DE3114362C2 - Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers bzw. Antiserums, Verwendung dieses Verfahrens zur Gewinnung von Säugetierzellen, welche fähig sind, einen solchen Antikörper zu erzeugen und Verwendung des so hergestellten Antikörpers bzw. Antiserums zur Immunoprüfung - Google Patents

Abstract

Ein Antikörper mit hoher Spezifität für ein erstes Antigen, welches eine gewünschte antigene Determinante bei geringer Vernetzungsreaktivität mit wenigstens einem anderen Antigen besitzt, welches wenigstens eine der gewünschten antigenen Determinante des ersten Antigen strukturell verwandte antigene Determinante enthält, wird dadurch hergestellt, daß einem Säugetier ein Copolymer von D-glutaminsäure und D-lysin verabreicht wird, welches mit dem anderen Antigen gekuppelt ist, wodurch eine im wesentlichen effektive immunologische Toleranz induziert wird, woraufhin das Säugetier mit dem ersten Antigen immunisiert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zur Herstellung von Stämmen, welche fähig sind, die gewünschten Antikörper zu erzeugen. Diese Stämme können nach Entnahme von ihrem Wirt selbständig verwendet werden, um die gewünschten Antikörper zu erzeugen. Die derart gewonnenen Antikörper besitzen eine sehr geringe Vernetzungsreaktivität und hohe Spezifität, und sind besonders brauchbar als spezifische Antikörper für die Immunoprüfung von verschiedenen im menschlichen Körper vorhandenen Substanzen.

Description

Die Erfindung betrifft einerseits ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers bzw. Antiserums mit hoher Spezifität für ein erstes Antigen^ welches eine gewünschte antigene Determinante bei geringer Vernetzungsreaktivität mit wenigstens einem anderen Antigen besitzt, welches wenigstens eine der gewünschten antigenen Determinante des ersten Antigens strukturell verwandte antigene Determinante enthält, durch Immunisierung eines Säugetieres oder Züchtung von zur Antikörper-Erzeugung fähigen Säugetierzellen, und andererseits die Verwendung dieses Verfahrens zur

ίο Gewinnung von Säugetierzellen, welche fähig sind, einen solchen Antikörper zu erzeugen, sowie die Verwendung dieser Antikörper bzw. Antiseren zu Immunoprüfung-

Es sind verschiedene Verfahren zur Immunoprüfung einer Anzahl von im lebenden Körper von Menschen 'and Tieren vorhandenen Substanzen bekannt, bei denen die kompetitive Antigen-Antikörper-Reaktion ausgenutzt wird, indem eine gegebene Menge eines Antikörpers und unterschiedliche Mengen von Antigenen verwendet werden. Die Immuno-Prüfungsverfahren der bekannten Art haben im allgemeinen jedoch den Nachteil, daß sefost in Fällen, in denen das zur Immunoprüfung verwendete Reagenz (Antikörper) als stark spezifisch für die zu prüfende Substanz (Antigen) angenommen wird, die Spezifität der Probe dazu neigt, durch die vernetzungsreaktiven Substanzen, welche mit der zu prüfenden Substanz strukturell verwandt sind, beeinträchtigt zu werden.

Um eine derartige Schwierigkeit zu überwinden, ist es vorteilhaft, einen Antikörper zu benutzen, welcher eine höhere Spezifität zu der zu prüfenden Substanz besitzt Zu diesem Zweck wurde beispielsweise vorgeschlagen, ein Antigen vor seiner Verwendung an ein Trägerprotein an einer geeigneten Stelle seiner chemischen Struktur zu binden, wodurch die vom Antikörper zu ermittelnde Ermittlungsstelle am Antigen an der Oberfläche des Trägermoleküls freiliegt Eine derartige Freilegung stimuliert infolgedessen die Bildung eines Antikörpers mit geringer Vernetzungsreaktivität. So ist es beispielsweise bekannt, einen spezifischen Antikörper durch Verwendung von Polymeren oder Copolymeren von Glutaminsäure oder Lysin herzustellen (DE-OS 26 08 096; Kabat, E. A, Einführung in die Immunochemie und Immunologie, Springer Verlag, Berlin 1971,

S. 16—19; Bier, O. G, u. a. Experimentelle und klinische Immunologie, Springer Verlag, Berlin 1979, S. 68). Die bekannten Verfahren dieser Art sind jedoch noch unzulänglich, da komplizierte Arbeitsgänge erforderlich sind und es außerdem in einigen Fällen noch schwierig

so ist, eine Erzeugung vernetzungsreaktiver Antikörper zu vermeiden.

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß es möglich ist, die Menge an vernetzungsreaktiven Antikörpern unerwarteterweise zu reduzieren und auch einen erwünschten Antikörper mit einer sehr hohen Spezifität für eine beispielsweise zu prüfende Substanz zu erhalten, indem ein Copolymer aus D-Glutaminsäure und D-Lysin, welches mit dem vernetzungsreaktiven Antigen gekuppelt ist (nachstehend als D-GL bezeichnet), verwendet wird.

Die Erfindung hat sieh die Aufgäbe gestellt, einen verbesserten Antikörper mit einer hohen Spezifität und geringer Vernetzungsreaktivität, ein einen derartigen Antikörper enthaltendes Antiserum, zur Produktion derartiger Antikörper fähige Zellen (nachstehend als Stämme bezeichnet) und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen. Die Erfindung will außerdem ein Immuno-Prüfungsverfahren angeben, bei welchem

derartige Antikörper oder Antiseren verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers bzw. Antiserums mit hoher Spezifität für ein erstes Antigen, welches eine gewünschte antigene Determinante bei geringer Vernetzungsreaktivität mit wenigstens einem anderen Antigen besitzt, welches wenigstens eine der gewünschten antigenen Determinante des ersten Antigens strukturell verwandte antigene Determinante enthält, durch Immunisierung eines Säugetieres oder Züchtung von zur Aatikörper-Erzeugung fähigen Säugetierzellen dieses Säugetieres nach dessen Immunisierung ist dadurch gekennzeichnet, daß dem Säugetier jeweils ein Copolymer von D-Glutaminsäure und D-Lysin verabreicht wird, welches mit dem anderen Antigen gekuppelt «st, und nach Induzierung einer deutlichen immunologischen Toleranz demgegenüber das Säugetier mit dem ersten Antigen immunisiert wird.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich, die Menge an vernetzungsreaktivem Antikörper auf ein Minimum zu reduzieren und auch den gewünschten Antikörper oder das Antiserum mit verbesserten Eigenschaften herzustellen, da Q-GL eine substantiell effektive immunologische Toieranz in B-Zellen induziert, welche als Vorläufer für die Herstellung von Antikörpern dienen. Wenn ein Säugetier nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wird, werden D-Aminosäuren im lebenden Körper nicht ohne weiteres metabolisiert, und außerdem induziert D-GL substantiell keine immunologische Reaktion in T-Zellen im lebenden Körper. Es wird daher angenommen, daß, wenn ein Lebewesen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wird, ein derartiges Hapten-D-GL-Konjugat sich speziell an Oberflächen-Immunoglobulin-Rezeptoren an B-Lymphozyten bindet und diese Zellen irreversibel tolerant macht.

Der gewünschte Antikörper kann in Form eines reinen Antikörpers oder in Form eines den gewünschten Antikörper enthaltenden Antiserums erhalten werden. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zur Herstellung von Zellen der gleichen genetischen Konstitution (nachstehend als Stämme bezeichnet) im lebenden Körper, welche die gewünschten Antikörper erzeugen können. Es ist daher möglich, den gewünschten Antikörper durch Züchtung des auf diese Weise erhaltenen Stammes in herkömmlicher Weise zu erhalten.

In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, daß die dem lebenden Körper des Lebewesens entnommenen Stämme zur Herstellung des gewünschten Antikörpers selbst in Abwesenheit des initiierenden Lebewesens verwendet werden können, da es bekannt ist, einen geeigneten Stamm mit einer geeigneten Tumorzelle zu verbinden, um ein Hybridoma zu erhalten, beispielsweise indem ein derartiger Stamm mit einer Myeloma-Ztlle verbunden wird, wie dies beispielsweise berichtet wird in Nature, Vol. 256/1975, S. 495-497; European J. of Innunol., Vol. 6/1976, S. 511 - 519; Nature, Vol. 266/1977, S. 550-552 und Nature, Vol. 266/1977, S. 495. Ein derartiges Hybridoma wird auf oder in ein anderes Lebewesen übertragen und die Hybridoma-Zeüen vermehren sich ständig, um eine große Menge des gewünschten erfindungsgemäßen Antikörpers zu erzeugen. Infolgedessen ist es möglich, ein derartiges Hybridoma als eine neue Quelle für den gewünschten AntikörDer zu verwenden.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Imminoprüfung einer Substanz vorgesehen, weiche als ein Antigen dient, bei welchem das erste Antigen, d.h. die zu prüfende Substanz, mit einem erfindungsgemäßen Antikörper oder Antiserum in Gegenwart des zweiten (anderen) Antigen zur Reaktion gebracht wird, daß das erste Antigen von dem auf diese Weise erhaltenen immunen Komplex getrennt wird und daß die Aktivität des ersten Antigen bestimmt wird.

Die erfindungsgemäße Imminoprüfung kann in herkömmlicher Weise durchgeführt werden, beispielsweise durch Radio-Immunoprüfung oder durch Verwendung nicht-isotopischer Markierungen wie Enzymen, freien Radikalen, Zellen, Viren, Metallionen sowie fluoreszierenden und chemiluminiszierenden Gruppen. Bei der erfindungsgemäßen Radio-Imminoprüfung kann die Prüfung selbst in Gegenwart eines vernetzungsreaktiven Antigen durchgeführt werden.

Erfindungsgemäß wird vorzugsweise D-GL mit einem Molekulargewicht von etwa 27 000 bis etwa 120 000 verwendet. Das Molverhältnis von D-Gluitaminsäure zu D-Lysin beträgt vorzi>i5weise 70:30 bis 30 :70, beispielsweise 60 :40. Ein derartiges Copolymer ist im Handel erhältlich, wenn man auch ein derartiges Copolymer in üblicher Weise beispielsweise dadurch herstellen kann, daß N-Carboxylanhydrid von y-Alkyl-D-g!ut.Amat mit N-Carboxylanhydrid von ε-N-Carbobenzyloxy-L-lysin in Gegenwart eines geeigenten Amins copolymerisiert und anschließend die Schutzgruppe entfernt wird.

Verschiedene natürlich vorkommende Substanzen können z.B. zur Herstellung des Antikörpers zur Imminoprüfung verwendet werden. Beispiele bevorzugter Stoffe für diesen Zweck sind Steroide, ihre Glucuronate und deren Sulfate, Catechinamine, Peptide, ihre Untereinheiten und deren verwandte Fragmente sowie verschiedene pharmazeutische Wirkstoffe.

Besonders bevorzugte Beispiele von Steoriden sind Testosteron (nachstehend als T bezeichnet), 5 a-Dihydrotestosteron (nachstehend bezeichnet als DHT), Androsteron, Etiocholanolon, Progesteron, 17 Λ-Hydroxy-progesteron, Pregnenolon, Dehydroepiandrosteron, ösi/adiol. Östron, östriol, Aldosteron, Desoxycorticosteron, Cortisol, Cortison, Corticosteron, 11-Desoxy cortisol, Cholsäure, Desoxycholsäure, Lithocho'säure und deren konjugierte Verbindungen (Konjugate).

Catechinamine sind beispielsweise Dopamin, Norepinephrin, Epinephrin und dergleichen.

Peptid-Hormone sind beispielsweise Gastrin und Cholecystokininpancreozymin, Insulin, Proinsulin, GIucagon, follikeistimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH), humanes Choriongonadotropin (HCG) und seine Untereinheiten, Somatostatin, thyro'dstimulierendes Hormon (TSH) und ihre Untereinheiten und omit verwandte Peptide.

Pharmazeutische Mittel sind beispielsweise 1-Propranolol als ß-Blockmgmittel, 1- oder d-Cyclazocin als Analgetikum und dergleichen.

Wenn beispielsweise ein Anti-T-Antikörper oder -Antiserum nach dem herkömmlichen Immunisierungsverfahren hergestellt wird, wirkt DHT als verneizungsreaktives Antigen, da ihre Strukturen einander sehr ähnlich sind. In gleicher Weise wirkt, wenn ein Anti-DHT-Antikörper oder -Antiserum hergestellt wird, T als das vernetzungsreaktive Antigen. Auf diese Weise wirken verschiedene Steroide als vernetzungsreaktive Antigene auf andere Steroide.

