DK158644B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antistof eller antiserum, anvendelse af denne fremgangsmaade til opnaaelse af pattedyrsceller, der er i stand til at producere et saadant antistof, og anvendelse af det saaledes fremstillede antistof eller antiserum til immunoassay. - Google Patents

Description

DK 158644 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et antistof eller antiserum med høj specificitet over for et første antigen, der har en ønsket antigen determinant ved ringe krydsreaktivitet med mindst 5 ét andet antigen, som indeholder mindst én antigen determinant, der er strukturelt beslægtet med den ønskede antigene determinant på det første antigen, ved immunisering af et pattedyr eller dyrkning af til antistofproduktion egnede pattedyrsceller fra dette patte-10 dyr efter dets immunisering, og opfindelsen angår desuden anvendelsen af denne fremgangsmåde til opnåelse « af pattedyrsceller, der er i stand til at producere et sådant antistof, samt anvendelsen af dette antistof eller antiserum til immunoassay.

15 Der kendes forskellige fremgangsmåder til immuno assay af en række stoffer, der er til stede i mennesker og dyrs levende krop, ved hvilke fremgangsmåder man udnytter den konkurrerende antigen-antistofreaktion, idet man anvender en given mængde af et antistof og for-20 skellige mængder af antigener. De kendte immunoassay-metoder har imidlertid i almindelighed den ulempe, at assayspecificiteten selv i tilfælde, hvor det til immu-noassayen anvendte reagens (antistof) antages at være stærkt specifikt for det til afprøvning foreliggende 25 stof (antigen), har tendens til at blive forstyrret af de krydsreaktive stoffer, der er strukturelt beslægtede med det til undersøgelse foreliggende stof.

Til overvindelse af et sådan vanskelighed er det fordelagtigt at anvende et antistof, der har en 30 højere specificitet over for det stof, der skal afprøves. Til dette formål er det f.eks. blevet foreslået før dets anvendelse at binde et antigen til et bæreprotein på et egnet sted i dets kemiske struktur, hvorved det genkendelsessted på antigenet, der skal genkendes 35 af antistoffet, blotlægges på bæremolekylets overflade.

En sådan blotlæggelse stimulerer følgelig dannelsen af et antistof med ringe krydsreaktivitet. Således er det f.eks. kendt at fremstille et specifikt antistof ved 2

DK 15 8644 B

anvendelse af polymere eller copolymere af glutaminsyre eller lysin (DE-offentliggørelsesskrift nr. 2.608.096;

Kabat, E.A., Einfiihrung in die Immunochemie und Immuno-logie, Springer Verlag, Berlin 1971, side 16-19; Bier, 5 O.G. et al., Experimentelle und klinische Immunologie, Springer Verlag, Berlin 1979, side 68). De kendte fremgangsmåder af denne type er imidlertid stadig utilfredsstillende, da det er nødvendigt med komplicerede procedurer, og da det desuden i nogle tilfælde stadig er 10 vanskeligt at undgå frembringelsen af krydsreagerende antistoffer.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den erkendelse, at det uventet er muligt at reducere mængden af krydsreaktive antistoffer og desuden at opnå et 15 ønsket antistof med en meget høj specificitet over for et f.eks. til afprøvning foreliggende stof, idet man anvender en copolymer af D-glutaminsyre og D-lysin (herefter benævnt D-GL), der er koblet med det krydsreaktive antigen.

20 Formålet med opfindelsen er at tilvejebringe et forbedret antistof med en høj specificitet og ringe krydsreaktivitet, et antiserum, der indeholder et sådant antistof, til produktion af sådanne antistoffer egnede celler (i det følgende betegnet stammer) og en 25 fremgangsmåde til fremstilling deraf. Opfindelsen vil desuden angive en immunoassaymetode, ved hvilken der anvendes sådanne antistoffer eller antisera.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man indgiver pattedyret en copolymer af D-gluta-30 minsyre og D-lysin, som er koblet med det andet antigen, og efter inducering af et tydelig immunologisk tolerance immuniserer pattedyret med det første antigen.

Der kan benyttes forskellige hensigtsmæssige udføresesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen 35 som angivet i krav 2-7.

Ved fremgangsmådem ifølge opfindelsen er det muligt at reducere mængden af krydsreaktivt antistof til et minimum og desuden at fremstille det ønskede antistof

DK 158644 B

3 eller antiserumet med forbedrede egenskaber, da D-GL inducerer en væsentlig effektiv immunologisk tolerance i B-celler, der tjener som precursor for produktionen af antistoffer. Når et pattedyr behandles ved fremgangs-5 måden ifølge opfindelsen metaboliseres D-aminosyrerne i det levende legeme ikke uden videre, og desuden inducerer D-GL i det væsentlige ingen immunologisk reaktion i T-celler i det levende legeme. Det antages derfor, at når et levende væsen behandles ved fremgangsmåden ifølge 10 opfindelsen, binder et sådant hapten-D-GL-konjugat sig specifikt til overfladeimmunoglobulinreceptorer på B-lymfocyter og gør disse celler irreversibelt tolerante.

Det ønskede antistof kan opnås i form af et rent antistof eller i form af et antiserum, der indeholder 15 det ønskede antistof. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen fører til fremstilling af celler med samme genetiske konstitution (i det følgende betegnet som stammer) i det levende legeme, hvilke celler kan producere de ønskede antistoffer. Det er derfor muligt at opnå det ønskede 20 antistof ved dyrkning af den på denne måde opnåede stamme på sædvanlig måde.

I denne sammenhæng skal der henvises til, at de fra det levende væsens levende krop udtagne stammer til fremstilling af det ønskede antistof kan anvendes selv 25 i fraværelse af det initierende levende væsen, da det er kendt at sammensmelte en egnet stamme med en egnet tumorcelle til opnåelse af et hybridoma, f.eks. ved at en sådan stamme sammensmeltes med en myelomacelle, som det f.eks. er rapporteret i Nature, vol. 256, 495-497 30 (1975), og European J. of Immunol., vol. 6, 511-519 (1976) af Kohier et al., Nature, vol. 266, 550-552 (1977) af Milstein et al.; Nature, vol. 266, 495 (1977) af Walsh). Et sådant hybridoma overføres til et andet levende væsen, og hybridomacellerne formerer sig ved- 35 varende til fremstilling af en stor mængde af det ønskede antistof. Det er således muligt at anvende et sådant hybridoma som en ny kilde for det ønskede antistof .

DK 158644 B

4 På basis af opfindelsen tilvejebringes der en fremgangsmåde til immunoassay af et stof, der tjener som antigen, ved hvilken fremgangsmåde det første antigen, dvs. det til afprøvning foreliggende stof, bringes til 5 reaktion med et ifølge opfindelsen fremstillet antistof eller antiserum, det første antigen skilles fra det på denne måde opnåede immune kompleks og aktiviteten af det første antigen bestemmes.

Immunoassayen kan udføres på sædvanlig måde, 10 f.eks. ved radioimmunoassay eller ved anvendelse af ikke-isotopiske mærker, f.eks. enzymer, frie radikaler, celler, vira, metalioner samt fluorescerende og kemi-luminescerende grupper. Ved radioimmunoassayen kan as-sayen udføres selv i nærværelse af et krydsreaktivt 15 antigen.

Ifølge opfindelsen foretrækkes det at anvende D-GL med en molekylvægt på fra ca. 27000 til ca. 120000. Molforholdet mellem D-glutaminsyre og D-lysin ligger fortrinsvis inden for området 70:30 til 30:70, f.eks.

20 60:40. Copolymere af denne type fås i handelen, men det er også muligt at fremstille sådanne copolymere på sædvanlig vis, f.eks. ved copolymerisation af N-carboxyl-anhydrid af γ-alkyl-D-glutamat og N-carboxylanhydrid af ε-N-carbobenzyloxy-L-lysin i nærværelse af en passende 25 amin efterfulgt af fjernelse af de beskyttende grupper.

Forskellige naturligt forekommende stoffer kan f.eks. anvendes ved fremstillingen af antistoffet til immunoassay. Eksempler på foretrukne materialer til dette formål inkluderer steroider, disses glucuronater og 30 sulfater deraf, catecholaminer, peptider, disses underenheder og beslægtede fragmenter deraf og forskellige farmaceutiske midler.

Særligt foretrukne eksempler på steroider inkluderer testosteron (herefter benævnt T), 5a-dihydrotesto-35 steron (herefter benævnt DHT), androsteron, etiocholano-lon, progesteron, 17a-hydroxyprogesteron, pregnenolon, dehydroepiandrosteron, estradiol, estron, estriol, aldosteron, deoxycorticosteron, cortisol, cortison , 5 DK 1586448 corticosteron, 11-deoxycortisol, cholsyre, deoxycholsyre, lithocholsyre og konjugerede forbindelser deraf.

Catecholaminer er f.eks. dopamin, norepinephrin, epinephrin og lignende.

5 Peptidhormoner er f.eks. gastrin, cholecystoki- nin-pancreozymin, insulin, proinsulin, glucagon, follikelstimulerende hormon (FSH), luteiniserings-hormon (LH) , humant choriongonadotropin (HCG) , somatostatin, thyroidstimulerende hormon (TSH) samt deres un- 10 derenheder og dermed beslægtede peptider.

Farmaceutiske midler er f.eks. 1-propranolol, der * er et β-blokerende middel, og 1- eller d-cyclazocin, der er analgetika.

F.eks. når et anti-T-antistof eller-antiserum 15 fremstilles ved konventionelle immuniseringsprocedurer, virker DHT som det krydsreaktive antigen, eftersom deres strukturer er meget lig hinanden. Tilsvarende virker T som krydsreaktivt antigen, når der fremstilles et an-ti-DHT-antistof eller -antiserum. På denne måde virker 20 forskellige steroider som krydsreaktive antigener på andre steroider.

