DE2722038C2 - Isocyanat-Reaktionsprodukte, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Description

Die Erfifidung betrifft neue Reaktionsprodukte auf der Basis von Isocyanaten, die für eine Aoialyse

ίο zahlreicher Substanzen in biologischen Flüssigkeiten oder dergleichen brauchbar sind und Derivate bilden, die radioaktiv markiert werden können, die Herstellung sowie die Verwendung derartiger Reaktionsprodukte zur Durchführung von Radioimmunanalysen.

is Für eine Vielzahl von klinischen Zwecken, wie beispielsweise die Oberprüfung der radioaktiven Strahlungsintensität von Dosierungszusammenstellungen, die Oberprüfung von Hormonspiegeln einer kur?. zuvor erfolgten Arzneirriittclaufnahme oder der folgenden pharmakologischen Wirkungen auf eine biologische Verwendbarkeit, der Absorption, des Abbaus oder der Ausscheidung, ist es von großem Vorteil, die Konzentration von verschiedenen Arzneimitteln oder dergleichen hinsichtlich nanomolarer oder sogar picomolarer Mengen zu messen. Bekanntlich kann dies durch eine Radioimmunanalyse erfolgen. Zur Durchführung einer derartigen Analyse müssen annehmbare Ausrüstungen oder Systeme, ein Antiserum, ein Standard der zu messenden Verbindung, ein radioaktiv markiertes Derivat der zu messenden Verbindung, eine Puffersubstanz oder Puffersubstanzen und häufig ein Verdrängungsmittel vorhanden sein. Es ist bekannt, daß ein Antiserum aus Blut von Tieren erzeugt wird, die durch Impfen, beispielsweise mit einem Hapten-Protein-Paar (immunogen) entsprechend der zu messenden Verbindung, das charakteristischerweise als »Antigen« bezeichnet wird, immunisiert worden sind.

Es ist bekannt, daß im allgemeinen die Technik der Radioimmunanalysen den Wettkaroof zwischen dem radioaktiv markierten Antigen und dem nichtmarkierten Antigen hinsichtlich der Binduügsstellen an dem Antikörper im Antiserum mißt Durch einen Zusatz bekannter Mengen von zu untersuchendem Antigen und einem radioaktiv markierten Analogon zum Antiserum wird eine Kurve aufgrund der Dosis für gebundenes oder freies Antigen gegenüber der Konzentration des Antigens aufgestellt. Nachdem diese Immunitätseichung durchgeführt worden ist, können dann unbekannte Konzentrationen mit der Standardkurve zu Untersu chungszwecken verglichen werden. Entscheidend bei derartigen Untersuchungen ist das Vorliegen radioaktiv markierter Antigene, die in wirksamer Weise mit nicht radioaktiv markierten Antigenen in Wettbewerb treten. Um demgemäß eine größtmögliche Genauigkeit, Richtigkeit, Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit des Versuchs zu erhalten, sind gereinigte, gut charakterisierte synthetische radioaktiv markierte Antigene erforderlich. Die Empfindlichkeit bezieht sich auf die Leistungsfähigkeit der Versuchstechnik, auf ge ringstmögliche Konzentrationen des Antigens (bei spielsweise der zu untersuchenden Substanzen) zu reagieren. Die größtmögliche Empfindlichkeit wird erreicht, wenn die Konzentration des freien, radioaktiv markierten Antigens vernachlässigbar ist und die Konzentration des nichtmarkierten Antigens sich dem Wert Null nähert. Wenn das synthetische, radioaktiv markierte Antigen rein ist und sich genau an die Struktur des Antigens, das untersucht werden soll,

anpaßt, ist die Radioimmunanalyse potentiell von höchster Empfindlichkeit und Spezifität,

Die Herstellung zufriedenstellender radioaktiv markierter Antigene erfordert deshalb bestimmte Richtlinien. Es müssen reine Reagentien mit einer geringstmöglichen Konzentration an Nebenprodukten eingesetzt werden. Außerdem sind schonende Reaktionen, die in hoher Ausbeute verlaufen, und die das Antigen oder Hapten aicht umlagern, erwünscht, die nämlich lediglich geringfügige strukturelle Veränderungen des Haptens oder Antigens hervorrufen. Des weiteren ist es noch erwünscht, chemische Derivate einzusetzen, die die Unterschiede hinsichtlich der Affinität gegenüber dem Bindungsreagens, d.h. dem Antikörper, des Radioindikators und gegenüber dem ursprünglichen Hapten oder Antigen auf ein Minimum herabsetzen, so daß eine wirksame !competitive Analyse möglich ist

Das Markieren des Haptens oder des zu untersuchenden Antigens kann bekanntlich mit ¹⁴C oder ³H erreicht werden. Jedoch verlaufen derartige Analysen mit markierten Haptenen oder Antigenen bei diesen Techniken langsam und umständlich und können im allgemeinen nur mittels Flüssigkeits-Scintillationsmethoden ausgeführt werden. Es ist demzufolge bei einer radioaktiven Markierung erwünscht, sie mit einem radioaktiven Jodisotop, wie beispielsweise ¹²⁵J durchzuführen. Jedoch können die meisten Verbindungen, die von Interesse sind, nicht mittels einer derartigen Technik markiert werden und müssen folglich mit einer jodaufnehmenden Gruppe umgesetzt werden. Aromatisehe Ringe und einige heterozyklische Ringe, insbesondere die für eine einfach durchzuführende Substitution aktiviert sind, sind deshalb die bevorzugten Bausteine für eine Kupplung zweier Verbindungen, um Derivate für eine Aufnahme einer Jodmarkierung zur Verfugung zu stellen. Aus diesem Grunde sind Tyrosin-methylester und Tyramin, die beide aktivierte phenolische Hydroxylgruppen enthalten, zur Herstellung von Derivaten verwendet worden, die dann später radioaktiv markiert werden kö'.inen.

Eine der üblichen, früher angewendeten Methoden zur Herstellung markierter Steroide besteht in der anfänglichen Bildung eines Zwischenproduktaddukts durch Behandlung des Steroids mit einem Chlorformiat oder einem Bernsteinsäure-, Malonsäure-, Fumarsäure- oder Phthalsäureester oder -anhyd/id mit anschließender Umsetzung mit einem Jodakzeptor. Dieser Versuch ist beschrieben von Oliver und Mitarbeitern in »J. Clinical Investigation«, 47 (1968), Seite 1035, wonach S-O-Succinyl-digitoxigtnin-tyrosin-methylester und dessen entsprechendes ¹²⁵J-Derivat zur Verwendung bei der Radioimmunanalyse von Digitoxin bei Menschen hergestellt worden sind. Ein weiterer Versuch dieser Art ist in der US-PS 38 10 866 beschrieben, wonach Digitoxigenin an Derivate des Tyrosins, des 4-Hydroxyphenyl-glycins, des 3-Hydroxytroptophans, des Tryptophans und des Histidins mittels einer Bernsteinsäure-, Malonsäure-, Fumarsäure- oder Phthalsäuregruppe gebunden wird.

Die Herstellung derartiger Derivate kann mehrere Monate in Anspruch nehmen.

Ein weiteres Verfahren ist in der DE-OS 23 31 922 beschrieben. Bei diesem Verfahren werden Derivate von 14 verschiedenen Herzglycosiden beschrieben, die radioaktiv markiert werden, indem zuerst der endständige Digitoxose-Ring geöffnet und mit Perjodat zum Dialdehyd oxidiert wiri. Der Dialdehyd wird dann mit einem Reagens, wie L-Tyrosin-methylester-hydrochlo rid, gekuppelt. Das erhaltene Addukt wird dann mit Natriurn-borhydrid reduziert, um die restlichen Hydroxylgruppen am endständigen Zuckerring zu reduzieren und nebenbei den Ester zur Säure zw verseifen. Dieses Addukt kann dann am aromatischen Ring mit radioaktivem Jod jodiert werden. Dieses Verfahren kann jedoch beschwerlich sein, bei den verschiedene!= Zwischenstufen Nebenprodukte bilden und weiterhin den Einsatz verhältnismäßig kräftig wirkender Reagentien erfordern.

Ein anderes Verfahren ist in der ZA-PS 73-8312 beschrieben. Dieses Kupplungsverfahren kann bei Steroidketonen, wie Testosteron, angewendet werden, indem zuerst das Carboxymethyl-oxim gebildet wird. Dann wird ein Jodakzeptor, wie beispielsweise Tyrosinmethylester, zur Reaktion mit einem typischen Carbodiimid, wie N.N-Dicyclohexyl-carbodiimid, in Gegenwart von Triäthylamin in Methylenchlorid zur Umsetzung gebracht, um das Tyrosin-methylester-amid des ursprünglichen O-Carboxymethyl-oMins zu erzeugen.

Schließlich beschreibt die FS-PS 22 66 888 ein Verfahren zur Herstellung von Reaktionsprodukten aus Steroiden, Steroidglycosiden, Vitaminen, Hormonen, Alkaloiden und Antibiotika mit Verbindungen der allgemeinen Formel

OH

X-(CH₂),

in der η eine Zahl von 1 bis 5 ist und Ri und R2 Halogenatome oder Methyl-, Äthyl-, Methoxy- oder Äthoxygruppen bedeuten und X ein Halogenatom oder die Hydroxyamine-, Hydrazino-, Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl- oder Mercaptogruppe ist. Die Reaktionsprodukte können anschließend mit radioaktivem Jod jodiert werden. Die Umsetzung verläuft jedoch urvollständig und unter verhältnismäßig harten Bedingungen, so daß stark verunreinigte Reaktionsprodukte erhalten werden, die eine sorgfältige Aufbereitung erfordern.

Aufgabe vorliegender Erfindung war es nun, neue Carbamat- und Harnstoff-Derivate von Verbindungen mit biologischem, klinischem oder anderem Interesse zur Verfügung zu stellen, die in einfacher Weise mittels einer leicht durchführbaren, schonenden chemischen Reaktion herstellbar und praktisch frei von Nebenprodukten sind und die für eine radioaktive Markierung aufnahmefähig sind.

Gegenstand vorliegender Erfindung sind demzufolge Isocyanat-Reaktionsprodukte aus

a) einer Isocyanatverbindung der allgemeinen Formeln (I) oder (II)

(R)₃SiO

oder

-CH₂CHjN = C =

CO₂CH₃
(R)₃SiO-/ON—CH₂CHN = C = O (U)

in der R ein bis zu 10 Kohlenstoffatome

aufweisender Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Aralkylrest ist, und

b) einer Substanz der Gruppe Digoxin, Testosteron, Cortisol, östron, Digoxigenin, Digitoxin, 170-östradiol und Östriol jeweils in der 3-Stellung, Testosteron in der 17-Stellung, Cortisol in der 21-Stellung, 11«-Hydroxyprogesteron in der 1 !-Stellung, Digoxin und Digitoxin jeweils in der 15'-Stellung und gegebenenfalls in der 12-Stellung und 2- und 6-Amino-nicotin jeweils in der Aminogruppe durch die Isocyanatverbindung substituiert sind, wobei nach der Bildung des Reaktionsproduktes die (R^Si-Gruppe durch ein Wasserstoffatom ersetzt worden ist, und deren mit radioaktivem Jod im Phenylkern des Isocyanatrestes jodierte Derivate.

Einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung bildet ein Verfahren zur Herstellung der Isocyanat-Reaktionsprodukte, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Substanz der Gruppe Digoxin, Testosteron, Cortisol, östron, Digoxigenin, Digitoxin, 170-östradiol, östriol, 1l<x-Hydroxyprogesteron und 2- oder 6-Aminonicotin, mit einer Isocyanatverbindung der allgemeinen Formeln (I) oder(ll)

25

(R)₅SiO —

-CH₂CH₂N = C = O (I)

oder

(R),SiO

CO₂CH₃ CH₂CHN = C =

(Π)

in denen R ein bis zu 10 Kohlenstoffatome aufweisender Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Alkaryl-, oder Aralkylrest ist, in an sich bekannter Weise bei einer geeigneten Temperatur oder unter photochemischen Bedingungen umsetzt, die (R)jSi-Gruppe abspaltet, das Reaktionsprodukt isoliert und gegebenenfalls mit einer radioaktives Jod enthaltenden Verbindung jodiert.

In der Zeichnung ist eine typische Kurve aufgrund der Dosierung veranschaulicht, die unter Verwendung eines mit radioaktivem Jod markierten Digoxin-Derivats vorliegender Erfindung als Radiomarkierangsmittel erhalten worden ist.