Die voreenannten Substanzen sind im allgemeinen

die Hnpiene od. dgl., d.h. die Siibsiiin/cn. welche fähig sind, sich mil einem Antikörper zu verbinden, jedoch unfähig oder kaum in der Lage sind. Immunreaktionen zu induzieren, wenn sie nicht mit einem Träger vor ihrer Verabreichung an ein Lebewesen gekuppelt sind. Es ist daher erforderlich, sie mit einem geeigneten Träger zu kuppeln, um die Antikörper Bildung zu induzieren. Um beispielsweise einen Antikörper zu induzieren, welcher für ein bestimmtes Antigen, wie beispielsweise Anli-Teslostcron (Anli-T-Antikörper). spezifisch ist. so sollte dieses Antigen mit einem geeigneten Träger gekuppelt sein und für die Immunisierung verwendet werden. Die auf diese Weise erhaltenen Anli-T-Slämme und -Antikörper haben jedoch gewöhnlich eine starke Verneizungsreaktiviiiit mil den Substanzen, welche eine analoge Struktur haben, wie beispielsweise PIIT. ErfindungsgemiiU ist es möglich, speziell die Rildung derartiger verneizungsreakiiver Anli-DHT-Slämnie und -Antikörper zu inhibieren, indem das Lebewesen mit einem gekuppelten Produkt eines Copolymers von D-GL mit einem vcrneizungsreaktiven Antigen, in diesem Fall DHT. behandelt wird.

überdies wurde festgestellt, da 13 ein Antikörper, welcher fähig ist, mil der spezifischen Determinante des gewünschten Antigens zu reagieren, erhalten wurde, wenn ein Lebewesen mit einem Conjugal von D-GL und einem diesem Antigen analogen Peptid oder einem mit der des gewünschten Antigens übereinstimmenden Peplidfragment behandeli wird. Ein Beispiel, welches einen Vorteil der Erfindung demonstriert, ist tier Fall von Antikörpern gegenüber einem Oetapeplid. welches ein C-Terminal-Peplid mit 8 Aminosäuren von Cholecvsiokinin-pancreo/ymin (CCK) ist. bei dem es sich um ein Magen-Darm-Normon handelt. Die Strukturen (Aminosäure-Folge) von Gastrin (human). CCK und ihren l-'ragmenien sind in nachstehender Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Gastrin (human): (Pyro)Glu — GIy- Pro — Trp — Leu --GIu — GIu — GIu — GIu — CUu — AIa — Tyr 1

(SO₅H)

CCK-33:

— GIy- Trp — Met — Asp — Phe — N H₁
Lys —AIa — Pro — Ser —GIy — Arg — VaI—Ser — Met —He — Lys — Asn — Leu

-GIn — Ser — Leu — Asp — Pro — Ser — His — Arg — He—Ser—· Asp — Arg -

Asp—Tyr — Met—GIy—Trp — Met—Asp — NH,

i SO₃H

CCK-8-P:

Asp—Tyr — Met — GIy—Trp — Met—Asp — Phe — NH₂

SO₃H Pentagastrin. GIy—Trp — Met — Asp — Phe — NH_:

in neuerer Zeit ist festgestellt worden, daß CCK Octapeptid (nachstehend als CCK-8-P bezeichnet) und sein reaktiver Rezeptor auch im Gehirn vorhanden sind, und es ergab sich der Wunsch, die Funktion dieses Hormons als Nervenübenrager zu prüfen sowie die an ihm hervorgerufenen Sekretionen und Auswirkungen auf verschiedene Krankheiten des Magen-Darni-Traktes. Es ist daher wichtig, einen Antikörper zu schaffen, welcher speziell mit CCK-8-P reagieren kann.

Antikörper bildende Stämme und Antikörper, welche mit CCK-8-P spezifisch reagieren können, können erfindungsgemäß dadurch erhalten werden, daß man

einem Lebewesen Konjugate von D-GL mit einem Pentagastrin verabreicht (d. h. die 5 Aminosäuren, weiche am C-Tcrminal sowohl von Gastrin wie von

ho CCK-8-P liegen), um Stämme zu inaktivieren, welche Antikörper produzieren, die mit Pentagastrin und/oder gastrinartigen Verbindungen vernetzt reagieren, und dann dieses Lebewesen mit CCK-8-P immunisiert.

Erfindungsgernäß ist es daher auch möglich, gastrinspezifische Antikörper zu erzeugen, indem die Bildung von Stämmen verzögert wird, weiche mit CCK-PZ vernetzungsreaktiv sind, indem ein Lebewesen mit einem Konjugat von D-GL und Pentagastrin behandelt

wird, welches das C-Terminal-Fragment des gewünschten Antigen ist, und dann das Lebewesen mit Gastrin immunisiert wird.

Wie die Durchführungsbeispiele der Erfindung zeigen, kann es ?uch möglich sein, einen gewünschten spezifischen Antikörper zu erhalten, indem man einem immunen Lebewesen ein Konjugat von D-GL mit einem vernetzungsreaktiven Peptid verabreicht, und zwar selbst -Jann, wenn spezifische antigene Determinanten nicht chne weiteres dem gesamten Peptid durch Peptid-Fragmentation entzogen werden können (vgl. z.B. Atassi, M. Z., Immunochemistry, Vol. 15/1978, S. 909-936).

Ein derartiges Konjugat von D-GL und einem vernetzungsreaktiven Antigen kann entweder durch direkte Kupplung des Antigens mit D-GL erhalten werden oder durch indirekte Kupplung des Antigens mit D-GL durch Bildung einer Brücke zwischen Antigen und D-GL. Für diesen Zweck wurden die verschiedensten Derivate des Antigen, insbesondere Steroid-Antigene, hergestellt. Diese Derivate sind beispielsweise als Oxim-Derivate, Sukzinyl-Derivate und Chlorocarboxylsäure-Derivate von Erlanger und anderen (d. h. B. F. Erlanger und anderen, J. Biol. Chem, 1957, S. 228), als Carboxylmethylthioäther-Derivate von A. Weinstein und anderen (Steroid. 20/1972, S. 789). als Carboxylmethyläther-Derivate von P. N. Rao und anderen (J. Steroid Biochem., 9/1978, S. 539) usw. beschrieben worden. Bevorzugte Kupplungsmethoden sind beispielsweise die Carbodiimid-Methode, die gemischte Anhydrid-Methode, die Schotten-Baumann-Methode und di · Isoxazolium-Methode.

Wenn in eine derartige Verbindung eine Nl-b-Gruppe eingeführt wird, wird die Kupplungsreaktion durch die Glutaraldehyd-Methode erreicht, und wenn eine NH₂- J5 oder SH-Gruppe in eine derartige Verbindung eingebracht wird, kann die Reaktion durch die Methode erreicht werden, welche ein m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-sukzinimid-ester, Sukzinimidyl-4-(N-maleimidomethylcyclohexyn)-l-carboxylat, Sukzinimidyl-4-(p-maleimidophenyl) butyral und dgl. oder N-Sukzinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionat, N-Sukzinimidy!-(4-azidophenyldithio) propionat und dgl. verwendet.

Außerdem können zur Kupplung von D-GL mit einem Antigen auch verschiedene andere Methoden verwendet werden, wie sie zur Kupplung von Peptiden mit anderen Substanzen auf dem Gebiet der Peptid-Chemie angewendet werden.

Die Antigene, welche für Zwecke der Erfindung verwendet werden, sind im allgemeinen Haptene od dgl, so daß es erforderlich ist, das Antigen vor seiner Verwendung mit einem geeigneten Träger zu kuppeln, welcher in herkömmlichen Immunisierungs-Methoden verwendet wird. Bevorzugte Träger für diesen Zweck sind beispielsweise »keyhole limpet haemocyanin« (KLH), y-Globulin und Albumin, welches aus dem Serum verschiedener Lebewesen-Spezies herrührt, welches zur Immunisierung, beispielsweise von Menschen, Ziegen, Rindern und dgl, verwendet wird.

Die Antigene, ihre Untereinheiten oder verwandten Fragmente sollten mit einem Trägerprotein in der gleichen Weise gekuppelt werden, wie es zur Kupplung eines vernetzungsreaktiven Antigens, seiner Untereinheit oder verwandten Fragmente mit D-GL angewendet wird Infolgedessen kann die Kupplung direkt oder indirekt durch die Brücke herbeigeführt werden. In letzterem Fall sollte die gleiche Intermediärverbindung zur Kupplung des gewünschten Antigens mit einem Trägerprotein verwendet werden, wie sie zur Kupplung von D-GL mit dem vernetzungsreaktiven Antigen verwendet wird.

Die Immunisierungs-Behandlung kann in herkömmlicher Weise durchgeführt werden. Vorzugsweise werden jedoch kleine Lebewesen, wie Mäuse, mit Antigen in einmaligen Dosen von 1 —100μg oder große Lebewesen, wie beispielsweise Kaninchen, in einmaligen Dosen von 0,1 — 1 mg immunisiert, was beispielsweise 2- bis 5mal in 2- bis 4wöchentlichen Intervallen wiederholt werden kann. Gewöhnlich kann 2 bis 3 Tage vor der Primär-Immunisierung ein Konjugat von D-GL und einem vernetzungsreaktiven Antigen dem Lebewesen verabreicht werden, wenn auch in einigen Fällen das D-GL-Konjugat auch nach der Primär- und Sekundärimmunisierung verabreicht werden kann. Dies hängt von der Art des vernetzungsreaktiven Antigens ab. Die Dosis des D-GL-Konjugats mit vernetzungsreaktivem Antigen kann in Abhängigkeit von dem kombinierten Verhältnis des vernetzungsreaktiven Antigens (Hapien od. dgl.) zu D-GL, den Kupplungsstellen, den Arten der Zwischenverbindung und dgl. schwanken und beträgt vorzugsweise 100—500 μg bei kleineren Lebewesen wie beispielsweise Mäusen oder 2—10 mg bei größeren Lebewesen wie beispielsweise Kaninchen. Das D-GL-Konjugat kann in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst werden und intraperitoneal verabreicht werden.

Da es vorteilhaft ist, das vernetzungsreaktive Antigen mit D-GL zu kuppeln, um die gleiche Form zu erhalten, wie sie für das Immunisierungs-Antigen mit dem Träger verwendet wird, wird für diesen Zweck vorzugsweise die gleiche Zwischenverbindung zur Bildung der jeweiligen Kombinationen verwendet.

Wie bereits erwähnt, ist es möglich, eine im wesentlichen für ein bestimmtes vernetzungsreaktives Antigen spezifische effektive immunologische Toleranz zu induzieren, indem einem Lebewesen ein Konjugat von D-GL mit dem vernetzungsreaktiven Antigen verabreicht wird. Anschließend wird das Lebewesen mit dem gewünschten Antigen immunisiert, welches die spezifischen antigenen Determinanten enthält. Auf diese Weise ist es möglich, einen Stamm zu erhalten, welcher fähig ist, einen Antikörper mit einer niedrigen Vernetzungsreaktivität und ausgezeichneter Spezifität für die relevanten spezifischen antigenen Determinanten zu erzeugen, sowie ein diesen Antikörper enthaltendes Antiserum.

Die vorbeschriebenen Feststellungen wurden nicht nur bei kleineren Lebewesen, wie Mäusen, sondern auch bei größeren Lebewesen, wie Kaninchen, getestet. Für die Praxis ist es wichtig, daß die gleichen Resultate bei kleineren und bei größeren Lebewesen trotz der zu erwartenden großen Unterschiede unter den verschiedenen Spezies der Lebewesen festgestellt wurden. Man erhält allerdings eine wesentlich größere Menge eines Antikörpers bei größeren Lebewesen, wie beispielsweise Kaninchen, als bei vergleichsweise kleinen Lebewesen, wie Mäusen.

Die Erfindung ist besonders vorteilhaft, denn bisher war es schwierig, einen Antikörper herzustellen, welcher fähig war, analoge Strukturen, wie beispielsweise T und DHT, zu unterscheiden.

Infolge erhöhter Produktivität des spezifischen Antikörper-erzeugenden Stammes kann es praktisch möglich sein, einen spezifischen Stamm zu trennen und zu isolieren. In der Fachliteratur war es bisher bekannt, daß die Wahrscheinlichkeit der Trennung und Isolierung eines Stammes, welcher ein spezifisches Antigen

erkennen kann, annähernd 1/10* bis 1/10⁷ beträgt. Dies bedeutet, daß eine derartige Trennung und Isolierung praktisch unmöglich war.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es daher ohne weiteres möglich, einen spezifischen Antikörpererzeugenden Stamm zu erhalten, welcher fähig ist, speziell zwischen einer gewünschten antigenen Determinante und strukturell verwandten antigenen Determinanten selbst bei Immunisierung mit einem vernetzungsreaktive Determinanten enthaltenden Antigen zu unterscheiden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann man derartige spezifische Antikörper mit größerer Wahrscheinlichkeit erhalten, und es ist infolgedessen auch möglich, die Wahrscheinlichkeit der Produktion derartiger spezifischer Antikörper-erzeugender Stämme zu erhöhen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei jedem beliebigen Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern angewendet werden, indem das Verfahren der Verbindung von D-GL mit einem vernetzungsreaktiven Antigen, die Arten des Verbindungsproduktes und dgl. modifiziert werden.

Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung liefert die Erfindung ein einfaches Verfahren zur Bestimmung einer bestimmten Substanz, deren in der Probe enthaltene Menge unbekannt ist, indem ein durch das nachstehend beschriebene Verfahren erhaltener Antikörper oder erhaltenes Antiserum verwendet wird.

Die Reagentien und die Prüfmethode, welche in den nachstehenden Beispielen verwendet werden, sind nachstehend erläutert;

(1) Synthese von DHT-3-(o-carboxymethyl)-oxim (nachstehend als DHT-3-CMO bezeichnet) und Testosteron-3-(o-carboxymethyl)-oxim (nächste- J5 hend als T-3-CM0 bezeichnet:

DHT-3-CMO bzw.T-3-CMO wurden aus DHT und Testosteron nach der Methode von Erianger u. a. (j. BioLChem. 234/1959, S. 1090) hergestellt.

