» 6, 7» 8 bzw. 9 gegeben, sowie 50 ,ul Antiserum in Röhrchen 10.

5. Alle Röhrchen wurden mit einem Vortex-Mischer gemischt und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

6. Ein konstantes Volumen (200 /Ul) Ammoniumsulfatlösung wurde in jedes Röhrchen gegeben und mit einem Vortex-Mischer vermischt.

7. Nach 20 Minuten langem Zentrifugieren mit 2000g bei Raumtemperatur wurde die überstehende Flüssigkeit verworfen, die Teströhrchen wurden auf Papier (tissue paper) umgedreht und konnten 5 Minuten lang ablaufen.

8. Ein konstantes Volumen (100 /Ul) einer Phosphatpufferlösung wurde zu jedem Röhrchen zugegeben,und nach dem Vermischen mit einem Vortex-Mischer wurden gleiche Anteile (30 /Ul) mit einer Eppendorf-Pipette abgezogen und in die Graphitkammer des Messgeräts für die Atomabsorption eingespritzt. Die Ergebnisse zeigten, daß die Präzipitate aus den Röhrchen 1 bis 4 (NRS-Vergleich) sowie Röhrchen 5 (10 ,ul Antiserum) und Röhrchen 10 (kein Hapten zugesetzt) 6 % oder weniger "gebundenes" Kobalt-markiertes Hapten enthielten. Die Röhrchen 6, 7, 8 und 9 enthielten 50, 68, 76 bzw.85 % "gebundenes" Kobalt-markiertes Hapten.

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tt-w-

Ein ähnlicher Versuch wurde durchgeführt unter Verwendung eines festen Volumens Antiserum (30 /ul) und Zugabe unterschiedlicher Volumina (20 bis 100 /ul) Hetallhapten und Ergänzung der Differenz zu einem konstanten Volumen (130 /Ul) mit Phosphatpuffer. Diese beiden Versuchsreihen erfordern die geeignete Auswahl entsprechender Gemische von Antisera und Metallhaptenverdunnungen für eine Konkurrenz-Bindungsbestimmung .

Beispiel 23 Synthese eines Palladiumreagenses und eines

Palladium-markierten Östrogen-Haptens

Stufe I - Synthese eines T^-Allylpalladium-Sorbinsäure-Komplex-Dimers, 23-2

Zu einer Suspension von Kaliumtetrachlorpalladit, KpPdCl,,(2,09, 6,12 mrtol) in 30 ml Wasser wurden unter Rühren 1»5 g 02,3 mHol) Sorbinsäure 23-1 und anschließend 250 ml Methanol und 20 ml Wasser gegeben. Es wurde eine weitere Stunde gerührt bis alle festen Teilchen in Lösung gegangen waren. Das Reaktionsgemisch wurde auf ungefähr ein Drittel des Volumens auf einem Rotationsverdampfer im Vakuum eingedampft und der gelbe Niederschlag abfiltriert, mit mehreren Anteilen Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 1,1 g (38 3o) gelber Kristalle, Fp. 17O-173°C. Das IR-Spektrum (KBr) zeigte die Carbonylbande bei 1690 cm , und das NMR-Spektrum (in Deuteropyridin) zeigte Resonanzen zur Stützung der Struktur 23-2 oder von dessen Isomer bei dem die -OCH-,-Gruppe sich

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272ΛΑ86

in φ-Stellung zu der endständigen Methylgruppe befindet: cf(ppm), 1,42 ( Dublett, CH₃), 3,46 (Singulett, OCH₃), 3,72-4,65 (Multiplett, terminale Allyl-Protonen), 6,72 (Triplett, zentrales Allyl-Proton).

Stufe II - Synthese eines 7T~Allylpalladium-sorbinsäure-Komplex-Monomers, 23-2

Das in Stufe I erhaltene T^-Allylpalladiumderivat, 23-2 (0,2 g, 0,435 mMol) wurde in 5 ml Methylenchlorid suspendiert und 0,2 ml (2,6 mMol) Pyridin langsam unter Rückfluß zugetropft. Nach Zugabe des Pyridins ging der gesamte Feststoff in Lösung,und die gelbe Lösung wurde im Vakuum eingedampft. Der feste Rückstand v/urde mehrere Male mit leichtem Petroläther zur Entfernung von nicht-umgesetzten Pyridin gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 0,13 g (50 %) eines gelben Feststoffes, Fp. 65-70⁰C, löslich anorganischen Lösungsmitteln, v/ie Chloroform und Methylenchlorid. Das IR-Spektrum (CHCl^) zeigte die Carbonylbande bei 1720 cm~ und das NMR-Spektrum (CDCl^) die erwarteten Resonanzen für die Struktur 23-3; cf(ppm): 7,55 (Multiplett, Pyridin-Protonen); 6,4 (Triplett, zentrales Allyl-Proton); 3,7-4,1 (Multiplett, terminale Allyl-Protonen); 3,45 (Singulett, OCH,); 1,4 (Dublett, terminales CH₃).