De ovennævnte stoffer er i almindelighed haptener eller lignende (dvs. stoffer, der er i stand til at kombineres med et antistof, men ude af stand til at induce-25 re en immunreaktion,eller i stand til kun at inducere en svag immunreaktion, hvis de ikke er koblede med en bærer inden deres administration til et levende væsen. Det er således nødvendigt at koble dem til en passende bærer for at inducere dannelsen af et antistof. F.eks. for at 30 inducere et antistof, der er specifikt over for et bestemt antigen, såsom anti-testosteron (herefter benævnt anti-T-antistof),skal dette antigen kobles med en passende bærer og anvendes til immunisering. Imidlertid har de således opnåede anti-T-stammer og -antistoffer i almin-35 delighed en stærk krydsreaktivitet med stoffer, der har en analog struktur, såsom DHT. Ifølge opfindelsen er det muligt specifikt at hæmme dannelsen af sådanne krydsreaktive anti-DHT-stainmer og -antistoffer ved at behandle

DK 158644 B

6 det levende væsen med et stof, der er produktet af at koble en copolymer af D-GL med et krydsreaktivt antigen, i dette tilfælde DHT.

Endvidere har det også vist sig, at et antistof, 5 der er i stand til at reagere med den specifikke determinant på den ønskede antigen, blev opnået, når et levende væsen behandles med et konjugat af D-GL og et peptid, der er analogt med det nævnte antigen, eller et med det ønskede antigen overensstemmende peptidfragment.

10 Et eksempel, der viser en sådan fordel ved opfindelsen, inkluderer tilfældet med antistoffer over for et octa-peptid, der er et C-terminalpeptid, der indeholder otte aminosyrer fra cholecystokinin-pancreozymin (herefter benævnt CCK), der er et gastrointestinalt hormon, strukturen (aminosyresekvens) af gastrin (humant), CCK samt deres fragmenter er vist i tabel 1.

Tabel 1

Gastrin (humant): (Pyro)Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu- 20

Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met- (so3h)

Asp-Phe-NH2 CCK-33 : Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Val-Ser-Msb- ^ Ile-Lys-Asn-Leu-Gln-Ser-Leu-Asp-Pro-

Ser-His-Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-

Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH9 -3h CCK-8-P : Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH-

SO H

30 3

Pentagastrin : Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2

Det har for nylig vist sig, at CCK octapeptid (i det følgende betegnet CCK-8-P) og dets reaktive receptor 35 også er til stede i hjernen, og undersøgelsen af dette hormons funktion som neurotransmitter såvel som de sekretioner, det fremmer, og dets virkning på forskellige sygdomme i mave-tarmkanalen er af interesse. Det er såle-

DK 158644 B

7 des vigtigt at tilvejebringe et antistof, der er i stand til specifikt at reagere med CCK-8-P.

Antistofdannende stammer og antistoffer, der er i stand til specifikt at reagere med CCK-8-P, kan ifølge 5 opfindelsen opnås ved at give et dyr konjugater af D-GL med pentagastrin (dvs. de fem aminosyrer, der findes ved C-terminalen på gastrin og CCK-8-P) for at inaktivere stammer, der producerer antistoffer, der krydsreagerer med pentagastrin og/eller gastrinlignende forbindelser, 10 og derpå immunisere det nævnte dyr med CCK-8-P.

Det er således ifølge opfindelsen også muligt at fremstille gastrinspecifikt antistof ved at hæmme dannelsen af stammer, der krydsreagerer med CCK-33, ved at behandle et dyr med et konjugat af D-GL og pentagastrin, 15 der er C-terminal-fragmentet af det ønskede antigen, og derpå immunisere det nævnte dyr med gastrin.

Som det fremgår af udførelseseksemplerne, der følger senere, kan det også være muligt at opnå et ønsket specifikt antistof ved at give et immunt dyr et konjugat 20 af D-GL med et krydsreaktivt peptid, endog i det tilfælde, hvor specifikke antigene determinanter ikke uden videre kan fjernes fra hele peptidet ved peptidfragmentering (jf. f.eks. Attasi M.Z., Immunochemistry, vol. 15, side 909-936 (1978).

25 Et sådant konjugat af D-GL og et krydsreaktivt antigen kan opnås enten (1) ved at koble antigenet direkte med D-GL eller (2) ved at koble antigenet indirekte med D-GL, idet der dannes en bro mellem antigen og D-GL. Til dette formål er der blevet fremstillet for-30 skellige derivater af antigenet, især steroide antigener.

Disse derivater er f.eks. beskrevet som oximderivater, succinylderivater og chlorcarboxylsyrederivater af Er-langer et al. [dvs. B.F. Erlanger et al., J. Biol. Chem., 228, 713 ( 1957)], som carboxylmethylthioetherderivater af 35 a. Weinstein et al. [Steroid, 2Q, 789 (1972)], som carboxylmethyletherderivater af P.N. Rao et al. [J.

Steroid Biochem., ' 9_, 539 ( 1978)] osv. Foretrukne koblingsmetoder er f.eks. carbodiimidmetoden, den blandede

DK 158644 B

8 anhydridmetode, Schotten-Baumann-metoden og isoxazolium-metoden.

Når en Nl^-gruppe indføres i en sådan forbindelse, udføres koblingsreaktionen ved glutaraldehydmetoden, og 5 når en NI^- eller SH-gruppe indføres i en sådan forbindelse, kan omsætningen udføres ved anvendelse af en m-ma-leinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, succinimidyl- 4-(N-Faleirmodomethylcyclohexan)-1-carboxylat, succinimi-dyl-4-(p-maleinimidophenyl) butyrat og lignende eller N-10 succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, N-succinimi-dyl-(4-azidophenyldithio)propionat og lignende.

Derudover kan der også anvendes forskellige andre metoder, der konventionelt anvendes til at koble peptider med andre stoffer inden for peptidkemien, til kob-15 ling af D-GL med et antigen.

De antigener, der kan anvendes til opfindelsens formål, er i almindelighed haptener eller lignende, og det er således nødvendigt at koble antigenet med en passende bærer, der anvendes ved konventionelle immunise-20 ringsmetoder,inden anvendelse. Foretrukne bærere til dette formål er f.eks. "keyhole limpet" haemocyanin (KLH), γ-globulin og albumin fra serum fra forskellige dyrearter, der anvendes til immunisering, såsom f.eks. mennesker, geder, kalve og lignende.

25 Antigenerne, deres underenheder eller beslægtede fragmenter bør kobles med et bærerprotein på en måde, der svarer til den, der anvendes til at koble et kryds-reaktivt antigen, dets underenheder eller beslægtede fragment med D-GL. Koblingen kan således udføres direkte 30 eller indirekte. I det sidste tilfælde bør der anvendes det samme intermediat, som anvendes til kobling af D-GL med det krydsreaktive antigen, til kobling af det ønskede antigen med et bærerprotein.

Immuniseringsbehandlingen kan udføres på sædvan-35 lig vis. Det foretrækkes dog at immunisere små dyr, såsom mus, med antigen i engangsdoser på 1-100 yg eller større dyr, f.eks. kaniner, med engangsdoser på 0,1-1 mg, hvilket kan gentages,f.eks. 2-5 gange med 2-4 ugers in-

DK 158644 B

9 tervaller. Sædvanligvis kan der 2-3 dage inden den primære immunisering gives dyret et konjugat af D-GL og et krydsreaktivt antigen, skønt D-GL-konjugatet i nogle tilfælde også kan gives efter den primære eller sekundære 5 immunisering afhængigt af typen af krydsreaktivt antigen. Dosis af D-GL-konjugatet med krydsreaktivt antigen kan variere· afhængigt af det kombinerede forhold mellem det krydsreaktive antigen (hapten eller lignende) og D-GL, koblingssteder, mellemproduktstyper og lignende, men den ligger fortrinsvis i 10 området 100-500 yg/mindre dyr , f.eks. mus, eller 2-10 mg/større dyr, såsom f.eks. kanin. D-Gl-Konjugatet kan , opløses i en saltopløsning og administreres intraperito- nealt.

Eftersom det er fordelagtigt at koble det kryds-15 reaktive antigen med D-GL, så det tager samme form som den, der anvendes til det immuniserende antigen med bærer, foretrækkes det til dette formål at anvende det samme mellemprodukt til dannelsen af respektive kombinationer.

20 Som beskrevet ovenfor er det muligt at inducere en i det væsentlige effektiv immunologisk tolerance, der er specifik over for et bestemt krydsreaktivt antigen, ved at give et dyr et konjugat af D-GL og det krydsreaktive antigen. Herefter immuniseres dyret med det ønskede 25 antigen, der indeholder de specifikke ønskede antigene determinanter. På denne måde er det muligt at opnå en stamme, der er i stand til at fremstille et antistof, der har lille krydsreaktivitet og fremragende specificitet over for de relevante specifikke antigendeterminanter, 30 og et antiserum, der indeholder det nævnte antistof.

Det bør bemærkes, at de ovennævnte resultater ikke blot er blevet afprøvet på mindre dyr, såsom mus, men også på større dyr, såsom kaniner. Det er betydningsfuldt, at der er fremkommet de samme resultater hos både 35 mindre og større dyr på trods af de forskelle, der kunne forventes for dyrearterne. I denne forbindelse opnås en i det væsentlige større mængde antistof ved anvendelse

DK 158644B

10 af større dyr, såsom kanin, end ved anvendelse af forholdsvis mindre dyr, såsom mus.

Opfindelsen er særligt fordelagtig, eftersom det tidligere var vanskeligt at fremstille et antistof, der 5 er i stand til at skelne mellem analoge strukturer, såsom T og DHT.

Som et resultat af forøget produktivitet hos den specifikt antistofproducerende stamme kan det være praktisk muligt at separere og isolere en specifik stamme.

10 Det var tidligere kendt i litteraturen, at standsynlig-heden for at udseparere og isolere en stamme med evnen

C

til at genkende et specifikt antigen, var ca. 1/10 til 7 1/10 . Dette betyder, at en sådan separering og isolation i praksis var umulig.

15 Ved hjælp af den omhandlede fremgangsmåde er det således uden videre muligt at opnå en specifik antistofproducerende stamme, der er i stand til specifikt at skelne mellem en ønsket antigen determinant og strukturelt beslægtede antigene determinanter, selv ved immu- 20 nisering med et antigen, der indeholder krydsreaktive determinanter. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør det muligt at opnå sådanne specifikke antistoffer med større sandsynlighed, og som følge heraf er det også muligt at forøge sandsynligheden for produktion af sådanne spe- 25 cifikke antistofproducerende stammer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes ved enhver antistofproducerende metode ved at modificere metoden til kobling af D-GL med et krydsreagerende antigen, typerne for koblingsproduktet og lignende.