(2) Synthese von Hapten-D-GL: (A) Synthese von DHT-3-(o-carboxymethyl)-oxim-D-GL (nachstehend als DHT-3-D-GL bezeichnet): DHT-3-D-GL wurde nach der gemischten Säureanhydrid-Methode von Erlanger u.a. (J. Biol. Chem. 228/1957, S. 713) unter Verwendung folgender Stoffe hergestellt:

Mischung. Infolgedessen wurden große Mengen von Wasser und Dioxan der Mischung zugesetzt, um die Gelatinierung des darin enthaltenen D-GL zu vermeiden und außerdem die Reaktion adäquat ablaufen zu > lassen. Dadurch wurde durch die gemischte Anhydrid-Methode die Konjugation von D-GL mit Oxim ermöglicht, so daß eine ausreichende Menge des Oxim mit dem D-GL verbunden wurde.

(B) Herstellung von

Testosteron-3-(o-carboxymethyl)-oxim-D-GL
(nachstehend als T-3-D-GL) bezeichnet

Es wurde in der gleichen Weise wie vorbeschrieben vorgegangen mit Ausnahme dessen, daß Τ-3-oxim verwendet wurde, welches ³H-markiertes Τ-3-oxim als Tracer enthielt, um T-3-D-GL zu erhalten (Molarverhältnis von T : D-GL = 30:1).

^;n (3) Synthese von Hapten-KLH

DHT-3-CMO-KLH (nachstehend als DHT-3-KLH bezeichnet) und T-3-CMO-KLH (nachstehend als T-3-KLH bezeichnet) wurden nach der Methode von Erlanger u. a. (J. Biol. Chem. 228/1957, S. 713) hergestellt. Das Molarverhältnis von DHT : KLH und T : KLH der Produkte betrug 10 :1 bzw. 8 :1.

DHT-3-CMO mit DMT-3-CMO markiert mit

³H-Tracer 20 mg

Dioxan (trocken) 6 ml

Tri-n-butylamin 20 μΐ

Isobutylchloroformat 10 μΐ

Destilliertes Wasser 6 ml

D-GL (MG=49 000) 30 mg

IN-NaOH 150 μΐ

Die Zahl der Mole DHT, die sich mit 1 Mol D-GL vereinigen, wurde durch Messung der Radioaktivität von 1 mg ³h-DHT-3-CMO, welches als Tracer verwendet wurde, und der Radioaktivität von 1 mg des Reaktionsproduktes bestimmt Das Molarverhältnis von DHT zu D-GL im Reaktionsprodukt betrug 30 :1.

Wenn die Mengen an verwendetem Wasser und Dioxan den entsprechenden Mengen entsprachen, weiche auf Basis der gemischten Anhydrid-Methode von Erianger u.a. (J. BioL Chem, 228/1957, S.713), berechnet wurden, ergab sich eine Gelatinierung der

jo (4) Radioimmunoprüfungsverfahren

Reagentien

1) ³H-T-Standardlösung:

1,2-³H-T (59 ci/m mol) wurde mit Äthanol verdünnt, j5 um eine Äthanol-Lösung zu ergeben, welche 20 000 dpm/10 μΙ enthielt (45 pg als T).

2) tH-DHT-Standardlösung:

5 «-Dihydro-i,2,4,5,5,7-³H-T (i 14 Ci/'in i'nöl) würde mit Äthanol verdünnt, um eine Äthanol-Lösung zu ergeben, welche 40 000 dpm/10 μΐ (45 pg als DHT) ergab.

3) 0,05 M tris-Pufferlösung {pH 8,0), weiche 0,05% Rinderserum-Albumin (nachstehend als BSA bezeichnet) und 0,1% Rinderserum-y-Globulin (nachstehend als BGG bezeichnet) enthielt.

4) Gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung.

5) Unmarkierte T-Standard-Lösung.

6) Unmarkierte DHT-Standard-Lösung.

Verfahren 1

Bestimmung des Titers
von Anti-Testosteron-Antikörpern

Eine ³H-T-Standardlösung (10 μΐ) wurde in einem Glasrohr durch Verdampfung getrocknet. Alsdann wurde ein Antiserum (0,2 ml; stufenweise verdünnt mit einer tris-Pufferlösung) zugesetzt und beides gut vermischt Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 h lang stehengelassen und dann wurde eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung (0,2 ml) zugesetzt Die Lösung wurde gut umgerührt und bei 3000 U/min 20 min lang zentrifugiert, so daß eine überstehende Flüssigkeit entstand, von welcher 0,2 ml in ein Zählrohr getan wurden. Die Radioaktivität der Probe wurde nach Zusatz eines Szintillators (2 ml; hergestellt durch Lösung von 2,0 g PPO in 1 1 Toluol) bestimmt

Il

Verfahren 2

Bestimmung der Vernetzungsreaktivität
von Anti-Testosteron-Antikörpern mit DHT

10 μΐ einer ³H-T-Standardlösung wurden in Testrohre getan und diese in zwei Gruppen unterseil;. Eine unmarkierte Standardlösung von T und DHT wurden jeweils den Testrohren zugesetzt, welche ³H-T-Standardlösungen von zwei Gruppen enthielten. Die Menge der unmarkierten Steroide, welche zugesetzt wurde, wurde jedoch jeweils schrittweise erhöht. Alle Lösungsmischungen wurden durch Verdampfung gegrocknet. Dazu wurden jeweils 0,2 ml Antiserum zugesetzt und das Ganze gut vermischt. Antiserum wurde bei der Verdiinnung verwendet, welches 60% des ³H-T (45 pg) band.

Verfahren 3
Bestimmung des Titers von Anti-DHT-Antikörpern

Das gleiche Verfahren wie beim Verfahren 1 wurde unter Verwendung von ³H-DHT anstelle von ³H-T durchgeführt.

Verfahren 4

Bestimmung der Vernetzungsreaktivität
von Anti-DHT-Antikörpern mit T

Es wurde das gleiche Verfahren wie im Verfahren 2 durchgeführt, wobei ³H-DHT anstelle von ³H-T verwendet wurde.

Beispiel 1

Herstellung von

Anti-Testosteron spezifischem Antikörper mit
geringer Vernetzungsreaktivität (Maus)

Drei Gruppen von Mäusen (jede Gruppe bestand aus 4 bis 5 weiblichen Tieren; C57BL/6-Siamm; 8-10 Wochen alt) wurden bei diesem Beispiel verwendet. Jeder Maus der 1. Gruppe (Kontrollgruppe) wurde nur

ίο eine Salzlösung verabreicht, und es wurde keL DHT-3-D-GL gegeben. Drei Tage vor einer Primiir-Immunisierung mit T-3-KLH wurde jeder Maus der 2. Gruppe durch i.p.-Injektion DHT-3-D-GL (500 μg) verabreicht.

Allen Mäusen wurde (ip.) T-3-KLH (100μg/Maus) in Salzlösung zusammen mit Freundschem vollständigem Adjuvans verabreicht und 3 Wochen danach die gfershe Menge von T-3-KLH in Salzlösung zusammen mit Freundschem unvollständigem Adjuvans. Desgleichen wurde 5, 7, 9 und 17 Wochen danach die gleiche Menge von T-3-KLH in Salzlösung verabreicht.

3 Tage vor der Sekundär-Immunisierung und 3 Tage vor der Tertiär-Immunisierung (5 Wochen nach der Primär-Immunisierung) mit T-3-KLH wurde jeweils den Mäusen der 3. Gruppe DHT-3-D-GL (500 μg) verabreicht.

Serum wurde dem retro-orbitalen Plexus der Mäuse nacheinander in 2wöchentlichen Intervallen entnommen, um das Titer und die Vernetzungsreaktivität des Antikörpers zu bestimmen. Die Vernetzungsreaktivität wurde nach der Abrahamschen Methode (Abraham, G. E., J. Clin. Endocr., Vol. 29/1969, S. 866-870) bestimmt. Die Resultate sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle !

(A) Titer des Anti-Testosteron-Antikörpers*) und

(B) seine Vernetzungsreaktivität mit DHT**)

Wochen	A B	Gruppe 1 (nicht vorbehandelt)	Gruppe 2 vorbehandelt mit DHT-3-D-GL (500 ag, ip.)	Gruppe 3 (nicht vorbehandelt,'*")
9	A B	3331 30,3+4,9	1004***) 7,1 ± 1,9***)	Antikörper-Bildung: ±
11	A B	4320 54,1+24,1	1711 11,2 ±6,2	desgl.
13	A B	2886 43,0 +12,5	819 7,9 ±4,5	desgl.
19	1494 30,8 ± 10,1	461 7,4 ±4,1	desgl.

Anmerkungen:

*1 - Das Titer ist ausgedrückt durch den Kehrwert der Verdünnung des Serums, welche sich mit 50% von ³H-Testosteron (4$ pg)

verbinden kann. *2 - Die Vernetzungsreaktivität (%) ist ausgedrückt durch (die Menge (ng) von Testosteron, weiche zur 50%igen Verzögerung der

Bindung benötigt wird, die Menge (ng) von DHT, welche zur 50%igen Verzögerung der Bindung benötigt wird) X 100%. *3 - Der Durchschnittswert des Antikörper-Titers ist ausgedrückt durch den geometrischen Mittelwert, und die Vemetzungs-

reaitiviiät ist durch den arithmetischen Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt *4 - DHT-3-GL wurde nicht für die Vorbehandlung verwendet, sondern wurde nach der Primär-immiinicipnino _u»r,k~:.u

Wie diese Tabelle zeigt, war das Antikörper-Titer der

2. Gruppe etwas geringer als das der 1. (KontroIl-)Gruppe, und die Kinetik der Antikörper-Bildung der 2. Gruppe war die gleiche wie der Kontrollgruppe. Andererseits wurde über die gesamte Zeitspanne in der

3. Gnippe keine merkbare Antikörper-Bildung beobachtet. Die Vernetzungsreaktivität mit DHT der 2. Gruppe, welche mit DHT-3-D-GL vorbehandlet wurde, war wesentlich geringer als die der Kontrollgruppe.

Die Beziehung zwischen dem Antikörper-Titer und der Vernetzungsreaktivität des von jeder der Testmäuse erhaltenen Antikörpers wurde aufgezeichnet. Wenn auch die Daten hier nicht wiedergeben sind, so wurde keine wichtige Beziehung zwischen dem Antikörper-Titer und der Vemetzungsreaktivität festgestellt. Im allgemeinen wurde festgestellt, daß die Behandlung mit DHT-3-DOL zu einer Abnahme der Vernetzungsreaktivität mit DHT führt, und daß dies in keiner Wechselbeziehung zur Abnahme im Antikörper-Titer stand. Mit anderen Worten, eine Abnahme der Vsrnetrüiigsreakiivitäi ergab keine merkbare Abnahme im Titer.

Aus diesen Fakten ergibt sich einwandfrei, dab, wenn die Stämme, welche eine Vemetzungsreaktivität mit DHT besitzen, durch Vorbehandlung mit DHT-3-D-GL entfernt werden, die nachfolgende Immunisierung mit T-3-KLH selektiv die Bildung von Antikörper-bildenden Stämmen verstärken kann, welche eine höhere Spezifität gegenüber T besitzen. Eine derartige Fälligkeit der spezifischen Bildung des Antikörpers mit einer niedrigen Vemetzungsreaktivität durch das erfindungsgemäße Verfahren ist für praktische Zwecke äußerst wichtig.

Beispiel 2

Herstellung von spezifischen Anti-DHT-Antikörpern mit geringer Vemetzungsreaktivität (Mäuse)

5 Gruppen von Mäusen, deren jede aus 5 bis 7 weiblichen Mäusen vom C57BL/6-Stamm bestand und welche 8 Wochen alt waren, wurden bei diesem Beispiel verwendet. Mäusen der 1. Gruppe (Kontrollgruppe) wurde kein T-3-D-GL verabreicht und eine Primär-Immunisierung wurde mit DHT-3-KLH vorgenommen. Drei bzw. fünf Wochen danach wurde eine Sekundär- und eine Tertiär-Immunisierung durchgeführt, an welche sich zusätzliche Immunisierungen anschlossen, welche in 2wöchentlichen Inte.vallen durchgeführt wurden. Mäuse der anderen Gruppen wurden ebenfalls gleichzeitig mit den Mäusen der Kontrollgruppe auf die gleiche Weise immunisiert.

Drei Tage vor der Primär-Immunisierung mit DHT-3-KLH wurde den Mäusen der 2. Gruppe durch ip.-Injektion T-3-D-GL (500 μg/Maus) verabreicht. Als weitere Kontrollgruppe wurde den Mäusen der 3. Gruppe DHT-3-D-GL (5O^g/Maus) durch ip.-Injektion verabreicht, und zwar drei Tage vor der Primär-Immunisierung mit DHT-3-KLH.

