DE2732388A1

DE2732388A1 - Jodierbare gallensalze

Info

Publication number: DE2732388A1
Application number: DE19772732388
Authority: DE
Inventors: Jerry Gorton Spenney
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-09-02
Filing date: 1977-07-18
Publication date: 1978-05-11
Also published as: CA1102306A; US4207308A; JPS5334766A

Description

Patentanwälte

Dr.-lng. Walter Abi«

Dr Dieter F. Morf

Dipl.-Fhys. M. Grilschneder

8Münch«iSb.Pie>«enauerstr.28

18. JULI 1977

P-619

JERRY GORTON SPENNEY Birmingham, Alabama 35223, V.St.A.

Jodierbare Gallensalze

ÖU9819/0554

Die Erfindung betrifft eine neue Gruppe von Gallensalzderivaten, die die gemeinsame Eigenschaft besitzen, daß sie unter Verwendung entweder stabiler oder instabiler Isotopen des Jod jodiert werden können. Die Erfindung betrifft weiterhin mit radioaktivem Jod umgesetzte Gallensalzderivate, ihre Herstellung und ihre Reinigung und ihre Anwendung bei Gallensalz-Radioimmunoassays, hepatitischen Aufnahme- und Exkretionsmessungen und hepatitischer Szintillationsgraphie.

In verschiedenen Publikationen mehrerer Laboratorien wurde auf die potentielle Empfindlichkeit von Serumgallensalzmessungen bei der Feststellung von Leberkrankheiten hingewiesen. Wegen der technischen Schwierigkeiten sind diese Analysen auf einige wenige Laboratorien beschränkt.

Die Analyse bzw. der Nachweis der gesamten und einzelnen Gallensalze im Serum durch Dünnschicht- oder Gas/Flüssigkeits-Chromatographie hat in der klinischen Forschung mehrere Jahre lang nur beschränkt Verwendung gefunden. Kürzlich wurde durch die Entwicklung von fluorimetrischen Analysen unter Verwendung von 3-a- und 7-a-Hydroxysteroiddehydrogenaseenzymen aus Mikroorganismen die Empfindlichkeit auf Werte erhöht, bei denen Serumanalysen sinnvoll erscheinen. Seit kurzem ist ein gereinigtes Enzym (Sterognost 3-oc) verfügbar, wodurch die Spezifizität dieses Analyseverfahrens weiter erhöht werden kann. Trotzdem ist vor der Analyse noch eine Extraktion erforderlich.

Seit kurzem wurde durch die Radioimmunoassays (Radioimmunoanalysen) verschiedener Gallensalze das Analysenverfahren vereinfacht, und die Messung der einzelnen Gallensalze in dem Serum von normalen Einzelpersonen wurde möglich. Diese Radioimmunoanalysen bzw. -assays gründen sich auf titrierte Gallensalze oder "s (im Falle sulfatierter Gallensalze). Diese Verbindungen sind ß-eraittierende Leitisotope bzw. Iso-

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topenlndikatoren. Eine weite klinische Verwendung hat bis jetzt noch nicht stattgefunden, vielleicht da (a) die klinischen Gallensalzmessungen unsichere Werte ergeben; (b) die erforderlichen Vorrichtungen (Flüssigkeitsszintillationszähler) für RIA auf Tritiumgrundlage schwierig, teuer und nicht leicht verfügbar sind; (c) die hohen Kosten für eine Analyse auf Tritiumgrundlage (Anlage, Szintillationsfluor- und Zählampullen) für viele klinische Laboratorien nicht gerechtfertigt sind; und (d) die niedrige spezifische Aktivität der Leitisotopen und die niedrigen Antikörpertiter die Antikörperlieferung unsicher machen. Die Unsicherheit der klinischen Werte für die Serumgailensalzmessungen werden geklärt werden und klinische Versuche unter Verwendung dieser Analysenverfahren werden in der Zukunft häufiger verwendet werden. Man hat bereits gezeigt, daß Serumgailensalzmessungen der früheste Indikator für einen Rückfall der chronischen aktiven Hepatitis sind. Die restlichen Schwierigkeiten würden zum großen Teil durch einen hochspezifi-

125 sehen Aktivitätsisotopenindikator, wie J, ein γ-emittierendes Radionucleotid, beseitigt werden. Die üblichen Gallensalze besitzen jedoch keine Stelle, die jodiert werden kann.

Verschiedene Verbindungen, die keine Stelle für die Jodierung besitzen - Adrenalsteroide, Testosteron, Estrogene und cyclische Nucleotide -, wurden chemisch durch Addition von Histamin, Tyrosin, Tyrosinmethylester oder Pheny!propionsäure, die jodiert werden können, modifiziert·

125 Diese Derivate haben Immunoassays auf der Grundlage von J für diese Verbindungen ermöglicht.

Die spezifische Aktivität von radiojodierten Gallensalzen würde sich 2000 Ci/mMol nähern im Vergleich zu 3,5 Ci/mMol für ^H-Isotopenindikatoren. Die erhöhte spezifische Aktivität würde eine erhöhte Empfindlichkeit und einen erhöhten Antikörpertiter ermöglichen, und quantitative Auswertungen könn-

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ten unter Verwendung eines γ-Spektrometers anstelle eines Flüssigkeitsszintillationsspektrometers durchgeführt werden. Weiterhin würde das y-eraittierende Derivat, wenn es physiologisch aktiv ist, nützlich für physiologische Transportoder Absorptionsuntersuchungen der Gallensalze verwendet werden können. Die Blutclearance der Gallensalze und die hepatitische Aufnahme und Exkretion könnten gemessen werden. Hepatitische, biliäre und intestinale Szintigraphie bzw. Szintillationsgraphie oder die quantitative Szintigraphie bzw. Szintillationsgraphie könnten durchgeführt werden und die Absorptionsfunktion des Ileums könnte quantitativ bestimmt werden. Die üblichen Gallensalze besitzen jedoch keine Gruppe, die leicht jodiert werden kann.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Gallensalzderivate zu schaffen, die leicht jodiert werden können.

Erfindungsgemäß sollen radiojodierte bzw. mit radioaktivem Jod umgesetzte Gallensalzderivate geschaffen werden. Der Einfachheit halber wird zur Beschreibung dieser Verbindungen im folgenden der Ausdruck "radiojodiert" verwendet.

Erfindungsgemäß sollen Verfahren zur Reinigung dieser Derivate zur Verfügung gestellt werden.

Erfindungsgemäß sollen weiterhin radiojodierte Gallensalzderivate bei Radioimmunoassays bzw. -analysen, bei der Messung der hepatitischen Aufnahme und Exkretion und bei der Szintillationsgraphie verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung sind Gallensäuren und ihre Aminosäure und Diaminderivate bzw. konjugierten Verbindungen bzw. Konjugate mit jodierbaren Gruppen. Insbesondere werden als Gallensäuren und konjugierte Verbindungen Cholsäure,

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Chenodeoxycholsäure, Deoxycholsäure und Lithocholsäure und ihre Glycin- und Taurinkonjugate, gebunden mit einer Peptid(Amid)-Bindung, wie auch ihre Konjugate mit anderen Aminosäuren und Diaminen der folgenden Formel

angesehen, in der R₁, R₂ und R, entweder für -OH oder -H stehen und innerhalb der Grenzen der folgenden Tabelle liegen:

	^R1	R₂	^R3
Cho1säure	-OH	-OH	-OH
Chenodeoxycholsäure	-OH	-OH	-H
Deoxycholsäure	-OH	-H	-OH
Lithocholsäure	-OH	-H	-H

und in der R^ -OH oder Glycin oder Taurin, gebunden mit einer Amid(Peptid)-Bindung, oder eine andere Aminosäure oder ein Diamin, auf ähnliche Weise gebunden, bedeutet.