Die vorliegende Erfindung basiert allgemein auf der Feststellung, daß neue Isocyanate als Verbindungen mit solchen Resten hergestellt werden können, von denen bekannt k' daß s^;<? für Markierungen, wie für eine radioaktive Markierung, aufnahmefähig sind, beispielsweise Tyramin und Tyrosin, und zwar mittels eines Verfahrens, bei dem eine andere funktioneile reaktionsfähige Gruppe als die Isocyanatgruppe durch Haftung blockiert wird, so daß die Herstellung von Derivaten derartiger Isocyanate mit Verbindungen von klinischem oder anderem Interesse ermöglicht wird. Die erhaltenen Derivate können dann nach einer geeigneten Abspaltung der Schutzgruppe in einfacher Weise markiert und bei Techniken eingesetzt werden, wie beispielsweise der Radioimmunanalyse, um zuverlässige, genaue, empfindliche Versuche zur Verfügung zu stellen.

Nach vorliegender Erfindung sind neue Isocyanate vorgesehen, die einen blockierten bzw. geschützten Rest enthalten, der nach Abspalten der blockierenden bzw. schützenden Gruppe derart reagiert, daß sie eine reaktionsfähige Gruppe schafft, die entweder für eine Markierung oder eine Kupplung an ein interessierendes Substrat aufnahmefähig ist. Die Verwendung der neuen Isocyanate liefert insofern Vorteile gegenüber den früheren Verfahren, daß die diese Derivate bildenden Reaktionen einfach und von Natur aus schonend verlaufen und nur eine geringfügige Änderung der Struktur der interessierenden Verbindung zur Folge haben.

Die blockierte bzw. geschützte funktionell reaktionsfähige Gruppe bzw. die entsprechenden Gruppen des Isocyanats hängen von der beabsichtigten Anwendung ab. Wenn demzufolge ein Isocyanat zu verwenden ist, um letztlich ein mit radioaktivem Iod markiertes Addukt mit einer Verbindung von klinischem oder anderem Interesse zu bilden, muß die funktionell reaktionsfähige Gruppe natürlich für eine radioaktive Jodmarkierug aufnahmefähig sein oder den Rest aktivieren, damit er mit radioaktivem Jod markierbar ist. Zu diesem Zweck wird ein Isocyanat verwendet, das entweder auf Tyramin oder auf dem L-Tyrosin-methylester beruht. Bei diesen Verbindungen aktiviert bekanntlich die p-Hydroxygruppe avn Ring, so daß eine Markierung mit radioaktivem Jod möglich ist.

Die gemäß vorliegender Erfindung brauchbaren Isocyanate können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Bevorzugt wird ein Carbaminsäuresalz aus dem entsprechenden primären Amin gebildet, das dann unter Bildung des entsprechenden Halogensilylcarbamats als Isocyanat-Vorstufe umgesetzt wird. Das Isocyanat bildet sich dann durch schwaches Erwärmen des Halogensilylcarbamats.

Bei der Bildung dieser Isocyanate kann man bei Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis etwa 150⁰C ausgehen, wobei niedrigere Temperaturen im Bereich von etwa 30 bis etwa 60° C bevorzugt sind, um die Bildung von Nebenprodukten auf ein Mindestmaß herabzusetzen. Die Umsetzungen können in Gegenwart entweder eines nichtpolaren Lösungsmittels oder eines polaren Lösungsmittels, wie eines tertiären Amins, durchgeführt werden. Weitere Einzelheiten sind der US-PS 40 64 151 zu entnehmen, deren Offenbarung ebenfalls Gegenstand vorliegender Erfindung ist.

Wenn eine Blockierung bzw. Schutzgruppenbildung erforderlich ist, um eine Polymerisation, eine innere Cyclisierung oder andere bei der Isocyanatherste'"ing unerwünschte Nebenprodukte bildende Reaktionen zu verhindern, ist es vorteilhaft, ein Austauschverfahren anzuwenden. Bei diesem Verfahren erreicht man in eigentümlicher Weise eine Blockierung der reaktionsfähigen funktionellen Gruppe des Amins. Die Bildung des entsprechenden blockierten Isocyanats aus Tyramin zeigt diese Schutzgruppenbildung. Wie nachstehend ausgeführt wird, bildet sich das Trialkylsilyl-carbamat durch Umsetzen von Tyramin mit Kohlendioxid und einem Halogensilan, wobei die Umsetzung in Triethylamin als Lösungsmittel durchgeführt wird:

Lösungsmittel (C₂Hs),N

HO

-> (CH₃^SiO

CH₂CH₂NH₂ + CO₂ + 2(CH₃)^SiCl CH₂CH₂NHCOOSKCh₃),

Wie ersichtlich ist, ergibt sich bei der Bildung des TrialkylsUyl-carbamats eine Blockierung der Hydroxylgruppe des Tyramins. Das Isocyanat kann dann durch eine trans-Silylierungsreaktion unter Bildung des Halogensilylcarb- amats und anschließendes Erhitzen gebildet werden. Diese Reaktionsfolge ist nachstehend angegeben:

(CHj)₁SiO

-> (CHj)₃SiO

Erhitzen

(CHj)₅SiO

-> (CHj))SiO

CH₂CH₂NHCOOSi(CHj)) + SiCL,
CH₂CH₂NHCOOSiCl₃
CH₂CH₂NHCOOSiCI₃
CH₂CH₂N = C = O

Bei dem vorstehenden Beispiel ist die Schutzgruppe die Trimethylsiloxy-Gruppe, doch stellt dies nur eine beispielhafte Ausführung dar. Die jeweilige Siloxy-Schutzgruppe hängt vom organischen Rest des zur Bildung des Silylcarbamats nach dem Austauschverfahren verwendeten Sicherungsmittel ab. Der organische Rest kann vom Begriff her ein beliebiger Rest sein, der die Bildung eines Silylcarbamats, die anschließende Transsilylierung und die Umwandlung in das entsprechende Isocyanat gestattet.

Beispiele brauchbarer organischer Reste sind niedere Alkylreste mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, wie die Dinethyl-, die Methyläthyl- oder die Methylpropyl-Gruppe. Cycloalkylreste, wie die Cyclopentyl-, Cyclohexyl- oder Cycloheptyl-Gruppe, können auch verwendet werden, doch sollten sie etwa 10 Kohlenstoffatome oder weniger enthalten. Des weiteren können Aryl- oder Alkarylreste mit bis zu IO Kohlenstoffatomen verwendet werden. Geeignete Beispiele sind die Phenyl-, ToIyI- und Xylylgruppe. Außerdem können auch Aralkylreste mit bis zu etwa 10 Kohlenstoffatomen, wie die Benzylgruppe, verwendet werden. Jeder dieser Reste kann mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sein. Es ist ersichtlich, daß die Verwendung organischer Reste mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen oder weniger eher eine bevorzugte Ausführungsform als eine Begrenzung darstellt. Die Verfügbarkeit und die Kosten bestimmen häufig das verwendete jeweilige Silan. Ein weiteres Merkmal ist die Leichtigkeit der Umwandlung in das Isocyana⁴., wobei größere und umfangreichere organische Moleküle eine weniger leichte Umwandlung erleiden können.

Für Isocyanate auf der Basis von Tryamin kommt demgemäß die nachstehende Strukturformel in Betracht;

(KhSiO

-CH₂CH₂N=C =

in der R ein beliebiger organischer Rest sein kann, wie er in Verbindung mit dem Silylierungsmittel beschrieben ist Auch kann der Rest R ein einheitlicher Rest oder ein gemischter Rest, wie der tert-Butyl-dimethyl-Rest, sein. Für Isocyanate auf Basis des L-Tyrosin-methylesters kommt die nachstehende Strukturformel in Betracht:

(R)₃SiO

CO₂CH₃ -CH₂CHN=C=O (Π)

in der R die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzt.

Obwohl in den meisten Fällen, wie sie mit Tryamin abgehandelt worden sind, die Anwendung des Austauschverfahrens eine adäquate Schutzgruppenbildung hervorruft, gibt es Situationen, in denen sich diese Art Schutzgruppe als inadäquat zeigt. Wenn beispielsweise eine Aminogruppe geschützt wird, kann dies mittels des Austauschverfahrens durchgeführt werden. Wenn jedoch das erhaltene Isocyanat mit einer Verbindung von klinischem oder anderem Interesse umgesetzt v.'ird, kann eine vorzeitige Abspaltung der Schutzgruppe, beispielsweise durch Hydrolyse, auftreten, was unerwünschte Nebenreaktionen zur Folge hat. Dies kann man gegebenenfalls durch entsprechende Auswahl der Silylierungsmittel, die verhältnismäßig umfangreiche Schutzgruppen ausbilden, oder durch Modifizieren der Reaktionsbedingungen vermeiden. Gegebenenfalls können andere bekannte Blockierungsverfahren angewendet werden. Beispielsweise könnte eine reaktionsfähige Gruppe durch Einführen des Trifluor-acetamido-Restes geschützt werden.

Die Isocyanate können dann mit beliebigen interessierenden Verbindungen umgesetzt werden, die selbstverständlich mit der Isocyanatgruppe reagieren können. Typische Beispiele von Verbindungen, die an die Isocyanate gekuppelt werden können, enthalten im klassischen Sinne aktive Wasserstoffatome, wie dies bei Verbindungen mit Hydroxyl-, Amino-, Sulfhydryl- oder Carboxylgruppen der Fall ist. Bekanntlich enthält eine große Anzahl von Steroiden, Steoridglycosiden und Nikotinderivaten derartige mit Isocyanatgruppen reaktionsfähige Gruppen. Spezielle Beispiele von Verbindungen von klinischem oder anderem Interesse sind Digoxin, Digitoxin, Digoxigenin, Testosteron, Cortisol, Östron, östradiol, östriol und lla-Hydroxy-progeste ron.

Es ist auch darauf hinzuweisen, daß die vorliegende Erfindung auch in bezug auf Verbindungen von Interesse angewendet werden kann, die keine mit Isocyanatgruppen reaktionsfähige Reste enthalten. Dies erfordert eine Modifizierung der Verbindungen, um eine derartige reaktionsfähige Gruppe einzuführen. Beispielsweise kann Nikotin verwendet werden, indem es zuerst in das 6-Amino-nicotin überführt wird, das dann mit dem gewünschten Isocyanat reagiert Das erhaltene Addukt ist ein geeignetes Analogen zur Anwendung in Nikotinversuehen.

Die Isocyanat-Verbindung des interessierenden Ad- dukts oder Derivats kann im allgemeinen unter

Anwendung an sich bekannter Verfahrensbedingungen zur Umsetzung von Isocyanaten hergestellt werden. Es ist deshalb beispielsweise zweckmäßig, das Addukt durch Umsetzung in einem Lösungsmittel — falls erforderlich — bei einer Temperatur im Bereich von Raumtemperatur bis etwa 150° C herzustellen. Gegebenenfalls kann man auch verschiedene Arten von Katalysatoren mtverwenden, die sich bei der Herstellung von Urethanen als brauchbar gezeigt haben. Beispiele von brauchbaren Katalysatoren sind tertiäre Amine, Salze organischer Säuren mit den verschiedensten Metallen, wie Alkalimetallen, und dergleichen. Beispiele von brauchbaren Lösungsmitteln sind Pyridin, Formamid, Tetrahydrofuran, Triethylamin. Dimethylformamid, Äther, Methylenchlorid und dergleichen, wobei Pyridin bevorzugt ist.

Die Menge des gegebenenfalls vorhandenen Lösungsmittels kann gewünschtenfalls variieren und wird häufig durch den Zweck bei seiner Verwendung an erster Stelle bestimmt. Die relativen Mengen der verwendeten Reaktionsteilnehmer können in gleicher Weise wie gewünscht variieren, und ein geringer Überschuß eines der Reaktionsteilnehmer führt zu keinen nachteiligen Wirkungen. Die Verwendung eines der Reaktionsteilnehmer in einer geringeren als der stöchiometrischen Menge neigt - wie nicht anders zu erwarten - zur Herabsetzung der Ausbeute.

Wie ersichtlich ist, sollten die Bedingungen so gewählt sein, um zu gewährleisten, daß die Struktur der interessierenden Verbindung nicht abgebaut oder in anderer Weise nachteilig beeinflußt wird. Aus diesem Grunde bevorzugt man die Anwendung möglichst schonender Bedingungen.

Zahlreiche interessierende Verbindungen enthalten mehr als einen mit der Isocyanatgruppe reagierenden Rest. Dies kann zur Bildung von mehr als einer Spezies führen. Man kann diese Bildung auf ein Mindestmaß herabsetzen oder sogar vermeiden, indem man besondere Techniken anwendet. Zu diesem Zweck und nach einer Ausführungsform vorliegender Erfindung kann deshalb die Umsetzung auf photochemischem Wege erfolgen. Um die Hersiellung von Urethanen zu ermöglichen, die nicht durch andere Verfahren hergestellt werden können, kann man bekanntlich die Reaktion in Tetrachlorkohlenstoff mit Ferrocen durchführen.