Drei Tage vor der Sekundär-Immunisierung, welche 3 Wochen nach der Primär-Immunisierung mit DHT-3-KLH durchgeführt wurde, wurde den Mäusen der 4. und 5. Gruppe intraperitoneal jeweils 500 μg pro Maus T-3-D-GL bzw. DHT-3-D-GL verabreicht. Sieben Wochen nach der Primär-Immunisierung und alsdann in 2wöchentlichen Intervallen wurde jeder Maus der 5 Gruppen Serum entnommen, um das Antikörper-Titer und die Vemetzungsreaktivität im Serum zu bestimmen. Die erhaltenen Resultate durch Verwendung des 13 Wochen nach der Primär-Immunisierung entnommenen Serums sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2	Antikörper-Titei*)	Vemetzungs- Reaktivität**)	I I
Gruppe	3457 1286 1079 0 0	90,3 ± 12,9 38,2 ±14,6 86,3 ±23,7	1
1 2 3 4 5

•1 und *2: siehe Fußnote von Tabelle 1.

Tabelle 2 zeigt, daß ein Anti-DHT-Antikörper mit

geringer Vemetzungsreaktivität durch Vorbehandlung mit T-3-D-GL (2. Gruppe) erhalten wurde. Bei diesem Beispiel wurde keine merkbare Anti-DHT-Antikörper-Bildung in der 4. und 5. Gruppe beobachtet, weiche mit T-3-D-GL bzw. DHT-3-D-GL nach der Primär-Immuni sierung behandelt worden waren.

In der 3. Gruppe wurden die Mäuse mit DHT-3-D-GL vorbehandelt und dann mit DHT-3-KLH immunisiert, wobei der auf diese Weise gebildete Anti-DHT-Antikörper eine hohe Vemetzungsreaktivität mit T zeigte wie im Fall der Kontrollmäuse, obwohl fast die gleichen Größen für die Antikörper-Titer in der 2. und der 3. Gruppe beobachtet wurden. Aus diesen Resultaten kann geschlossen werden, daß ein Anti-DHT-Antikörper mit geringer Vemetzungsreaktivität mit T effektiv durch

Behandlung mit T-3-D-GL erhalten wurde. Beispiel 3

Herstellung von Anti-T- oder Anti-DHT-Antikörper (Kaninchen)

6 Gruppen von weiblichen Kaninchen, wobei jede Gruppe aus zwei Kaninchen mit einem Gewicht von etwa 3 kg bestand, wurden verwendet.

Drei Tage vor der Primär-Immunisierung mit 100 μg von DHT-3-KLH, emulgiert in vollständigem Freundschem Adjuvans, wurde dem Kaninchen der I. Gruppe T-3-D-GL (10 mg/Kaninchen) intraperitoneal verabreicht Drei Wochen danach erhielten die Kaninchen subkutan eine Sekundär-Immunisierung mit 200 μg von DHT-3-KLH in unvollständigem Freundschem Adjuvans.

Sie wurden dann subkutan viermal abwechselnd mit 200 μg von DHT-3-KLH in vollständigem bzw. in unvollständigem Freundschem Adjuvans in monatlichen Intervallen aktiviert

Die Kontroll-Kaninchen (die 2. Gruppe) wurden ebenfalls mit DHT-3-KLH in der gleichen Weise wie die I. Gruppe immunisiert Jedoch wurde ihnen kein T-3-D-GL verabreicht. Den Kaninchen der 3. Gruppe wurde T'3-D'GL (10 mg/Kaninchen) intraperitoneal drei Tage vor der Sekundär- und der Tertiär-Immunisierung mit DHT-3-KLH verabreicht, wobei die Sekundär- und die Tertiär-Immunisierung drei bzw. sieben Wochen nach der Primär-Immunisierung erfolgte.

Den Kaninchen der 4. Gruppe wurden intraperitoneal DHT-3-D-GL (10 mg/Kaninchen) drei Tage vor der Primär-Immunisierung mit T-3-KLH verabreicht. Die Methode der Immunisierung mit T-3-KLH wurde in

gleicher Weise wie bei der 1. Gruppe durchgeführt

In der 5. Gruppe (Kontroll-Gruppe) wurden die Kaninchen mit T-3-KLH in gleicher Weise wie die der 4. Gruppe immunisiert. Es wurde ihnen jedoch kein DHT-3-D-GL verabreicht

In der 6. Gruppe wurden den Kaninchen intraperitoneal DHT-3-D-GL (10 mg/Kaninchen) drei Tage vor der Sekundär- und der Tertiär-Immunisierung mit T-3-KLH verabreicht, wobei diese Immunisierungen drei bzw. sieben Wochen nach der Primär-Immunisierung vorgenommen wurden.

Zehn Tage nach jedem der vorbeschriebenen Aktivierungs-Injektions-Verfahren wurde jedem Kaninchen Serum abgenommen und dasselbe bestimmt, wobei sich nachstehende Resultate ergaben.

In der 3. und 6. Gruppe wurde keine merkbare Antikörper-Bildung während der gesamten Periode beobachtet Aus der 2. und 5. Gruppe (Kontrollgruppen) erhaltene Anti-DHT- und Anti-T-Antikörper zeigten im wesentlichen die gleiche Reaktivität mit den beiden Haptenen, welche zur Immunisierung und für das vernetzungsreaktive Hapten verwendet wurden. So zeigten die Anti-DHT-Antikörper der Kaninchen der 2. Gruppe eine 100%ige Vemetzungsreaktivität mit T und die Anti-T-Antikörper der Kaninchen der 5. Gruppe eine 95,2%ige Vernetzungsreaktivität mit DHT. Andererseits zeigten die Kaninchen der 1. und 4. Gruppe eine merkbar geringe Vernetzungsreaktivität, die Anti-DHT-Antikörper der Kaninchen der 1. Gruppe eine ll,9%ige Vernetzungsreaktivität mit T und die Anti-T-Antikörper der Kaninchen der 4. Gruppe eine 22,0%ige Vernetzungsreaktivität mit DHT.

Beispiel 4 Bestimmung von T und DHT im menschlichen Blut

durch Verwendung spezifischer

Anti-T- und Anti-DHT-Antikörper, welche von Kaninchen erhalten wurden

1) Herstellung von Anti-T- und Anti-DHT-Proben

Anti-T- und Anti-DHT-Antikörper mit geringer Vernetzungsreaktivität wurden von Kaninchen der Gruppen 1 und 4 der vorbeschriebenen Beispiele erhalten. Nachstehende Tests wurden durchgeführt, um die praktischen Möglichkeiten dieser Antikörper zur Bestimmung von T und DHT im menschlichen Serum zu untersuchen.

Für diesen Zweck wurden Proben von menschlichem Serum gegebene Mengen von T bzw. DHT zugesetzt und die Beziehung zwischen der zugesetzten Menge und der Menge an T bzw. DHT untersucht, welche durch Radioimmunoprüfung unter Verwendung dieses Antiserums bestimmt wurde. Um die Menge von T im menschlichen Serum zu bestimmen, wurde T (1,2 und 4 ng) oder DHT (0,1; 0,2 und 03 ng) einem angesammelten Serum zugesetzt (1 ml: entnommen von Frauen, welches einen niedrigen T-Wert hatte), welchem dann 3H-T (2000 dpm) bzw. ³H-DHT (2000 dpm) zugesetzt wurde, um die Ausbeute bei der Extraktion zu bestimmen. In jedem Fall wurde die Mischung gut gemischt und dann eine Mischung von Hexan/Äther (3:2, 3 ml) zugesetzt und anschließend mit einem Wirbelmischer 1 min lang geschüttelt. Anschließend wurde das Glas in einem Trockeneis/Aceton-Bad 10 see lang stehengelassen und die organische Lösungsmittelschicht wurde in ein anderes Glas übergeführt. Das organische Lösungsmittel wurde abgedampft und dem Rückstand wurde Äthanol (2 ml) unter Schütteln zugesetzt Ein Teil der Äthanol-Lösung wurde in ein kleines Gas gegebea Die Menge der in das Glas gegebenen Lösung wurde derart eingestellt daß die Bestimmung von T unter Verwendung der Verzögerungskurve möglich war, welche durch das vorerwähnte Antiserum geeicht war. Die Lösung wurde durch Verdampfung getrocknet und der Radioimirunoprüfung unterworfen, wobei der schwach vernetzungsrea- gierende Anti-T-Antikörper verwendet wurde, welcher durch die DHT-3-D-GL-Behandlung erhalten wurde. Andererseits wurde eine Äthanol-Lösung (0,5 ml) in einen Glaskolben getan und durch Verdampfung getrocknet Dem Rückstand wurde ein Szintillator zugesetzt und gezählt, um die Ausbeute der Extraktion zu bestimmen. Dieses Ausbeute-Verhältnis wurde verwendet um den durch die Radioimminoprüfung erhaltenen Wert zu korrigieren.

Um die Menge von DHT im Serum zu berdmmen,

wurde dem angesammelten Serum von Frauen (1 ml) DHT (0,2 und 04 ng) bzw. T (0,2 und 0,5 ng) und danach ³H-T (200 dpm) bzw. ³H-DHT (2000 dpm) zugesetzt um die Ausbeute zu bestimmen. Der Mischung wurde Hexan/Äther (3:2, 3 ml) zugesetzt und in gleicher Weise wie vorbeschrieben extrahiert Dem Rückstand des Extraktes wurde Äthanol (2 ml) zugesetzt und ein Teil der Äthanol-Lösung wurde in ein kleines Glas gegeben. Die Menge der Lösung im Glas wurde derart eingestellt daß sie ausreichte, um die Bestimmung von

DHT zu ermöglichen, wobei die Dämpfungskurve von DHT verwendet wurde, welche durch Verwendung des vorgenannten Antiserums erhalten war. Die Lösung wurde durch Verdampfung getrocknet und der Radioimmunoprüfung unterworfen, wobei das Antiserum mit geringer Vernetzungsreaktivität verwendet wurde, welches durch die Behandlung mil T-D-GL erhalten worden war. Andererseits wurde die Äthanol-Lösung (0,5 ml) in einen Glaskolben gegeben und das Äthanol durch Verdampfung entfernt Dem Rückstand wurde ein Szintillator zugesetzt und gezählt um die Ausbeute bei der Extraktion zu bestimmen. Dieses Ausbeute-Verhältnis wurde verwendet um den durch die Radioimmunoprüfung erhaltenen Wert zu korrigieren. Als Resultat wurde festgestellt, daß, wenn ein Anti-T-Antikörper mit geringer Vernetzungsreaktivität verwendet wurde, um T (1, 2 und 4 ng) zu messen, welches einem normalen weiblichen menschlichen Serum zugesetzt war, welches ursprünglich einen T-Wert von 030 ng hatte, der gemessene T-Wert 1,15;

so 230 bzw. 4,60 ng betrug.

Wenn andererseits DHT (0,1; 0,2 und 03 ng) dem weiblichen Serum anstelle von T zugesetzt wurde, um den Einfluß von DHT auf die Menge des geprüften T zu untersuchen, wurde kein merkbarer Einfluß festgestellt, und die Menge an T im normalen weiblichen menschlichen Serum blieb im großen und ganzen unverändert

In einem getrennten Versuch wurde dem normalen weiblichen menschlichen Serum DHT (0,2 und 0,5 ng) zugesetzt und die Menge von DHT im Serum durch Verwendung eines Anti-DHT-Antikörpers mit geringer Vernetzungsreaktivität bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die Menge von DHT im normalen weiblichen menschlichen Serum vor dem Zusatz 0,21 ng betrug und nach dem Zusatz auf 0,41 bzw. 0,72 ng anstieg. Diese Werte waren ausreichend in Übereinstimmung mit den zugesetzten Mengen von DHT. Wenn andererseits T (0,2 und 03 ng) dem normalen

Tabelle 3

Menge von
zugesetztem DHT

Menge von
zugesetztem'T

(ng)

10

10

5,67

10,17

9,20

In gleicher Weise wurden dem Serum (0,1 ml) T und DHT (jeweils 5 bzw. 10 ng; 10 bzw. 5 ng oder 10 bzw. 10 ng) zugesetzt und die T-Mengen wurden durch Verwendung des Anti-T-Antikörpers mit geringer Vernetzungsreaktivität bestimmt. In jedem Fall betrugen die festgestellten Mengen von T 6,80, 103 bzw. 10,5 ng, wie dies in Tabelle 4 dargestellt ist, woraus sich eindeutig ergibt, daß, wenn der vorgenannte Anti-T-Antikörper mit geringer Vernetzungsreaktivität verwendet wird, T in Gegenwart von DHT, welches ein Vernetzungsreagierendes Antigen ist, genau analysiert wird.

Tabelle 4

Menge von
zugesetztem T

Menge von
zugesetztem DHT

(ng)

Festgestelltes T

(ng)

10

5
10

6,80
10,3
10.59

ίο

weiblichen Serum anstelle von DHT zugesetzt wurde, um den Einfluß von T auf die Menge vom geprüften DHT zu untersuchen, so ergab sich keine merkbare Veränderung der DHT-Menge im normalen weiblichen Serum durch Zusatz von T.

Es ist offenbar, daß die Mengen von T und DHT im Serum durch Verwendung der im Beispiel 3 beschriebenen Antikörper mit geringer Vernetzungsreaktivität genau bestimmt werden können.