Beispiele für jodierbare Gruppen sind Tyrosin- und Tyrosinestergruppen, Histidin- und Histidinestergruppen, Tyramin-, Histamin-, Pheny!propionsäure-, Phenylalanin- und Phenylalaninestergruppen und Tryptophan- und Tryptophanestergruppen.

Diese Gruppen können an die C^-Carboxylgruppe des Gallensalzes oder die Carboxylgruppe der glycinkonjugierten Gallensalze gebunden sein. Zusätzlich können sie entweder direkt oder über eine ÜberbrUckungsgruppe, wie Bernsteinsäure oder andere Dicarbonsäuren, an die 3-oc-HydroxyIgruppe des Gallensalzes gebunden sein.

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Beispiele für die zuvor beschriebenen Verbindungen sind:

(a) Derivate unter Verwendung eines Diamins: R.

worin η 2 oder mehr bedeutet und R₁₀ Tyrosin, Histidin,Phenylalanin, Tryptophan oder Phenylpropionsäure bedeutet, wobei die Aminogruppe (im Falle der ersten 4) primär, sekundär oder tertiär ist und R₁₀ in einer Amidbindung gebunden ist;

(b) Derivate an der C-^-Carboxylgruppe der Gallensalze

Steroidringe NHCHpCH., d.Gallensalze ^ ^

worin R,- Tyrosin, einen Tyrosinester, Histidin, einen Histidinester, Phenylalanin, einen Phenylalaninester, Tryptophan, einen Tryptophanester, Tyramin oder Histamin, gebunden an eine Amidbindunc, bedeutet. Lithocholylhistamin und Cholyltyrosin sind spezifische Beispiele;

(c) Derivate an der Carboxylgruppe von Glycinkonjugaten oder Gallensalzen, die mit anderen Aminosäuren konju-

ORIGINAL INSPECTED

giert sind. Glycinkonjugat wird als Beispiel verwendet.

HHOH₂- C=O

⁸S

Rc besitzt die oben angegebene Bedeutung und ist auf ähnliche Weise gebunden. Cholylglycylhistamin und Deoxycholylglycylhistidin sind spezifische Beispiele;

(d) Derivate an der 3-cc-Hydroxy!gruppe.

Rg bedeutet -OH oder einen Alkohol, gebunden über eine Ester- bindung_foder oder einen Glycinester (z.B. Methylester) oder ein Taurin oder einen Ester einer anderen Aminocarbonsäure, wobei die Aminosäuren über eine Amidbindung gebunden sind. Ry bedeutet -(CH₂) -» worin 1 oder mehr bedeutet. R₈ besitzt die gleiche Bedeutung wie R₁-;

(e) zusätzliche Derivate an der 3-α-Hydroxylgruppe

Rq besitzt die gleiche Bedeutung wie Rc, ausgenommen Hist amin und Tyramin, und ist an die Esterbindung gebunden, wobei

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die Aminogruppe primär, sekundär oder tertiär sein kann.

Die Ester der obigen, beispielhaft aufgeführten Verbindungen sind typischerweise Alkylester, wie die Methylester.

Die oben beschriebenen Verbindungen, worin die jodierbare Gruppe an die Amidbindung gebunden ist, können nach dem Carbodiimidverfahren oder nach dem N-Hydroxysuccinimidaktivierten Ester-Verfahren hergestellt werden. Die Verbindungen, worin die jodierbare Gruppe in einer Esterbindung gebunden ist, können nach Standardveresterungsverfahren, wie Erhitzen mit wasserfreien Säuren, erzeugt werden. Die Jodierung erfolgt nach dem Chloramin-T-Verfahren oder nach anderen Standardverfahren. Die Reinigung erfolgt durch Extraktion und durch Silikagelchromatographie.

Die oben beschriebenen Gallensalzderivate sind bei dem Radioimmunoassay von Gallensalzen, bei physiologischen Forschungen und klinischen Untersuchungen, wie den Gallensalzclearanceraten, bei der Messung der Absorptions des Ileums, der hepatitischen Aufnahme und Exkretion, bei der hepatitischen, biliären und intestinalen Szintillationsgraphie und bei der quantitativen Szintillationsgraphie nützlich.

Die neuen Verbindungen mit Amingruppen können in Form der Säureadditionssalze kristallisiert und gelagert werden, wie als Hydrochloride und Phosphate. Die neuen Verbindungen, die freie Carboxyl- und Sulfonsäuregruppen enthalten, können auf ähnliche Weise als Basenadditionssalze, wie Natrium-, Kalium-, Ammonium- oder Dicyclohexylaminsalze, isoliert werden.

Besonders bevorzugt ist die Verbindung Cholylglycylhistamin, die in ihrer Hydrochloridfonn die folgende Struktur besitzt:

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Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der radiojodierten

125 Derivate ist die Jodierung unter Verwendung von Na J und Chloramin-T. Die Produkte sind größtenteils monojodiert, können jedoch etwas dijodierte Produkte enthalten.

Obgleich das bevorzugte Jodisotop J ist, können ^J und ^J ebenfalls verwendet werden. J ist, obgleich es eine

kürzere Halbwertszeit und ein weniger günstiges Energiespek-

125

trum als J besitzt, nützlich, wenn eine Hochenergiebestrahlung erforderlich ist, wie bei der Szintillationsgraphie.

^JZ besitzt ebenfalls bei der Szintillationsgraphie Vorteile.

Bei der Durchführung der Umsetzung liegen die molaren Verhältnisse von Gallensäurekonjugat zu NaJ im Bereich von 1:1

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bis 100:1 oder noch höher. Bei ^JZ werden 1 bis 2 mCi (0,5 bis 1 nMol) Na J und etwa 35/Ug Chloramin-T verwendet, und die Umsetzung wird stark auf einen pH-Wert von 7,4 unter Verwendung von 0,5 M Na - oder K -Phosphatpuffer gepuffert. Die Umsetzung wird initiiert, indem man das Chloramin-T zugibt und etwa 30 bis 60 see unter Rühren umsetzt. Die Umsetzung wird beendigt, indem man Natriummetabisulfit, typischerweise etwa 250/Ug, zugibt. Das Reaktionsgemisch wird auf etwa 2 ml mit 10 mMol des oben beschriebenen Phosphatpuffers verdünnt.

Die bevorzugte erste Stufe bei der Reinigung ist die Chromatographie an einem Harz der Art, wie es bei derartigen Ver-

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fahren verwendet wird. Chromatographische Materialien auf der Grundlage von Polystyrol allgemein einschließlich solcher der Styrol-Divinylbenzol-Copolymerart, wie Amberlite XAD-2 und Dowex-Harze, können verwendet werden, wie auch Harze des Acrylpolymertyps, wie Amberlite XAD-7. Ionenaustauschharze der Dowex- oder Amberlite-Reihen oder Cellulosereihen können verwendet werden. Die nichtumgesetzte Gallensäure und das jodierte Konjugat werden an dem Harz adsorbiert, während freies Jod und andere Reaktionsprodukte durch Wascheider Säule mit 10 mM Phosphatpuffer, geeigneterweise pH 7,^, und Wasser entfernt werden. Die Fraktionen werden gesammelt und in einem y-Spektrometer gezählt. Wenn der freie Radiojod-Peak eluiert ist, wird das Gemisch aus nichtumgesetztem und jodiertem Konjugiert eluiert, bevorzugt mit Methanol oder Äthanol, obgleich auch andere Lösungsmittel, wie Aceton, Äther oder Äthylacetat, verwendet werden können. Aliquote von jeder eluierten Fraktion werden in einem γ-Spektrometer gezählt, und die Fraktionen, die das nichtumgesetzte Material plus das jodierte Konjugat enthalten, werden vereinigt. Im Falle von ^ J kann dieses vereinigte Material für die Szintillationsgraphie verwendet werden.