Beispielsweise besitzt Digoxin sechs Hydroxylgruppen. Frühere Arbeiten vermuten, daß die Hydroxylgruppe am 15'-Kohlenstoffatom die reaktionsfähigste ist, gefolgt von der Hydroxylgruppe am 12-Kohlenstoffatom. Ohne Anwendung einer photochemischen Reaktion stimmt die Analyse des Reaktionsproduktes eines auf Tyr^min basierenden Isocyanats und Digoxin mit der Anwesenheit eines Gemisches von Digoxin-carbamaten ülerein, von denen eines eine Harnstoffbindung am ^'-Kohlenstoffatom und von denen ein anderes eine Carbamatbindung sowohl am 15'- als auch am 12-Kohlenstoffatom aufweist Es ist gefunden worden, daß die Anwendung einer photochemischen Reaktion nur eine einzige Art liefert, die mit einer Struktur mit einer Harnstoffbindung am ^'-Kohlenstoffatom übereinstimmt

Begrifflich ergibt eine photochemische Reaktion in gleicher Weise eine einzige Verbindung in den Fällen, bei denen die reaktionsfähigen Reste der interessierenden Verbindung relativ unterschiedliche Reaktionsfähigkeiten in einer Größenordnung ähnlich der der Hydroxylgruppen im Digoxin haben. Spezieller, d. h. in theoretischer Hinsicht, besagt dies, daß die photochemische Reaktion in ausreichender Weise die Reaktionskinetik mit den meisten reaktionsfähigen Gruppen in bezug auf die Reaktionsfähigkeit der anderen Gruppen vergrößert, um die Bildung einer einzigen Verbindung zu gestatten.

Gegebenenfalls kann zur Schaffung einer besonders gewünschten Verbindung eine Blockierung aller reaktionsfähigen Gruppen erfolgen, der sich dann eine

to selektive Abspaltung der Schutzgruppen an den gewünschten Stellen anschließt. Als spezielles Beispiel können bei Verwendung von 170-Östradiol die beiden Hydroxylgruppen mit jeweils einer Trimethylsilylgruppe durch Umsetzung mit Trimethylsilyl-N.N-dimethyl- carbamat geschützt werden. Für ein selektives Entfernen der 3-Trimethylsilylgruppe unter Beibehaltung der Schutzgruppe in der 17-Stellung kann das Rohprodukt selektiv unter Anwendung bekannter Spaltungsniittel, wie Methanol, gespalten werden, wie man durch die NMR-Spektroskopie überprüfen kann. Dieses Zwischenprodukt kann dann mit dem gewünschten Isocyanat umgesetzt werden, worauf sich eine Abspaltung der Schutzgruppe an der an sich unerwünschten Reaktionsstelle anschließt.

Sofern gegebenenfalls des weiteren bei der Umsetzung mehr als eine Verbindung erzeugt wird, können übliche Trennverfahren, beispielsweise die Dünnschicht-Chromatographie, angewendet werden, um die gewünschte Verbindung zu isolieren. Ein Umkristallisie ren oder dergleichen kann ebenfalls angewendet werden.

Wie aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich ist, wenn eine Blockierung des reaktionsfähigen Restes des Isocyanats erforderlich ist, bevorzugt man die Bildung des gewünschten Addukts oder Derivats vor einer Abspaltung der Schutzgruppe oder Schutzgruppen. Bekanntlich kann eine Abspaltung der Schutzgruppe zweckmäßigerweisfc unter Verwendung verschiedener Lösungsmittel, wie wäßriges Methanol oder dergleichen, durchgeführt werden. Die freigesetzte reaktionsfähige Gruppe kann dann zur Bildung des

Addukts mit dem Substrat oder einem anderen

interessierenden Material verwendet werden.

Die erfindur.gsgemäßen Isocyanate, die einen mar-

kierten Rest oder einen markierbaren Rest enthalten, können in vorteilhafter Weise in beliebigen der bekannter, zahlreichen Verfahren zur Herstellung einer kompetitiven Bindung eingesetzt werden, um das Vorhandensein der interessierenden Verbindung in

so quantitativer Weise zu bestimmen. Das jeweils verwendete Isocyanat hängt natürlich von der Markierungsart ab, die durch das ausgewählte Verfahren erforderlich ist Das ausgewählte Verfahren wird zu einem großen Teil durch die gewünschten Ergebnisse bestimmt Wenn man

demzufolge beispielsweise ein Verfahren zur Bestimmung des quantitativen Vorhandenseins einer Verbindung anwendet, wobei eine größtmögliche Empfindlichkeit erwünscht ist wie dies im allgemeinen der Fall bei Verbindungen von klinischem oder biologischem

Interesse ist, bevorzugt man die Anwendung der Radioimmunanalyse und einer mit radioaktivem Jod markierten Verbindung.

Die radioaktive Markierung einer Isocyanatverbindung eines interessierenden Derivats kann mittels

beliebiger an sich bekannter verschiedener Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise können die mit radioaktivem Jod markierten Derivate nach einer der nachstehenden Methoden hergestellt werden: Chlor-

amin-T-Methode nach Hunter-Greenwood gemäß »Nature« 194 (1962), Seite 495; Jod-nionochlorid-Methode nach Ceska, Grossmulier und Lundkvist, in wActa Endocrinologia«, 64 (1970), Seiten 112 bis 125; Isotopische Austauschmethode nach Counsel!» Ranade, Pocha, Willette und Diguilio in »Journal Pharmaceut. Sciences« 57 (!968), Seite 1657 und Electrolytische Jodierung nach Pennisi und Rosa, in »journal Nuclear Biol.& Medicine« 13 (1964), Seite 64. Es ist erwünscht, als Radioisotop ¹²⁵J zu verwenden, jedoch können auch andere Radioisotope, wie ¹²³J, ¹²⁹J oder ¹³¹J in gleicher Weise eingesetzt werden.

Das radioaktiv markierte Derivat kann dann gereinigt werden, um gegebenenfalls eine einzige Verbindung unter Anwendung üblicher bekannter Verfahren zu isolieren. Beispielsweise können die gebildeten mit radioaktivem Jod markierten Derivate, wie dies an sich bekannt ist, aus einem Gemisch von Mono- und Di-Iod-Verbindungen bestehen, und es kann vorteilhaft sein, eine ein.-ige Art der Verbindungen zu isolieren.

Die erfii dungsgemäßen Derivate sine! in hohem Maße vorteilhafte, gut charakterisierte Verbindungen, die ein Höchstmaß an Genauigke^:t, Richtigkeit, Empfindlichkf.it, Spezifität und Reproduzierbarkeit erlauben. Je nach der Art der Herstellung können demzufolge reine Reagentien mit einer geringstmöglirhen Konzentration an Nebenprodukten gebildet werden, und die schonende Reaktion zur Bildung der Derivate setzt die Möglichkeit einer Umlagerung der mit den erfindungsgemäßen Isocyanaten gekuppelten klinischen Verbindung auf ein Mindestmaß herab. Darüber hinaus verringert die Herstellung der Derivate die Unterschiede hinsichtlich der Affinität gegenüber dem Bindungsmittel des Radioindikators und des ursprünglichen Haptens oder Antigens, so daß ein wirksamer kompetitiver Versuch möglich ist.

Wie hieraus ersichtlich ist, bildet einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung die Verwendung der mit radioaktivem Jod im Phenylkern des Isocyanatrestes jodierte Verbindungen bei der kompetitiven Radioimmunanalyse einer interessierenden Verbindung. Dies hat bekanntlich die Erstellung einer Eich- bzw. Meßkurve des Zerfalls je Zeiteinheit gegenüber der Konzentration der interessierenden Verbindung zur Folge. Diese kann in einem vierstufigen Verfahren erstellt werden, wobei miteinander reagieren

1) eine feste Anzahl von Bindungsstellen (beispielsweise Antikörper), die spezifisch für die interessierende Verbindung sind,

2) eine feste Menge des Radiomarkierungsmittels oder Radioindikators und

3) unterschiedliche Mengen einer reinen Standard-Bezugsverbindu.-ig.

Für jede Verdünnung des Standards in der ersten Stufe werden die freien Verbindungen von den gebundenen Verbindungen getrennt Die Trennung kann durch Anwendung üblicher Methoden erfolgen. Eine Anzahl derartiger Methoden sind bekannt, beispielsweise die Chromatoelektrophorese oder die Absorption und die Eluierung aus einer kleinen Säule mit einer Beschickung von besonderer Aktivkohle, einem Austauscherharz, Cellulose oder Siliciumdioxid. Unter Verwendung eines geeigneten Strahlungszählers wird der Zerfall je Zeiteinheit entweder bei der gebundenen oder bei der freien Fraktion jeder Reaktion oder Verdünnung bestimmt Eine Standard-Zerfallskurve je Zeiteinheit gegen die Konzentration der reinen Bezugsverbindung kann danach konstruiert werden.

Der Zerfall je Zeiteinheit für eine interessierende Verbindung in einer Probe wird dann dadurch bestimmt, daß nan die Probe kompetitiven Bindungsbedingungen unterwirft. Dies wird unter Verwendung Jer gleichen allgemeinen Stufen erreicht, wie sie bei der Ermittlung der Standardkurve angewendet worden sind. Demzufolge reagieren bei der Probe miteinander die gleich'' Anzahl von Bindungsstellen und die identische festgelegte Menge des bei der Ermittlung der Standardkurve verwendeten Radioindikators. Nach der Abtrennung der freien Verbindungen von den gebundenen Verbindungen kann der zuvor verwendete Strahlungszähler zur Bestimmung des Zerfalls je Zeiteinheit für die gleiche Fraktion eingesetzt werden, die zur Ermittlung der Standardkurve verwendet worden ist.

Unter Verwendung der Standardkurve entspricht die Konzentration der interessierenden Verbindung derjenigen Konzentration, die dem Zerfall je Zeiteinheit entspricht, wie sie zuvor für die Probe bestimmt worden ist.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die Beispiele 1 bis 3 erläutern die Herstellung erfindungsgemaß verwendbarer Isocyanate. In den Beispielen 4 bis 21 ist die Herstellung der Reaktionsprodukte beschrieben, während die Beispiele 22 und 23 die Verwendung von Reaktionsprodukten nach der Erfindung erläutern.

Beispiel 1

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines Isocyanats aus einem Amin, das weitere reaktionsfähige funktionell Gruppen aufweist, nämlich dem 2-(4'-Hydroxyphenyl)-äthylamin mit Trivialnamen Ty a..iin, das nach dem Abspalten der Schutzgruppe mit radioaktivem Jod markiert werden und dann mit einer klinisch interessierenden Verbindung gekuppelt werden kann.

Ein 250 ml fassender, mit Rückflußkühler, Gaseinleitungsrohr und magnetischem Rührer ausgerüsteter Dreihalskolben wird unter Stickstoffdruck mit 100 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran, 1,4 g(0,01 Mol)Tyramin und 5,0 ml Triäthylamin beschickt Zu diesem Gemisch tropft man 3,0 ml Trimethylchlorsilan bei Raumtemperatur hinzu und rührt das Reaktionsgemisch 30'Minuten.

Anschließend leitet man mittels einer Injektionsnadel im Verlauf von 4 Stunden langsam Kohlendioxid in das Reaktionsgemisch ein, während das Gemisch gleichzeitig unter Rückfluß sieden gelassen wird. Nach Beendigung des Kohlendioxideinleitens fügt man unier Verwendung einer Injektionsspitze langsam 1,5 ml Siliciumtetrachlorid hinzu. Nach weiterem 30minütigen Erhitzen läßt man das Reaktionsgemisch abkühlen und filtriert das Triäthylamin-hydrochlorid ab. Anschließend entfernt man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck von 12 Torr bei 35° C und destilliert das erhaltene öl bei 88 bis 90⁰C unter 0,05 Torr. Man erhält 2-(4'-Trimethyl-siloxy-phenyl)-äthylisocyanat als farblose Flüssigkeit

Das IR-Spektrum dieser neuen Verbindung zeigt Absorptionsbanden bei 3,39, 4,41, 6,17 und 6,58 μ. Das NMR-Spektrum in Deuterochloroform zeigt Absorptionsbanden bei 6=7,08 und 6,77 (A₂BrQuartett 4, J =8,4 Hz, aromatische 3'-, 5'- und 2'-, 6'-Protonen); 3,43 (t, 2, J=6,6 -CH₂CH₂-N); 2,79 (t 2, J=6,6Hz, -CH₂CH₂N) und 0,25 ppm (s, 9, -OSi(CHs)₃).

Das Massenspektrum zeigt ein Molekularion bei m/'e 235 und weitere Maxima bei 179,163,107 und 73, sowie ein metastabiles Maximum bei 163,3.

Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-Isocyanato-3-(4'-trimetbyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester mit dem Trivialnamen geschütztes s L-Tyrosin-methylerter-isocyanat, die nach Abspalten der Schutzgruppe mit radioaktivem Jod markiert werden kann.