2) Prüfung einer Probe,
welche eine Mischung aus spezifischem Antigen
und vernetzungsreagierendem Antigen enthält

Die DHT-Menge im menschlichen Blut wurde wiederum bestimmt durch Verwendung eines Antikör- κ> pers mit geringer Vernetzungsreaktivität, der von Kaninchen herrührte, wie vorstehend beschrieben. In jedem Fall wurden DHT und T (5 und 10 ng; 10 und 5 ng bzw. 10 und 10 ng) (0,1 m) gleichzeitig dem angesammelten weiblichen menschlichen Serum zugesetzt, und die Bestimmung vrurde in gleicher Weise wie unter Punkt (i) vorstehend beschrieben durchgeführt Ais Resultat wurde festgestellt, daß, wie Tabelle 3 zeigt, selbst wenn eine große Menge von T, d. h. ein vernetzungsreaktives Antigen in der Probe vorhanden ist, die Mengen von DHT in jedem Fall 5,67, 10,17 und 9,20 ng betrugen. Infolgedessen kann festgestellt werden, daß DHT genau analysiert werden kann durch Verwendung des im Beispiel 3 erhaltenen Anti-DHT-Antikörpers mit geringer Vernetzungsreaktivität, und zwar selbst wenn eine große Menge von T, bei dem es sich um ein vernetzungsreai:ives Antigen handelt, in der Probe vorhanden ist

35

Festgestelltes DHT (ng)

40

50

55

60

65

3) Prüfung von menschlichen Proben
(direkte Methode)

Der Ausdruck »direkte Methode« bedeutet das Prüfverfahren, welches die vorherige Trennung von T und DHT nicht benötigt Zum Vergleich sind die durch ein herkömmliches Verfahren erhaltenen Werte ebenfalls angegeben. Bei dem letzteren Verfahren werden T und DHT durch Papierchromatograptiie vor der Bestimmung getrennt

3.1) Prüfung von T im menschlichen Serum
(A) Herstellung der Proben

Männliches Menschenserum (jeweils (0,1 ml) und weibliches Menschenserum (jeweils 0,5 ml) wurden jeweils in Testrohre gegeben und dann wurde ³H-T (jeweils 300 dpm) zugesetzt, um die Ausbeute bei der Extraktion oder bei der Extraktions-Chromatographie zu bestimmen. Denynännlichen Menschenserum wurde destilliertes Wasser (jeweils 0,5 ml) zugesetzt Den Serumproben wurde eine Mischung von Hexan/Äther (3 :2, jeweils 3 ml) zugesetzt und das Ganze dann mittels eines Wirbelmischers 1 min lang gut durchgemischt Die Testrohre wurden dann in ein Bad aus Trockeneis und Azeton 10 see lang eingesetzt, um die Serum-Fraktionen einzufrieren. Die organische Lösungsmittelschicht wurde in ein anderes Testrohr getan und das organische Lösungsmittel durch Verdampfung entfernt

(B) Direkte Methode

Äthanol (0,4 ml) wurde jedem Rückstand der männlichen Menschserum-Probe zugesetzt und das Ganze gut durchgemischt und die Mischung dann in ein Radioimmunoprüfrohr gegeben. Die Menge der Lösung im Testrohr wurde auf 50 bis 400 pg eingestellt, d. h. 100 μΙ im Fall des Normalbereiches und 50 μΙ im Fall des Serums mit großer T-Menge wie bei den Testnummern 1, 2 und 3 in nachstehend zu beschreibender Tabelle 5. Um die Ausbeute bei der Extraktion zu bestimmen, wurde die Lösung (100 μΙ) in einen Glaskolben getan und durch Verdampfung getrocknet. Nach Zusatz eines Szintillator wurde der Rückstand gezählt.

Bei weiblichem Menschenserum wurde jedem Rückstand Äthanol (0,7 ml) zugesetzt und die Äthanol-Lösung (0,5 ml) in einen Radioimmunoprüfkolben gegeben. Um die Ausbeute bei der Extraktion zu bestimmen, wurde die Lösung (100 μΐ) in einen Glaskolben gegeben und durch Verdampfung getrocknet Der Rückstand wurde nach Zusatz eines Szintillators gezählt.

In beiden vorgenannten Fällen wurde Äthanol durch Verdampfung unter einem Stickstoffstrom entfernt und der erhaltene Trockenextrakt für die Radioimmunoprüfung verwendet.

(C) Papierchromatographie

Der in gleicher Weise wie bei der direkten Methode gemäß (A) hergestellte Trockenextrakt wurde auf einen Papierstreifen gegeben und dreimal mit 50 μ! Chloro form durchgespült. Auf einen identischen Papierstreifen wurde T (10μg) als Vergleichssubstanz gegeben, den man mit jeder Bestimmungsgruppe durchlaufen ließ.

Die Papierstreifen wurden in eine Chromatographiekammer eingesetzt, welche ein Lösungssystem aus Cyclohexan/Methanol/Wasser = 10:8:2 enthielt. Nach 2 Stunden Ruhe wurden sie in der oberen Schicht

des Lösungssystems entwickelt

Nach 16stündiger Entwicklung wurde der als Vergleichssubstanz verwendete T-Kleks Surch Ultraviolett-Absorption bei 254 nm festgestellt, und ein 3 cm langer, der Lage dieser Vergleichssubstanz entsprechender Abschnitt des Teststreifens wurde abgetrennt und mit Äthanol extrahiert Das Äthanol wurde durch Verdampfung im Stickstoffstrom entfernt Der Rückstand wurde dann in gleicher Weise wie bei der direkten. Methode (B) beschrieben zur Radioimminoprüfung verwendet

(D) Radioimminoprüfung

3.2) Prüfung der DHT im weiblichen Menschenserum

Die Probenherstellung des Sen ims, Extraktion und Trennung von DHT und T durch Papierchromatographie wurden in der gleichen Weise wie bei der Prüfung von T unter Verwendung einer weiblichen Menschenserum-Probe durchgeführt Die Lage eines DHT-Vergleichsklekses wurde durch Besprühen mit Lösungen von 1 %igem m-Dinitrobenzol in absolutem Äthanol und 2,5 N NaOH in absolutem Äthanol in jeweils gleicher Menge festgestellt Die Radioimminoprüfung von DHT wurde durch Verwendung der Standard-Äthanol-Lösung von DHT und einer Äthanol-Lösung von ³H-DHT (40 00(Ηριπ/10μΙ) in gleicher Weise wie bei der Radioimminoprüfung von T durchgeführt. In allen Fällen wurde das Resultat der Radicimminoprüfung durch das Ausbeute-Verhältnis korrigiert

Bei der direkten Methode lag das Ausbeute-Verhältnis von T bzw. DHT innerhalb eines Bereiches von 95 bis 100%, so daß die Korrektur der Ausbeute durch Zusatz von 'H-T oder ³H-DHT für Routinearbeiten nicht erforderlich sein dürfte-

Die erzielten ResjlRte sind in den Tabellen 5 und 6 wiedergegeben.

(E) Resultate und Analyse

15

Um eine T-Standardkurve zu erstellen, wurde Äthanol-Lösung, welche 0, 20, 50, 200 bzw. 400 pg T enthielt in doppelter Ausfertigung in Testrohre getan. Diesen und anderen Testrohren mit Testproben wurde eine Äthanol-Lösung (jeweils 10 ul), welche 20 000 dpmi von ³H-T/10 μΐ enthielt zugesetzt und das Äthanol dann durch Verdampfung entfernt Ein von Kaninchen herrührendes Anü-T-Antiserum wurde mit einer 0.05 ΎΑ tris-Pufferiösung (pH = 8,0; welche 0,05% BSA und 0,1% BGG enthielt) auf die Konzentration von B₀ = 60% verdünnt, welche fähig ist, 60% von 20 000 dpm von ³H-T (45 pg wie T) zu binden. Jeweils 0,2 ml dieser Antiserum-Lösung wurden in jedes Testrohr getan und anschließend mit einem Wirbelmischer gut vermischt Separat wurde diese tris-Pufferlösung (jeweils 0,2 ml) in zwei Testrohre gegeben, weiche jeweils 20 000 dpm ³H-T allein enthielten, woraufhin das Ganze gut durchgemischt wurde, um die gesamten dpm (Bo = 100%) zu erhalten. In jedem Fall wurde dann das Ganze bei Raumtemperatur 2 Stunden lang stehengelassen, anschließend der Lösung ein gesättigtes Ammoniumsulfat (0,2 ml) zugesetzt und das Ganze gut durchgemischt Nach 10 min Zentrifugieren bei 3000 U/min wurden 0,2 ml der überstehenden Flüssigkeit in einen Glaskolben gegeben.

Nach Zusatz eines Szintillator (0,2 ml) wurde die Aktivität gezählt und auf einen Wert von BZBo(Vo) berechnet

45

Tabelle 5	Festgestelltes T (ng/ml)	Papier chromatographie
Test ^	direkte Methode	9,60
1 ( i	10,35	15,36
1 '	13,34	19,08
2 s	22,84	9,16
3 *	8,92	4,38
4 i	4,40	4,90
5 *	5,00	7,95
6 *	8,20	7,10
7 *	7,43	0,740
8 <	0,88	0,292
9 *	0,310	0,191
10 *	0,180	0,158
	0,160	0,356
Verwendetes	0,340	0,490
Serum ♦männlich '•weiblich)	0,500	0,240
	0,250	0,218
	0,154
t*
I*
11 **
12 **
13 **
14 **
15 **
16 **

Aur dieser Tabelle zeigt sich, daß die Resultate der beiden Prüfmethoden miteinander übereinstimmen.

Tabelle 6

(Verwendetes Serum - Serum von Frauen)

Test Nr.	Festgestelltes	DHT (ng/ml)	0,154
	direkte Methode Papierchromatographie	0,201
1	0,175	0,200
2	0,210	0,190
3	0,198	0,280
4	0,195	0,260
5	0,280	0,232
6	0,250	0,198
7	0,221
8	0,201

In dieser Tabelle stimmen die Resultate der beiden Methoden miteinander überein.

Wie diese experimentellen Resultate zeigen, ist es mit Hilfe der direkten Methode der Erfindung bei Verwendung eines Antikörpers mit geringer Vernetzungsreaktivität möglich, einfach und genau die gewünschte Substanz selbst dann zu prüfen, wenn vernetzungsreaktives Antigen vorhanden ist In diesem Fall ist es nicht mehr erforderlich, das vernfctzungsreaktive Antigen vorher durch Papierchromatographie zu trennen, wie dies bei den herkömmlichen Verfahren bisher erforderlich war.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, bei welchem ein spezifischer Antikörper sowie ein Stamm, welcher einen derartigen Antikörper zu erzeugen vermag, durch Vorbehandlung eines Lebewesens mit einem Konjugat eines vernetzungsreaktiven Antigens und D-GL erhalten wurde, wird einem vernetzungsreaktiven Antigen eine immunologische Reaktionslosigkeit induziert. Dieses Prinzip ist nicht auf die vorbeschriebenen speziellen

Durchführungsbeispiele unter Verwendung von T-3-D-GL und DHT-3-D-GL beschränkt, sondern kann auch auf andere Fälle angewendet werden, wie sie im nachfolgenden Beispiel 5 angegeben sind, wobei im wesentlichen die gleichen Resultate erzielt wurden, selbst wenn T und DHT mit den Trägern an unterschiedlichen Stellen gekuppelt waren. Im folgenden Beispiel wurden T und DHT wiederum als Modellsystem verwendet und ihre Kupplungsstellen wurden von der 3. bis zur 15. Position verändert, so daß die Struktur des an der Oberfläche von Trägermolekülen freiliegenden Haptens verändert wurde.

Beispiel 5

Feststellung der Eigenschaften eines Antiserums, welches durch Verwendung eines Konjugats von 15 /J-Carboxyäthylmercaptotestosteron (nachstehend bezeichnet als 15 0-CEM-T) und 15 0-Carboxyäthylmercapto-5 a-dihydroiestosteron (nachstehend bezeichnet als 15 0-CEM-5a-DHT) mit KLH und D-GL erhalten wurde:

Bei diesem Beispiel wurde 15 /3-CEM-T nach dem Verfahren synthetisch hergestellt, welches von Rao, P. N. (Steroid, 28/1976, S. 101) berichtet wird, während 15/?-CEM-5a-DHT synthetisch nach dem Verfahren hergestellt wurde, welches von Rao, P. N., u. a. (Steroid, 29/1977.S. 171)berichtet wird.

Die Konjugation von 15 0-CEM-T zu D-GL und KLH und die Konjugation von 15 0-CEM-5 a-DHT zu D-GL und KLH wurde in der gleichen Weise durchgeführt, wie dies für die vorgenannte Konjugation von DHT-3-CMO oder T-3-CM0 zu D-GL oder KLH beschrieben ist. Die auf diese Weise erhaltenen Konjugate werdeti nachstehend als T-15-D-GL, T-15-KLH. DHT-15-D-GL bzw. DHT-15-KLH bezeichnet.

Bei diesem Beispiel wurden 6 Gruppen von Mäusen, deren jede aus 7 Mäusen (C57BL/6 Stamm: 8—10 Wochen alt) bestand, verwendet.