Die Verwendung molarer Anteile von Konjugat zu NaJ im Bereich von 50:1 bis 100:1 und eine Reaktionszeit von 60 see ergibt eine Aufnahme von 70% bis fast 100% Jod. Durch diese ausgezeichnete Aufnahme bzw. Einarbeitung ist der Preis, der für die spezifische Aktivität gezahlt werden muß, niedrig. Wo-

'IOC

hingegen (im Falle von Cholylglycyl- J-histamin) die spezifische Aktivität des als Ausgangsmaterial verwendeten Na¹²⁵J 2125 Ci/mMol beträgt, die spezifische Aktivität des CGH + CGH¹²⁵J beträgt zu diesem Zeitpunkt etwa 21,25 Ci/mMol. Material mit dieser spezifischen Aktivität ist für die Szintillationsgraphie nützlich, insbesondere wenn J verwendet wird, bevor es jedoch optimal für Radioimmunoassays verwendet werden kann, ist es wichtig, daß es weiter gereinigt wird.

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Zur Herstellung eines im wesentlichen trägerfreien Produkts (frei von nichtmarkiertem Gallensäurekonjugat) wird die vereinigte Charge aus nichtumgesetztem Material plus jodiertem Material, die wie oben beschrieben erhalten wurde, durch Verdampfen, geeigneterweise auf 100 /ul oder weniger, mit einem Strom aus Luft oder Inertgas (Stickstoff, Argon, Helium, Xenon usw.) konzentriert. Das konzentrierte Material wird dünnschichtchromatographisch untersucht, wobei bevorzugt Silikagel-Chromatographieplatten verwendet werden. Das Material wird durch Aufstreichen oder Auftragen eines Fleckens in üblicher Weise angewendet. Es wird dann zur Entfernung des Lösungsmittels an der Luft getrocknet und in einem Lösungsmittel entwickelt. Es wurde gefunden, daß bei jodierten, kationischen Gallensäurekonjugaten die Lösungsmittel, die eine Stickstoffbase enthalten, besonders gute Trennungen ergeben. Als Stickstoffbase wird bevorzugt Triäthylamin verwendet, obgleich andere primäre, sekundäre und tertiäre Amine wie auch Ammoniumhydroxid und Hydroxylamin verwendet werden können. Für diesen Zweck geeignete Amine sind zusätzlich zu Triäthylamin andere Alkylamine, wie Trimethylamin, Tripropylamin und Tributylamin; Cycloalkylamine, wie Dicyclohexylamin; Arylamine, wie Anilin; und heterocyclische Amine, wie Pyridin. Zusätzlich zu der Stickstoffbase sollte das Lösungsmittel geeigneterweise einen niedrigen Alkylester einer niedrigen Alkansäure enthalten, wobei die niedrige Alkylgruppe als solche definiert wird, die 1 bis 6 Kohlenstoff atome enthält, und der Ester insgesamt bis zu 8 Kohlenstoff atome enthält. Andere Komponenten des Lösungsmittels können z.B. Benzol oder seine niedrigen Homologen, niedriges Alkanol, niedriges Alkanon und ein Di-niedrig-alkyläther sein, wobei der Alkylmolekülteil die zuvor gegebene Definition besitzt und im Falle der Äther gleich oder unterschiedlich sein kann. Die bevorzugten Bereiche für die Anteile an diesen Verbindungen sind: Stickstoffbase 5 bis 20; niedrig-Alkylester von niedrig-Alkansäure 20 bis 80%;

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die anderen Komponenten, allein oder im Gemisch, 0 bis 75%. Ein Lösungsmittel, das eine der oben erwähnten Stickstoffbasen, ein niedriges Alkanol, Äthylacetat und Benzol enthält, ist besonders geeignet. Ein gut geeignetes Lösungsmittel enthält 25 Vol-Teile niedriges Alkanol (bevorzugt Methanol oder Äthanol), 10 Vol-Teile Stickstoffbase (bevorzugt Triäthylamin) und 75 Vol-Teile eines Gemisches aus Äthylacetat und Benzol, wobei jeder der Bestandteile in einer Menge im Bereich von 25 bis 50 Vol-Teilen verwendet wird.

Im Falle von jodierten anionischen Gallensäurekonjugaten (z.B. solche, die eine freie Säuregruppe enthalten) kann ein saures Lösungsmittelsystem verwendet werden. Ein solches System kann ähnlich wie das sein, das oben für die Verwendung von kationischen Gallensäurekonjugaten beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß eine schwache Säure, wie Essigsäure, anstelle der Stickstoffbase verwendet wird. Ein Lösungsmittel, das 40 Vol-tf Äthylacetat, 40 Vol-% Benzol, 10 Vol-# Methan und 10 Vol-% Essigsäure enthält, ist besonders bevorzugt. Bei Verfahren unter Verwendung dieser Systeme migriert eine Bande aus nichtjodiertem Konjugat an eine Stelle hinter der Bande des jodierten Konjugats.

Als Materialien für die Dünnschichtchromatographie können, zusätzlich zu Silikagel, Aluminiumoxid, Kieselgur und andere Beschichtungsmaterialien, wie sie auf den Seiten 29-34 von Stahl, "Thin Layer Chromatography" (Springer Verlag, New York, 1965), beschrieben werden, verwendet werden. Das Lösungsmittel kann, abhängig von der verwendeten Vorrichtung, aufsteigend, absteigend oder horizontal, wie es an sich bekannt ist und von Stahl beschrieben wird, wandern, obgleich das aufsteigende Verfahren bevorzugt ist. In jedem Fall wandert die markierte Verbindung zu einer Stelle der Chromatographieplatte, die sich von der der nichtmarkierten Verbindung unterscheidet.

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Zur Erleichterung der Feststellung der radiomarkierten Verbindung auf der Chromatographieplatte kann das folgende Verfahren (unter Verwendung von z.B. J-CGH) verwendet werden.

Das konzentrierte Material wird längs der Koordinate einer Silikagelchromatographieplatte unter Verwendung einer feinen Glaskapillare ausgestrichen. Leitspuren bzw. -bahnen werden auf jeder Seite der Platte für nichtmarkiertes CGH angebracht.

Nachdem das Chromatogramm durchgelaufen und zur Entfernung des Lösungsmittels getrocknet wurde, geeigneterweise an der Luft, wird J auf die Ecken und/oder an anderen Stellen des Chromatogramms zur Erleichterung der Orientierung gesprüht. Das Chromatogramm wird über eine Platte aus Röntgenfilm in einer Pappkassette während 10 bis 30 min gelegt, abhängig von der Menge der bei der Umsetzung verwendeten Radioaktivität.

Die Hauptentwicklung des Röntgenfilms findet an der Stelle

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von .J-CGH statt. Nach der Belichtung bzw. Einwirkung wird die Chromatographieplatte, die nichtmarkiertes CGH enthält, mit Pauley's Reagens besprüht. Der Teil des Chromatogramms, der das jodierte Gallensalz enthält, wird vor dem Sprühmaterial geschützt. Der Röntgenfilm wird entwickelt, Das Chromatogramm wird über die Autoradiographie zur Lokalisierung der markierten Verbindung auf der Chromatography, e-

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platte gelegt. Die ^J-Flecken werden verwendet, um das Chromatogramm auf die richtige Stelle zu legen. Die Stelle des kodierten CGH wird auf dem Chromatogramm markiert, wobei man sorgfältig darauf achtet, daß nichtmarkiertes Material nicht mitumfaßt wird (die Lokalisierung erfolgt mit dem nichtmarkierten Material, das in den Außenspuren des Chromatogramms laufengelassen wurde).

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Bei einem anderen Verfahren zur Lokalisierung der markierten Verbindung, bei dem kein Röntgenfilm verwendet werden muß, werden die oberen Teile des Chromatogramms geschützt und der untere Teil wird mit Pauley's Reagens besprüht. Die Sprühhöhe wird langsam erhöht, bis CGH sichtbar wird. Das radiomarkierte Material liegt gerade darüber.