30 Ifølge et yderligere træk ved opfindelsen angiver opfindelsen en simpel metode til bestemmelse af et givent stof, hvis mængde i prøven er ukendt, ved anvendelse af et antistof eller antiserum, der opnås ved fremgangsmåden som beskrevet nedenfor.

35 Reagenserne og assaymetoden, der anvendes i neden stående eksempler, forklares som følger.

DK 158644 B

11 (1) Syntese af DHT-3-(o-carboxymethyl)oxim [herefter benævnt DHT-3-CMO]: (A) Reaktionsskema:

OH

\ rh ^-1 + H2N - o - ch2 - c

I ^OH

10

H OH

r^fS

Tllbagesvalin^ I

15 NaOH/ethanol ^

C - CH_ - O - N / 2 H

HO

(B) Anvendte materialer: 3 20 H-DHT (Radiochemical Centre, Amersham) 6 yci (0,015 yg som DHT) DHT (Sigma Chemical Co., U.S.A.) 0,3 g (1 mmol) O-Carboxymethyl-hydroxylamin-hemihydrochlorid 25 (Tokyo Kasei Kogyo K.K., Japan) 0,3 g (2,7 mmol) 2N NaOH 1,25 ml

Ethanol 15 ml (C) Procedure: 30 Materialerne blev anbragt i en rundbundet kolbe forsynet med tilbagesvalingsapparatur og tilbagesvalet under opvarmning i 3 timer. Reaktionsblandingen blev tilsat destilleret vand (45 ml), og opløsningens pH blev justeret til 8 med en fortyndet NaOH-opløsning. Opløs-35 ningen blev overført til en skilletragt og tilsat ethyl-acetat (ca. 30 ml) og rystet. Derpå blev ethylacetatlaget udtaget for at fjerne det ikke omsatte DHT. Det vandige lag blev afkølet ved tilsætning af is og gjort surt 12

DK 15 86 44 B

til opnåelse af en pH på ca. 4 med fortyndet saltsyre.

Det således fremstillede DHT-3-(o-carboxymethyl)-oxim blev ekstraheret ved tilsætning af koldt ethylacetat.

Der blev anvendt vandfrit sulfat til at tørre ethylace-5 tatlaget, der yderligere blev fjernet ved afdampning.

Den resulterende rest omkrystalliseredes i varm methanol til opnåelse af det ønskede produkt.

(2) Syntese af testosteron-3-(o-carboxymethyl)-oxim (herefter benævnt T-3-CM0):

Proceduren fra (1) blev gentaget til opnåelse af det ønskede produkt med den undtagelse, at der blev an- 3 3 vendt henholdsvis H-T og T i stedet for H-DHT og DHT i de samme molære mængder.

(3) Syntese af hapten-D-GL:

15 (A) Syntese af DHT-3-(o-carboxymethyl)oxim-D-GL

[herefter benævnt DHT-3-D-GL]: I overensstemmelse med den blandede syreanhydrid-metode af Erlangen et al.

Reaktionsskema:

20 OH

I I + ClCOO-C4Hg-i 25 HOOC-CH^-O-N^-'^i''^

^ H

OH

tC4H3>3N. /\Λ/-^

30 -ϊ O

Dioxan ^ X. J

C-CH--0-N / 2 H

i-C4H9-C020 oh ” . rVr1

D-GL II 1 1 J

____. D-GL-NH-C-CHo0-N^^T\^

* 2 H

Dioxan/vand

DK 158644B

13

Anvendte materialer: DHT-3-CM0 indeholdende DMT-3-CM0 mærket med 3 H sporstof 20 mg

Dioxan (tørret) 6 ml 5 Tri-n-butylamin 20 yl

Isobutylchlorformat 10 μΐ

Destilleret vand 6 ml D-GL (Mw = 49.000) 30 mg IN NaOH 150 μΐ 10 Procedure: DHT-3-CMO (20 mg) opløstes i tør,ret dioxan (1 ml) . Blandingen blev omrørt under tilsætning af tri-n-butyl-amin (20 μΐ) og omrørtes derefter ved lil°C i 5 minutter. Herefter sattes der isobutylchlorforma-^ (10 μΐ) til op-15 løsningen, der blev underkastet omsætning ved 11°C i 1 time under omrøring. Separat opløstes D-GjL (30 mg) i destilleret vand (6 ml) , og blandingen bleyi tilsat 1 N NaOH (150 μΐ) . Blandingen tilsattes dioxin. (5 ml) gradvist. Denne D-GL-opløsning blev sat til den nævnte reak-20 tionsblanding på én gang under omrøring. 10 Minutter herefter justeredes blandingens pH til 6,5-7,0 ved tilsætning af dråber 1 N NaOH-opløsning,og opløsningen omrørtes ved ca. 10°C i ca. 2 timer. Herefter dialyseredes reaktionsopløsningen over for vand ved 4°C natten over.

25 Den næste morgen justeredes opløsningens pH til 4,5 med en fortyndet saltsyre til dannelse af udfældninger. Udfældningen blev afsluttet ved, at opløsningen henstilledes ved 4°C i 7 timer. Reaktionsblandingen centrifugeredes ved 4°C i 20 minutter (3.000 omdrejninger pr. minut), 30 og den ovenstående væske fjernedes. Det udfældede stof blev tilsat destilleret vand (10 ml), og pH justeredes til ca. 7,0 med 1 N NaOH, således at det udfældede stof blev opløst. Herefter dialyseredes opløsningen over for destilleret vand ved 4°C natten over efterfulgt af lyo-35 filisering.

I overensstemmelse med radioaktiviteten pr. 1 mg 3 H-DHT-3-CM0, der blev anvendt som sporstof,og radioaktiviteten pr. 1 mg reaktionsprodukt bestemtes antallet af

DK 158644 B

14 DHT kombineret med 1 mol D-GL. Molforholdet mellem DHT og D-GL i reaktionsproduktet var 30:1.

Når de mængder vand og dioxan, der anvendtes, var lig med de tilsvarende mængder beregnet på basis af den 5 blandede anhydridmetode af Erlangen et al. [J. Biol.

Cheiru, 228, 713 (1957)] i forhold til BSA, geleredes blandingen. Der blev således sat store mængder vand og dioxan til blandingen for at undgå geleringen af D-GL deri og endvidere for at gennemføre reaktionen passende.

10 Herved blev konjugeringen af D-GL med oximet gjort mulig ved den blandede anhydridmetode, således at en tilstrækkelig mængde oxim blev kombineret med D-GL.

(B) Fremstilling af testosteron-3-(o-carboxymethyl) oxim-D-GL [herefter benævnt T-3-D-GL]: 15 Den samme procedure som ovenfor blev udført bort- 3 set fra anvendelsen af T-3-oxim indeholdende H-raærket T-3-oxim som sporstof til opnåelse af T-3-D-GL (molfor-holdet for T:D-GL = 30:1).

(4) Syntese af hapten-KLH: 20 (A) Fremstilling af DHT-3-(o-carboxymethyl)oxim- KLH [herefter benævnt DHT-3-KLH]:

Anvendte materialer: 3 DHT-3-CMO {indeholdende H-mærket oxxm som sporstof 12 mg 25 tørret dioxan 3,0 ml tri-n-butylamin 10 yl isobutylchlorformat 5 yl destilleret vand 4 ml KLH (Mw = 100.000) 150 mg 30 1 N NaOH 75 yl

Procedure:

Den samme procedure som beskrevet ovenfor gav DHT-3-KLH (molforholdet DHT:KLH = 10:1).

(B) Fremstilling af testosteron-3-(o-carboxymeth-35 yl)oxim-KLH [herefter benævnt T-3-KLH]:

DK 158644 B

15

Anvendte materialer: 3 T-3-CM0 (indeholdende H-mærket oxim som sporstof) 40 mg tørret dioxan 7 ml 5 tri-n-butylamin 40 yl isobutylchlorformat 20 yl destilleret vand 10 ml KLH 300 mg 1 N NaOH 300 yl 10 Procedure:

Den samme procedure som ovenfor gav T-3-KLH (molforholdet T:KLH = 8:1).

(5) Radioimmunoassayprocedure:

Reagenser: 3 15 1) H-T standardopløsning: 3 1,2- H-T (58 Ci/mmol) fortyndedes med ethanol til opnåelse af en ethanolopløsning, der indeholdt 20.000 dpm/10 yl (45 pg som T).

2) "^H-DHT standardopløsning: 20 5a-Dihydro-l,2,4,5,6,7-^H-T (114 Ci/mmol) fortyn dedes med ethanol til opnåelse af en ethanolopløsning, der indeholdt 40.000 dpm/10 yl (45 pg som DHT).

3) 0,05 M tris-pufferopløsning (pH 8,0), der indeholdt 0,05% kalveserumalbumin (herefter benævnt BSA) 25 og 0,1% kalveserum γ-globulin (herefter benævnt BGG).

4) Mættet ammoniumsulfatopløsning.

5) Umærket T standardopløsning.

6) Umærket DHT standardopløsning.

Procedure 1: 30 Bestemmelse af anti-testosteron-antistoftiteren: 3

En H-T standardopløsning (10 yl) blev anbragt i et glasrør og tørret ved afdampning. Hertil sattes et antiserum (0,2 ml, trinvist fortyndet med en tris-pufferopløsning) og blandedes godt. Blandingen hensattes 35 ved stuetemperatur i 2 timer og tilsattes derefter en mættet ammoniumsulfatopløsning (0,2 ml) . Opløsningen om-rørtes godt og centrifugeredes (3000 omdrejninger pr.

DK 158644B

16 minut) i 20 minutter til opnåelse af .en ovenstående væske, hvoraf 0,2 ml blev anbragt i et tælleglas. Prøvens radioaktivitet bestemtes efter tilsætning af en scintillator [2 ml, fremstillet ved opløsning af PPO (2,0 g) i 5 toluen (1 liter)].

Procedure 2:

Bestemmelse af anti-testosteron antistofs krydsreaktivitet med DHT: 3 10 μΐ af en H-T standaropløsning blev anbragt i 10 glasrør,og rørene blev opdelt i to grupper. Umærkede standardopløsninger af henholdsvis T og DHT blev sat til 3 de to grupper rør, der indeholdt H-T standardopløsninger. Imidlertid blev den tilsatte mængde umærkede steroider trinvis forøget hver gang. Alle de blandede opløs-15 ninger blev indtørret ved afdampning. Til hvert af dem sattes 0,2 ml antiserum og blandedes godt. Der blev anvendt antiserum ved den fortynding, der bandt 60% af 3H-T (45 pg).