Dabei wurde die 1. Gruppe als Kontrollgruppe verwendet und dim Mäusen wurde eine Salzlösung (ohne DHT-15-D-GL) verabreicht. Den Mäusen der 2. Gruppe wurde drei Tage vor der Primär-Immunisierung DHT-15-D-GL (jeweils 500μg/Maus) verabreicht Die 3. Gruppe wurde wiederum als Kontrollgruppe benutzt und diesen Mäusen wurde intraperitoneal T-15-D-GL (Jeweils 500 μg/Maus) drei Tage vor der Primär-Immunisemng mitT-15-KLH verabreicht Zur Immunisierung der 1., 2. und 3. Gruppe wurde T-15-KLH mit jeweils 100 μg/Maus verwendet Nach drei Wochen erfolgte die Sekundär-Immunisierung dieser Mäuse und im Anschluß daran alk zwei Wochen zusätzliche Aktivierungs-Immunisierungen. Die Mäuse der 4, 5. und 6. Gruppe wurden mit DHT-15-KLH immunisiert Drei Tage vor der Primär-Immunisierung mit DHT-15-KLH wurde den Mäusen der 5. Gruppe intraperitoneal T-15-D-GL (500 iLg/M&us) verabreicht Gleichzeitig mit der 5. Gruppe dienten die Mäuse der 4. Gruppe als Kontrollgruppe und erhielten anstelle von T-15-D-GL intraperitoneal Salzlösung verabreicht

Den Mäusen der 6. Gruppe wurde als weitere Kontrollgruppe intraperitoneal DHT-15-D-GL (500 μ§/ Maus) drei Tage vor der Primär-Immunisierung mit DHT-15-KLH verabreicht

Sieben Wochen nach der Primär-Immunisierung wurde jeder Maus in 2wöchentlichen Intervallen Serum entnommen, um das Antikörper-Titer und die Vernetzungsreaktivität zu messen. Dabei stellte sich heraus, daß das 13 Wochen nach der Primär-Immunisierung entzogene Antiserum das höchste Antikörper-Titer besaß, von welchem die nachstehenden Resultate erzielt wurden.

1) Eigenschaften der Anti-T-Antiseren
der 1., 2. und 3. Gruppe

Ausgedrückt als Kehrwert der Verdünnung des

ίο Antiserums, fähig zum Binden von 50% von ³H-T (45 pg.), liegen die Anti-T-Antikörper-Titer der Mäuse der 1. Kontrollgruppe und der 2. Gruppe innerhalb der Bereiche von 1600 bis 9000 bzw. 1000 bis 3500. Die Mäuse der 3. Gruppe, denen T-15-D-GL verabreicht worden war, zeigten keine Antikörper-Bildung.

Bei Bestimmung nach der Abrahamschen Methode zeigte das Antiserum der Mäuse der 1. Gruppe Vernetzungsreaktivitäten von 4,1 bis 8,2, während die Vernetzungsreaktivitäten· im Antiserum der Mäuse der

2. Gruppe 0,27 bis 0,94 betrugen. Die Resultate der 2. Gruppe liegen über den Werten der Vernetzungsreaktivitäten mit DHT, welche von anderen berichtet wurden und mit anderen bekannten Anti-T-Antiseren erzielt wurden. Es kann daher gesagt werden, daß die Vernetzungsreaktivität mit DHT des erhaltenen Antiserums praktisch erfindungsgemäß vernachlässigt werden kann. Es ist bekannt, daß 1,81% die geringste Vernefungsreaktivität mit DHT irgendeines bisher in der Fachliteratur genannten Anti-T-Antiserums ist, und

ω daß Rao u. a. einen derart niedrigen Wert durch Verwendung eines Anti-T-Antiserum erhielten, welches durch Immunisierung von Kaninchen mit 15 /J-CEM-T-BSA erhalten wurde, wie dies auch in dem vorbeschriebenen Beispiel verwendet wurde (P. N. Rao

u. a. und P. H. Moore Jr.: Steroid, 28/1976, S. 101). Die Vernetzungsreaktivitäten der Mäuse der 1. Gruppe bei diesem Beispiel sind im wesentlichen diesem niedrigsten Wert gleich.

2) Eigenschaften der Anti-DHT-Antiseren
aus der 4., 5. und 6. Gruppe

Ausgedrückt als Kehrwert der Verdünnung, welche eine 50%ige Bindung von ³H-DHT (45 pg) ermöglicht, lagen die Anti-DHT-Antikörper-Titer der 4. Gruppe (Kontrollgruppe) innerhalb eines Bereiches von 1500 bis 5600. Die Werte der 5. Gruppe, deren Mäuse T-15-D-GL bekommen hatten, lagen im Bereich von 1000 bis 7600. Die Mäuse der 6. Gruppe, denen

so DHT-15-D-GL verabreicht worden war, zeigten keine Antikörper-Bildung.

Bei einer Untersuchung nach der Abrahmschen Methode der Antiseren, welche den Mäusen der 5. Gruppe entnommen wurden, die mit T-15-D-GL behandelt worden waren, lagen die Vernetzungsreaktivitäten mit T der auf diese Weise erhaltenen Antiseren innerhalb eines Bereiches von 6,5 bis 19,0% im Gegensatz zu den Vemetzungsreaktivität-Werten von 48,3 bis 68,5 in Antiseren der Mäuse der 4. Gruppe (Kontrollgruppe). Diese Fakten zeigen, daß die Verabreichung von T-15-D-GL die Vemetzungsreaktivität mit T sehr stark reduziert

Die Antikörper-Bildung wurde bei den Mäusen der 6. Gruppe, denen DHT-15-D-GL verabreicht worden war, nicht festgestellt Als Grund dafür wird angenommen, daß durch Verabreichung von DHT-15-D-GL Anti-DHT-Antikörper produzierende Stämme spezifisch inaktiviert werden.

Bemerkungen zu den Beispielen 6—10

Die Reagentien und Prüfmethoden, welche in den nachstehenden Beispielen verwendet wurden, werden nachstehend erläutert. In diesen Beispielen wurde das vorbeschriebene Prinzip der Erfindung auf Peptid-Determinanten angewendet.

Ci-) Herstellung von Pentagastrin-D-GL-Konjugat

Literatur: Liu u. a.,

Biochemistry, Vol. 18/1979, S. 690

(RIA) Synthese von S-Acetylmercaptosukzinyl-D-GL (nachstehend als As-S-D-GL bezeichnet)

D-GL (MG 34 300; 40 mg = 1,166 μ mol) wurde in einer 0,125 M Phosphat-Pufferlösung (900 μΙ; pH = 7,2) gelöst und der pH-Wert wurde auf 7,2 mit 1 N NaOH-Lösung eingestellt. Nach Zusatz von 50 μΙ (57,44 μ mol) einer Dimethylformamid-Lösung (nachstehend a!s DMF bezeichne·.) von S-Acetylmercaptosuk- :o zinanhydrid (200 mg/ml) wurde die Mischung bei Raumtemperatur 30 min lang gerührt. Während der Reaktion wurde der pH-Wert der Mischung auf 7,2 gehalten. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Lösung in eine Sephadex-G-25-Säule getan und mit 0,01 M Phosphat-Puffersalzlösung (pH = 7,2), welche 0,01 M Na₂-EDTA enthielt, ins Gleichgewicht gebracht, um das Reaktionsprodukt von unreagiertem S-Acetylmercaptosukzinanhydrid zu trennen. Eine Fraktion (100 μΐ) der Lösung, welche das Reaktionsprodukt enthielt, wurde mit einer wäßrigen Lösung von 0,5 M Hydroxylamin (100 μΐ = 50 μΐ mol; pH = 7J) versetzt und 20 min lang bei 37°C zur Entfernung der Acetyl-Schutzgruppe bebrütet. Die Mengen der Sulfhydryl-Gruppen, welche in D-GL eingeführt wurden, wurden nach der Methode von Ellman u. a. (Arch. Biochem. Biophys, Vol. 83/1959, S. 70) bestimmt. Die Menge der in ein Molekül von D-GL eingeführten S-Acetylmercapto-Gruppe betrug etwa 15. Das auf diese Weise erhaltene S-Acethylmercaptosukzinyl-D-GL wird nachstehend als Ac-Sis-D-GL bezeichnet. Die Ausbeute betrug annähernd 77%. Da D-GL keine Extinktion bei 280 nm besitzt, kann die Ausbeute und die das abgeleitete D-GL enthaltende Fraktion nicht durch Extinktion bei 280 nm bestimmt werden. Daher wurde die Ausbeute durch Verwendung eines Reaktionsproduktes als Kontrollsubstanz bestimmt, welche durch die Reaktion von N-Succinimidyl-3-(4-hydroxyphenyl)-propionat mit D-GL erhalten wurde, und in eine Säule von SephadexG-25 eingefüllt Da dieses Produkt eine Extinktion bei 280 nm besitzt, wurde die Bestimmung zweckmäßigerweise durch die Extinktion bei 280 nm durchgeführt

(Rl B) Herstellung von

m-Maleimidobenzoyl-pentagastrin

(nachstehend bezeichnet als MB-pentagastrin)

55

Pentagastrin (11 mg; 16,1 μ mol) wurde in einer 0,1 M Phosphat-Pufferlösung (9,5 ml; pH = 8,0) gelöst und als Ganzes m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-sukzinimidester (253 mg; 80,5 μ mol) (nachstehend bezeichnet als MBS) zugesetzt, welches in DMF (1 ml) gelöst war. Die Mischung wurde gerührt und die Reaktion durch eine Dünnschicht-Chromatographie überwacht, welche ein Lösungsmittelsystem von Cyclohexan/Äthylacetat = 1:1 (VoI) verwendete. 25 min nach Beginn der Reaktion wurde Dichlormethan (3 ml) der Reaktionsmischung zugesetzt um unreagiertes MBS zu entfernen.

Die Mischung wurde kräftig gerührt und zentrifugiert.

Die obere Schicht der Pufferlösung wurde in ein anderes Testrohr getan. Die Dichlormethan-Schicht (untere Schicht) wurde mit einer geringen Menge eines Phosphat-Puffers versetzt, das Ganze dann gut durchgemischt und zentrifugiert. Die obere Schicht wurde mit dieser Lösung kombiniert. Durch Dünnschicht-Chromatographie wurde bestätigt, daß das unreagierte M BS aus der Fraktion der Pufferlösung, welche MB-Pentagastrin enthielt, fast vollständig entfernt war.

Separat wurde die vorgenannte Pufferlösung (20 μΐ), welche MBS-Pentagastrin enthielt, einer wäßrigen Lösung von 2-Mercaptoäthanol (20 μΙ; 70 η mol; desoxidiert im Stickstoffstrom) zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 20 min lang durchgeführt, und die molare Menge an verbrauchtem 2-Mercaptoäthanol wurde durch die Ellmansche Methode bestimmt, welche der Menge der in Pentagastrin eingebrachten Maleimidobenzoyl-Gruppe entspricht. Die Menge der in ein Molekül von Pentagastrin eingebrachten Maicirnidcbenzoyl-Gruppe betrug 0,9. Diese Verbindung wird nachstehend als M B₀^-Pentagastrin bezeichnet.

(R 1 C) Herstellung des Konjugats aus
Pentagastrin und D-GL

Eine Lösung des in (Rl A) hergestellten Ac-Si₃-D-GL wurde mit einer Lösung des in (RlB) hergestellten MBo.9-Pentagastrin vermischt, um die Reaktion'in folgender Weise durchzuführen. Nach vollständiger Desoxidierung im Stickstoffstrom wurde der Mischung eine 5 M wäßrige Lösung von Hydroxylamin (500 μΙ; pH = 73) zugesetzt und das Ganze 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Alsdann wurde die Reaktionslösung teilweise abgezogen, um das Vorhandensein unreagierter SH-Gruppen zu untersuchen. Keine derartige Gruppe wurde festgestellt. Dies bedeutet, daß keine SH-Gruppe vorhanden war, welche sich nicht mit MB-Pentagastrin verbunden hatte. Dadurch wurde bestätigt, daß die gesamte von D-GL festgehaltene SH-Gruppe mit MB-Pentagastrin reagiert hatte.

Zwei Stunden nach Zusatz der wäßrigen Lösung vor Hydroxylamin wurde der Reaktionsmischung 2-Mercaptoäthanol zugesetzt, um eine endgültige Konzentration von 1 mM zu erreichen, woraufhin 20 min lang gerührt wurde.

Anschließend wurde die Reaktionsmischung gegen 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (pH = 72) etwa 24 h lang durch Verwendung einer Zellulose-Membrane dialysiert und die so erhaltene Lösung mit oder ohne Verdünnung verwendet.

Das Mol-Verhältnis von Pentagastrin zu D-GL in dem auf diese Weise erhaltenen Pentagastrin-D-GL-Konjugat betrug 15 :1. Dieses Produkt wird nachstehend als Pentagastrinis-D-GL bezeichnet

(R2) Herstellung von

CCK-8-P-keyhole limpet hemocyanin

(nachstehend bezeichnet als CCK-8-P-KLH)

(R2A) Herstellung von

S-Acetyl-mercaptosukzinyl-KLH

(nachstehend bezeichnet als AC-S-KLH)

Die Herstellung erfolgte in gleicher Weise wie die Herstellung von Ac-S-D-GL gemäß (Rl A).

Vor der Synthese wurde KLH (70 mg) in einer l%igen Lösung von K₂COa (1,4 ml) gelöst und gegen eine 0,125 M Phosphat-Pufferlösung (pH = 72) dialysiert, woraufhin die Extinktion bei 280 nm gemessen

wurde, so daß die Menge an KLH bestimmt wurde.