Durch ein gerührtes Gemisch von 9,75 g (0,05 Mol) L-Tyrosinmethylester, der in 200 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran suspendiert ist, und 45 ml (0,30 Mol) Triethylamin läßt man einen Strom wasserfreies Kohlendioxid durchperlen. Nach 30 Minuten fügt man langsam 20 ml (0,16 MoI) Trimethylchlorsilan hinzu. Das Reaktionsgemisch läßt man unter ständigem Durchlei- is ten von Kohlendioxid 4 Stunden unter Rückfluß sieden und anschließend auf Raumtemperatur abkühlen. Das Einleiten von Kohlendioxid wird beendet Dann fügt man langsam 8,5 g (6,0 ml; 10,05 Mol) Siliciumtetrachlorid hinzu und rührt das Reaktionsgemisch weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Dann iäüt man das Reaktionsgemisch 60 Minuten unter Rückfluß sieden, kühlt es auf Raumtemperatur und versetzt es mit 50 ml tert-ButanoL Das Gemisch wird weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Stickstoff filtriert Der Filterkuchen wird mit 30 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gewaschen.

Die vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft und unter Verwendung einer Kurzwegkolonne destilliert

Die unter einem Druck von 0,05 Torr bei 100 bis 145° C erhaltene Fraktion wird nochmals destilliert Man erhält 5,8 g ( = 39% der Theorie) 2-Isocyanato-3-(4'-trirnethyl-siloxyphenyl)-propionsäuremethylester als viskoses farbloses öl vom Kp. 139 bis 140° C bei 0,1 Torr.

IR-Spektrum (unverdünnter Aufstrich): 338, 4,45 (N = C=O), 5,73 (Ester-C = O); 6,22, 6,64, 103 und 113 μ.

NMR-Spektrum (CCI₄): <5 = 7,00 und 6,70 (A₂B₂-Quartett, 4, J =8,6 Hz, aromatische 3'-, 5'- und 2'-, «o 6'-Protonen); 4,10 (t, I, J = 6,0 Hz, -CH₂-CH-); 3,66 (s, 3, -OCH₃); 231 (d, 2, J = 6,0 -CH₂-CH-) und 0.22 ppm (s, 9, (CH₃J₃Si-).

Massenspekirum (70 eV): m/e(rel. Intensität): 293 (5),

278 (1,5), 250 (1), 234 (2£), 218 (0,75), 179 (100), 163 (2,3), 149 (2), 107 (2) und 73 (40).

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-Isocyanato-3-(4'-tert-butyl-dimethyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester, die nach Abspalten der Schutzgruppe radioaktiv jcdiert werden kann.

Das Verfahren der Beispiele 1 bzw. 2 wird in analoger Weise wiederholt In 100 ml wasserfreies Tetrahydrofuran werden 8,0 g (0jD4Mol) L-Tyrosin-methylester gegeben. Dann leitet man während 30 Minuten in das gerührte Reaktionsgemisch einen langsamen Strom von wasserfreiem Kohlendioxid ein, währenddessen 50 ml Triäthylamin zugetropft werden. Dann gibt man 15 g (0,1 Mol) teit-Butyldimethyl-chlorsilan hinzu und erhitzt das Reaktionsgemisch 43 Stunden unter Rückfluß. Nach dem Abkühlen werden 8,5 g (6,0 ml; 0,05MoI) Siliciumtetrachlorid hinzugegeben. Danach rührt man das Reaktionsgemisch weitere 30 Minuten und erhitzt es zusätzliche 60 Minuten unter Rückfluß. Dann fügt man 50 ml tert-Butanol hinzu, um gebildete Silyichioride zu zersetzen, und setzt das Rühren weitere 30 Minuten fort

Nach dem Filtrieren, Waschen und Einengen des Reaktionsgemisches, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, gewinnt man 2,7 g ( = 20% der Theorie) des farblosen Isocyanate vom Kp. 180° C bei 0,5 Torr.

IR-Spektrum (Aufstrich): 338, 4,44, 5,71, 6,17 und 6,53 μ.

NMR-Spektrum in CDCI₃: 0=7,13 und 6,83 (A₂Br Quartett 4, J=8,6 Hz, aromatische 3'-, 5'- und T-, 6'-Protonen); 4,26 (t 1, J = 6,0 Hz, -CH₂CH); 333 (s, 3, -OCH₃); 3,08 (d, 2, J =6,0 Hz, -CH₂CH-); 1,03 (s, 9, -qCH₃)₃) und 0,26 ppm(s,6, -Si(CH₃J₂).

Massenspektrum: m/e335,278,250,236,221,205,172, 73 und 57.

Beispiel 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3^O-[O-H30-O-{N-[Carbomethoxy-2-(4'-hydroxyphenyl)-äthyl-1 -ylj-carbamyl-digitoxosyl)-(l -» 4)-O-/?-digitoxosy l-{ 1 — 4)-0-digitoxos-1 -yl]-120,1 4/?-dihydroxy-5/3-card-20(22)-enolid, Trivia/bezeichnung: 15'-(Tyrosinmethylester)-carbamyl-digoxin:

NH

OCH₃

Ein Gemisch von 0300 g (3,84x10-» MqI) kristallinem Djgoxin und 0,122 g (3,84 χ 10"» Mol) 2-Isocyanato-3-(4'-trimethyl-siloxy-phenyl)-propionsäure-methylester_r der nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, wird in 3 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und 6 Tage bei 45-50°C gerührt Dann entfernt man das Pyridin bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck, versetzt den Rückstand mit 5 ml Methanol und rührt das Gemisch weitere 30 Minuten. Das Methanolvohimen wird dann unter vermindertem Druck auf etwa 1 ml vermindert Das rohe Reaktionsgemisch wird dann einer preparativen Dünnschichtchromatographie an Silicagel (20 χ 20 χ 0,2 cm große, vorbeschichtete Dünnschichtchromatographie-Platten) unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystems unterworfen.

Nach dem Entwickeln werden 3 Hauptbanden und eine Nebenbande auf der Dünnschichtchromatographie-Platte unter einer kurzwelligen Ultraviolettlampe (254 nm) beobachtet. Das Sichtbarmachen der Banden als eine Reihe von bräunüch-schwarzen Flecken erfolgt durch vorsichtiges Herausschneiden eines 1,5 χ 20 cm großen Streifens von der jeweiligen senkrechten Kante der Dünnschichtchromatographie-Platte unter Verwendung eines Glasschneiders durch Besprühen des Streifens mit einer geringen Menge eines Aerosols von konzentrierter Schwefelsäure und durch Erhitzen auf 10O⁰C, bis die Flecken deutlich genug geworden sind. Dann wird ein unmittelbarer Vergleich dieses Streifens mit dem Rest auf der Dünnschichtchromatographieplatte als alternierendes Mittel der Bandenlokalisierung angewendet. Von der Platte werden alle Banden abfQSchabt und mit 10 Prozent Methanol enthaltendem Methylenchlorid eluiert Das Lösungsmittel wird dann bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck entfernt

Die erste Hauptbande mit einem Laufwert Rf»0,65 (für einen genaueren Vergleich der anderen drei Komponenten wird die relative Mobilität mit 1,0 bezeichnet) enthält 0,120 g (-40 Prozent der Theorie) eines weißen Farbstoffes vom Fp. 241 bis 244⁰C. Diese Verbindung wird durch Vergleich mit einer authentischen Probe als Digoxin identifiziert

Die zweite Bande (Nebenbande) mit einem Laufwert Rf -0,7 (relative Mobilität-1,07) enthält Spuren (< 0,001g) eines nicht identifizierbaren farblosen Feststoffes, det .licht weiter charakterisiert worden ist

Die 3. Hauptbande, R₍-0,76 (relative Mobilität-1.17), ergibt 0,057 g (15%) 30-O-[O-0-(30-O-|N-[1 -Carbomethoxy-2-(4'-hydroxyphenyl)]-äth-1 -yl)-carbamyl-digitoxosyl)-(l-* 4)-O-0-digitoxosy1)(l-» 4)-/?-digitoxos-1 -yl> 120,140-dihydroxy-5/J-card-2O(22)-enolid als glasartigen farblosen Feststoff vom Fp. 215-220⁰C (Zers.).

UV-Spektrum in CH₃OH: A_m„ 222 nm (β -11 930) und 275 nm (ε-1870).

IR-Spektrum (KBr): 2,99 (-OH). 330,5,78 (Lacton-C-O), 533(Ester-C»O), 6,19,6,65,6,95,7,27,735,7,96, 820,8,63,9,22,9,41,9,86,1136,12,01,12,23 und 1234 μ.

NMR-Spektrum (5Q% CDCl₃- Aceton-ds) d - 7,73 (s, 1, aromatisches -OH): 637 und 6,70 (AjB₂-Quartett, 4, J-8,6 Hz;Tyrosin-3\5'-und2\6'-Protonen);5,91 (s,l. Lacton-C-CH-); 3,74 (s, 3, Ester-OCHj); 053 (s, 3, 19-CH₃) und 0,83 ppm (s, 3,18-CH₃), Trivialbezeichnung: 15'-(TM E)-carbamyldigoxin.

Die 4. Hauptbande, Rr - 0,79 (relative Mobilität -1,22) ergibt 0,067 g (16%) 30-O-[O-/9-(30-O-|N -[ 1 -Carbometh oxy-2-(4'-hydro}cyphenyl)-ftth-l-yl]}-carbamyl-digitoxolHl4>OpdiJl(l4)^diitlri12^

O^N-[l-carboraethoxy-2-{4Miydroxyphenyl)-&th-l-yf|- carbamyI}-I4^-hydroxy-5^-card-20(22)-enolid als glasartigen farblosen Farbstoff vom Fp. 220-224⁰C, (Zers.).

UV-Spektnim in CH₃OH: Λ™, 222 nm (e=22 050)und 273nm(e-11540).

IR-Spektrum (KBr) v=3,01 (OH), 3,47, 5,78 (Lacton-C=O), 532 Ester-C=O), 6,17, 6,63, 6,95, 7,28, 735.7,95.8,19,838,837,9,17,9,40,936,10,05,1132,1139. 12,12 und 12,45 μ,

NMR-Spektrum (60MHz, 50% CDCb-Aceton-de) 0=7,61 (s, 1, aromatisches -OH): 7,06 und 6,78 (A₂B2-Quartett, 4, J=8,6 Hz, Tyrosin-3'-. 5'- und 2'-, 6'-Protonen); 7,02 und 6,78 (A₂BrQuartett, 4, J=8,6 Hz, Tyrosin-3'-, 5'- und T-, 6'-Protonen); 5J)1 (s, 1, Ucton-C=CH-): 3,75 (s, 6, Ester-OCH₃): 0,93 (s, 3, 19-CH₃) und 033 ppm (s, 3.18-CH₃).

NMR-Spektrum (220MHz, DMSO-(I₆) Λ=737 (s, 1,

2» aromatisches -OH): 7,03 und 6,99 (A^rQuartett, 4,

J=8.0 Hz, Tyrosin-3'-, 5'- und T-, 6'-Protonen); 6,66 und

6,64 (Ä₂B*-Quartert, 4, j - 8,0 Hz, Tyrosin-3'-, 5'- und T-, 6'Protonen); 5,90 (s, 1, Ucton-CH -CH-): 3,61 (s. 3,

Ester-OCH₃); 3,60 (s, 1, Ester-OCH₃): 034 (s, 3,

r> 19-CH₃) und 0,76 ppm(s,3,le-CH^Triviaibezeichnung:

12,15'-(Di -TMEJ-carbamyl-digoxin.

Beispiel 5 Zu einem Gemisch einer Na-'^J-Lösung mit 2,0

»< Millicurie, 25 μΙ einer 03 m Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 73 und 2pg von in 20 μΙ Methanol gelöstem 15'-(TME)-carbamyl-digoxin in einem 13 ml Mikroproberöhrchen werden auf einmal 50 pg Chloramin T (Natriumsalz des N-Chlor-para-toluolsulfonsäu-

r» reamid-trihydrats) gegeben, die in 20 μΙ einer 0,05-m Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 73 gelöst sind.. Nach genau 20 Sekunden werden 100 pg Natriummetabisulfit zugegeben, die in 20 μΙ einer 0,05-m Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 73 gelöst sind, um die

><> Reaktion zu beenden.

Eine 1 μΙ Probe des Reaktionsgemisches wird auf eine analytische Silicagel-Dünnschichtchromatographie-Platte mit einer Größe von 5 χ 20 χ 0,025 cm aufgebracht Der Rückstand wird in einer 6 χ 0,2 cm breiten

-π Bande auf eine präparative DOnnschichtchromatographie-Platte der Abmessungen 20 χ 20 χ 0,2 cm aus einer Silicagelschicht in einer Entfernung von 2 cm von der Grundkante der Platte aufgetragen. Die Platten werden 15 Minuten an der Luft getrocknet und dann unter

~>n Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmittelsystems entwickelt, bis die Lösungsmittelfront die Oberkante jeder Platte erreicht hat. Die Platten werden dann 30 Minuten an der Luft getrocknet, dann mit einer dünnen transparenten

'"< Polyäthylenfolie umhüllt und mit einem Röntgenfilm und einem Radiochromatogramm-Abtaster analysiert um die radioaktiven Banden auf den Platten zu lokalisieren und quantitativ zu bestimmen.