Procedure 3: 20 Bestemmelse af anti-DHT antistoftiteren:

Der blev anvendt den samme procedure som beskre- 3 vet i procedure 1 under anvendelse af H-DHT i stedet for 3 H-T.

Procedure 4: 25 Bestemmelse af anti-DHT antistofs krydsreaktivi tet med T:

Der blev anvendt den samme procedure som beskre- 3 vet i procedure 2 under anvendelse af H-DHT i stedet for 3H-T.

30 Eksempel 1

Fremstilling af anti-testosteron specifikt antistof med lille krydsreaktivitet (mus):

Tre grupper mus (hver gruppe bestående af 4-5 hunmus, C57BL/6-stammen, 8-10 uger gamle) anvendtes i 35 dette eksempel. Hver mus fra den første gruppe (kontrolgruppe) blev givet udelukkende en saltopløsning, og der blev ikke givet noget DHT-3-D-GL. 3 Dage inden en primær

DK 158644B

17 immunisering med T-3-KLH blev der givet DHT-3-D-GL (500 yg) til hver mus i den anden gruppe ved i.p.injektion.

Alle mus blev indgivet (ip.) T-3-KLH (100 yg/mus) i saltopløsning sammen med Freunds fuldstændige adjuvans 5 og 3 uger herefter yderligere indgivet samme mængde T-3-KLH i saltopløsning sammen med Freuds ufuldstændige adjuvans. De blev endvidere indgivet den samme mængde T-3-KLH i saltopløsning efter 5, 7, 9 og 17 uger.

3 Dage inden den sekundære immunisering og 3 dage 10 inden den tertiære immunisering (5 uger efter den primære immunisering) med T-3-KLH blev der i hvert tilfælde • indgivet DHT-3-D-GL (500 yg) til musen^ i den tredje gruppe.

Serum opsamledes med på hinande$ følgende 2 ugers 15 intervaller fra musenes retroorbitale plexus til bestemmelse af antistoffets titer og krydsreaktivitet. Krydsreaktiviteten blev bestemt ved Abrahams metode. Resul-.) taterne er vist i tabel 1.

Tabel 1

20 (A) Titer af anti-testosteron antistof og (B) dets krydsreaktivitet med DHT

Uger Gruppe 1_Gruppe 2_Gruppe 3_ (ikke forbe- forbehandlet (ikke forbe-r handlet) med DHT-3-D- handlet 25 _GL (500 yg/ ip.)_ 9 A 3331 1004*** Dannelse af antistof + B 30,3+4,9 7,1+9 * 11 A 4320 1711 30 B 54,1+24,1 11,2+6,2 13 A 2886 819 B 43,0+12,5 7,9+4,5 19 A 1494 461 B 30,8+10,1 ' 7,4+4,1 35 Noter: - 1 - Titeren udtrykkes ved det reciprokke tal for fortyndingen af serum, der er i stand til at kombinere 50% af ^H-testosteron (45 pg).

18

DK 15 8 6 44 B

*2 - Krydsreaktivitet (%) udtrykkes ved [den mængde (ng) testosteron, der er nødvendig til at hæmme binding med 50%/mængde (ng) DHT, der er nødvendig til at hæmme binding med 50%] x 100%.

5 3 - Middelværdi for antistoftiteren udtrykkes som den geometriske middelværdi,og krydsreaktiviteten udtrykkes som den aritmetiske middelværdi + standardafgivelse .

4 - DHT-3-D-GL anvendtes ikke til forbehandling, men 10 blev indgivet efter den primære immunisering.

Som det fremgår af denne tabel var antistoftiteren i den anden gruppe lidt lavere end titeren for den første (kontrol)gruppe, og kinetikken for antistofdannelsen i den anden gruppe svarede til kinetikken for 15 kontrolgruppen. På den anden side observeredes der ingen betydningsfuld antistofdannelse hos den tredje gruppe i hele perioden. Krydsreaktiviteten med DHT for den anden gruppe, der blev forbehandlet med DHT-D-GL, var væsentligt mindre end krydsreaktiviteten for kontrolgruppen.

20 Relationen mellem antistoftiteren og antistoffets krydsreaktivitet, der blev opnået for hver af prøvemusene, blev plottet.

Skønt dataene ikke er vist her, fandtes der imidlertid ingen signifikant forbindelse mellem antistofti- % 25 teren og krydsreaktiviteten. I almindelighed fandtes det, at behandlingen med DHT-3-D-GL resulterer i en sænkning i krydsreaktiviteten med DHT,og dette korrelerede ikke med faldet i antistoftiteren. Med andre ord resulterer et fald i krydsreaktiviteten ikke i et betydningsfuldt 30 fald i titeren.

Ud fra disse fakta postuleres det, at når de kloner, der har en krydsreaktivitet med DHT fjernes med forbehandling med DHT-3-D-GL, kan den efterfølgende immunisering med T-3-KLH selektivt forøge dannelsen af an--3 b ti stof dannende kloner med en højere specificitet over for T. En sådan evne for specifik dannelse af det antistof, der har en mindre krydsreaktivitet,ved fremgangs-

DK 158644 B

19 måden ifølge opfindelsen, er betydningsfuld for praktiske formål.

Eksempel 2

Fremstilling af specifikt anti-DHT antistof med 5 lille krydsreaktivitet (mus):

Fem grupper mus (hver gruppe bestående af 5-7 hunmus, C57BL/6-stammen, 8 uger gamle) anvendtes til dette eksempel. Mus fra den første gruppe (kontrolgruppe) blev ikke indgivet T-3-D-GL, og en primær immunise-10 ring blev udført ved anvendelse af DHT-3-KLH. 3 og 5 ' Uger herefter udførtes en sekundær og en tertiær immuni sering efterfulgt af yderligere immunisering, der blev udført med 2 ugers intervaller. Mus fra andre grupper blev også immuniseret på denne måde samtidigt med musene 15 i kontrolgruppen.

3 Dage inden den primære immunisering med DHT-3-KLH blev musene i den anden gruppe indgivet T-3-D-GL (500 yg/mus) ved ip.-injektion. Som en anden kontrolgruppe blev mus fra den tredje gruppe indgivet DHT-3-D-20 GL (500 yg/mus) ved i.p.injektion 3 dage inden den primære immunisering med DHT-3-KLH.

3 Dage inden den sekundære immunisering, der blev udført 3 uger efter den primære immunisering med DHT-3-KLH, blev musene i den fjerde og femte gruppe indgivet 25 henholdsvis T-3-D-GL og DHT-3-D-GL (hver 500 yg/mus(ip.)).

Fra 7 uger efter den primære immunisering indsamledes serum fra hver mus i de fem grupper med 2 ugers intervaller til bestemmelse af antistoftiteren og krydsreaktiviteten i serummet. De resultater, der blev opnået ved 30 anvendelse af det serum, der indsamledes 13 uger efter den primære immunisering, er vist i tabel 2.

DK 158644B

20

Tabel 2

Gruppe Antistoftiter Krydsreaktivitet 1 3457 90,3+12,9 2 1286 38,2+14,6 5 3 1079 86,3+23,7 4 0 5 0 *1 og '*2: Jf. fodnote til tabel 1.

Tabel 2 antyder, at anti-DHT antistof med lille 10 krydsreaktivitet blev opnået ved forbehandling med T-3-D-GL (den anden gruppe)- I dette eksempel observeredes der ingen signifikant dannelse af anti-DHT antistof i fjerde og femte gruppe, der var blevet behandlet med T-3-D-GL eller DHT-3-D-GL, efter den primære immunisering.

15 I den tredje gruppe blev musene forbehandlet med DHT-3-D-GL og immuniseredes derefter med DHT-3-KLH, og det herved dannede anti-DHT antistof viste en stor kryds-reaktivitet med T ligesom i tilfældet med kontrolmusene, skønt der(Jbbserveredes næsten den samme størrelsesorden 2.0 på antistof ti terne i den anden og tredje gruppe. Ud fra disse resultater kan det kontrolleres, at der effektivt opnåedes et anti-DHT antistof med lille krydsreaktivitet. med hénsyn til T ved behandling med T-3-D-GL.

Eksempel 3 25 Fremstilling af anti-T eller anti-DHT antistof (kanin):

Seks grupper hunkaniner (hver gruppe bestående af 2 kaniner, vægt ca. 3 kg) anvendtes.

3 Dage inden den primære immunisering med 100 ug 30 DHT-3-KLH emulgeret i Freunds fuldstændige adjuvans blev kaninerne i den første gruppe (ip.) indgivet T-3-D-GL (10 mg/kanin), og 3 uger herefter blev kaninerne subcu-tant indgivet en sekundær immunisering med 200 pg DHT-3-KLH i Freunds ufuldstændige adjuvans.

35 De blev derpå boosterinjiceret subcutant fire

DK 158644 B

21 gange i træk med 200 yg DHT-3-KLH i skiftevis Freunds fuldstændige adjuvans og Freunds ufuldstændige adjuvans med månedlige intervaller.

Kontrolkaninerne (den anden gruppe) immuniseredes 5 også med DHT-3-KLH på en måde, der svarede til den, der anvendtes for den første gruppe. Disse blev imidlertid ikke indgivet T-3-D-GL. Kaninerne i den tredje gruppe blev indgivet (ip.) T-3-D-GL (10 mg/kanin) 3 dagen inden den sekundære og tertiære immunisering med DHT-3-KLH, 10 der blev udført henholdsvis 3 og 7 uger efter den primære immunisering.

Kaninerne i den fjerde gruppe blev indgivet (ip.) DHT-3-D-GL (10 mg/kanin) 3 dage inden den primære immunisering med T-3-KLH. Immuniseringen med T-3-KLH blev 15 udført på en måde, der svarede til den, der blev anvendt for den første gruppe.

I den femte gruppe (kontrolgruppe) immuniseredes kaninerne med T-3-KLH på en måde, der svarede til den, der blev anvendt til den fjerde gruppe. Disse blev imid-20 lertid ikke indgivet noget DHT-3-D-GL.