S-Acetylmercaptosukzinanhydrid (6,5 μ mol) wurde der KLH-Lösung von 0,7 ml zugesetzt, welche 26,0 mg enthielt (entsprechend 260 iimol unter der Annahme, daß das Molekulargewicht etwa 100 000 beträgt; pH = 7,2). Die Synthese wurde in gleicher Weise wie in (6-A) beschrieben durchgeführt. Das Mol-Verhältnis der S-Acetylmereapto-Gruppe zu KLH im Produkt betrug 6,8 (nachstehend bezeichnet als AC-S₆^-KLH).

(R2B) Herstellung von

m-Maleimidobenzoyl-CCK-8-P

(nachstehend bezeichnet als MB-CCK-8-P)

Die Herstellung erfolgt in gleicher Weise wie die Herstellung von MB-Pentagastrin. CCK-8-P (0,42 mg; 385 η mol), welches durch die Fragment-Kondensations-Methode synthetisch hergestellt worden war. würde in 0,2 M Phosphat-Pufferlösung (0,5 mi) gelöst und der Reaktion mit MBS (600 μg; 1,9 μΐυοΐ) unterworfen, wobei 50 μΐ einer DMF-Lösung von 1,2 mg MBS in 100 μΙ DMF verwendet wurde. Das Reaktionsprodukt enthielt CCK-8-P und MB in einem Verhältnis von 1 :1,0(nachstehend als MBi.o-CCK-8-P bezeichnet).

(R2QCCK-8-P-KLH

Eine AC-Sej-KLH-Lösung(23 ml; 75,9 η mol), welche gemäß (R2A) hergestellt worden war, und eine gemäß (R2B) hergestellte MBi,₀-CCK-8-P-Lösung wurde miteinander vermischt und dieser Mischung wurde 0,5MNH₂OH (03 cc; 150μπιο1) zugesetzt. Anschließend wurde eine der in (RlC) beschriebenen analoge Behandlung durchgeführt. Das Verhältnis von CCK-8-P zu KLH in dem entstandenen Produkt betrug etwa 5:1.

(R4) Herstellung von Pentagastrin-BSA
(R4A) Herstellung von MB-Pentagastrin

Pentagastrin (0,5 mg; 750 nmol) wurde in 0,1 M Phosphat-Pufferlösung (0,5 ml; pH = 8,0) gelöst und der Reaktion mit MBS (1,05 mg; 3,3 μίτιοΙ) unterworfen, wobei 50 μΙ einer DMF-Lösung verwendet wurden, welche durch Lösung von MBS (2,1 mg) in DMF(IOO μΐ) hergestellt worden war. Die Reaktion wurde in gleicher

ίο Weise wie in (RlB) durchgeführt. Das Verhältnis von MB zu Pentagastrin betrug 1,0 : 1. Das Produkt wird nachstehend als MBi.o-Pentagastrin bezeichnef.

(R4B) Herstellung von Pentagastrin-BSA

Eine gemäß (R3A) hergestellte Lösung 2,54 ml; 112 nmol) wurde mit der gemäß (R4A) hergestellten Lösung gemischt. Der Mischung wurde 0,5 M NH₂OH (0,4 cc; 200 μπιοί) zugesetzt und das Ganze in gleicher Weise wie in (RiC) beschrieben behandelt. Das Verhältnis von Pentagastrin zu BSA im Produkt betrug etwa 5:1. Das erhaltene Produkt wird nachstehend als Pentagastrin-BSA bezeichnet.

(R5) das vorstehend unter (RI) beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit Ausnahme dessen, daß D-GL mit einem Molekulargewicht von 115 000 statt mit einem Molekulargewicht von 34 300 verwendet wurde (das molare Reaktionsverhältnis blieb das gleiche wie vorstehend in [RI] beschrieben). Erhalten wurde Pentagastrin33-D-GL, welches die gleiche Dichte der

so mit D-GL kombinierten Antigen-Determinante an der molekularen Oberfläche besaß.

Beispiel 6

(R3) CCK-S-PRinderserurn Albumin
(nachstehend bezeichnet als CCK-8-P-BSA)

(R3A) Herstellung von
S-Acetylmercaptosukzinyl-BSA

Die Herstellung erfolgte in gleicher Weise wie im Beispiel (RIA) durch Verwendung von BSA (25 mg; 351 η mol) und S-Acetylmercaptosukzinanhydrid (1,5 mg; 8,8 μπιοί). Das Verhältnis von BSA zur S-Acetylmercapto-Gruppe im Produkt betrug 7,6 :1.

(R3B) Herstellung von MB-CCK-8-P

CCK-8-P (0,5 mg; 457 nmol) wurde in 0,1 M Phosphat-Pufferlösung (03 ml; pH = 8,0) gelöst und der Reaktion mit MBS (700 μg; 2,29 μπιοί) unterworfen, wobei 50 μΐ einer DMF-Lösung von 1,4 mg MSB in ΙΟΟμΙ DMF in gleicher Weise wie in (RlB) gelöst verwendet wurden. Das Verhältnis von MB zu CCK-8-P betrug 1,0:1. Das Produkt wird nachstehend als MB,j)-CCK-8-P bezeichnet

(R3C) Herstellung von CCK-8-P-BSA

Die in (R3A) erhaltene Lösung (1,9 ml; 84 nmol) wurde mit der in (R3B) erhaltenen Lösung vermischt und dieser Mischung wurde 0,5 M NH₂OH (035 cc; 175 μπιοί) zugesetzt Die Mischung wurde in gleicher Weise wie in (RlC) behandelt, um ein Konjugai zu erhalten, bei welchem das Verhältnis von CCK-8-P zu BSA etwa 5 :1 begmg (nachstehend als CCK-S-P-BSA bezeichnet).

A. Programm der Immunisierung und der
Serum-Entnahme

(C578L/6J χ DBA/2) F, weibliche Mäuse {jede Gruppe aus 6 Mäusen) wurde immunisiert.

Alle Mäuse einer jeden Gruppe wurden mit CCK-8-P-KLH (jeweils 10 μg) in Freundschem vollständigem Adjuvans (jeweils 0,2 ml) immunisiert und drei Wochen danach nochmals immunisiert mit CCK-8-P-KLH (jeweils 10 μg) in Freundschem unvollständigem Adjuvans (0,2 ml). Zwei Wochen nach der Sekundär-Immunisierung wurden sie mit CCK-8-P-KLH (jeweils 10μg) aktiviert, welches mit 2 mg Aluminium-Hydroxid-Gel gemischt war. Zwei und vier Wochen danach wurden sie nochmals zweimal durch Injektion von 0,2 ml einer Salzlösung von CCK-8-P-KLH (jeweils 10 μg) immunisiert Alle Behandlungen erfolgten durch intraperitoneale Injektion.

Drei Tage vor der Primär-Immunisierung wurde allen Mäusen der 2. Gruppe intraperitoneal 0,5 ml einer Salzlösung von Pentagastrini5-D-GL (jeweils 300 μg) verabreicht Die Mäuse der 1. Gruppe dienten als Kontrolle und erhielten 03 ml Salzlösung ohne Pentagastrini5-D-GL

Drei Tage vor der Sekundär-Immunisierung und drei Tage vor der Tertiär-Immunisierung wurden allen Mäusen der 3. Gruppe intraperitoneal 03 ml einer Salzlösung von Pentagastrinis-D-GL (jeweils 300 μg) verabreicht Aus dem retro-orbitalen Plexus eines jeden Tieres wurde Blut entzogen, um das Antiserum herzustellen.

B. Prüfung des Antikörper-Titers

Die Prüfung erfolgte durch Radioimmunoprüfung. Jeweils 100 μΐ einer 0,01 M Phosphat-Pufferlösung

(pH - 7,2; w-lche 0,15MNaCI, nachstehend als PBS bezeichnet, enthielt), welche 10μ§/πιΙ eines Antigens (wie CCK-8-P-BSA oder Pentagastrin-BSA) enthielt, wurde jeweils in ein Tauchrohr einer aus Polyvinyl bestehenden Rundboden-Mikroplatte für die Festphasen-Radioimmunoprüfung dispensiert, und das Antigen wurde an die Oberfläche der Polyvinyl-Platte durch 2stündige Bebrütung bei Raumtemperatur gebunden. Die Antigen-Lösung im Tauchrohr wurde weggeschüttet und das Tauchrohr wurde viermal mit Leitungswasser ausgewaschen. Nach Abschleudern des überschüssigen Wassers wurden in jedes Tauchrohr 200 μ! einer l%igen BSA-Salzlösung eingefüllt und das Ganze dann über Nacht bei 4° C stehengelassen, so daß die proteinbindende Fähigkeit der Polyvinyl-Platte vollständig gelöscht wurde. Anschließend wurde die Lösung aus den Tauchrohren entfernt und die Platte viermal mit Leitungswasser gespült. Die Platte wurde nach dem Abschütteln des überschüssigen Wassers für die Radioimmunoprüfung verwendet.

jeweils ö,i mi des mit i% BSA-PBS verdünnten Antiserums wurde in jedes Tauchrohr dispensiert, welches dann bei 4°C über Nacht stehengelassen wurde. Die Antiserumlösung wurde abgeschüttet und anschließend wurde das Tauchrohr dreimal mit Leitungswasser, sechsmal mit 2 M NaCl-PBS und anschließend noch einmal mit Leitungswasser gewaschen.

Nachdem das Wasser abgeschüttet war, wurde Kaninchen-Anti-Mäuse-IgG Fab Antikörper, welcher speziell durch Verwendung eines Immunoadsorbens gereinigt und mit ¹²⁵I markieu worden war, mit 1% PSA-PBS verdünnt. Jeweils 0,1 ml (50 000 dpm/20 ng) als spezifisches Antikörper-Protein der verdünnten Lösung wurde in jedes Tauchrohr eingefüllt und bei 4° C über Nacht stehengelassen. Falls irgendein Antikörper vorhanden wäre, welcher eine Bindung mit einem Antigen an der Oberfläche von Polyvinyl eingehen könnte, so würde der Antikörper mit dem Antigen gekuppelt werden. Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines derartigen Antikörpers kann durch das Ausmaß der Kupplung des Kaninchen-Anti-Mäuse-IgG Fab-Antikörpers, der mit ¹²⁵I markiert wurde, festgestellt werden. Jede isotope Lösung im Tauchrohr wurde mit Hilfe einer Pipette entfernt. Nach einem durchgreifenden Waschen mit Wasser wurde die flexible Platte in eine starre Plastik-Platte eingesetzt und die Oberkante der flexiblen Platte mit einem Heizdraht abgeschnitten, woraufhin die Radioaktivität in jedem Tauchrohr gezählt wurde.

C. Ergebnisse

Bei jeder Entnahme von Serum wurde das Antikörper-Titer des von den Mäusen einer jeden Gruppe zusammengefaßten Serums geprüft Elf Wochen nach der Primär-Immunis'^rung entnommene Proben enthielten die größten Mengen an Antikörpern. Infolgedessen wurden Antikörper in den Antiseren, welche elf Wochen nach der Primär-Immunisierung entnommen wurden, einer weiteren detailliserten Analyse unterworfen.

Bei dieser Messung wurde angesammeltes Antiserum der 1. Gruppe, welche sieben Wochen nach der Primär-Immunisierung entnommen worden war, als Standard-Antiserum verwendet Die Antikörper-Menge in der Probe, welche den einzelnen Mäusen in der 11. Woche entnommen wurde, wurde als das Verhältnis der Antikörper-Menge im Standardserum ausgedrückt, welches als 1 Einheit definiert wurde. Das Titer des Standardserums war wie folgt: Bei der Prüfung djrch die nachstehende Flüssigphasen-Radioimmunoprüfung unter Verwendung von CCK-8-P war dieses Serum bei 600facher Verdünnung fähig, 0,0015 pmol an Cholecystokinin (CCK-33) zu binden.

In den von den Mäusen der 1. Gruppe erhaltenen Antikörpern, wobei den Mäusen dieser Gruppe kein Pentagastrini5-D-GL verabreicht worden war (dargestellt durch die Markierung »O« in Fig. 1), waien die

ίο Mengen des mit CCK-8-P reagierenden Antikörper* und die des mit Pentagastrin reagierenden Antikörpers im wesentlichen gleich. Es wurde festgestellt, daß Antikörper, welche von den Mäusen erhalten wurden, denen Pentagastrinis-D-GL verabreicht worden war,

d. h. die Mäuse der 2. und 3. Gruppe, welche durch die Markierungen »A« und »·« in Fig. 1 dargestellt sind, ein sehr geringes Titer von gegenüber Pentagastrin reaktiven Antikörpern zeigten. Insbesondere zeigten die Antikörper, welche von den Mäusen der 3. Gruppe

erhalten wurden, denen Pentagastrin_]s-D-GL nach der Primär-Immunisierung, d. h. drei Tage vor der Sekundär- und der Tertiär-Immunisierung verabreicht worden war, ein extrem niedriges Titer des gegenüber Pentagastrin reaktiven Antikörpers.

Aus diesen Resultaten zeigt sich, daß durch die Erfindung ein Antikörper herstellbar ist, welcher eine Spezifität für spezifische Aminosäure-Folgen von CCK-8-P, d.h.