Jede Platte zeigt typischerweise drei radioaktive

μ) Banden (Flecken auf der analytischen Dünnschichtchromatographie-Platte), Die Bande beim Ausgangspunkt, Rf-O₁O, enthält typischerweise 200 μθ (10 Prozent der Gesamt-Radioaktivität) und entspricht nicht umgesetztem ^IMJ.

<>> Die Hauptbande, Ri-0,28 (präparative Dünnschichtchromatographieplatte) und 035 (analytische Dünnschichtchromatographieplatte) enthält 160OpCi (80 Prozent der Gesamtradioaktivität) der Verbindung

3fl-0-ro-fl-i3fl-0-[NHl-C»rbomethoxy-2-[4'-hydroxy-3'-(t*JHod-phenyl]}-äthyl-

t -yf|-carbfMi»yl-digHoxosy!}-{l -t- 4>O-^-digitoxosyl-(j-f4)-j3-djgitpxos-l-yri-12ji,14^- dihydroxy-5^-card-20(22)-enoIid (Trivialbezeichnung; 15'-(TME)-carbamyI-digoxra->²⁵I). Diese Bande wird von der präparativen Dfinnschichtchromatographieplatte abgeschabt, in eine Glassäule der Abmessungen 15 χ 03 cm Oberführt, die am unteren Ende mit einem Glaswolle-Pfropfen verschlossen ist, und mit 30 ml eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmittelsystems in 1 ml Anteilen eluiert. Das gesammelte Eluat wird mittels eines Stroms von wasserfreiem Stickstoff zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird in 0,5 ml wasserfreiem Äthanol gelöst, die Lösung auf eine analytische Dünnschichtchromatographieplatte der Abmessungen 20 χ 20 χ 0,025 cm aufgebracht und dann unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmittelsystems entwickeln gelassen. Die Dünnschichtchrotnatographieplatte wird dann an Luft getrocknet, mit einer dünnen transparenten Polyäthylenfolie umhüllt und mittels Autoradiographie unter Verwendung eines Röntgenfilms analysiert, um die radioaktiven Banden auf der Platte zu lokalisieren. Die radioaktive Bande, die dem 15'-(TME)-carbamyI-digoxin-^l25J entspricht, wird von der Dünnschichtchromatographieplatte abgeschabt, in eine Glassäule der Abmessungen 15 χ 0,9 cm überführt, die am unteren Ende mit einem Glaswollepfropfen verschlossen ist, und aus dem Silicagel mittels 30 ml einer 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösung eluiert, die in 3 ml-Anteilen auf die Säule aufgebracht wird. Das Gesamteluat wird mittels eines Stromes wasserfreien Stickstoffs eingedampft Der Rückstand wird in 1 ml wasserfreiem Äthanol gelöst Die Dünnschichtchromatographie an Silicagel mit den Abmessungen 5 χ 20 χ 0,025 cm zeigt unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmittelsystems das Vorhandensein eines einzigen homoge nen Flecks. Die gereinigte Substanz, die bei -20⁰C aufbewahrt wird, ist mehrere Monate stabil

Die dritte Bande (Nebenbande) mit einem Laufwert Rf=0,34 (präparative Dünnschichtchromatographie-

platte) und 0,43 (analytische Dünnschichtchromarogra-

phieplatte) enthält 300 μθ (15 Prozent der Gesamt-Ra dioaktivität) der Verbindung

30-O-[O-0-{3/}-O-[N-{l -Carbomethoxy-

2{4'-hydroxy-3',5'<'^MJ>dijod-phenyl]}-äthyl-l-yl]-carbamyl-digitoxosylHl -*4)-

O-p-digitoxosyl-O-^y-p-digitoxos-l-yl]-12^,14^-dihydroxy-5^-card-20(22)-enolid-(Trivialbezeichnung: 15'-(TME)-carbamyldigoxin-di-¹²⁵J).

>n Diese Bande wird von der präparativen Dünnschichtchromatographieplatte abgeschabt, in eine Glassäule mit den Abmessungen 15 κ 05 cm überführt, die am unteren Ende mit einem Glaswollepfropfen verschlossen ist, und mit 30 ml eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmittelsystems eluiert Das gesammelte Eluat wird unter einem Strom von wasserfreiem Stickstoff zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird in 04 m! wasserfreiem Äthanol gelöst und bei - 20° C aufbewahrt

Beispiel 6

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 17ß-O-|N-[2-(4'-Hydroxyphenyl)-äthyl]}-carbamyl-androst-4-en-3-on, Trivialbezeichnung: 17-(Tyramin)-carbamyl-testosteron:

OCNHCH₂CHj-

Diese Verbindung wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 beschrieben durch dreitägiges Reagierenlassen von 0,25 g Testosteron mit 0,24 g des nach Beispiel 1 hergestellten 2-(4'-Trimethyl-siloxyphenyl)-äthylisocyanats in 5 ml Methylenchiorid bei 50°C hergestellt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels erhält man das Rohprodukt. Nach dem Entfernen der Schutzgruppe mit Methanol und anschließendem Kristallisieren aus dem gleichen Lösungsmittel erhält man 0,100 g der vorstehend genannten Verbindung vom Fp. 244 bis 246° C. Die Dünnschichtchromatographie an Silicagel mit den Plattenabmessungen 2Ox5χ0,025cm unter Verwendung eines 5 Prozent Methanol enthaltenden Chloroform· Lösungsmittelsystems zeigt einen Laufwert Ri = 0,46 für diese Verbindung.

Diese Verbindung wird durch das IR-Spektrum (KBr) charakterisiert. Das Spektrum zeigt Banden bei: 3,05 (OH), 3,40, 5,92 (Carbamat-carbonyl), 6,02 (Vinylcarbonyl). 6,20 (aromatisch), 6,60, 6,90, 7,90, 8,10, 9,52, 9,90, 11,60 und 1138 u-

Das NMR-Spektrum in 30% CF₃CO₂H-CDCl₃ zeigt Signale bei d = 726 (s, 1, aromatisches -OH); 7,08 und 6,82 (A₂B₂-Quartett, 4, J =8,4 Hz, Tyramin-3'-,5'- und 2'-,6'-Protonen), 5,96 (s, 1, -CH = C-); 1.25 (s, 3, (

Analyse:	C 74,46	H 8,25	N 3,1%
ber:	C 7435	H 8,05	N 33%
gef.:

Beispiel 7

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 21-O-|N-[2-(4'-Hydroxyphenyl)-äthyl])-carbamyl-pregn-4-en-11 /3,17«-diol-3,20-dion, Trivialbezeichnung:

21 -{TyraminJ-earbarnyl-cortisol;

YYV

OH

OH

Man läßt 4Std. lang bei Raumtemperatur 0,150 g Cortisol mit 0,240 g 2-{4'-TrimethyI-siloxyphenyI)-äthyI-isocyanat in 2 ml Pyridin reagieren. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck und nach dem Abspalten der Schutzgruppe mittels Methanol isoliert man das Carbarnat mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 20 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsrnittelsystems (Rf=0,63).

Das IR-Spektrum dieser Verbindung an KBr zeigt die nachstehenden Banden: 2,98 (Hydroxyl), 3,42, 5,80 jo (Carbamat-C=O), 5,85 (C20-C=O), C.04 (Vinyl-C=O), 6,62,6,88,7,05,7,20, 735,7,90,8,10,8,52,8,80,835, 9,45,9,70,11,55,12,05,12,80 und 14,70 μ.

Das NMR-Spektrum in 50% CDCl₃-DMSO-d« zeigt

Signale bei <5=7,55 (s, 1, aromatisches OH); 7,02 und 6,73 (A₂B₂-Quartett, 4, J =8,2 Hz₁ Tyramin-3'-5'- und 2'-,6'-Protonen); 5,63 (s, 1, -CH=C); i/iA (s, 3, 19-CH₃) und 0,89 ppm (5,3,18-CH₃).

Beispiel 8

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von S-O-JN-p^'-HydroxyphenylJ-äthylJJ-carbamyl-östra-13,5(10)-trien-17-on, Trivialbezeichnung: 3-(Tryamin)-carbamyl-östron:

HO

V-CH₂CH₂NHCO

In der gleichen allgemeinen Weise wie in Beispiel 4 beschrieben stellt man die vorgenannte Verbindung durch 24stündiges Umsetzen von 0,190 g östron und 0360 g 2-(4'-Trimethyl-siloxyphenyl)-äthylisocyanat, das in einem Geinisch von 3 ml Triäthylamin und 0,5 ml Dioxan gelöst ist, in Gegenwart von 0,050 g Triphenylphosphin als Katalysator bei 70° C die vorgenannte Verbindung her. Nach dem Abdampfen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck und nach dem Entfernen der Schutzgruppe mit Methanol isoliert man die vorstehend genannte Verbindung mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel mit den Plattenabmessungen 20 χ 20 χ 0,2 cm unter Verwendung eines 2 Prozent Methanol enthaltenden Chloro- formlösungsmitteisystems (Rf = 0,48).

Das IR-Spektrum (Aufstrich) zeigt Banden bei 3,03 (Hydroxyl), 3,43, 5,8? ibreit, Carbonyl), 6.22, 6,68, 6,93, 7,40,8,20,9,50,12,20 und 1330 μ.

Das NMR-Spektrum (CDCl₃) zeigt Signale bei (J-7,15 (m, 8 aromatische Protonen und aromatisches OH) uüd 0,83 ppm (s, 18-CH₃).

Beispiel 9

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herr.teihing von 30-O-[O-jJ-(3ß-O-(N-[2-(4'-Hydroxyphenyl)-äthyl-l-yl]|. carbamyl-digitoxosyI)-(I -► 4)-O-/J-digitoxosyl-(l -*4)-/?- digitcxos-1 -yl]-12/U40-dihydroxy-50-card-2O(22)-enolid, Trivialbezeichnung: 15'-(Tyramin)-carbamyl-digoxin:

OH

Ein Gemisch aus 0,200 g (2,65 χ ΙΟ-⁴ Mol) kristallinem Digoxin und 0,061g (2,56 χ ΙΟ"⁴ Mol) des nach Beispiel 1 hergestellten 2-(4'-Trimethyl-siloxyphenyl)-äthylisocyanats wird in 3 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und 7 Tage bei 45 bis 5O^CC gtrührt. Dann entfernt man das Pyridin unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur, fügt 5 ml Methanol zu dem Rückstand und rührt das Gemisch weitere 30 Minuten. Das Methanolvolumen engt man unter vermindertem Druck auf etwa 1 ml ein und unterwirft das rohe Reaktionsgemisch der präparativen Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmitte'.systems. Nach dem Entwickeln werden auf der Dünnschichtchromatographieplatte unter UV-Licht der Wellenlänge 254 nm zwei Hauptbanden und zusätzlich eine Bande für nicht umgesetztes Digoxin beobachtet.

Die erste Bande, R_f = 0.44, enthält 0,030 g 15'-(Tyramin)-carbamyl-digoxin. Diese Verbindung wird durch das IR-Spektrum an KBr charakterisiert und liefert folgende Banden: 2,95 (Hydroxyl), 3,45, 5,80 (breit, Carbonyl), 6,18, 6,63, 6,90, 7,28,8,55,8,85,935,9,85, 11,50, 12,10undl3,75^

Das NMR-Spektrum in 50% CDClrAceton-dö zeigt Signale bei ö = 7,55 (s, 1, aromatisches OH); 7,05 und 6,79 (A₂B₂-Quartett, 4. J = 8,4 Hz, Tyramin-3'-,5'- und 2'-.6'-Protonen); 5,90 (s, 1, Lacton-C = CH-); 0,93 (s, 3, 19-CH₃) und 0,83 ppm (s, 3,18-CH₃).

Die zv,:ite Hnptbande, Rr = 0,55, liefert 0,030 g 12,15'-(Dityramin)-carbamyl-digoxin.

NMR-Spektrum (50% CDCb-Aceton-d*) bei O = 7,73 (s, 1, aromatisches -OH); 7,08 und 6,76 (A«B«-Ouartett, 8,) =8,6 Hz, Tyramin-3',5'- und 2'-,6'-Protonen); 5,86 (d, -'. I₁ Lacton-C = CH); 0,93 (s. 3. 19-CH₃) und 0,83 ppm (s, 3,18-CH₃).

Beispiel 10

Diese.« Beispiel veranschaulicht Jie Herstellung von

)" IS'-fTyraminJ-carbamyl-digoxin unter Anwendung einer photochemischen Reaktion, wie sie von Brunner und Mitarbeitern in »Journal of the Chemical Society«, Chemical Communications, (1974), S. 253, beschrieben worden ist.