I den sjette gruppe blev kaninerne indgivet (ip.) DHT-3-D-GL (10 mg/kanin) 3 dage inden den sekundære og tertiære immunisering med T-3-KLH, der udførtes henholdsvis 3 og 7 uger efter den primære immunisering.

25 10 Dage efter hver af de ovennævnte booster-in- jektioner indsamledes serum fra hver kanin og bestemtes til opnåelse af de følgende resultater: I den tredje og sjette gruppe observeredes ingen signifikant dannelse af antistoffer i hele perioden. An-30 ti-DHT- og anti-T-antistoffer opnået fra den anden og femte gruppe (kontrolgrupper) viste i det væsentlige den samme reaktivitet med de haptener, der blev anvendt til immunisering og krydsreaktivt hapten. Dvs. anti-DHT-an-tistoffer fra kaninerne i den anden gruppe viste en 100% 35 krydsreaktivitet med T, og anti-T-antistoffer fra kaninerne i den femte gruppe viste en 95,2% krydsreaktivitet med DHT. På den anden siden gav kaninerne fra den første og fjerde gruppe signifikant lave krydsreaktiviteter, og

DK 158644B

22 anti-DHT-antistofferne fra kaninerne i den første gruppe viste en 11/9% krydsreaktivitet med T,og anti-T-antistof-ferne fra kaninerne i den fjerde gruppe viste en 22,0% krydsreaktivitet med DHT.

5 Eksempel 4

Bestemmelse af T og DHT i humant blod under anvendelse af specifikke anti-T- og anti-DHT-antistoffer fra kaniner: 1) Anti-T- og Anti-DHT-antistoffer med lav kryds-10 reaktivitet opnåedes fra kaniner i gruppe 1 og 4 i det ovennævnte eksempel. De følgende undersøgelser blev udført for at undersøge den praktiske anvendelighed af disse antistoffer til bestemmelse af tilstedeværende T og DHT i humant serum. Hertil blev der sat givne mængder 15 henholdsvis T og DHT til humane serumprøver/ og forbindelsen mellem den tilsatte mængde og mængden af T eller DHT bestemt med radioimmunoassay under anvendelse af det nævnte antiserum blev undersøgt. For at bestemme niveauet af tilstedeværende T i humant serum sattes T (1/ 2 20 og 4 ng) eller DHT (0,1, 0/2 og 0,3 ng) til samlet serum (1 ml, indsamlet fra kvinder og med lav T-værdi), der derpå tilsattes ^H-T (2000 dpm) eller ^H-DHT (2000 dpm) for at bestemme udbyttet i ekstraktionstrinnet. I hvert tilfælde blev blandingen blandet godt og tilsat en bian- i 25 ding af hexan/ether (3:2/ 3 ml) efterfulgt af omrystning i 1 minut med en vortex-blander. Herefter blev reagensglasset hensat i et tøris/acetonebad i 10 sekunder, og det organiske opløsningsmiddellag blev overført til et andet reagensglas. Det organiske opløsningsmiddel blev 30 afdampet, og resten tilsat ethanol (2 ml) under omrystning. En del af ethanolopløsningen blev anbragt i et lille reagensglas. Mængden af opløsning, der var overført til reagensglasset blev justeret for at muliggøre bestemmelsen af T under anvendelse af en hæmningskurve 35 kalibreret med det ovennævnte antiserum. Opløsningen blev tørret ved afdampning og underkastet radioimmunoassay under anvendelse af det lavt krydsreagerende anti-

DK 158644 B

23 T-antistof, der blev opnået ved DHT-3-D-GL-behandling.

På den anden side blev en ethanolopløsning (0,5 ml) anbragt i et glas og tørret ved afdampning. Resten blev tilsat en scintillator og talt til bestemmelse af udbyt-5 tet i ekstraktionstrinnet. Dette udbytteforhold blev anvendt til at korrigere den værdi, der blev opnået ved radioimmunoas sayet.

For at bestemme niveauet af tilstedeværende DHT i serum blev det samlede serum fra kvinder (1 ml) tilsat 10 DHT (0,2 og 0,5 ng) eller T (0,2 og 0,5 ng) og blev derefter tilsat ^H-T (2000 dpm) eller ^H-DHT (2000 dpm) for ' at bestemme udbyttet. Blandingen blev tilsat hexan/ether (3:2, 3 ml) og ekstraheret på tilsvarende måde som beskrevet ovenfor. Ekstraktionsresten blev tilsat ethanol 15 (2 ml), og en del af ethanolopløsningen anbragtes i et lille reagensglas. Mængden af opløsning i reagensglasset blev justeret til at være tilstrækkelig til at muliggøre bestemmelsen af DHT under anvendelse af en DHT hæmnings-kurve opnået ved anvendelse af det ovennævnte antiserum.

20 Opløsningen blev tørret ved afdampning og underkastet radioimmunoassay under anvendelse af antiserummet med lav krydsreaktivitet, der blev opnået ved behandlingen med T-D-GL. På den anden side blev ethanolopløsningen (0,5 ml) anbragt i et glas, og ethanol fjernedes ved af-25 dampning. Resten blev tilsat scintillatoren og talt til bestemmelse af udbyttet i ekstraktionstrinnet. Dette udbytteforhold blev anvendt til at korrigere den værdi, der opnåedes ved radioimmunoassayet.

Som et resultat fandtes det, at når det anvendtes 30 et anti-T-antistof med lille krydsreaktivitet til at måle T (1, 2 og 4 ng), der var tilsat et normalt kvindeligt serum med en oprindelig T-værdi på 0,30 ng, var den målte T-værdi henholdsvis 1,15, 2,30 og 4,60 ng.

På den anden side fandtes der, når DHT (0,1, 0,2 35 og 0,3 ng) blev sat til kvindeligt serum i stedet for T for at undersøge DHT's indflydelse på mængden af assay-bestemt T, ingen signifikant indflydelse,og T-niveauet i normalt kvindeligt serum var næsten uændret.

DK 158644 B

24 I et separat eksperiment blev der sat DHT (0,2 og 0,5 ng) til normalt kvindeligt serum, og mængden af DHT i serummet bestemtes ved anvendelse af et anti-DHT-antistcf med lav krydsreaktivitet. Det fandtes, at mængden af DHT 5 i det normale kvindelige serum inden tilsætning var 0,21 ng og derpå efter tilsætning ændredes til 0,41 og 0,72 ng i hvert tilfælde. Disse værdier var tilstrækkeligt i overensstemmelse med de tilsatte mængder DHT.

På den anden side skete der, når T (0,2 og 0,5 ng) 10 sattes til normalt kvindeligt serum i stedet for DHT for at undersøge Τ's indflydelse på det assaybestemte DHT-niveau, ingen signifikant ændring i DHT-niveauet i normalt kvindeligt serum ved tilsætning af T.

Det ses, at T- og DHT-niveauer i serummet kan be-15 stemmes nøjagtigt ved anvendelse af antistofferne med lav krydsreaktivitet, der er beskrevet i eksempel 3.

2) Assay af en prøve indeholdende en blanding af specifikt antigen og krydsreaktivt antigen: DHT-niveauet i humant blod bestemtes igen under 20 anvendelse af et antistof med lav krydsreaktivitet fra kaninerrsom beskrevet ovenfor. I hvert tilfælde blev der samtidigt sat DHT og T (henholdsvis 5 og 10 ng, 10 og 5 ng eller 10 og 10 ng) til kvindeligt samlet serum (0,1 ml),og bestemmelsen udførtes på en tilsvarende måde som 25 den, der er beskrevet ved (1) ovenfor. Som et resultat fandtes det som vist i tabel 3, at når endog en stor mængde T, dvs. et krydsreaktivt antigen, er til stede i prøven, var mængderne af DHT 5,67, 10,17 og 9,20 ng i hvert tilfælde. Det kan således siges, at DHT kan assay-30 bestemmes nøjagtigt ved anvendelse af det lavt krydsreaktive anti-DHT-antistof fra eksempel 3, når endog en stor mængde T, der er det krydsreaktivt antigen, er til stede i prøven.

DK 158644 B

25

Tabel 3

Tilsat mængde DHT Tilsat mængde T DHT fundet _(ng) _(ncf)_(ng)_ 5 10 5,67 5 10 5 10,17 10 10 9,20 På tilsvarende vis blev der sat T og DHT (henholdsvis 5 og 10 ng, 10 og 5 ng eller 10 og 10 ng) til serummet (0,1 ml), og T-niveauer bestemtes ved anvendel-10 se af det lavt krydsreaktive anti-T-antistof. I hvert tilfælde var mængderne af fundet T henholdsvis 6,80, 10,3 og 10,5 ng som vist i tabel 4, hvoraf det fremgår, at når det ovennævnte anti-T-antistof med lav krydsreaktivitet anvendes, assaybestemmes T nøjagtigt i nærvæ-15 relse af DHT, der er et krydsreaktivt antigen.

Tabel 4

Tilsat mængde T Tilsat mængde DHT T fundet _(ng)_(ng)_(ng)_ 5 10 6,80 20 10 5 10,3 10 10 10,59 3) Assay af human prøve (direkte metode):

Udtrykket "direkte metode" angiver den assay-metode, der ikke kræver en forudgående separation af T 25 og DHT. Til sammenligning er endvidere anført værdier opnået ved en konventionel metode. I den sidstnævnte metode separeres T og DHT ved papirchromatografi inden bestemmelse.

3.1) Assay af T i humant serum: 30 (A) Prøvefremstilling: landligt serum (hver 0,1 ml) og kvindeligt serum (hver 0,5 ml) anbragtes i respektive reagensglas og til- 3 sattes H-T (hver 3000 dpm) for at bestemme udbyttet i ekstraktionstrinnet eller ekstraktions-chromatografe-35 ringstrinnet. Det mandlige serum blev tilsat destilleret vand (hver 0,5 ml). En blanding af hexan/ether (3:2, hver 3 ml) blev sat til serumprøverne og blandet godt

DK 158644B

26 under anvendelse af en vortex-blander i 1 minut. Reagensglassene anbragtes derefter i et tøris/acetonebad i 10 sekunder til frysning af serumfraktionerne. Det organiske opløsningsmiddellag blev overført til et andet rea-5 gensglas, og det organiske opløsningsmiddel blev fjernet ved afdampning.