Nachdem das Chromatogramm getrocknet wurde, wird die Fläche

125
des Chromatogramms, die das J-CGH enthält, herausge-

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schnitten oder herausgekratzt, und das J-CGH wird mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Äthanol, das langsam auf das Chromatogramm getropft wird, eluiert. Irgendwelches SiIikagel, das herausgewaschen wird, kann durch Zentrifugieren oder Milliporenfiltration entfernt werden. Für die Verwendung bei tatsächlichen Tierversuchen oder Immunoassays wird das ¹²⁵J-CGH auf 100 bis 250 ml mit 10 mMol Na⁺- oder K⁺- Phosphatpuffer, pH 7,4, der Rinder-y-Globulin (1 mg/ml) enthält, verdünnt. Das verwendete Volumen hängt von der erforderlichen Konzentration ( /uCi/ml) ab.

Für pharmazeutische Verwendungen bei Menschen können pharmazeutisch annehmbare Träger anstelle solcher, die Rinder-γ-Globulin enthalten, verwendet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Alle verwendeten Chemikalien besitzen Analysenqualität oder die beste verfügbare Qualität. Cholylglycin für die Immunisierung und die Gallensalze für Standardkurven werden von Supelco bezogen. Cholylglycin für die Synthese wird von Sigma bezogen. 1-Äthy1-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-HCl (EDC), Histamin-dihydrochlorid, N-Hydroxysuccinimid und Tri-

äthylamin werden von Aldrich bezogen. ^H-Cholylglycin wird

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von New England Nuclear bezogen, und Na J und Na ^XJ 'J werden von Amersham Searle und New England Nuclear bezogen.

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Beispiel 1 Synthese von Cholylglycylhistamin

10 mMol Cholylglycin und 10 mMol N-Hydroxysuccinimid werden in 75 ml Ν,Ν-Dimethylformamid gelöst. 10 mMol EDC werden zugegeben, und das Gemisch wird 1,5 h bei 23°C gerührt. 10 mMol Histamin-dihydrochlorid und 10 mMol Triäthylamin werden in 25 ml Ν,Ν-Dimethylformamid suspendiert und zu dem oben gebildeten aktivierten Ester gegeben. Die Umsetzung kann während 2 h ablaufen. Die Umsetzung wird durch Zugabe eines gleichen Volumens ^O beendigt, und dann wird der pH-Wert mit NaOH auf 10 bis 11 eingestellt. Nach 60 min wird der pH-Wert mit HCl auf 5 eingestellt, und die Lösung wird über eine Dowex 5OW χ θ Kationenaustauschsäule, die 20 g Harz enthält, das zuvor mit Äthanol und Benzol gewaschen und dann mit N,N-Dimethylformamid:Wasser (1:1), eingestellt auf einen pH-Wert von 5,0, äquilibriert wurde, gegeben. Nachdem die Probe absorbiert ist, wird die Säule mit 50 ml Ν,Ν-Dimethylformamid:Wasser (9:1) und dann mit 100 ml abs. Äthanol gewaechen. Das Cholylglycylhistamin wird mit Äthanol:NH, (85:15) eluiert. 3 ml aliquote Teile werden gesammelt und jedes fünfte Rohr wird auf Gallensalz und Histamin geprüft, indem man 10/Ul-Proben in Form von Flecken an Silikagelplatten prüft. Das Gallensalz wiixL durch SKSprühen mit 15#iger Phosphomolybdänsäure in Äthanol und Erhitzen sichtbar gemacht. Das Histamin wird durch Sprühen mit Pauley's Reagens (diazotierte SuIfani!säure), wie von Stahl in "Thin Layer Chromatography", S. 899 (Springer Verlag, New York, 1969) beschrieben, sichtbar gemacht.

Die sowohl Gallensalz als auch Histamin enthaltenden Fraktionen werden zur Entfernung von freiem Histamin chromatographiert. Die Proben, die Cholylglycylhistamin enthalten, werden vereinigt und bei vermindertem Druck unter Verwendung eines Rotationsverdampfers eingedampft. Das Cholylglycylhist-

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amin ist ein hellgelbes öl. Das Cholylglycylhistamin wird 18 h im Vakuum getrocknet, in abs. Äthanol gelöst und als Hydrochloridsalz durch Zugabe von HCl kristallisiert. Die Kristalle werden durch Filtration gesammelt, mit einem geringen Äthanolvolumen gewaschen und im Vakuum getrocknet. Der Schmelzpunkt der Kristalle beträgt 191 bis 194°C.

Die Beendigung der Umsetzung, bei der man den aktivierten Ester erhält, kann unter Verwendung eines Gemisches aus Äthylacetat, Benzol, Methanol und Essigsäure (40:40:10:10) oder eines Gemisches aus Äthylacetat, Benzol, Methanol und Triethylamin (50:25:25:10) als Lösungsmittel verfolgt bzw. bestimmt werden. Die Umsetzung, die zu Cholylglycylhistamin führt, kann durch Dünnschichtchromatographie auf zwei getrennten Platten verfolgt werden. Eine Platte wird für die Gallensalze mit 15%iger Phosphomolybdänsäure in Äthanol angefärbt und die andere wird mit Pauley's Reagens, wie von Stahl beschriebe«, entwickelt. Wenn die Umsetzung beendigt ist, sollte der freie Histaminfleck verblassen oder verschwinden, während der freie Cholylglycinfleck verschwinden sollte, und der neue Cholylglycylhistaminfleck sollte überwiegen.

Analyse des Produktes

Das Produkt wird auf Cholat, Glycin und Histamin nach der Hydrolyse bei 110⁰C in verschlossenen, evakuierten Ampullen analysiert. Die Proben werden in 6n HCl während einer Zeit bis zu 120 h hydrolysiert, während die Proben in 1,25 M NaOH so lange wie 8 h hydrolysiert werden.

Die Hydrolysate werden auf Cholat nach der 3-a-Hydroxysteroiddehydrogenase-Reaktion, wie sie von Murphy et al in "J.Clin.Path.", Band 23. Seiten 594-8 (1970) beschrieben wird, analysiert. Glycin wird auf einem Durrum-Aminosäure-Analysator analysiert, und Histamin wird quantitativ unter

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Verwendung der o-Phthalaldehyd-Reaktion, modifiziert von Hakanson und Rönnberg ["Anal.Biochem.", Band 60, Seiten 560-67 (1974)], bestimmt.

Die Hydrolyse bei 110°C in verschlossenen, evakuierten Ampullen, die 6n HCl enthalten, ergibt niedrige Wiedergewinnungen von Cholsäure, bestimmt nach der 3-a-Hydroxysteroiddehydrogenase-Reaktion. Die verlängerte Hydrolyse (80 bis 120 h), die für die quantitative Gewinnung von Glycin erforderlich ist, kann für den beobachteten Abbau des Steroidmolekülteils verantwortlich sein, aber Glycin und Histamin konnten quantitativ bestimmt werden. Zur quantitativen Bestimmung von Cholat ist eine alkalische Hydrolyse in 1,25 M NaOH während 1 h bei 110⁰C in verschlossenen, evakuierten Ampullen erforderlich. Histamin konnte ebenfalls quantitativ bestimmt werden. Da NaCl nach der Neutralisation vorhanden ist, ist die Aminosäureanalyse nicht genau und Glycin kann nicht bestimmt werden. In Tabelle I sind die Ergebnisse dieser vereinigten Analysen für Cholat, Glycin und Histamin aufgeführt. Das Verhältnis (1:0,94:1,01) liegt innerhalb der Versuchsfehlergrenze, da alle Komponenten nicht in einem einzigen Hydrolysat quantitativ bestimmt werden können. Die angegebene Struktur wird somit bestätigt.

In Tabelle I ist die Gesamtmenge die theoretische Menge, die für die Hydrolyse angenommen wurde, auf Grundlage eines Molekulargewichts von 596,32. Die berechnete Zusammensetzung beruht auf der Analyse der Hydrolysate; Histamin ist bei beiden Hydrolyseverfahren gleich.