Ähnliche Monomere können hergestellt werden unter Anwendung anderer Liganden, wie von ß-Diketonaten und Cyclopentadienylen, von denen bekannt ist, daß sie die Chlorbrücken in TT-AHylpalladium-chloriddimeren ersetzen.

Stufe III - Synthese von aktivem N-Succinimidester, 23-4

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23-3

Eine Lösung von 40 mg DCC in 2 ml THF wurde unter Rühren zu einer kalten Lösung (0°) des Palladiumkomplexes, 23-3 (60 mg, 0,19 mMol) und N-Hydroxysuccinimid (22 mg, 0,19 mMol) in 5 ml THF gegeben, lic wurde weitere 2 Stunden bei O⁰C gerührt und dann weitere 2Stundenbei Raumtemperatur. Der entstandene weiße Niederschlag wurde abfiltriert^unaas gelbe Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde mit Methylenchlorid extrahiert und der gelbe organische Auszug im Vakuum eingedampft. Man erhielt einen gelben Feststoff, der aufgrund des IR-Spektrums (KBr) der Succinimidester 23-4 war (^_co 1820, 1780 und 1745 cm"¹), Diese Verbindung kann als allgemeines Reagens zur Markierung von Haptenen mit Palladium durch Umsetzung mit einer in dem Hapten vorhandenen funktioneilen Aminogruppe dienen, wie z.B. 1,3,5-östratrien-3-ol-17-amin , E₁-NHp oder Amphetamin-(1-phenyl-2-aminopropan).

Beispiel 24 Synthese von Kobalt-markiertem Rinderserumalbumin und dessen Umsetzung mit Anti-BSA-Antikörpern

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272U86

Stufe I - Kobaltmarkierung von BSA

Eine Lösung von Carboxykobalticenium-N-succinimidester (0,15 g, 0,236 mMol), der entsprechend Beispiel 20, Stufe I hergestellt worden war, in 2 ml Acetonitril wurde zu einer gekühlten Lösung von BSA (0,15 g, 2,36x10 Mol) in 20 ml Wasser gegeben. Nach Zugabe von einigen Tropfen Triäthylamin zur Einstellung eines alkalischen pH-Wertes von 10 wurde das Reaktionsgemisch 48 Stunden bei 4°C gerührt. Die Lösung wurde dann gegen ein Wasser-Acetonitril-System zweimal dialysiert und dann dreimal gegen destilliertes Wasser. Beim Lyophilisieren des Üialysats erhielt man 117 mg eines gelblichen flockigen Pulvers, das sich als das BSA-Carboxyjkobalticenium-Konjugat erwies.

Stufe II - Bestimmung von η (Anzahl der Metallhapten-Markierungs-Moleküle)in dem BSA-Konjugat

(A) Es wurden die folgenden Ausgangslösungen hergestellt:

1. BSA-Ausgangslösung (10" m) : 3,2 mg BSA, gelöst in 50 ml Wasser.

2. Carboxykobalticenium-Vorratslösung (10~-^m) : 3,2 mg Carboxyfcobalticeniuin-PFg-SaIz in 10 ml 40-%iger DMF/H₂O-Lösung.

3. Kobalt-markiertes BSA-Konjugat-Vorratslösung: 4,2 mg BSA-Konjugat, entsprechend Stufe I, gelöst in 50 ml 16 % DMF/H₂0-Lösung.

(B) Es wurden zwei Eichkurven hergestellt durch Atomabsorptionsmessungen :

Eichung (1)

Es wurde eine Reihe von Verdünnungen von Carboxykobalticeniumsalz in 15 % DMF/HpO (Gesamtvolumen von 3OO ml) im Bereich zwischen 0 bis 0,39 /Ug Co/ml hergestellt. Die lineare Steigung der Gleichung Y = 71,654x + 3,296 besaß einen Korrelationskoeffizienten r=O,9933.

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ZA

272U86

Eichung (2)

Es wurde die gleiche Reihe von Verdünnungen von Carboxyeobalticeniumsalz, wie bei Eichkurve (1) hergestellt, unter Zusatz eines konstanten Volumens (60 /Ul) der BSA-Vorratslösung auf ein Gesamtvolumen von 300 /Ul. Die Steigung der linearen Gleichung

Y = 72,034x +2,2 besaß einen Korrelationskoeffizienten r=O,9995.