SO₃H

Asp—Tyr—Met

besitzt.

Beispiel 7

Die Vernetzungsreaktivitäten der vorstehend erhaltenen Antikörper wurden durch ein Flüssigphasen-Radioimmunoprüfungs-System bestimmt, weiches die

■»ο Koexistenz von CCK-8-P und Pentagastrin erlaubte. CCK-8-P wurde mit "⁵I unter Verwendung des Bolton-Hunter-Reagenz markiert (H. Sankaran u. a., J. Biol. Chem., VoI. 254/1979, S. 9349-9351), welches nachstehend als ^I25I-BH-CCK-8-P bezeichnet wird.

In kleinen Testrohren wurden 50 μΐ ve* 0,02 M Phosphat-Pufferlösung (pH = 8,0; mit 1% Gelatine), welche verschiedene Mengen an unmarkiertem CCK-8-P enthielten, zugesetzt, um eine CCK-8-P-Standardkurve aufzuzeichnen. Getrennt wurde in ein kleines Testrohr 50 μΐ Pufferlösung, welche verschiedene Mengen von Pentagastrin enthielt, zugesetzt, μΐη eine Pentagastrin-Standardkurve aufzuzeichnen.

In jedem Fall wurde Antiserum (50 μΐ), verdünnt mit Mäuseserum, in die Testrohre gefüllt und alsdann die gleiche Phosphat-Pufferlösung (50 μΐ) zugesetzt, welche ^l2SI-BH-CCK-8-P (etwa 5000 cpm) enthielt, woraufhin die Lösung mit Hilfe eines Wirbelmischers gut durchgemischt und anschließend 24 h lang bei 4° C bebrütet wurde. Danach wurden den Testrohren 50 μΐ von Kaninchen-Anti-Mäuse IgG Fab-Antikörper zugesetzt, welche mit der gleichen Phosphat-Pufferlösung auf 1 :2 verdünnt worden waren, woraufhin das Ganze gut durchgemischt und 24 h lang bei 4° C bebrütet wurde. Anschließend wurden die Testrohre mit 3000 U/min 25 min lang zentrifugiert Das überstehende wurde abgesaugt und die Radioaktivität des Niederschlages in einem Zählgerät gezählt
Anstelle der Standardlösaneen von CCK-8-P und

Pentagastrin wurde der gleiche Phosphat-Puffer verwendet, um die Radioaktivität von ¹²⁵I-BH-CCK-S-P insgesamt zu bestimmen (Zählung, B₀, ausgedrückt als 100). Die gebundenen Verhältnisse (BZBo⁰Zo) des Antikörpers mit ¹^I-BH-CCK-S-P in Gegenwart von CCK-8-P oder Pentagastrin wurden bei unterschiedlichen Konzentrationen berechnet

Die molaren Mengen verschiedener Peptide, welche für eine 50%ige Inhibition der Bindung des Antikörpers an ^I2äI-BH-CCK-8-P erforderlich sind, sind wie folgt:

In der 1. Gruppe betrug CCK-8-P 1,1 pmol und Pentagastrin 20,1 pmoL Infolgedessen betrug die nach der Abrahamschen Methode berechnete Vernetzungsreaktivität 5,5% (1,1/20,1 χ 100).

In der 2. Gruppe, deren Mäuse Pentagastrini₅-D-GL vor der Primär-Immunisierung erhalten hatten, betrug die Vernetzungsreaktivität 2,7% (4 pmol/ 150 pmol χ 100).

In der 3. Gruppe, deren Mäusen Pentagastrinis-D-GL naciri der Primär-Immunisierung verabreicht worden war, d.h. drei Tage vor der Sekundär- und der Tertiär-Immunisierung, wurde keine Vernetzungsreaktivität mit Gastrin festgestellt Dies bedeutet, daß 1,7 pmol von CCK-8-P für eine 50%ige Inhibition erforderlich war, wenn dieser Antikörper verwendet wurde, daß jedoch keine Inhibition durch 10 000 pmol von Pentagastrin festgestellt wurde. Dies bedeutet, daß Pentagastrin tatsächlich unfähig ist mit dem durch die Mäuse der 3. Gruppe erzeugten Antikörper zu reagieren.

Diese Resultate zeigen, daß CCK-8-P ohne merkbare Wirkung des gleichzeitig existierenden Pentagastrins spezifisch geprüft werden kann, indem die von den Mäusen der 3. Gruppe herrührenden Antikörper verwendet werden, wobei diesen Mäusen Pentagastrini5-D-GL verabreicht worden war.

Beispiel 8

Das im Beispiel 6 beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit Ausnahme dessen, daß die Mäuse durch Kaninchen ersetzt wurden.

Bei Verwendung von Freundschem vollständigem oder unvollständigem Adjuvans, welches 100 μg von CCK-8-P-KLH und 10 ml an Salzlösung enthielt wobei letztere 10 mg an Pentagastrinu-D-GL enthielt waren die erzielten Resultate im wesentlichen den Resultaten gleich, welche an Mäusen erhalten wurden.

Beispiel 9

Das Verfahren gemäß Beispiel 6 wurde wiederholt mit Ausnahme dessen, daß Pentagastrin,₅-D-GL durch Pentagastrinu-D-GL mit einem Molekulargewicht 115 000 ersetzt wurde. Die Resultate waren im wesentlichen die gleichen wie die im Beispiel 6 erzielten Resultate.

In der Fig. 1 zeigt die Abszisse die Menge des mit Pentagastrin reagierten Antikörpers und die Ordinate die Menge des mit CCK-8-P reagierten Antikörpers. Die Markierung » O« zeigt den Antikörper, der von den Mäusen der 1. Gruppe erhalten wurde, denen kein Pentagastrinis-D-GL verabreicht worden war. Die Markierung »A« zeigt die Antikörper-Menge, welche von den Mäusen der 2. Gruppe erhalten wurde, denen Pentagastrinis-D-GL vor der Primär-Immunisierung verabreicht worden war. Die Markierung » ·« zeigt die Antikörper, welche von den Mäusen der 3. Gruppe erhalten wurden, denen Pentagastrinis-D-GL nach der Primär-Immunisierung verabreicht worden war.

Jeder Wert ist zweckmäßigerweise als das Verhältnis einer jeden Antikörper-Menge zu der Menge ausgedrückt, welche in dem von den Mäusen der 1. Gruppe sieben Wochen nach der Primär-Immunisierung entnoromenen und angesammelten Serum vorhanden war.

Beispiel 10 (nachgereicht)

Herstellung von Anti-CCK-8-P spezifische ι ο Antikörper erzeugenden Stämmen

A) Verfahren

Die Milzzellen (jeweils 2 χ 10⁸) der Mäuse der ersten (Kontroll-)Gruppe und der dritten Gruppe (behandelt mit Pentagastrin-D-GL), weiche durch das im Beispiel 6(A) beschriebene Verfahren immunisiert waren, wurden jeweils als Ausgangsstoffe verwendet In jedem FaU wurden die Zellen mit P3-X63-Ag8-Ul (P3Ul>Tumorzellen (2XlO⁷) in Polyäthylenglykol 4000 aufge- schlössen.

Die Zellhäutchen wurden abgelöst und mit einer PEG-Lösung (1 ml) verdünnt der tropfenweise eine Mischung von 9 g PEG 4000 und 20 ml HANKS zugegeben wurde, um eine Zellsuspension zu erhalten, welche dann bei Raumtemperatur 8 mm lang stehengelassen wurde. Dann wurde der Zellsuspension innerhalb von 5 min MEM (15 ml) langsam zugesetzt und anschließend weiteres MEM bis zu einer Gesamtmenge von 50 ml. Die Zellen wurden aus der Suspension abgeschleudert und dann in einer 10%igen FCS-RPMI-Lösung nochmals suspendiert und in einer Kulturschale (f ml/Tauchrohr) zur Züchtung bei 37° C über Nacht durch Verwendung eines befeuchteten COrlnkubators, welcher 7% CO2 in Luft mit einer relativen Feuchtigkeit von 85—95% enthielt verteilt Am nächsten Tag wurde jedem Tauchrohr ein HAT-Medium (1 ml) beigegeben. An jedem Morgen der nächsten zwei Tage wurde ein HAT-Medium (1 ml) aus dem Tauchrohr abgesaugt und durch ein frisches HAT-Medium (1 ml) ersetzt Der gleiche Austausch wurde während der nächsten zwei Wochen in Abständen von drei Tagen durchgeführt Anschließend wurde die Zuchtbrühe herausgenommen und geprüft um die Antikörper-Sekretion zu bestimmen, wobei die Festphasen-Radio-Immunoprüfung angewendet wurde, wie sie im Beispiel 6 (B) beschrieben ist Zur Stammbildung wurden die positiven Zuchtmedien durch Verwendung einer 10%igen FCS-RMPI begrenzt verdünnt, und die gezüchteten Brühen, weiche Stämme enthielten, wurden nach der im Beispiel 6 (B) beschriebenen Festphasen-Radio-Immunopriifung geprüft um die Spezifität der durch die so erhaltenen Stämme erzeugten Antikörper zu bestimmen.

B) Ergebnisse

Durch Verwendung der Milzzellen der Mäuse der ersten Gruppe erhielt man 18 Stämme, mit denen Anti-CCK-8-P-Antikörper erzeugt werden konnten. Alle auf diese Weise erhaltenen Antikörper reagierten sowohl mit CCK=S=P wie mit Pentagastrin. Es wurde daher festgestellt, daß es sich bei dem auf diese Weise erhaltenen Antikörpern um einstämmige Antikörper handelte, welche für den Pentagastrin-Anteil von CCK-8-P spezifisch waren. Andererseits wurden unter Verwendung der Milzzellen der dritten Gruppe 15 Stämme erhalten, welche Anti-CCK-8-P-Antikörper erzeugen konnten. Unter diesen 15 Stämmen konnten 12 Stämme Anti-CCK-8-P-Antikörper erzeugen, welche nicht mit Pentagastrin und anderen verwandten

Peptiden und spezifisch für CCK-8-P reagierten, während die durch die restlichen 3 Stämme erzeugten Antikörper mit Pentagastrin vernetzungsreaktiv waren. Durch Verwendung der Milzzellen der mit dem erfindungsgemäßen Pentagastrin-D-GL behandelten Mäuse ist es daher möglich, eine größere Zahl der

gewünschten spezifische Anti-CCK-JJ-P-Antikörper erzeugenden Stämme zu erhalten als bei Verwendung der in herkömmlicher Weise behandelten Müzzellen. Die auf diese Weise erhaltenen spezifischen Anti-CCK-8-P-Antikörper zeigten keine Vernetzungsreaktivität mit Pentagastrin.

Hierzu i Blatt Zeichnungen

Claims (9)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers bzw. Antiserums mit hoher Spezifität für ein erstes Antigen, welches eine gewünschte antigene Determinante bei geringer Vernetzungsreaktivität mit wenigstens einem anderen Antigen besitzt, welches wenigstens eine der gewünschten antigenen Determinante des ersten Antigens strukturell verwandte antigene Determinante enthält, durch Immunisierung eines Säugetieres oder Züchtung von zur Antikörper-Erzeugung fähigen Säugetierzellen dieses Säugetieres nach dessen Immunisierung, dadurch gekennzeichnet, daß dem Säugetier jeweils ein Copolymer von D-Glutaminsäure und D-Lysin verabreicht wird, welches mit dem anderen Antigen gekuppelt ist, und nach Induzierung einer deutlichen immunologischen Toleranz demgegenüber das Säugetier mit dem ersten Antigen immunisiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß das Copolymer ein Molekulargewicht von etwa 27 000 bis etwa 120 000 hat

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von D-Glutaminsäure zu D-Lysin im Copolymer etwa 70 :30 bis etwa 30 :70 beträgt

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das andere Antigen ein Steroid, Catechinamin, Peptid, 1-Propranold oder I- oder d-Cyclsu.ocin oder, wenn zweckmäßig, eine Untereinheit oder ein Fragment dieser Stoffe ist

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Steroid arr, gewählt wird aus Testosteron, 5 «-Dihydrotestosteron, Androtestosteron, Etiocholanolon, Progesteron, 17 ot-Hydroxyprogesteron, Pregenenolon, Dehydroepiandrosteron, östradiol, östron, Östriol, Aldosteron, desoxycorticosteron, Cortisol, Cortison, Corticosteron, 11-Desoxycortisol, Cholsäure, Desoxycholsäure, Lithocholsäure und deren konjugierten Verbindungen.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Catechinamin ausgewählt wird aus Dopamin, Norepinephrin oder Epinephrin und deren Derivaten.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid ausgewählt wird aus Gastrin, Cholecystokinin-pancreozymin, Insulin, Proinsulin, Glucagon, follikelstimulierendem Hormon (FSH), luteinisierendem Hormon (LH), humanem Choriongonadotropin (HCG), Somatostatin, thyroidstimulierendem Hormon (TSH) oder einer Untereinheit und damit verwandten Peptiden.

8. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Gewinnung von Säugetierzellen, welche fähig sind, einen Antikörper gemäß Anspruch 1 zu erzeugen.

9. Verwendung des gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder mit Hilfe von Säugetierzellen gemäß Anspruch 9 hergestellten Antikörpers bzw. Antiserums zur Immunoprüfung.