Tabelle I

Saure Hydrolyse Alkalische Hydro- Berechnete Zu-(nMol) lyse (nMol) sammensetzung

(Mol)

INSGESAMT 3120 1615 1

Cholat - 1395 1

Glycin 3088 - 0,94

Histamin 3338 1403 1,01

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Beispiel 2

JodierunK von Cholylglycylhistamin

50 nMol (10/ul) Cholylglycylhistamin werden aus einer 20%igen wäßrigen Äthanollösung, die 5,0/uM/ml (10/ul) 0,5 M Phosphatpuffer, pH 7,4, und 2 mCi (1 nMol) Na¹²⁵J (etwa 2,5/ul)enthält, entnommen, und 35/Ug (10/ul) Chloramin-T in 0,5 M Phosphatpuffer, pH 7,4, werden zugegeben. Das Gemisch wird 30 see auf einem magnetischen Rührer gerührt. 250/Ug (100 /Ul) Natriummetabisulfit werden zur Beendigung der Reaktion zugegeben. 2 ml eines 10 mMol Phosphatpuffers, pH 7,4, werden zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, das unter Verwendung einer Amberlite XAD-2 Säule (0,7 x 3 cm, Brinkman Inst.), die etwa 1 g Harz enthält, fraktioniert wird. Die Säule wird mit 0,2 ml/min eluiert und 0,2 ml-Fraktionen werden gesammelt. Nachdem die Probe adsorbiert ist, wird die Säule mit 3 ml 10 Mol PO»-Puffer, pH 7,4, und dann mit destilliertem

125 Wasser gewaschen, bis ein freier ^J-Peak eluiert wird.

Das jodierte Cholylglycylhistamin wird mit abs. Äthanol eluiert. Erfolgt die Jodierung nach diesem Verfahren, so erhält man eine relativ niedrige spezifische Aktivität und es ist eine weitere Reinigung erforderlich. In dem Puffer wurde Kalium als Metallkation verwendet; es können jedoch auch Natrium- oder andere Kationen verwendet werden.

In Fig. 1 ist die Fraktionierung dargestellt, die man bei diesem Verfahren erhält. Der erste Peak, der mit wäßrigem

125 Puffer eluiert wurde, stellt freies Na J dar und macht bei dieser Jodierung etwa 1/3 des Na ³J aus. Der zweite Peak, der mit Äthanol oder Methanol eluiert wurde, enthält die Mono- oder Di-jodcholylglycylhistamine. Zur Erzielung

125 einer 66?6igen Einarbeitung von J muß ein großer molarer Überschuß an Cholylglycylhistamin verwendet werden. Das jodierte Produkt besitzt eine niedrige spezifische Aktivität, aber das monojodierte Derivat wurde fast exklusiv gebildet.

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Beispiel 3

Reinigung von Cholylglycyl- J-histamin

125
Die Cholylglycyl- J-histamin-Peaks werden vereinigt und auf ein Volumen von etwa 0,1 ml unter einem Strom aus trockenem Stickstoff eingedampft. Das vereinigte Material wird auf eine Silikagelchromatographieplatte (Eastman Kodak) durch Aufstreichen aufgetragen. In Spuren bzw. als Leitlinien werden auf beiden Seiten der Platte 10 nMol authentisches Cholylglycylhistamin und eine Probe des ursprünglichen vereinigten Materials als Flecken aufgetragen. Das Chromatogramm wird unter Verwendung von Äthylacetat:Benzol:Methanol: Triethylamin (50:25:25:10) eluiert. Nachdem das Lösungsmittel aufgestiegen und die Platte getrocknet ist, wird

125
Na J an drei Stellen als Flecken aufgetragen, und eine Autoradiographie wird durch Belichtung mit einem Röntgenstrahlenfilm in einer Pappkassette während 10 bis 30 min durchgeführt. Der Film wird entwickelt, und die Teile des Chromatogramms, auf die authentisches Cholylglycylhistamin als Flecken aufgetragen wurde, werden mit Pauley's Reagens besprüht. Das Chromatogramm und die Autoradiographie werden übereinandergelegt, und die kodierte Bande, die 2 cm über den authentischen Cholylglycylhistamin-Flecken migriert, wird lokalisiert und aus dem Chromatogramm herausgeschnitten oder -gekratzt, wobei man sorgfältig darauf achtet, kein nichtjodiertes Material mit abzukratzen. Das kodierte Cholylglycylhistamin wird aus dem Silikagel mit abs.Äthanol eluiert. Dieses Produkt kann etwas disubstituiertes Derivat enthalten, aber in den meisten Fällen wird es weitgehend monojodiert sein.

In Fig. 2 ist eine auf diese Art hergestellte Autoradiographie dargestellt. Die Flecken (kreuzweise schraffiert), die das nichtjodierte, authentische Cholylglycylhistamin anzeigen, werden erhalten, indem man die Autoradiographie auf das Chroraatogramm legt. Die klare Trennung des Cholylglycyl-

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125
histamins von Cholylglycyl- J-histamin ist erkennbar. Ein

125
Herausschneiden der J-Fläche des Chromatogramms und ein Eluieren mit 10 ml Äthanol ergibt trägerfreies Cholylglycylhistamin. Die Eluierung ist über 99% vollständig. Das Material wird auf etwa 5/uCi/ml mit 10 mMol Phosphatpuffer, pH 7,4, (wie oben beschrieben), 1 mg Rinder-γ-Glubulin/ml

125 Lösung enthält, verdünnt. Cholylglycyl- J-histamin kann bei -20° oder -70°C gelagert werden. Bei diesen Versuchen zeigte es keinen Abbau (Abnahme der Anfangs-B/F oder Erhöhung der nichtspezifischen Bindung) beim Lagern während drei Halbwertszeiten (6 Monate).

In der folgenden Tabelle sind die chromatographischen Lösungsmittelsysteme, die für die Synthese, Jodierung und/oder Analyse von Cholylglycylhistamin durch Dünnschichtchromatographie an Silikagel (Eastman Kodak) geeignet sind, aufgeführt. Das Lösungsmittelsystem I ist sauer, die anderen sind basisch. In dem Lösungsmittelsystem I besitzt die Cholsäure einen R_f-Wert von 0,7; das Cholylglycin einen R_f-Wert von 0,4 und Cholylglycylhistamin bewegt sich nicht wesentlich. In dem Lösungsmittelsystem II besitzt Cholylglycylhistamin einen R_f-Wert von 0,8 bis 0,9, während Cholylglycin weniger mobil ist. Das Losungsmittelsystem III ist insbesondere für das jodierte Produkt nützlich, das einen R^-Wert besitzt, der wesentlich größer ist als der des nichtmarkierten Cholylglycylhistamins (0,72 gegenüber 0,64). Man erhält eine klare

125

Trennung von Cholylglycyl- J-histamin von Cholylglycylhistamin. Die Lösungsmittelsysteme IV und V sind zur Unterscheidung des Cholylglycylhistamins von freiem Histamin nützlich. In den Systemen II bis V sind die anionischen Gallensalze immobil.

- 19 -

809819/055Λ

P-619

Reagens Äthylacetat Benzol Methanol Essigsäure NH,

Triethylamin Pyridin

Die oben für Cholylglycylhistamin und sein radiokodiertes Produkt beschriebenen Synthese-, Jodierungs-, Trenn- und Reinigungsverfahren können ebenfalls mit analogen Verbindungen durchgeführt bzw. diesen angepaßt werden.