(B) Direkte metode:

Ethanol (0,4 ml) blev sat til hver rest af de mandlige serumprøver og blandet godt, og opløsningen 10 blev overført til et radioimmunoassayrør. Mængden af opløsning i prøverøret blev justeret til at ligge i et område fra 50 til 400 pg, dvs. 100 μΐ i tilfældet af et normalt område og 50 μΐ i tilfælde med serum med højt T-niveau, såsom prøverne nr. 1, 2 og 3 i tabel 5, der 15 beskrives nedenfor. For at bestemme udbyttet i ekstraktionstrinnet blev opløsningen (100 μΐ) overført til et glas og tørret ved afdampning. Efter tilsætning af en scintillator taltes resten.

I tilfældet med kvindeligt serum sattes ethanol 20 (0,7 ml) til hver rest, og ethanolopløsningen (0,5 ml) overførtes til et radioimmumoassayrør. For at bestemme udbyttet i ekstraktionstrinnet anbragtes opløsningen (100 μΐ) i et glas og tørredes ved inddampning. Resten taltes efter tilsætning af en scintillator.

25 I begge de ovennævnte tilfælde fjernedes ethanol ved afdampning under en nitrogenstrøm, og det opnåede tørre ekstrakt blev anvendt til radioimmunoassay.

(C) Papirchromatografi:

Det tørrede ekstrakt, der var fremstillet på en 30 tilsvarende måde, som blev anvendt ved den direkte metode, blev anbragt på et stykke papir med tre 50 μΐ chlo-roformskylninger. På et identisk stykke papir anbragtes T (10 μg) som reference og gennemførtes sammen med hvert sæt bestemmelser. Papirstrimlerne blev anbragt i et chro-35 matograferingskar indeholdende Bush A (et opløsningsmiddelsystem af cyclohexan/methanol/vand = 10:8:2). Efter 2 timer til ligevægtsindstilling fremkaldtes de i det øvre lag Bush A. Efter fremkaldelse i 16 timer bestemtes

DK 158644B

27 T-pletten, der anvendtes som reference ved ultraviolet absorption ved 254 nm og et 3 cm langt afsnit af prøvepapiret svarende til placeringen af den nævnte referenceplet/ blev skåret af fra papiret og ekstraheret med 5 ethanol (3 ml). Ethanol fjernedes ved afdampning under nitrogenstrøm, og resten anvendtes til radioimmunoassay på en måde, der svarede til den, der er beskrevet i den direkte metode.

(D) Radioimmunoassay: 10 For at fremstille en T-standardkurve anbragtes ethanolopløsninger, der indeholdt 0, 20, 50, 100, 200 og 400 pg T i reagensglas in duplo. Til disse reagensglas, der indeholdt undersøgelsesprøver, sattes en ethanolop- 3 løsning (hver 10 μΐ), der indeholdt 20.000 dpm H-T/lOvl, 15 og derpå fjernedes ethanolen ved afdampning. Et anti-T- antistof fra kanin fortyndedes med en 0,05M tris-puffer- opløsning [pH = 8,0, indeholdende 0,05% BSA og 0,1% BGG] til den koncentration (B_ = 60%), der er i stand til at

V

binde 60% af 20.000 dpm H-T (45 pg som T) og 0,2 ml af 20 denne antiserumopløsning blev anbragt i hvert reagensglas efterfulgt af omrøring under anvendelse af en vor-tex-blander. Separat overførtes denne tris-pufferopløsning (hver 0,2 ml) til to reagensglas, der hver inde- 3 holdt 20.000 dpm H-T alene og blandedes godt til opnå-25 else af total dpm (Bq = 100%). Efter henstand ved stuetemperatur i 2 timer tilsattes opløsningen mættet ammoniumsulfat (0,2 ml) og blandedes godt. Efter centrifugering ved 3000 omdrejninger pr. minut i 10 minutter overførtes 0,2 ml af den ovenstående væske til et glas.

30 Efter tilsætning af en scintillator (0,2 ml) tal tes aktiviteten og beregnedes til et B/BQ (%).

3.2) Assay af DHT i kvindeligt serum: Serumprøvefremstilling, ekstraktion og separation af DHT og T ved papirchromatografi var den samme som 35 udført ved assay af T under anvendelse af kvindelig serumprøve. Placeringen af en reference DHT-plet bestemtes ved sprøjtning med en opløsning af lige store rumfang

DK 158644 B

28 1%'s m-dinitrobenzen i absolut ethanol og 2,5 N NaOH i absolut ethanol. Radioimmunoassay af DHT blev udført ved anvendelse af standardethanolopløsningen af DHT og en

O

ethanolopløsning af H-DHT (40.000 dpm/10 yl) på en til-5 svarende måde som den, der blev anvendt til radioimmunoassay af T. I hvert tilfælde blev resultatet fra radio-immunoassayet korrigeret med udbytteforholdet.

Ved den direkte metode lå udbytteforholdet for T eller DHT inden for et område fra 95 til 100%, og ud- 3 3 10 byttekorrektionen ved tilsætning af H-T eller H-DHT er derfor ikke nødvendigvis nødvendig til rutinearbejde. Resultaterne er vist i tabellerne 5 og 6.

(E) Resultater og analyse:

Tabel 5 -i- 15 Prøve nr J Anvendt serum *undet T <n(t/ml) (* mandligt; -p-—-— I Xk kvindeligt) Direkte metode Papirchromato-_i___grafi 1 * 10,35 9,60 2 * 13,34 15,36 20 3 * 22,84 19,08 4 * 8,92 9,16 5 * 4,40 4,38 6 * 5,00 4,90 7 * 8,20 7,95 25 8 * 7,43 7,10 9 %% 0,88 0,740 10 . ** 0.310 0,292 11 ** 0.180 0,191 12 ** 0,160 0,158 30 13 XX 0,340 0,356 14 ** 0,500 0,490 i 15 ** ! 0,250 0,240 16 ** 0,154 0,218

Af tabellen fremgår, at resultaterne fra de to 35 assaymetoder er i overensstemmelse med hinanden.

DK 158644B

29

Tabel 6 (Anvendt serum — kvindeligt serum)

Fundet DHT (ng/ml)

Prøve nr. --

Direkte metode PapirchromatigrafL

5 1 0,175 0,154 2 0,210 0,201 3 0,198 0,200 4 0,195 0,190 5 0,280 0,280 10 6 0,250 0,260 7 0,221 0,232 8 0,201 0,198 I___ I denne tabel er resultaterne fra de to metoder i overensstemmelse med hinanden.

15 Som det fremgår af disse eksperimentelle resulta ter, er det ved anvendelse af den direkte metode ifølge opfindelsen ved anvendelse af et lavt krydsreaktivt antistof muligt enkelt og nøjagtigt at assaybe?stemme det ønskede stof endog i nærværelse af krydsreaktivt antigen.

20 i dette tilfælde er det ikke længere nødvendigt at separere det krydsreaktive antigen forinden ved .papirchroma-tografi, hvilket er..blevet anvendt i konventionelle metoder .

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen,ved hvilken der 25 opnåedes et specifikt antistof såvel som en klon, der var i stand til at fremstille sådant antistof ved forbehandling af et dyr med et konjugat af et krydsreaktivt antigen og D-GL for at inducere en immunologisk passivitet over for et krydsreaktivt antigen. Dette princip er 30 ikke begrænset til de ovennævnte særlige udførelsesformer under anvendelse af T-3-D-GL og DHT-3-D-GL og kan anvendes i andre tilfælde sådan, som det fremgår af det følgende eksempel 5, hvorved der opnåedes i det væsentlige de samme resultater, endog når T og DHT var koblet 35 til bærerne på forskellige steder. I det følgende eksempel anvendtes T og DHT igen som modelsystemer, og deres koblingspositioner ændredes fra den tredje til den

DK 158644 E

30 femtende position, således at strukturen af den hapten, der var frit tilgængelig på bærermolekylets overflade, ændredes.

Eksempel 5 5 Egenskaber af et antiserum opnået under anvendel se af et konjugat af 153-carboxyethylmercaptotestosteron (herefter benævnt 153-CEM-T) samt 153-carboxyethylmercap-to-5a-dihydrotestosteron (herefter benævnt 153-CEM-5a-DHT) med KLH og D-GL: 10 I dette eksempel syntetiseredes 15 3-CEM-T ved den fremgangsmåde, der er angivet af Rao, P.N. et al: [Steroid, 28, side 101 (1976)) og 153-CEM-5a-DHT syntetiseredes efter den fremgangsmåde, der er angivet af Rao, P.N., et al: [Steroid, 29[, side 171 (1977)].

15 Konjugeringen af 153-CEM-T-til D-GL og KLH samt konjugeringen af 158-CEM-5a-DHT til D-GL og KLH udførtes på en måde, der svarede til den, der blev anvendt til den ovennævnte konjugering af DHT-3-CM0 eller T-3-CM0 til D-GL eller KLH. Det således opnåede konjugat benæv-20 nes henholdsvis T-15-D-GL, T-15-KLH, DHT-15-D-GL og DHT-15-KLH.

I dette eksempel anvendtes 6 grupper mus (hver gruppe bestående af 7 mus; C57BL/6 stammen; 8-10 uger gamle) .

25 Den første gruppe var kontrolgruppe, og musene blev givet saltopløsning (uden DHT-15-D-GL). Den anden gruppe blev givet DHT-15-D-GL (hver 500 yg/mus) 3 dage inden den primære immunisering; en anden kontrolgruppe var den tredje gruppe, og musene blev givet (ip.) T-15-30 D-GL (hver 500 yg/mus) 3 dage inden den første immunisering med T-15-KLH. T-15-KLH (100 yg/mus) anvendtes til immunisering af den første, anden og tredje gruppe. Efter 3 uger udførtes den sekundære immunisering af disse mus, og derefter blev der udført booster-immuniseringer 35 for hver 2 uger efter den sekundære immunisering. Den fjerde, femte og sjette gruppe mus immuniseredes med DHT-15-KLH. 3 Dage inden den primære immunisering med

DK 158644B

31 DHT-15-KLH blev musene i den femte gruppe givet (ip.) T-15-D-GL (500 yg/mus). Samtidig med den femte gruppe blev musene i den fjerde gruppe, der optrådte som kontrolgruppe, givet (ip.) saltopløsning i stedet for T-15-5 D-GL.