J. Zu 0,100 g (1,28XlO-⁴MoI) Digoxin, das in 100 ml entgastem Tetrachlorkohlenstoff suspendiert ist, werden 0,032 g (1,36 χ 10-⁴ Mol) 2-(4'-Trimethyl-siloxyphenyl)-äthylisocyanat und 0,003 g (1,61 χ 10-⁵ Mol) Ferrocen gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 12 Stunden

■»» unter ständiger Bestrahlung mit dem Licht einer Wolframlampe bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wird in Methanol gelöst, um die Trimethylsilyl-Schutzgruppen abzuspalten.

j ■> Die Reinigung des Rohproduktes mittels präparativer Dünnschichtchromatographie wie in Beispiel 9 beschrieben ergibt 0,025 g 15'-(Tyramin)-carbamyl-digoxin. Es wird kein 12,15'-(Dityramin)-carbamyl-digoxin festgestellt.

"' Beispiel 11

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung- von

30-O-{N-[2-(4'-Hydroxyphenyl)-äthyl]}-carbamyl-120,14ß-dihydroxy-5/?-card-2O(22)-enolid, Trivialbe- > zeichnung: 3-{Tyrainin)-carbamyl-digoxigenin:

HO-

-CH₂CH₂NHCO

Unter Anwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie in Beispiel 4 beschrieben werden 24 Stunden lang 0,100 g Digoxigenin mit 0,220 g 2-(4'-Trimethyl-siloxyphenyl)-äthylisocyanat in 2 ml wasserfreiem Pyridin bei 80⁰C umgesetzt. Dann entfernt man dns Lösungsmittel unter vermindertem Druck und behandelt den Rückstand mit Methanol, um die Trimethylsilyl Schutzgruppe abzuspalten. Die Reinigung des Rohproduktes miti/'S präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystems ergibt 0,025 g der vorstehend genannten Verbindung (Rr = 0,57).

Das IR-Spektrum dieser Verbindung an KBr zeigt Absorptionsbanden bei: 3,00 (Hydroxyl), 3,48, 5,85,

O CO₂CH₃

Il I

OCNHCHCH,

HO

Unter Anwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie in Beispiel 4 beschrieben werden 4 Tage lang 0y 2 g Cortisol mit 0,297 g 2-lsocyanato-3-(4'-trimethyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester in 5 ml wasserfreiem Pyridin bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach dem Entferner, des Lösungsmittels unter vermindertem Druck löst man das rohe Reaktionsgemisch in Methanol, um die Schutzgruppe zu entfernen. Dann reinigt man das erhaltene Produkt mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 50 Prozent Chloroform enthaltenden Acetonlösungsmittelsystems. Man erhält 0,455 g der vorstehend genannten Verbindung (Rf = 0,64).

Das IR-Spektrum an KBr zeigt die folgenden Banden:

{breit, Carbonyl), 6,20,6,62,6,92,7.05.7,40,7,95,8,20,8,55, 9,05,9,72,10,10,10,50 und 12,00 μ.

Das NMR-Spektrum in Methanol^ zeigt Signale bei (5 = 7,88 (s, 1, aromatisches OH); 7,05 und 6,70 (A₂B₂-Quartett, 4, J - 8,2 Hz, Tyramin-3'-^'- 2'-,6'-Protonen); 5,83 (s, 1, Lacton-C^CH); 0,96 (s, 3,19-CH₃) und 0,85 ppm (s, 3,18-CH₃).

Beispiel 12

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 21-O-(N-[l-Carbomethoxy-2-(4'-hydroxyphenyl)-

äthy!]|-carbamyl-pregn-4-en-11/3,17«-diol-3,20-dion,
Trivialbezeichnung: 21-(Tyrosin methyl-ester)-carbamyl-cortisol:

— OH

3 00 (Hydroxyl), 3,48, 5,82 (breit. Carbonyl), 6,05 (Vinyicarbo.iyl), 6,65,6,98,735,7,90,8,20,9,05,9,48,10,60, 10,93,11,10,11,55,11,85,12,00,12,48,12,80 und 13,65 μ.

Das NMR-Spektrum in 50% CDCIrAceton-de zeigt Signale bei ό - 7,66 (s, 1, aromatisches OH); 7,05 und 6,75 (A₂B₂-Quartett, 4, J =8,4 Hz, Tyrosin-3'-,5'- und 2'-,6'-Protonen), 5,65 (s, 1, C = CH); 3,75 (s, 3, -OCH₃); 1,46 (s, 3,19-CH₃) und 0,93 ppm(s,3,18-CH₃).

Beispiel 13

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 17/?-O-(N-[l-Carbomethoxy-2-(4'-hydroxyphenyl)-äthyl])-carbamyl-androst-4-en-3-on, Trivialbezeichnung: 17-(Tyrosin-methylester)-carbamyl-testosteron:

OCNHCHCH:-
CO₂CH₃

-OH

In gleicher Weise wie in Beispiel 4 IaBt man 4 Tage lang 0,200 g Testosteron mit 0,280 g 2-Isocyanato-3-{4'-trimethyl-siloxyphenylj-propionsäure-methylester in 3 ml wasserfreiem Pyridin bei 50⁰C reagieren. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wird mit Methanol behandelt, um die Trimethylsilyl-Schutzgruppe abzuspalten. Nach der Reinigung mittels präparativer Dünnschicht-Chromatograplliie an Silicagel unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsy- es stems erhält man 0,063 g der vorstehend genannten Verbindung (Rf=0,68).

Dais IR-Spektrum an KBr zeigt die folgenden Banden:

239 (Hydroxyl), 3,40, 535 (breit, Carbonyl), 6,19 (Vinylcarbonyl), 6,68, 6,95, 7,42, 7,90, 830, 9.45, 11,55. 12,10,12^0 und 12^0 μ.

Das NMR-Spektnim (CDCl₃) zeigt Signale bei 0=7,26 (s, 1, aromatisches OH); 6,98 und 7,73 (A₂B2-Quartett, 4, 1=8,6 Hz, Tyrosin-3'-^'- und 2'-,6'-Protonen);573(s, 1. -C=CH);3.73 (s,3, -OCH₃); 1,16 (s, 3,19-CH₃) und 0,76 ppm (s, 3,18-CH₃).

Beispiel 14

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3ß-O-{N-[l -Carbomethoxy-2-(4'-hydroxyphenyI)-ft^dihdS^d^^J

lid, Trivialbezeichnung: 3-(Tyrosin-methylester)-carbamyl-digoxigenin:

HO-

-CH₂CHNHCO
CO₂CH₃

Unter Anwendung des in Beispiel 4 beschriebenen allgemeinen Verfahrens rührt man 3 Tage lang ein Gemisch von 0,100 g Digoxigenin und 0,085 g 2-l?ocy?n?.tO-^r'-(4'-trimethyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester in 1,5 ml wasserfreies Pyridin bei 70⁰C. Dann entfernt man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck und löst den Rückstand in Methanol, um die Trimethylsilyl-Schutzgruppe abzuspalten. Dann unterwirft man das Reaktionsgemische der präparativen Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 5 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystems. Man erhält 0,029 g der vorstehend genannten Verbindung (Rf = 0,60).

Das IR-Spektrum dieser Verbindung zeigt Banden bei: 3,00 (Hydroxyl), 3,45,5,80 (breit, Carbonyl), 6,20,6,65,

20

25 7,00, 7,38,7,95,8,20,9.55,9,80 und 12,00 μ.

Das NMR-Spektrum in 50% CDCIj-Aceton-de zeigt Signale bei 6 = 7,51 (s, 1, aromatisches OH); 7,03 und 6,79 (A₂B₃-Ouartett. 4. 1=8.6 Hz. Tyrosin-3'-,5'- und 2'-,6'-Protonen); 5,93 (s, 1, Lacton-C - CH); 3,75 (s. 3, OCH₃): 0,97 (s, 3.19-CH3) und 0,86 ppm (s. 3,18-CH3).

Beispiel 15

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3ß-0-[O-^-(3^-O-fN-[l-Carboinethoxy-2-(4'-hydroxyphenyl)]-äth-1-yll-carbamyl-digitoxosyl)-(l — 4)-O-0-di-

gitoxosyl-( 1 — 4)-p-digitoxos-1 -yl]-140-hydroxy-50-card-20(22)-enolid, Trivialbezeichnung: 15'-(Tyrosinmethylester)-carbamyl-digitoxin:

NH

OCHj

Unter Anwendung des in Beispiel 4 beschriebenen allgemeinen Verfahrens läßt man 5 Tage lang ein Gemisch von 0,200 g Digitoxin und 0,100 g 2-Isocyanato-3-(4'-trimethyl-stloxyphenyl)-propionsäure-methylester in 2£ ml wasserfreiem Pyridin bei 50° C reagieren. Das Lösungsmittel wird anschließend unter vermindertem Druck abgedampft, und das rohe Reaktionsgemisch mit Methanol behandelt, um die Schutzgruppe abzuspalten. Nach der Reinigung des Rohprodukts mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystetns erhält man 0,134 g der vorgenannten Verbindung (Rf=0,71).

Das IR-Spektrum zeigt Banden bei 235 (Hydroxyl), 3,42,5,85 (breit, Carbonyl), 6,20,6,65,635,735,7,95,83, 8,65.830,9,40 (breit), 11,60 und 12^0 u.

Das NMR-Spektrum (50% CDCh-Aceton-de) zeigt Signale bei <5 = 7,71 <s, 1, aromatisches OH); 633 und 6,63 (A₂B2-Quartett, 4, J=8,6 Hz, Tyrosin-3'-,5'- und 2'-,6'-Protonen), 5,78 (s, 1, Lacton-C=CH); 3,61 (s, 3, OCH₃); 0,83 (s, 3,19-CH3) und 0,73 ppm (s, 3,18-CH₃).

Beispiel 16

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3-O-{N-[l-Carbomethoxy-2-(4'-hydroxyphenyl)-äthyl]}-carbamyi-östra-1 3p(1 0>trien-i 7-on, Trivialbezeichnung: 3-(Tyrosin-methylester)-carbamyI-östron:

HO-

-CH₂CHNHCO
CO₂CHj

Unter Anwendung des in Beispiel 4 beschriebenen allgemeinen Verfahrens lüßt man 5 Tage lang ein Gemisch von 0,200 g östron und 0,"!5O g 2-Isocyanato-3-(4'-trimethyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester in 3 ml wasserfreiem Pyridin bei 60°C reagieren. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck löst man das erhaltene rohe Reaktionsgemisch in Methanol, um die Schutzgruppe abzuspalten. Nach der Reinigung mittels Dünnschichtchromatographie an Silicagel un'er Verwendung eines 5 Prozent Methanol enthaltend, η Chloroformlösungsmittelsystems erhält man 0,079 g der vorgenannten Verbindung (Rf = 0,68).

Das IR-Spektrum dieser Verbindurj zeigt Banden

bei: 3,00 (Hydroxyl), 3,42,5,87 (breit, Carbonyl), 6,23,6,65, 6,95, 7.35, 7,95, 8,22, 8,50, 9,53, 10,00, 10,95, 12,00 und 12,90 μ.

Das NMR-Spektrum in CDCIj zeigt Signale bei (5 = 6,83 (m, 7, aromatische Protonen); 3,66 (s, 3, OCH₃) und 0,81 ppm (s, 3.18-CH₃).

Beispiel 17

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3-O-|N-f1-Carbomethoxy-2-(4'-hydroxyphenyl]|-carbamyl-17/J-hydroxy-östra-1,3,5( 10)-trien, Trivialbezeichnung: -5-(Tyrosin-methylester)-carbamyl-östradiol:

HO-

y ν

-CH₂CHNHCO
CO₂CH₃

Zuerst wird die reaktionsfähige 170-Hydroxylgruppe mittels einer Trimethylsilyl-Gruppe (im folgenden abgekürzt als TMS-Gruppe) geschützt. Zu diesem Zweck rührt man eine Stunde lang ein Gemisch von 0,272 g 17j3-östradiol und 2 ml Trimethylsilyl-N.N-dimethyl-carbamat (Oberschuß) bei Raumtemperatur, um beide Hydroxylgruppen mit TMS-Gruppen zu schützen. Dann entfernt man nicht umgesetztes Trimethylsilyl-Ν,Ν-dimethyi-carbamat unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur.