Beispiel 4

Tabelle	II	Vol-Teile	II	III	IV	V
		50	50	55	55
I	-	25	-	-
40	40	25	35	35
40	-	-	-	-
10	10	-	10	-
10	-	10	-	-
-			mm	10
-

Herstellung des Imraunoflens

6,3 mg Cholylglycin werden in 1,5 ml 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 7,0, der 3,0 mg Rinderserumalbumin enthält, gelöst. 6,0 mg EDC werden zu der Lösung zugegeben und dann rührt man 18 h bei 4°C. 10 CPM von ^H-cholylglycin werden zu dem Inkubationsgemisch zugegeben, so daß man die Kupplungswirksamkeit messen kann. Nichtgekuppeltes Cholylglycin und andere Reaktionsprodukte werden durch Dialyse gegen zwei Chragen des gleichen Carbonatpuffers entfernt. Ein aliquoter Teil des BÜA-Cholylglycinkonjugats wird in einem Beckman LS-133 Flüssigkeitsszintillationszähler unter Verwendung von Redi-solv IV gezählt. Die durchschnittliche Zufuhr an H-cholylglycin-Isotopenindikator beträgt 4%.

Beispiel 5 Schema für die Immunisierung

Junge, erwachsene, männliche weiße Neuseelandkaninchen wer-

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8 0 9819/055/.

den an mehreren Stellen des Rückens in zweiwöchigen Intervallen unter Verwendung von 1,0 ml BSA-Cholylglycinkonjugat (50/Ug), emulgiert mit einem gleichen Volumen an Freund's Adjuvans, immunisiert. Das Serum wird alle zwei Wochen, beginnend einen Monat nach der Anfangs inununi si erung, entnommen.

Beispiel 6 Radioimmunoassayverfahren

Der Radioimmunoassay (Radioimmunoanalyse) wird auf ähnliche Heise, wie von Simmonds et al in "Gastroenterology", Band 65, Seiten 705-11 (1973), beschrieben, durchgeführt. 1 mg Rinder- γ-globulin wird in jedes Rohr gegeben. Die Zusammensetzung eines beispielhaften Rohrs beträgt: 1 mg Rinder-γ-globulin, 10/uMol Phosphatpuffer, pH 7,4, 2000 bis 3000 CPM Cholylglycyl- ^J-histamin, geeignet verdünnter Antikörper (Kaninchenseruin) und eine geeignete Menge Serum (üblicherweise 10/ul) oder Cholylglycinstandard und 10/Ul gallensäurefreies Serum, hergestellt gemäß Simmonds et al, in einem Endvolumen von 1 ml. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei 4°C oder 45 min bei 42°C und anschließend 90 min bei 4°C

125 inkubiert. An Antikörper gebundenes Cholylglycyl- J-histamin (gebunden) wird von nichtgebundenem Gallensalz (frei) durch mit Dextran beschichtete Tierkohle abgetrennt, die wie folgt hergestellt wird: 5 g Norit A neutrale Aktivkohle werden dreimal mit 100 ml 10 mMol PO^-Puffer, pH 7,4, durch Schweresedimentation gewaschen. Die gewaschene Norit A Tierkohle, suspendiert in 100 ml 10 mMol PO^-Puffer, wird zu 100 ml 0,5%igem Dextran T-70 in 10 mMol PO^-Puffer gegeben. Das Gemisch wird 5 min gerührt und bei 4⁰C mindestens 3 h vor der Verwendung stehengelassen. Vor der Verwendung wird die mit Dextran beschichtete Aktivkohle mit weiteren 300 ml 10 mMol Phosphatpuffer, pH 7,4, (wie oben beschrieben) verdünnt. Die mit Dextran beschichtete Aktivkohle wird bei 4°C während einer längeren Zeit aufbewahrt. 0,5 ml dieser Lösung

- 21 809819/0554

werden in die Analyseröhrchen gegeben, dann wird aufgewirbelt und 5 min bei 4°C inkubiert und dann bei 1200 g χ 5 min zentrifugiert. Das überstehende Material (gebunden) wird in anderes Rohr abdekantiert und beide Röhrchen, das eine mit der Aktivkohle (frei) und das andere mit dem überstehenden Material (gebunden), werden auf einem γ-Spektrometer (Elscint) gezählt. Die Ergebnisse werden in gebundenes/freies (B/F)-Verhältnis ausgedrückt. Eine Gtandardkurve wird aufgestellt und die nichtbekannten Werte werden aus dieser Standardkurve bei jeder Analyse quantitativ bestimmt.

Antikörpertiterkurven

Antikörper von sechs verschiedenen Kaninchen werden hergestellt und geprüft. In Fig. 3 sind die Antikörpertiterkurven für vier dieser Antikörper unter Verwendung von etwa 3000 CPM

125

Cholylglycyl- ^-histamin aufgeführt. Bei der kleinsten Verdünnung (1:100), die verwendet wurde, ergeben die Antikörper anfängliche B/F-Werte von 10,5 bis 14,2. Der Wert von 14,2 entspricht einer 3indung von 93% des Isotopenindikators. Der Antikörper I, der mit Ab 927 bezeichnet wird und unter Verwendung von ^H-Cholylglycin erzeugt wurde, ergibt ein B/F von 1,0 bei einer Endverdünnung von 1:500. Der Titer dieses Antikörpers, für den die Kurve durch Punkte gezogen ist, die als ungeschwur;:te Kreise gezeigt sind, erhöht sich auf 1:80 000 unter Verwendung von Ab 927 und etwa 2500 bis

125
3000 CPM Cholylglycyl- ^J-histamin. Eine nichtspezifische Bindung (das CPM, das in dem überstehenden Material auftritt, wenn der Antikörper nicht vorhanden ist) beträgt konstant 2 bis k% und verbleibt so lange wie 6 Monate nach der Jodierung unverändert.

Spezifizltät des Isotopenindikators und des Antikörpers

In Fig. 4 ist eine Verdrängungskurve dargestellt, die man unter Verwendung von Cholyltaurin erhält. Die Verdrängung

- 22 -

8 0 9819/05 5 U

ist gegenüber Cholylglycylhistamin hochempfindlich und erfordert etwa das 1Ofache weniger als andere Gallensalze. In Tabelle III sind die Kreuzreaktivitäten für verschiedene konjugierte und nichtkonjugierte Gallensalze und andere Nicht-Gallensalzsteroide aufgeführt. Diese Tabelle wurde aufgestellt, indem man 100 pMol von jedem Gallensalz oder 1000 pMol der Nicht-Gallensalzsteroide, mit Ausnahme von Cholesterin, wovon 100 000 pMol zugegeben werden, zufügt. Polyäthylenglykol (PEG) und Aktivkohle werden bei getrennten Verfahren zur Trennung der gebundenen und freien Fraktionen verwendet. Ein Cholyltaurin-Äquivalent wird durch Vergleich des B/F auf einer Cholyltaurin-Standardkurve bestimmt. Die % Kreuzreaktivität wird als das Verhältnis Cholyltaurin-Äquivalent /pMol tatsächlich zugegeben genommen.

Tabelle III

Gallensalze	%	Aktivität	Nicht-Gallen- % Akti-	i vität (PEG und Aktiv kohle
		Aktivkohle	salzsteroidc	0
Cholyltaurin	100	100	Cholesterin	0
Cholylglycin	84	33	EstrioI	0
Cholsäure	33	1.7	Cortisol	0
			Testosteron	0
Chenodeoxycholyltaurin	27	3.5	Digoxin
Cehnodeoxycholylglycin	92	26
Chenodeoxycholsäure	33	1.3
Deoxycholylglycin	28	< 0,5
Deoxycholsäure	10	<0,5
Lithocholsäure	2	<0,5

Bei den natürlich vorkommenden Gallensalzen ist das Analysenverfahren am empfindlichsten bei Cholyltaurin, dem eine 100#ige Aktivität zugeordnet wurde. Die Analyse ist etwas weniger empfindlich bei Cholylglycin (84#) und Chenodeoxy-

- 23 -

809819/055/,

cholylglycin (92%). Die Analyse ist weniger empfindlich bei den nichtkonjugierten Gallensalzen, insbesondere Lithocholat (2%).