(3) Die Kobalt-markierte BSA-Konjugat-Vorratslösung wurde 1:10 und 1:20 verdünnt und unter den gleichen Gerätebedingungen wie für die Eichkurve (2) die Atomabsorption gemessen. Die Höhe der Signale bei 22 bzw. 12 mm wurde in die lineare Gleichung für

Y interpoliert und ergab eine Konzentration von 0,275 /ug Co/ml bzw. 0,136 ,ug Co/ml für die beiden Verdünnungen, entsprechend einer Konzentration von 2,735 /ug Co/ml in der ursprünglichen BSA-Konjugat-Vorratslösung entsprechend 46,4x10~⁹ Co-Atomen/ml.

Da die Vorratslösung, enthaltend 4,2 mg BSA-Konjugat in 50 ml,1,3x10 BSA-Mol/ml entsprach, betrug die Anzahl der ICabalticeniumhaptene pro Mol BSA in dem markierten Konjugat η = 46,4x10"^/1,3XiO""⁹ S₅ 35.

Stufe III - Wechselwirkung von Kobalt-markiertem BSA-Konjugat mit Anti-ßSA-Antikörpern

Ein einfaches Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung durch Atomabsorption ist in dem folgenden Beispiel angegeben:

Es wurden zwei Reihen von doppelten Röhrchen folgendermaßen hergestellt:

1) Anti-BSA-Antiserum (100 /ul) wurde zu jedem von vier Röhrchen 1 bis 4 gegeben. Das gleiche Volumen (100 ,ul) 0,01m Phosphatpuffer wurde zu jedem von weiteren 4 Röhrchen 5 bis 8 gegeben.

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21-

272U86

2) Ein festes Volumen (100 /Ul) von vier Verdünnungen von BSA-Kobalt-markiertem-Konjugat, enthaltend 0,23, 0,47, 0,94 bzw. 1,88 /Ug Co/ml (oder 0,8, 1,6, 3,1 bzv/. 6,2 /Ug BSA-Konjugat/100 /Ul Probe) wurde zu den Röhrchen 1 bis 4 zugegeben und entsprechend zu den Röhrchen 5 bis 8.

3) Die Lösungen wurden mit Hilfe eines Vortex-Mischers vermischt und eine Stunde bei 37°C und dann 48 Stunden bei 4°C inkubiert.

4) Die Röhrchen wurden 30 Hinuten bei 4⁰C zentrifugiert.

5) Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Hilfe der Atomabsorption auf Co untersucht.

Die für die Röhrchen 5 bis 8 erhaltenen Werte dienten zum Vergleich bzw. zur Eichung. Die V/erte von den Röhrchen 1 bis 4 zeigten dann die Menge an freiem Kobalt-markiertem-BSA in Lösung (durch Differenzbildung konnte das "gebundene" BSA-Antigen bestimmt werden). Die Atomabsorptionsmessungen wurden in die Eichkurve interpoliert und ergaben 0,00, 0,06, 0,59 bzw. 1,25 /Ug Co/ml "freies" Hapten, entsprechend einer Konzentration von 0, 0,2, 2,0 bzw. 4,3 /Ug BSA-Konjugat/100 /Ul Originalprobe in den Röhrchen 1, 2, 3 bzv/. 4.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf verschiedene Weise variieren. Zum Beispiel ist es möglich, die Antikörperproteine mit einer Art von Metallhapten und das Antigenprotein mit einer anderen Metallmarkierung zu markieren und dann durch Atomabsorption jedes Metall getrennt zu bestimmen. Der ausgefällte Antikörper-Antigen-Komplex kann gesammelt und erneut in einem geeigneten Lösungsmittel für die Atomabsorptionsmessung der beiden verschiedenen Metalle suspendiert werden .Es ist auch möglich, das gleiche Hapten mit zwei oder mehreren unterschied-

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- 77 -

272AA86

lichen Metallen zu markieren. Zum Beispiel kann BSA mit einem Gemisch von N-Succinimid aktivem Ester von Carboxyiöbalticenium und Carboxycymantren umgesetzt werden oder mit Carboxyferrocen und Carboxycymantren, um das gemischte Kobal1j-und Mangan-bzw. gemischte Eisen-und Mangan-markierte BSA-Hapten zu erhalten.