Musene i den sjette gruppe (som en anden kontrolgruppe) blev givet (ip.) DHT-15-D-GL (500 yg/mus) 3 dage inden den primære immunisering med DHT-15-KLH.

7 Uger efter den primære immunisering blev der 10 indsamlet serum fra hver mus med 2 ugers intervaller for at måle antistoftiteren og krydsreaktiviteten. Det antiserum, der blev opnået 13 uger efter den primære immunisering, havde størst antistoftiter. Heraf opnåedes de følgende resultater. Egenskaberne af anti-T-antisera fra 15 den første, anden og tredje gruppe var som følger:

Udtrykt som den reciprokke af den antiserumfor- 3 tynding, der var i stand til at binde 50% H-T (45 pg), ligger anti-T-antistoftiterne hos musene i den første (kontrol) og anden gruppe inden for områderne fra hen-20 holdsvis 1600 til 9000 og 1000 til 3500, og musene i den tredje gruppe, der havde fået T-15-D-GL, viste ingen dannelse af antistoffet.

Bestemt ved Abrahams metode viste antiserum fra musene i den første gruppe krydsrfeaktivitet inden for et 25 område fra 4,1 til 8,2, hvorimod der i antiserum fra musene i den anden gruppe opnåedes krydsreaktiviteter fra 0,27 til 0,94. Resultaterne fra den anden gruppe er overlegne med hensyn til krydsreaktiviteterne med DHT i forhold til de, der er blevet opnået med alle andre kendte 30 anti-T-antisera, der er rapporteret af andre. Det kan således siges, at krydsreaktiviteten med DHT for det opnåede antiserum, i praksis var negligerbart ved opfindelsen. Det vides, at 1,81% er den laveste krydsreaktivitet med DHT af noget anti-T-serum, der er anført i 35 den kendte litteratur, og at Rao et al opnåede denne laveste værdi ved anvendelse af et anti-T-serum fremstillet ved immunisering af kanin med Ιδβ-CEM-T-BSA [P.N.Rao et al og P.H. Moore Jr.: Steroid, 28 (1976)], der også an-

DK 158644B

32 vendes i det ovennævnte eksempel. Krydsreaktiviteten hos musene i den første gruppe i dette eksempel er i det væsentlige lig med den laveste værdi.

Egenskaber af anti-DHT-antisera fra den fjerde, 5 femte og sjette gruppe:

Udtrykt som den reciprokke af den fortynding, der er i stand til at binde 50% ^H-DHT (45 pg) lå anti-DHT-antistoftiterne i den fjerde gruppe (kontrolgruppe) inden for et område fra 1500 til 5600, og de i den 10 femte gruppe, der var givet T-15-D-GL, lå fra 1000 til 7600. Musene i den sjette gruppe, der var givet DHT-15-D-GL, viste ingen antistofdannelse.

Når de antisera, der var opnået fra musene i den femte gruppe, der var blevet behandlet med T-15—D-GL, 15 undersøgtes med Abrahams.metode, .lå krydsreaktiviteterne med T af de således opnåede antisera inden for et område fra 6,5 til 19% i kontrast til krydsreaktivitetsværdier fra 48,3 til 68,5 i antisera -fra musene i den fjerde gruppe (kontrolgruppe). Disse fakta antyder, at admini-20 stration af T-15-D-GL reducerer krydsreaktiviteten med T signifikant.

Dannelse af antistof fandtes ikke i musene fra den sjette gruppe, der var givet DHT-15-D-GL. Årsagen hertil menes at være den specifikke inaktivering af anti-25 DHT-antistof-producerende kloner ved administration af DHT-15-D-GL.

De reagenser og assaymetoder, der blev anvendt i de efterfølgende eksempler 6-9, forklares som følger. I disse eksempler anvendtes det ovennævnte princip ifølge 30 opfindelsen på peptiddeterminanter.

Fremstilling af pentagastrin-D-GL-konjugat.

Reference: Liu et al, Biochemistry, bind 18, 690 (1979).

(6-A) Syntes^ af S-acetylmercaptosuccinyl-D-GL (herefter 35 benævnt Ac-S-D-GL): D-GL (molvægt = 34.300* 40 mg = 1,166 ymol) opløstes i 0,125 M phosphatpufferopløsning (900 yl)* pH = 7,2),og pH justeredes til 7,2 med 1 N NaOH opløsning.

33 DK 1^8644 B

Efter tilsætning af 50 yl (57,44 ymol) dimethylformamid-opløsning (herefter benævnt DMF) af S-acetylmercaptosuc-ciri-anhydrid (200 mg/ral) omrørtes blandingen ved stuetemperatur i 30 minutter. Under omsætningen fastholdtes 5 blandingens pH på 7,2. Efter omsætningens afslutning anbragtes opløsningen på en Sephadex G-25 søjle, der var bragt i ligevægt med 0,01 M phosphatpuffersaltopløsning (pH = 7,2), der indeholdt 0,01 M Na2~EDTA for at adskille reaktionsproduktet fra ikke-omsat S-acetylmercapto-10 succinanhydrid. En fraktion (100 yl) af opløsningen, der indeholdt reaktionsproduktet, blev tilsat en vandig opløsning af 0,5 M hydroxylamin (100 μΐ = 50 ymol; pH = 7,3) og inkuberedes ved 37°C i 20 minutter for at fjerne den beskyttende acetylgruppe. Antallet af sulfhydrylgrup-15 per, der var indført i D-GL, bestemtes ved Ellman et al's metode [Arch. Biochem. Biophys., bind 82, side 70 (1979)3 på den følgende måde. Reaktionsopløsningen (50 yl) blev tilsat en methanolopløsning af 0,01 M 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoesyre) (afiltet; 0,1 ml) og 1 ml tris-20 pufferopløsning (pH = 8,0) og omsat i 20 minutter,og ab-sorbansen ved 412 nm måltes. Antallet af S-acetylmercap-togrupper, der var indført i et D-GL-molekyle, var ca.

15. Det således opnåede S-acetylmercaptosuccinyl-D-GL benævn tes herefter Ac-S^-D-GL. Udbyttet var ca. 77%.

25 Eftersom D-GL ikke viser nogen absorbans ved 280 nm, kunne udbyttet og den fraktion, der indeholdt det deri-vatiserede D-GL næppe bestemmes ved absorbans ved 280 nm. Derfor bestemtes udbyttet ved som monitorstof at anvende et reaktionsprodukt, der var opnået ved omsætning af N-30 succinimidyl-3-(4-hydroxyphenyl)propionat og D-GL, og som anbragtes på en Sephadex G-25 søjle. Eftersom dette produkt absorberer ved 280 nm, udførtes bestemmelsen bekvemt ved måling af absorbansen ved 280 nm.

(6-B) Fremstilling af m-maleinimidobenzoyl-pentagastrin 35 (herefter benævnt MB-pentagastrin):

Pentagastrin (11 mg; 16,1 ymol) opløstes i 0,1 M phosphatpuffer (9,5 ml; pH = 8,0) og sattes derefter i én portion til m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid-

DK 158644 B

34 ester (25,3 mg, 80,5 ymol; herefter benævnt MBS) opløst i DMF (1 ml). Blandingen blev omrørt, og omsætningen overvågedes med tyndtlagschromatografi under anvendelse af et opløsningsmiddelsystem af cyclohexan/ethylacetat = 5 1:1 efter rumfang- 25 Minutter efter omsætningens begyndelse sattes dichlormethan (3 ml) til reaktionsblandingen for at fjerne ikke omsat MBS. Blandingen omrørtes godt og centrifugeredes.

Det øverste lag af pufferopløsningen blev anbragt 10 i et andet reagensglas. Dichlormethanlaget (nedre lag) tilsattes en lille mængde phosphatpuffer, blandedes godt og centrifugeredes. Det øverste lag blev samlet med den nævnte opløsning. Ved tyndtlagschromatografi bekræftedes det, at det ikke omsatte MBS var fjernet næsten fuldstæn-15 digt fra den fraktion af pufferopløsningen, der indeholdt MB-pentagastrin.

Separat blev den ovennævnte pufferopløsning (20 μΐ), der indeholdt MB-pentagastrin, sat til en vandig opløsning af 2-mercaptoethanol (20 μΐ; 70 nmol; af- 20 iltet med nitrogenstrøm). Omsætningen blev udført ved stuetemperatur i 20 minutter, og den forbrugte molære mængde 2-mercaptoethanol bestemtes ved Ellman's metode og svarer til den mængde maleinimidobenzoylgruppe, der er indført i pentagastrin. Antallet af maleinimidoben- 25 zoylgrupper, der var indført i et molekyle pentagastrin, var 0,9. Denne forbindelse benævntes herefter MB_ Q-pen- u / y tagastrin).

(6-C) Fremstilling af konjugat af pentagastrin og D-GL.

En opløsning af Ac-S^-D-GL fremstillet i 6-A og

30 en opløsning af MBn Q-pentagastrin fremstillet i 6-B

u / y dannedes for at udføre omsætningen på den følgende måde.

Efter en fuldstændig afiltning i en nitrogenstrøm blev blandingen tilsat en 5 M vandig opløsning af hydroxylamin 500 yl; pH = 7,3) og omrørt ved stuetemperatur i 1 time.

35 Derpå udtoges reaktionsopløsningen delvis for at undersøge nærværelsen af ikke omsat SH-gruppe. Der fandtes intet af en sådan gruppe. Dvs., der var ingen SH-gruppe, der ikke var blevet bundet til MB-pentagastrin. Det be-

DK 158644 B

35 kræftedes således, at alle SH-grupperne i D-GL havde omsat sig med MB-pentagastrin.

2 Timer efter tilsætning af den vandige opløsning af hydroxylamin blev reaktionsblandingen tilsat 2-mer-5 captoethanol til opnåelse af en endelig koncentration på 1 mM, efterfulgt af omrøring i 20 minutter. Herefter dialyseredes reaktionsblandingen over for 0,01 M phos-phatpufferopløsning (pH = 7,2) i ca. 24 timer ved anvendelse af en cellulosemembran, og den således opnåede op-10 løsning blev anvendt med eller uden fortynding.

Molforholdet mellem pentagastrin og D-GL i det således opnåede pentagastrin D-GL-konjugat var 15:1.