Es wurde festgestellt, daß die Analyse für Gallensalze spezifisch ist, da die entsprechenden Östrogen-, Androgen- und Adrenalsteroide keine Kreuzreaktion zeigen. Die verwendeten Konzentrationen sind passend, so daß sowohl physiologische als auch pathologische Zustände abgedeckt werden. Weiterhin zeigen Digoxin und Cholesterin keine Kreuzreaktion,

125
Anwendung von Cholylglycyl- ^J-histamin bei Messungen der aerumkonzentratlonen

Durch die Isolierung von zu dem Serum zugegebenem Cholylglycin konnte gezeigt werden, daß diese Analyse genau ist. Für diese Untersuchungen wird eine Cholylglycin-Standardkurve verwendet. In Fig. 5 sind die Ergebnisse dargestellt, die man bei der Zugabe von Cholylglycin zu Serum von zwei Patienten mit Gallensalzkonzentrationen innerhalb des normalen Bereichs und von einem Patienten, dessen Serumgehalte beachtlich über dem normalen Gehalt liegen, erhält. Die verwendeten Zugaben bei den normalen Patienten beginnen innerhalb des normalen Bereichs und dehnen sich auf die erhöhten Werte aus. Bei dem erhöhten Serum liegen die Zugaben innerhalb des Bereichs des Serums und dehnen sich auf wesentlich höhere Gehalte aus. Wie in Fig.5 dargestellt ist, ist der gemessene y-Wert der Wert, der in dem Serum ohne Zugabe gemessen wird. Die Isolierungen bzw. Wiedergewinnungen betragen bei diesen drei Sera 12096, 123% und 133%. Die Intra-Analysenvariabilität wird mit zehn getrennten Bestimmungen bei zwei dieser Sera geprüft. Die Mittelwerte + SE betragen 55,2 + 1,25 und 9,03 + 0,43 pMol/ Analysenrohr.

- 24 -

80981P./055/

Diese jodierten Gallensalzderivate wurden zur Bestimmung der Serumgallensalze in einer Gruppe von Menschen verwendet, die keine erkennbare Krankheit hatten. In Fig. 6 sind die Ergebnisse dieser Untersuchungen aufgeführt. Die Serumgallensalzkonzentration bei 50 normalen Personen unter Verwendung von Ab 927 und Cholylglycyl-¹²⁵J-histamin beträgt 3,5 + 2,2 (SD) nMol/ml.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen radiojodierten Verbindungen bei physiologischen Untersuchungen wird in den folgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 7 Blutelearanceuntersuchung

125
Die Blutclearance von J-Gallensalz in Kaninchen, denen

125

man in die Ohrvene 6/uCi "\J-CGH injiziert hat, wird bestimmt. In der graphischen Darstellung der Fig. 7 ist die Kurve für das Verschwinden aufgetragen. Die t₁ /p beträgt etwa 3,0 min. Gegen Ende des Versuchs beträgt die Gallenblasengalle/Blut-Konzentration von J-CGH 150.

Beispiel 8 Orpcanverteilunflsuntersuchung

125 Zur Prüfung der organischen Verteilung von J-CGH werden Ratten damit in die Schwanzvene injiziert und 50 min später getötet. In der folgenden Tabelle ist der Prozentgehalt der Dosis angeführt, der in verschiedenen Organen festgestellt wird. Es ist wichtig, daß 80 bis 90% der Radioaktivität von der Leber ausgeschieden wurden und in dem Jejunum und dem Ileum festgestellt wurden.

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	2,156	Tabelle IV	9,056
Leber	0,0496	Jejunum	82,656
Milz	1,396	Ileum	2,0696
Magen	2,SW6	andere Organe
Duodenum

In Fig. 8 ist eine Uberlagerungsphotographie einer Maus,

125
in die "\J-CGH injiziert wurde, und ihr hepatitisches Szintigramm dargestellt. Die Leber ist hauptsächlich abgebildet, wobei etwas Radioaktivität in dem Dünndarm auftritt.

Aus der*obigen Beschreibung ist erkennbar, daß die Verwendung der erfindungsgemäßen Gallensalzderivate, insbesondere Cholylglycyl-¹²⁵J-histamin, die Möglichkeit eröffnet, von derF^üssigkeitsszintillationszählung zur Verwendung eines γ-Spektrometers überzugehen. Die Antikörpertiter sind einheitlich um das 50- bis 50Ofache erhöht, aber die Empfindlichkeit zeigt keine entsprechende Zunahme. Dies ist vermutlich auf die größere Affinität von Cholylglycylhistamin zurückzuführen. Trotz der größeren Affinität von Cholylglycylhistamin geht aus Fig. 3 und Tabelle III hervor, daß die Empfindlichkeit für primäre konjugierte Gallensalze in dem klinisch und experimentell nützlichen Bereich von 1 bis 500 pMol/Analysenrohr verbleibt.

Aus dem oben beschriebenen Immunoversuch, bei dem Cholylglycylhistamin verwendet wird, wird ein Antikörper eingesetzt, der unter Verwendung des entsprechenden konjugierten Gallensalzes, Cholylglycin, entwickelt wird. Der

125

Antikörper und das -\J-CGH erhalten eine Spezifizität gegenüber den konjugierten Gallensalzen, insbesondere Cholat- und Chenodeoxycholat-Konjugaten, aufrecht. Die anderen GaI-lensalzederivate sind mit Antikörpern, die gegenüber ihren Muttergallensalzen bzw. entsprechenden Gallensalzen ent-

- 26 -

wickelt wurden, verwendbar, z.B. Lithocholylglycylhistamin mit Antikörpern, die unter Verwendung von Lithocholylglycin entwickelt wurden,und Cholylhistamin mit Antikörpern, die unter Verwendung von Cholsäure entwickelt wurden. Eine Familie von Immunoanalysen kann somit die geeigneten jodierbaren Derivate von jedem Gallensalz mit Antikörpern, die gegenüber ihren Muttergallensalzen entwickelt wurden, verwenden,z.B.

Leitverbindung (Indikator) Antikörper entwickelt gegen

Cholylglycylhistamin Cholylglycin

Lithocholylhistamin Lithocholsäure

Cholyltyrosin Cholsäure

Deoxycholylglycylhistidin Deoxycholylglycin

Das gleiche Schema gilt für jedes Gallensalz und jedes eingeschlossene jodierbare Derivat.

Die beschriebene Radioimmunoanalyse ist nicht mono-spezifisch.

125

Ab 927 und Cholylglycyl- ^J-histamin bestimmen hauptsächlich die primären konjugierten Gallensalze. Andere, gegenüber Cholylglycin-Rinderserumalbumin gebildete Antikörper besitzen Spezifizitäten, die sich von den hier beschriebenen unterscheiden. Die Spezifizitäten unterscheiden sich ebenfalls von denen, die man unter Verwendung weniger verdünnter Antikörper (1:500) und %-Cholylglycin als Indikator erhält. Die Begrenzung des Beitrags des Indikators und des Antikörpers für die Analysenspezifizität wird bei genauen Untersuchungen einer Familie von jodierten Derivaten mit mehreren Antikörpern bestimmt werden. Derzeit liegt wenig Grund vor, eine mono-spezifische Analyse gegenüber einem System zu begünstigen, durch das mehrere Gallensalze quantitativ bestimmt werden. Werden neue Antikörper verwendet, können die Kreuzreaktivitäten analysiert werden, wie es oben für Ab 927 gezeigt wurde.

- 27 -

809813/055/=

Die Spezifizität des Indikators kann geändert werden, wenn man andere jodierbare Derivate, wie Histidin, Histidinmethylester, Tyrosin, Tyrosinmethylester oder Tyramin (Tyrosamin), verwendet. Die SpezifiZitaten können ebenfalls durch Konjugation an einer 3-α-Hydroxylgruppe anstelle des Gallensalzes oder der GIycincarboxylgruppe oder durch Jodierung von ungesättigten Gallensalzen geändert werden.