709851/0820

Claims (2)

1. B. ING. F. WUKSTHOFF SCCO I.tUNCIIE:? DC

   Till-on (Γ89) ar 20 Bl HH. ING. D. BKnHKNS

   TKI.KOHAMMB I PATENTANWALTS pwiiidtfitht mOhohi

   1A-49 412

   Anm.: Technion Research

   Patentansprüche

   mJ Heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigenMedium, wobei man

   (a) das flüssige Medium mit Mitteln (Reagentien) zusammenbringt, die einen markierten Bestandteil enthalten, umfassend ein Konjugat aus einer Markierungssubstanz und einer bindenden Komponente, das mit dem Liganden ein Bindungsreaktionssystem bildet und eine gebundene Phase und eine freie Phase ergibt, wobei die Menge der Markierungssubstanz in der gebundenen Phase eine Funktion ist von der Menge des in dem flüssigen Medium vorhandenen Liganden;

   (b) die gebundene Phase von der freien Phase trennt und

   (c) die Menge der Markierungssubstanz bestimmt, die entweder in der gebundenen oder in der freien Phase vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierungssubstanz ein Metallatom oder Metallatome verwendet.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der markierte Bestandteil ein Konjugat des Liganden oder eines spezifisch bindenden Analogen davon und ein Metallatom umfaßt.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß der markierte Bestandteil den Liganden oder ein spezifisch bindendes Analoges davon

   den bzw.
   umfaßt, in/das das Metallatom eingeführt worden ist.

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   272U86

   4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Bestandteil den Liganden oder ein spezifisch bindendes Analoges davon umfaßt, das an ein metallorganisches Derivat gebunden ist.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das metallorganische Derivat die Formel

   ^Mm ^Ln

   _T2 _T3 Λ τ5 _t6

   ^Lo ^Lp ^Lq ^Lr ^Ls besitzt,

   in der M das Metallatom ist, L his L Liganden oder spezifisch bindende Analoge davon bedeuten, die gleich oder verschieden sein können, m eine ganze Zahl von 1 bis 10 bedeutet und n,o,p,q,r und s ganze Zahlen von 0 bis 12 sind, vorausgesetzt, daß die Summe nicht größer ist als die Koordinationszahl von M .

   6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß das metallorganische Derivat eine metallorganische Verbindung oder ein Metallkoordinationskomplex ist.

   7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß die metallorganische Verbindung eine kovalente Bindung besitzt.

   8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß die metallorganische Verbindung eine 7T-Bindung besitzt.

   9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Menge des Metallatoms entweder in der gebundenen Phase oder in der freien Phase durch Atomabsorptions- oder-emissionsspektrophotoraetrie bestimmt wird.

   709851/0820

   272AA86

   10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Metall ein Obergangsmetall der Gruppen IB, HB, IHB, IVB, VB, VIB, VIIB und VIII des Periodensystems verwendet.

   11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens einen spezifischen Bindungspartner zu dem Liganden und ein daran gebundenes metallmarkiertes Konjugat umfaßt, wobei das Konjugat das Metallatom und den Liganden oder ein spezifisch bindendes Analoges davon umfaßt.

   12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Bindungspartner in unlöslicher Form vorliegt.

   13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ausgewählt ist
   aus der Gruppe von Antigenen, Haptenen und Antikörpern dazu, Hormonen, Vitaminen, pharmakologisehen Materialien, wie Arzneimitteln und Drogen, Metaboliten und ihren Rezeptoren und bindenden Substanzen.

   14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein pharmakologisches Material oder ein Metabolit davon ist.

   15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das pharmakologische Material ein
   Hormon oder ein Antagonist davon ist.

   16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Hormon ein Steroid ist.

   17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ausgewählt ist aus

   7098S 1 /0620

   der Gruppe von Antibiotika, Tranquilizern, Vitaminen, Narkotika, Cannabinoiden, Barbituraten oder Alkaloiden.

   Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß die markierte Substanz eine mit einem Metallatom, das genau bestimmt werden kann, markierte Substanz ist.

   19. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es

   1. ein Konjugat des Metallatoms und des Liganden oder eines spezifisch bindenden Analogen davon, und

   2. einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden enthält.

   20. Reagens nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat und der Bindungspartner durch den Liganden oder das Analoge davon aneinandergebunden sind.

   21. Mittel nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspartner in unlöslicher form vorliegt.

   22. Mittel nach Anspruch 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspartner in unlöslicher Form vorliegt und das Konjugat in löslicher Form vorliegt.

   23. Mittel nach Anspruch 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat in unlöslicher Form und der Bindungspartner in löslicher Form vorliegt.

   24. Mittel nach Anspruch 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet , daß es

   1. ein lösliches Konjugat des Metallatoms und eines spezifischen Bindungspartners des Liganden, und

   2. eine unlösliche Form des Liganden oder eines spezifisch bindenden Analogen davon

   enthält. 708861/0820

   25. Mittel nach Anspruch 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet , daß es

   1. ein lösliches Konjugat des Metallatoms und eines spezifisch bindenden Partneis des Liganden, und

   2. eine unlösliche Form eines spezifischen Bindungspartners des Liganden

   enthält.

   709851/0820