Um eine 3-TMS-Gruppe selektiv abzuspalten, während die 17-TrviC-Gruppe intakt bleibt, wird dann das rohe Reaktionsgemisch in 40 ml 50 Prozent Methanol enthaltender Chloroformlösung gelöst. Die Lösung wird zwei Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die selektiv freigesetzte 3-Hydroxylgruppe wird dann wie folgt mittels NMR-Spektroskopie überprüft. Bei dem 3,17-disubstituierten-TMS-Derivat in Deuterochloroform als Lösungsmittel erscheinen zwei scharfe Singuletts von gleicher Intensität, die der 3- und 17-TMS-Gruppe entsprechen, bei 30 bzw. 38,6 Hz oberhalb des Feldes des Signals für die 18-Methylgruppe. So wie die Freisetzung fortschreitet, verschwindet das Signal bei 30Hz (3-TMS), während das Signal bei 38,6Hz unverändert bestehen bleibt Das Lösungsmittel wird dann unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur abgezogen, und man erhält 0,345 g der nur in der -17-Stdlung~ geschütztem ^^-Dihydroxy^TMS^efbindung.

Die Gesamtausbeute an der Zwischenverbindung wird dann mit 0,400 g 2-isocyanato-3-(4'-teit-butyi-dimethyl-siloxyphenyi)-propionsäure-methylester in 4 ml wasserfreiem Pyridin 5 Tage lang bei Raumtemperatur umsetzen gelassen. Anschließend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wird mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungssystems gereinigt, und man erhält 3-O-|N-[l-Carbomethoxy-2-(4'-tert.-butyl-dimethyl-siloxy-phenyl)-äthyl])-carbamyl-17ß- trimethylsiloxy-östra-l,3,5(10)-trien als reint Verbindung, Rf= 0,6.

Um beide Silyl-Schutzgruppen zu entfernen, rührt man ein Gemisch von 0,080 g dieser Verbindung, die in 5 ml Dioxan gelöst ist, 1 ml Methanol und 0,200 g

so Tetraäthylammoniumfluorid, das in 1 ml destilliertem Wasser gelöst ist, zwei Tage lang bei Raumtemperatur. Anschließend werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur abgezogen. Der erhaltene Feststoff wird mit destilliertem Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet Man erhält die reine Verbindung.

Das IR-Spektrum (Aufstrich) der reinen Verbindung zeigt Banden bei: 3,00 (Hydroxyl), 3,42, 530 (breit, Carbonyl), 63,6,68,635,7,42,8,22,9,45,11,50,12^0 und

Das NMR-Spektrum (Aceton-de) zeigt Signale bei ο=6^5 (m, 7, aromatische Protonen): 3,66 (s, 3, OCH₃) und 076 ppm (s, 3,18-CH₃J. ..__._ _

Beispiel 18

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von l-Carbomethoxy-2-(4'-hydroxyphenyI)]}-carb-

29 30

amyi-16«,17/3-dthydroxy-östra-l,3,5(10)-trien, TrivialbezeichnungiS-CIVrosin-methylesterJ-rarbamyl-östriol;

OH

HO-

-CH₂CHNHCO CO₂CH₃

Zuerst werden die reaktionsfähigen 16a- und 170-Hydroxylgruppen mit Trimethylsilyl-Gnippen geschützt Zu diesem Zweck verrührt man 0,288 g östriol mit 2 ml Trimethyl-silyl-N.N-dimethyl-carbamat (Oberschuß) zwei Stunden lang bei 50⁰C₁ um alle drei Hydroxylgruppen mit TMS-Gruppen zu schützen. Nicht umgesetztes Trimethyl-silyl-N.N-dimethyl-carbamat wird anschließend unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur abgezogen.

Um d^;e 3-TMS-Gruppe selektiv zu entfernen, während die 16- und 17-TMS-Gruppen intakt bleiben, wird das rohe Reaktionsgemisch in 40 ml einer 50 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösung gelöst Die Lösung wird dann 4 Stunden unter Rückfluß zum Sieden erhitzt Die selektive Freisetzung der 3-Hydroxylgruppe wird mittels NMR-Spektroskopie wir folgt überwacht: Bei dem 3,16,17-tri-substituierten TMS- Derivat in Deuterochloroform als Lösungsmittel erscheinen zwei scharfe Singuletts mit einem Intensitätsverhältnis von 1 :2, die der 3-TMS-Gruppe bzw. den beiden zusammenfallenden 16- und 17-TMS-Gruppen entsprechen, bei 30,6 bzw. 36,6 Hz oberhalb des Feldes des Signals der 18-Methylgruppe. So wie die Freisetzung fortschreitet verschwindet das Signal bei 30,6 Hz (3-TMS), während das Signal bei 36,6 Hz unverändert bestehen bleibt Anschließend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur entfernt und man erhält 0,434 g (I₁Ox 10-³ Mol) der nur in den 16- und 17-StelIungen durch TMS-Gruppen geschützten 3,16,17-Trihydroxy- Verbindung.

Die Gesamtausbeute von 0,434 g dieser Zwischenverbindung wird dann 5 Tage lang bei 64°C mit 1,47 g (5,Ox ΙΟ-³ Mol) 2-Isocyanato-3-(4'-tert.-butyl-dimethyl-

15

20 siloxyphenylj-propionsäure-methylester in 3 ml wasserfreiem Pyridin umsetzen gelassen. Anschließend entfernt man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck und reinigt das erhaltene Rohprodukt mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung von 10 Prozent Methanol enthaltendem Methylenchlorid-Lösungsmittelsystems. Man erhält 0,060 g 3-O-{N-[l-Carbomethoxy-2-(4'-tert-butyl-dimethyl-siloxyphenyl)-äthyl]}-carbamyl-16ocl7/?-bis-trimethyt-siloxy-östra-l,3,5(l0)-trien als reine Verbindung. Rr=0,5. Um die Silyl-Schutzgruppen zu entfernen, rührt man einen Tag lang bei Raumtemperatur das Gemisch von 0,060 g dieser Verbindung, die in 10 ml Dioxan gelöst ist, und 0,150 g Tetraäthylammoniumfluorid, das in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst ist Dann entfernt man die Lösungsmittel unt»r vermindertem Druck bei Raum temperatur, wäscht den erhaltenen Feststoff mit destilliertem Wasser und trocknet ihn unter vermindertem Druck. Man erhält die reine Verbindung.

Das IR-Spektrum dieser Verbindung (Aufstrich) zeigt Banden bei: 3,00 (Hydroxyl), 3,44,530, (breit, Carbonyl), 6,22, 6,68, 6.95, 737, 8,15, 8,52, 9,45, 1035, 12,15 und 12,75 μ.

Das NMR-Spektrum (Aceton-d₆) zeigt Signale bei <5=8,O0 (s, 1, aromatisches OH): 6,84 (m, 7, aromatische Protonen); 3,70 (s, 3, OCH₃) und 0,81 ppm(s,3,18-CH₃).

Beispiel 19

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 11 «-O-{N-[1 -Carbomethoxy-2-(4'-hydroxyphenyl)-äthyl]}-carbamyl-pregn-4-en-3,20-dion, Trivialbezeichnung: 1 l-(Tyrosin-methylester)-carbamyl-progesteron:

HO-

■ CHjCHNHCO CO₂CH₃

Unter Anwendung des in Beispiel 4 beschriebenen allgemeinen Verfahrens läßt man 0,166 g (5 χ ΙΟ-⁴ Mol) 1 l«-Hydroxy-progesteron drei Tage lang bei 60⁰C mit 0,200 g (6 χ 10-⁴ Mol) 2-Isocyanato-3-(4'-trimethyl-siloxy-phenyl)-propionsäure-methylester in 4 ml wasserfreiem Pyridin reagieren. Anschließend entfernt man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck und löst das Rohprodukt in Methanol, um die Trimethylsilyl-Gruppe abzuspalten. Nach der Reinigung mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystems erhält man 0,207 g der vorstehend genannten Verbindung

60

65 (Rf-0,71).

Das IR-Spektrum (KBr) zeigt Banden bei: 3,10 (Hydroxyl), 340, 5,80 (breit, Carbonyl), 6,00, 6,65, 6,98, 7,45.8,25,9^5 und 12,00 μ.

Das NMR-Spektrum (CDCI₃) zeigt Signale bei <} = 6,98 {m, 5, aromatische Protonen und OH); 5J6 (s, I₁ CH =C);3,78(s,3,OCH₃);2,11 (s,3,CH₃C = 0): 1,23(s,3. 19-CH₃) und 0,70 ppm (s, 3,18-CH₃).

Beispiel 20

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 6-(TME)-ureido-nicotin (Trivialbezeichnung), einem Nicotin-isocyanat-Addukt, das zur Durchführung des

Nikotin-Versuchs geeignet ist;

HO-

-CH₂CH-NHCNH COjCH₃

N CH₃

Ein Gemisch von 0,280 g (0,00158 Mol) 6-Amino-nicctin und 0,5CO g (0,0017 Mol) 2-Isocyanato-3-(4'-trimethyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester, der nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist wird in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt Anschließend entfernt man das Pyridin unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur, fügt 5 ml Methanol hinzu und rührt das Gemisch weitere 30 Minuten.

Anschließend wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck auf etwa 1 ml eingeengt und der präparativen Dünnschichtchromatographie an Silicagel mit den "!attenabmessungen 20 χ 20 χ 0,2 cm unter Verwendung eines 20 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystems unterworfen. Man erhält die vorstehend genannte Verbindung (Rf=0,23).

Das IR-Spektrum (KBr) zeigt Banden bei: 3,1, 3,2 (NH), 53 (Ester-Carbonyl), 538 (Harnstoff-Carbonyl), 6,2,63.6,5,6,7,82 und 12,00 μ.

Das UV-Spektrum in 0,1 -n NaOH zeigt Maxima bei λ = 286 nm (ε - 9540) und 237 nm (ε=35 100).

Das NMR-Spektrum in DMSO-ds zeigt Signale bei 0=936 (s, 1, NH); 8,80 (breit Dublett 1, NHCH): 8,41 (s, 1, OH); 7,77 (m, 2, 2- und 4-Protonen); 638 und 6,66 (A?B₂-Quartett 4, J = 9,0 Hz, Tyrosin-3'-,5'- und 2'-,6'-Protonen); 4,50 (s, 1, Tyrosin-CHCH₂); 3,61 (s, 3, CO₂CH₃) und 2,09 ppm (s,3. NCH₃).

Beispiel 21

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines anderen analogen Nicotin-isocyanat-Addukts, das zur Durchführung des Nikotin-Versuchs geeignet ist Die Verbindung hat die Trivialbezeichnung 2-(TME)-ureidonicotin.

50

55

Ein Gemisch von 0,290 g 2-Amino-nicotin und 0,500 g des 2- Isocyanato-3-(4'-trimethyl-siloxyphenyl)-pro pionsäuremethylesters, der nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, wird in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt

Man entfernt das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur, versetzt das Reaktionsgemisch mit Methanol und rührt es weitere 30 Minuten. Dann entfernt man das Methanol unter vermindertem Druck und kristallisiert das Rohprodukt aus Aceton um. Man erhält die in der Oberschrift genannte \ erbindung als Feststoff vom Fp. 205 bis 206° C (Zersetzung).

Diese Verbindung zeigt einen Laufwert Rr=0,77, wenn es der Dünnschichtchromatogrephie an Silicagel unter Verwendung eines 15 Prozent Methanol enthaltenden Methylenchlorid-Lösungsmittelsystems unterworfen wird.

Das UV-Spektrum in 0,1 -n NaOH zeigt Maxima bei Λ 286 nm (ε = 6440) und 237 nm (ε =21 800).

Das IR-Spektrum (KBr) zeigt Banden bei 33.3,5,5,75, (CO₂CH₃); 6,08,632,6,52,6,97,4,45,830,1134,12,45 und I23O μ.

Das NMR-Spektrum in DMSOd₆ zeigt Signale bei O-IO32 (s, 1, NH); 9,70 (breites Dublett, 1, J-8,0 Hz, NH-CHCH₂); 9,23 (s, 1, -OH); 8,00 (d, 1, J-43 Hz, 6-Proton); 7,55 (d, 1, J = 7,0Hz, 4-Proton); 7,01 und 6,68 (A₂BrQuartett, 4, J = 8,1 Hz Tyrosin-3'-^'- und 2'-,6'-Protonen); 631 (m. 1, 5-Proton); 4,50 (m, 1, Tyrosin-CH-CH₂); 3,64 (s, 3, CO₂CH₃); 235 (m 2, Tyrosin-CHCH₂) und 2,13 ppm (s,3, N-CH₃).

B ρ i s ρ i e I 22

Dieses Beispiel zeigt die Anwendung vorliegender Erfindung bei der Bestimmung des Digoxinspiegels im Blutserum mittels der Radioimmunoassay-Technik.