Beispiele 9 und 10

Herstellung und Jodierung von Cholylglycyltyrosainin und

Cholylglycyltyrosin

Unter Verwendung von nur 1 nMol Gallensalz werden sowohl Cholylglycyl- ■'j-tyrosamin als auch Cholylglycyl- ^J-tyrosin hergestellt und durch Amberlite-Harz unter Verwendung der Verfahren der Beispiele 1 und 2 oben gereinigt. In den Fig. 9 bzw. 10 sind die erhaltenen Elutionsprofile dargestellt.

Ende der Beschreibung.

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8 0 9 8 1 Q. / 0 5 5 A

Claims

Jerry Gorton Spenney P-619

Patentansprüche

Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verbindung aus der Gruppe Gallensäuren und ihre Amino säure- und Diamin-amid-^eb .indene bezw. amidartig gebund- dene Konjugate , die direkt oder indirekt an eine jodierbare Gruppe gebunden sind, enthält, wobei die Gallensäure ausgewählt wird aus der Gruppe, die enthält: Cholsäure, Chenodeoxycholsäure, Deoxycholsäure und Lithocholsäure, und die jodierbare Gruppe ausgewählt wird aus der Gruppe: Tyrosin, Tyrosinester, Histidin, Histidinester, Tyramin, Histamin, Pheny!propionsäure, Phenylalanin, Phenylalaninester, Tryptophan und Tryptophanester.

2. Säureadditionssalz der eine Aminogruppe enthalten den Zusammensetzung nach Anspruch 1.

3. Basenadditionssalz der eine freie Säurefunktion enthaltenden Zusammensetzung nach Anspruch 1.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die jodler bare Gruppe an die C₂^-Carboxylgruppe des Gallensalzes oder die Carboxylgruppe der glycinkonjugierten Gallensalze gebunden ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die jodierbare Gruppe direkt oder Über eine Verbindungsgruppe an die 3-a-Hydroxylgruppe des Gallensalzes gebunden ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Uberbrückungsgruppe eine Oicarbonsäure ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekenn zeichnet, daß die Dicarbonsäure Bernsteinsäure ist.

309819^y0554

ORIGINAL INSPECTED

8. Zusammensetzung nach Anspruch 4, nämlich Cholylglycylhlstamln.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit radioaktivem Jod umgesetzt wurde bzw. radiojodiert ist.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 8,

dadurch gekennzeichnet, daß sie mit radioaktivem Jod umge-

12^5

125 setzt wurde bzw. radiojodiert ist, und daß das Jod J,

¹²⁵J oder ¹³¹J ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie monojodiert ist.

12. Radiojodierte Zusammensetzung nach Anspruch 9, da-

125 durch gekennzeichnet, daß das Jod J ist.

13* Radiojodierte Zusammensetzung nach Anspruch 8, da-

125 durch gekennzeichnet, daß sie Cholylglycyl- J-histamin

14. Radiojodierte Zusammensetzung, ausgewählt aus der Gruppe: Gallensäuren und ihre amidarti.g gebundenen Aminosäure- und Diaminkon jugate, wobei die Gallensäure oder ihr Konjugat direkt oder indirekt an eine Gruppe gebunden ist, die ein radioaktives Jodisotop enthält.

15. Verfahren zur radioimmunologischen Analyse von Gallensalzen, dadurch gekennzeichnet, daß man als radiomarkierte Verbindung für die Analyse eine Zusammensetzung nach Anspruch 14 verwendet.

16. Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen von Gallensalzen im Blut oder in Organen des Körpers, dadurch

309819/Π554

gekennzeichnet, daß man als Indikator eine Zusammensetzung nach Anspruch 14 verwendet.

17. Szintillationsgraphieverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man als Quelle für die Radioaktivität eine Zusammensetzung nach Anspruch 14 verwendet.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminosäure oder als Diamin Glycin und/oder Taurin verwendet.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit radioaktivem Jod umgesetzt wurde.

20. Verfahren zur Abtrennung eines kodierten kationischen Gallensäurekonjugats aus einer Lösung, die ebenfalls nichtjodiertes, kationisches Gallensäurekonjugat enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Lösung auf die Koordinate einer Dünnschichtchromatographieplatte aufbringt, das Chromatogramm mit einem eine Stickstoffbase enthaltenden Lösungsmittel entwickelt, Wobei eine Bande aus kodiertem Konjugat an ei::e Stellung über die Bande mit nichtjodiertem Konjugat wandert, und man das jodierte Konjugat entfernt. "■■'..·'·<

21. . Verfahren nach: Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel ebenfalls einen niedrigen Allylester einer niedrigen Alkansäure enthält, wobei der Ester bis zu 8 Kohlenstoffatome enthält.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß als Jod ¹²³J, ¹²⁵J oder ¹^¹J verwendet wird. .-■!

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichrtb, daß die Dunnschichtchromatographieplatte eine Silikagelchromatographieplätte ist* ν _; * - -. :'-,;.-

309815/05 5 4

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel ein Aufsteigen der Chromatographieplatte bewirkt und daß die Bande aus jodiertem Konjugat zu einer Stelle über der Bande aus nichtjodiertem Konjugat wandert.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Stickstoffbase aus der Gruppe ürimäre, sekundäre und tertiäre Alkylamine und Arylamine, heterocyclische Amine, Ammoniumhydroxid und Hydroxylamin ausgewählt wird.

26. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Stickstoffbase aus der Gruppe Trimethylamin, Triäthylamin, Tripropylamin, Tributylamin, Dicyclohexylamin, Anilin, Pyridin, Ammoniumhydroxid und Hydroxylamin ausgewählt wird.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Ester Äthylacetat ist.

28. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel außerdem Benzol enthält.

29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel außerdem ein niedriges Alkanol enthält.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel etwa 25 Vol-Teile Alkanol, etwa 10 Vol-Teile Stickstoffbase und etwa 25 bis 50 VoI- Teile von je Äthylacetat und Benzol enthält, wobei die Menge, ausgedrückt durch das Volumen der beiden letzteren Komponen ten, insgesamt etwa 75 Teile beträgt.

31. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die konjugierte Gallensäure Cholylglycylhistamin ist und daß das Lösungsmittel 50 Vol-Teile Äthylacetat, 25 VoI-Teile Benzol, 25 Vol-Teile Methanol und 10 Vol-Teile Triäthylamin enthält.

32. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus kodierter und nicht jodierter kationischer Gallensäure und Konjugat erhalten wird (1) durch Umsetzung des kationischen Gallensäurekonjugats mit einem Jodierungsgemisch, das Natriumiodid und Chloramin-T enthält, und (2) Abtrennung des Gemisches aus kodiertem und nichtjodiertem Konjugat aus dem Reaktionsgemisch.

33· Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus kodiertem und nichtjodiertem Konjugat aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt wird, indem man es selektiv an einem Harz adsorbiert und das Harz mit einem Lösungsmittel eluiert.

34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch ein Gemisch aus jodiertem und nichtjodiertem Cholylglycylhistamin ist, daß das Harz ein Polystyrol-Grundgerüst enthält und daß als Lösungsmittel Methanol oder Äthanol verwendet wird.

35. Verfahren zur Abtrennung eines jodierten, anionischen Gallensäurekonjugats aus einer Lösung, die ebenfalls nichtjodiertes, anionisches Gallensäurekonjugat enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung auf die Koor dinate einer Dünnschichtchromatographieplatte aufbringt, das Chromatogramm mit einem Lösungsmittel, das eine schwache Säure enthält, entwickelt, wobei eine Bande aus nichtjodiertem Konjugat bis zu einer Stelle über einer Bande aus

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jodiertem Konjugat migriert, und man das kodierte Konjugat entfernt.

36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet,

123 125 131
daß man als Jod -M, J oder ^J J verwendet und daß die Dünnschichtchromatographieplatte eine Silikagelchromatographieplatte ist und daß das Lösungsmittel 40 Vol-% Äthylacetat, 40 Vol-% Benzol, 10 Vol-% Methanol und 10 Mol-% Essigsäure enthalt.

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