Standardpräparate und unbekannte Präparate von Digoxin werden in getrennten Proberöhrchen mit monojodiertem IS'-CTMEJ-carbamyl-digoxin-¹²⁵] (kurz als Digoxin-'^MJ bezeichnet), das gemäß dem Verfahren in Beispiel 5 hergestellt worden ist hinsichtlich einer begrenzten Anzahl von Bindungsstellen bei einem in Kaninchen erzeugten Digoxin-Antiserum miteinander in Konkurrenz treten gelassen. Nach der Inkubation wird das Reaktionsgemisch auf eine mit Styrol vernetztem Dextran (»Sephadex G-25«, fein, der Firma Pharmacia Fine Chemicals Company) gefüllte Säule aufgebracht, wo die Trennung des gebundenen Digoxins von dem freien Digoxin bewirkt wird. Die Immunreaktionen können im Gleichgewicht wie folgt dargestellt werden:

Digoxin-¹²⁵] + Serum-Digoxin + Anti-Digoxin (Anti-Digoxin · Digoxin-¹²⁵J)

+ (Anti-Digoxin · Serum-Digoxin) + Digoxin-¹ "J + Digoxin

Das vorstehend gebildete Inkubationsgemisch wird auf die vorstehend genannte Säule aufgebracht. 1.7 ml-Anteile des Eluats werden so aufgebracht, daß die markierten und die nicht markierten Antigene absorbiert und die markierten und die nicht markierten Komplexe eluiert werden, und zwar mit dem folgenden

Ergebnis:

im Eluat: (,.nti-Digoxin-Digoxin-^I25J) +(Anti-Digoxin) · Digoxin auf der Säule; Digoxin-⁾²⁵J +Digoxin

Bei dem nachstehenden, im einzelnen beschriebenen Verfahren werden übliche Prototypen von einem Pipettenkarussel und einem automatischen Zentrifugalanalysator im Laboratoriumsmaßstab verwendet Es wird eine Digoxin-Vorratslösung durch Auflösen von 0,010 g Digoxin in 50 ml 95prozentigem Äthanol hergestellt 1 ml-Anteile werden in gefrorenem Zustand aufbewahrt Ein Zwischenprodukt-Standard wird dadurch erhalten, daß man 1 ml der Digoxin-Vorratslö- is sung mit 100 ml Phosphatpufferlösung verdünnt Die Phosphatpufferlösung wird durch Auflösen von 1,392 g Dikaliumhydrogenphosphat, 0,276 g Natriumdihydrogenphosphat und 8,76 g Natriumchlorid in 750 ml destilliertem, voll-entsalztem Wasser, Einstellen der Lösung auf pJ-1 7,4 und Verdünnen auf 800 ml mit destilliertem, voü-entsalztem Wasser hergestellt. Der Zwischenproduktstandard enthält 2,0μ§/ΐη1. Ein Arbeitsstandard, der durch Zugeben von 100 μΐ des Zwischenproduktstandards zu 9,9 ml Phosphatpuffer hergestellt worden ist, enthält 20 ng/ml. Die Vorratslösung und die Zwischenproduktlösung können bis zur Verwendung in gefrorenem Zustand aufbewahrt werden. Es werden Standardlösungen hergestellt die 20,0, 10,0, 5,0, 3,0, 2,0, 1,0, 0,4 und 0,0 ng/ml enthalten. Dann werden 250 μΙ-AnteiIe der Standardverbindungen und der unbekannten Verbindungen in 0,5 ml-Probeschälchen eingebracht die dann in das Pipettenkarussel eingesetzt werden.

Die Vorratslösung des Antiserums wird durch Verdünnen von 0,5 ml eines Kaninri.en-Antiserums mit dem Titer 1 :2300 auf 10,0 ml mittels einer 2prozentigen Rindersenimalbumins (RSA)/phosphatgepufferten Kochsalzpufferlösung (PBS) hergestellt

Die schließliche Arbeitsverdünnung (Titer) beträgt demzufolge 1 :46 000, von der je Probe 200 μΙ verwendet werden. Dann werden Reagens-Schiffchen (15 ml) zur Beschickung des Pipettiergeräts in das Pipettiergerät eingesetzt und mit 10 ml Antiserum-Reagens, 2 ml des nach Beispiel 5 hergestellten Digoxin-^I25| und mit 5 ml PBS-Lösung beschickt. Das Volumen der Probe wird so eingestellt daß 50 μΙ auslaufen. Das Volumen der Probe plus Lösung wird so eingestellt, daß 99 μΙ (50 μΙ der Probe plus 49 μΙ der PBS-Lösung) auslaufen. Das Pipettiergerät wird so eingestellt, daß 200 μΙ des Antiserums-Reagens und 50 μΙ des radioaktiven Antigens Digoxin-^l25J auslaufen. Eine 30 Proben fassende Übertragungsscheibe wird in der Mitte des Karussels angeordnet. Während die Übertragungsscheibe mit dem Pipettiergerät beschickt wird, werden 30 Prüfröhrchen mit den Abmessungen 15 κ 126 mm (Kimble 45042) in den Prüfröhrchenring des Inkubators/ Separators eingesetzt Dann wird eine ausreichende Anzahl von Säulen, die mit dem vorerwähnten mit Styrol vernetzten Dextran gefüllt sind, in die Prüfröhrchen eingesetzt, so daß bei dem Ansatz die Anzahl der Standardproben derjenigen der unbekannten Proben, gewöhnlich doppelte Ansätze, entsprechen. Das System wird mit der PBS-Pufferlösung gefüllt, und der Inkubator wird 15 Minuten bebrütet. Das Elutionsvolumen wird auf 1,7 ml festgesetzt.

Wenn der Umlauf des Pipettiergeräts beendet ist, so daß Antiserum, Standardverbindungen, unbekannte Verbindungen und radioaktives Digoxin"'^HJ in die inneren und äußeren Sektionen der Cbertragungsscheibe ausgelaufen sind, werden die letztgenannten aus dem Inkubator/Separator vorsichtig entfernt, so daß die unterschiedlichen Lösungen in ihren betreffenden Abteilen verbleiben. Dann wird der Inkubator/Separator eingeschaltet und etwa 16 Minuten laufen gelassen, und zwar 15 Minuten für die Inkubation und eine Minute für die Eluierung durch die mit dem Styrol vernetzten Dextran-gefüllten Säulen, Die Rotation währejd der Inkubation beträgt etwa 100 Umdrehungen je Minute, wobei die 200 μΐ des Antiserums von den jeweiligen inneren Teilen der Übertragungsscheibe in die jeweiligen äußeren Teile der Übertragungsscheibe überführt werden, in denen jeweils 50 μΐ der unbekannten Lösung cder der Standard-Antigenlösung mittels des Pipettiergeräts eingebracht worden sind. Nach 15minütiger Inkubation wird die Rotation zum Eluieren und Spülen auf 200 Upm gesteigert Nicht reagierter Antikörper, Serum und Antigen-Antikörper-Komplex werden durch die feinen Teilchen der auf Polystyrol basierenden Perlchen gewaschen und auf den Böden der Prüfröhrchen angesammelt während sich das markierte und nicht markierte freie Antigen durch Diffusion in die Poren der Perlchen langsamer bewegt und in den Säulen verbleibt

Ein Strahlungsintensitätsmesser, der drei von den 30 Röhrchen gleichzeitig in einer Minute zählt und so konstruiert ist daß nur der Eluatteil am Boden der Prüfröhrchen in den Strahlungsintensitätsmesser reicht wird dann zur Zählung aller Proben eingesetzt Das hintereinander erfolgende Zählen der 30 Röhrchen erfordert somit etwa 12 Minuten. Ein kleiner Computer mit Kopierfähigkeit druckt dann die Daten nach Beendigung des Umlaufs durch die 30 Lagen (20mal bei drei Ablesungen gleichzeitig) aus. Der Druck liefert im Effekt die Dosisreiz-Kurve für den Ansatz des Antiserums, da üblicherweise 18 der 30 Röhrchen mit Standardlösungen und 12 mit unbekannten Lösungen gefüllt sind. In charakteristischer Wsise laufen 4 bis 6 unbekannte Verbindungen als Doppelansätze. Der Mittelwerte von 1,4 ±0,4 ng/ml mit einem Bereich von 0,8 bis 2,4 ng/ml Digoxin ist bei nicht-toxischen Patienten gefunden worden. Der Mittelwert bei toxischen Patienten ist zu 3,3 ± 1,5 ng/ml mit einem Bereich von 2,1 bis 8,7 ng/ml gefunden worden.

Eine typische Standardkurve ist in der anliegenden Zeichnung zu sehen. Daraus ist ersichtlich, daß nach vorliegender Erfindung eine bessere adäquate Empfindlichkeit erreicht wirtf.

Beispiel 23

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von Derivaten vorliegender Erfindung bei der Untersuchung von Cortisolspiegeln im Blutserum unter Verwendung der Technik des Radioimmunoassays.

Cortisolspiegel in 0,2 ml Serum werden nach einer Vorbehandlung durch Extrahieren des Cortisols aus nichtspezifischen Bindeproteinen mittels 0,8 ml einer 11 Prozent Methanol enthaltenden 0,05-m Barbital-Pufferlösung vom pH 8,6 und durch 30minütiges Erhitzen auf 60⁸C bestimmt Es werden die gleiche Vorrichtung und die gleichen Eluierungssäulen wie in Beispiel 22 verwendet, doch wird das Eluierungsvolumen auf 1,4 ml herabgesetzt. Die anderen verwendeten Reagentien sind eine Gelatine-Barbital-Pufferlösung, die aus 0,1 Prozent Gelatine in einer 0,05-m Natriumbarbital-Pufferlösung besteht, Cortisol und Cortisol-Antiserum aus

Schafen (S-I H), tos in einer Verdünnung von I; 16 000 in O,lprozentiger Gelatine-Barbital-Pufferlösung vom pH 8,6 und einer 0,05-Molarität vorliegt Der Arbeitsstandard von Cortisol beträgt 16 ng/50 μΐ. Die Volumen von Antiserum und Probe betragen wiederum 200 μΐ und 50 μ]. Die Inkubationszeit wird auf 30 Minuten und die Separationszeit auf 1,5 Minuten erhöht Die Probe des radioaktiv markierten 2l-{TME)-carbamyl-cortisol-¹²⁵J (1,5 μΟϊ/0,5 ml Äthanol) wird mit 0,1 prozentiger Gelatine-Barbital-Pufferlösung verdünnt so daß man 18 000 bis 20000cpm erhalt Im Markierungsgerät Findet man ein Verhältnis von 50; 50 gebundene zu freie Verbindung bei einer weiteren Verdünnung von J : 10, d, h, etwa 1800 cpm unter Versuchsbedingungen.

In der gleichen Weise liefert radioaktiv markiertes 21-(Tyramin)-carbamyl-cortisol-'²⁵J ein Verhältnis von 1:2 von gebundener zu freier Verbindung bei 895 cpm (Zählungen je Minute).

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   1, Isocyanat-Reaktionsprodukt aus a) einer Isocyanatverbindung der allgemeinen Formeln (I) oder (Π)

   (R)₃SiO

   CH₂CH₂N=C=O (D

   CO₂CH₃

   -CH₂CHN=C=O OD

   in der R ein bis zu 10 Kohlenstoffateme aufweisender Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Araflcylrest ist. und

   b) einer Substanz der Gruppe Digoxin, Testosteron, Cortisol, östron, Digoxigenin, Digitoxin, 170-östradiol, östriol, 11«-Hydroxyprogesteron und 2- oder 6-Amino-nicotin, wobei östron, Digoxigenin, 17/7-östradiol und Östriol jeweils in der 3-SteIlung, Testosterm in der 17-Stellung, Cortisol in der 21-Stellung, 1 1«-Hydroxyprogesteron in der 11-Stellung, Digoxin und Digitoxin jeweils in der 15'-Stellung und gegebenenfalls in der 12-S'e!lung und 2- und 6-Amino-nicotin jeweils in der Aminogruppe durch die Isocyanatverbindung substituiert iind, wobei nach der Bildung des Reaktior-sprodukts die (R)₃Si-Gruppe durch ein Wasse Stoffatom ersetzt worden ist, und deren mit radioaktivem Jod im Phenylkern des Isocyanatrestes jodierte Derivate.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Isocyanat-Reaktionsprodukte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substanz der Gruppe Digoxin, Testosteron, Cortisol, Östron, Digoxigenin, Digitoxin, 17/?-östradiol, östriol, 110-Hydroxyprogesteron und 2- oder 6-Amino-nicotin, mit einer Isocyanatverbindung der allgemeinen Formeln (I) oder(Il)

   (R)jSiO

   -CH₂CH₂N = C = O (D

   (R)₃SiO

   CO₂CH₃

   iO—/Q)-CH₂CHN=-C = O

   OD

   in denen R ein bis zu 10 Kohlenstoff atome aufweisender Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Aralkylrest ist, in an sich bekannter Weise bei einer geeigneten Temperatur oder unter photochemischen Bedingungen umsetzt, die (R)₃Si-Gruppe abspaltet, das Reaktionsprodukt isoliert und gegebenenfalls mit einer radioaktives Jod enthaltenden Verbindung jodiert. 3. Verwendung der mit radioaktivem Jod im Phenylkem des Isocyanatrestes jodierten Verbindungen nach Anspruch 1, bei der kompetittven Radioimmunanalyse,