Dette produkt benævntes herefter pentagastrin^-D-GL.

(7) Fremstilling af CCK-8-P-keyhole limpet hæmocyanin 15 (herefter benævnt CCK-8-P-KLH): (7-A) Fremstilling af S-acetyl-mercaptosuccinyl-KLH (herefter benævnt Ac-S-KLH):

Fremstilledes på tilsvarende vis som den, der blev anvendt til fremstilling af Ασ-S-D-GL som beskrevet i 20 6-Ά.

Inden syntesen opløstes KLH (70 mg) i en 1%'s opløsning af (1,4 ml) og dialyseredes over for en 0,125 M phosphatpufferopløsning (pH = 7,2).,og absorban-sen ved 280 nm måltes, hvorved mængden af KLH bestemtes.

25 S-Acetylmercaptosuccinanhydrid (6,5 ymol) blev sat til KLH-opløsningen på 0,7 ml indenholdende 26,0 mg (svarende til 260 nmol under antagelse af, at molekylvægten er ca. 100.000; pH = 7,2), og syntesen gennemførtes på en tilsvarende måde som den, der er beskrevet i 30 6-A. Molforholdet mellem S-acetylmercaptogruppe og KLH i produktet var 6,8 (herefter benævnt AC-S, 0-KLH).

O if o (7-B) Fremstilling af m-maleinimidobenzoyl-CCK-8-P (herefter benævnt MB-CCK-8-P):

Fremstilledes på tilsvarende vi som den, der an-35 vendtes til fremstilling af MB-pentagastrin. CCK-8-P (0,42 mg; 385 nmol) syntetiseret ved fragmentkondensationsmetoden opløstes i 0,2 M phosphatpuffer (0,5 ml) og omsat

DK 158644 B

36 tes med MBS (600 ug/ 1,9 ymol) under anvendelse af 50 μΐ DMF-opløsning af 172 mg MBS opløst i 100 μΐ DMF. Reaktionsproduktet indeholdt CCK-8-P og MB i et forhold på 1:1/0 (herefter benævnt MB, n-CCK-8”P).

5 (7-C) CCK-8-P-KLH:

En AC-Sg g-KLH-opløsning (2,3 ml, 75,9 nmol) fremstillet under 7-A og en MB, n-CCK-8-P-opløsning fremstil- J- / u

let under 7-B blandedes sammen og tilsattes 0/5 M NH90H

3 ^ (0,3 cm ; 150 ymol). Herefter gennemførtes en behandling, 10 der svarede til den, der er beskrevet under 6-C. Forholdet mellem CCK-8-P og KLH i det resulterende produkt var ca. 5:1.

8. CCK-8-P-kalveserumalbumin (herefter benævnt CCK-8-P-BSA): 15 (8-A) Fremstilling"·af S-acetylmercaptosuccinyl-BSA:

Syntetiseredes på en måde, der svarede til den, der er beskrevet under 6-A under anvendelse af BSA (25 mg; 351 nmol) og S-acetylmercaptosuccinanhydrid (1,5 mg; 8,8 ymol). Forholdet mellem BSA og S-acetylmercaptogrup-20 pe i produktet var 7,6:1.

(8-B) Fremstilling af MB-CCK-8-P: CCK-8-P (0,5 mg, 457 nmol) opløstes i 0,1 M phos-phatpufferopløsning (0,5 ml; pH = 8,0) og omsattes med MBS (700 yg, 2,29 ymol) under anvendelse af 50 yl af en 25 DMF-opløsning af 1,4 mg MSB opløst i 100 ul DMF på en måde, der svarede til den, der er beskrevet under 6-B. Forholdet mellem MB og CCK-8-P var 1,0:1. Produktet be~ nævntes herefter MB^ g-CCK-8-P.

(8-C) Fremstilling af CCK-8-P-BSA: 30 Den opløsning, der opnåedes under 8-A (1,9 ml; 84 nmol), og den opløsning, der opnåedes under 8-B, blandedes og tilsattes 0,5 M N^OH (0,35 cm^; 175 ymol) ·

Blandingen blev behandlet på en måde, der svarede til den, der er beskrevet under 6-C,til opnåelse af et kon-35 jugat, hvori forholdet mellem CCK-8-P og BSA var ca. 5:1 (herefter benævnt CCK-8-P-BSA).

DK 158644B

37 9. Fremstilling af pentagastrin-BSA: (9-A) Fremstilling af MB-pentagastrin:

Pentagastrin (0,5 mg, 750 nmol) opløstes i 0,1 M phosphatpufferopløsning (0,5 ml; pH = 8,0) og omsattes 5 med MBS (1,05 mg; 3,3 umol) under anvendelse af 50 μΐ DMF-opløsning fremstillet ved opløsning af MBS (2,1 mg) i DMF (100 μΐ)· Omsætningen blev udført på en måde, der svarede til den, der er beskrevet under 6-B. Forholdet mellem MB og pentagastrin var 1,0:1. Produktet benævntes 10 herefter MB^ ^-pentagastrin.

(9-B) Fremstilling af pentagastrin-BSA:

En opløsning (2,54 ml; 112 nmol) fremstillet under 8-A blandedes med opløsningen fremstillet under 9-A. Blandingen blev tilsat 0,5 M N^OH (0,4 cm^; 200 μιηοΐ) 15 og behandlet på en måde, der svarer til den, der er beskrevet under β-C. Forholdet mellem pentagastrin og BSA i produktet var ca. 5:1. Det opnåede produkt benævntes pengagastrin-BSA.

10. En procedure, der svarede til den, der er beskre-20 vet under 6 ovenfor, blev gentaget bortset fra, at der anvendtes D-GL med en molekylvægt på 115.000 i stedet for en molekylvægt på 34.300 (idet det molære reaktionsforhold var det samme som det, der er beskrevet under 6).

Der opnåedes pentagastrin.^-D-GL, der havde aamme tæthed 25 af antigendeterminanten kombineret med D-GL på molekyl-overfladen.

Eksempel 6 A. Immuniseringsskema og indsamling af serum: (C57BL/6J x DBA/2) F^ hunmus; hver gruppe bestå-30 ende af 6 mus immuniseredes.

Alle musene i hver gruppe immuniseredes med CCK-8-P-KLH (hver 10 ug) i Freund's fuldstændige adjuvans (hver 0,2 ml), og 3 uger herefter immuniseredes de yderligere med CCK-8-P-KLH (hver 10 ug) i Freund's ufuldstæn-35 dige adjuvans (0,2 ml). 2 Uger efter den sekundære immunisering blev de booster-immuniseret med CCK-8-P-KLH

DK 158644 B

38 (hver 10 yg) blandet med 2 mg aluminiumhydroxidgel. 2 og 4 Uger herefter immuniseredes de yderligere 2 gange ved injektion af 0,2 ml saltopløsning af CCK-8-P-KLH (hver 10 yg). Alle behandlingerne udførtes ved ip.-in-5 jektion.

3 Dage inden den primære immunisering fik alle musene i den anden gruppe (ip.) 0,5 ml saltopløsning af pentagastrin^j.-D-GL (hver 300 yg) . Musene i den første gruppe optrådte som kontrol og fik 0,5 ml saltopløsning 10 uden pentagastrin^-D-GL.

3 Dage inden den sekundære immunisering og 3 dage inden den tertiære immunisering fik alle musene i den tredje gruppe 0,5 ml saltopløsning af pentagastrin^-D-GL (hver 300 yg) (ip.).

15 Blod blev udtaget fra det retroorbitale plexus på hvert dyr til fremstilling af serummet.

B. Assay af antistoftiter:

Udførtes ved radioimmunoassay. 100 yl 0,01 M phosphatpufferopløsning ( pH = 7,2, der indeholdt 0,15 M 20 NaCl, herefter benævnt PBS) indeholdende 10 yg/ml af et antigen (såsom CCK-8-P-BSA eller pentagastrin-BSA) blev afmålt i hver udboring på en polyvinylfremstillet rund-bundet mikroplade til fastfaseradioimmunoassay,og antigenet blev bundet til polyvinylpladens overflade ved in-25 kubering ved stuetemperatur i 2 timer. Antigenopløsningen i udboringen bortkastedes, og udboringen vaskedes 4 gange med vandværksvand. Efter at det overskydende vand var kastet af, sattes der 200 yl 1%'s BSA saltopløsning til hver udboring og henstilledes natten over ved 4°C, 30 således at polyvinylpladens proteinkombinerende evner var fuldstændig udtømt. Herefter fjernedes opløsningen fra udboringerne, og pladen rensedes 4 gange med vandværksvand. Pladen anvendtes til radioimmunoassay efter afkastning af det overskydende vand.

35 I hver udboring blev der anbragt 0,1 ml antiserum fortyndet med 1% BSA-PBS, og det henstilledes natten over ved 4°C, vaskedes godt 3 gange med vandværksvand, vaskedes 6 gange med 2 M NaCL-PBS og vaskedes med vand-

DK 158644 B

39 værksvand.

Efter afkastning af vandet udmåltes der i hver af udboringerne 0,1 ml (50.000 dpm/20 ng som specifikt antistofprotein) af en fortyndet opløsning af kanin anti 5 mus IgGFab antistof, som var blevet renset specifikt under anvendelse af et immunoadsorbent, mærket med 0g fortyndet med 1% BSA-PBS,og henstilledes natten over ved 4°C. Såfremt der findes noget antistof, der er i stand til at bindes til et antigen på polyvinyloverfladen, vil 10 antistoffet blive koblet med antigenet. Nærværet eller fraværet af et sådant antistof kan bestemmes ved koblingsgraden af kanin antimus igGFab-antistof mærket med 125 I. Hver isotopløsning i udboringen fjernedes under anvendelse af en pipette. Efter grundig vask med vand 15 blev den fleksible plade anbragt i en stiv plastplade, og toppen af den fleksible plade blev afskåret med en varm tråd, og derefter taltes radioaktiviteten i hver udboring.

C. Resultater: 20 Ved hvert tidspunkt for indsamling af serum as- saybestemtes antistoftiteren af det samlede serum fra musene i hver gruppe. Prøver indsamlet 11 uger efter den primære immunisering indeholdt maksimale niveauer af antistof. Derfor underkastedes antistoffer i antiseraene, 25 der indsamledes 11 uger efter den primære immunisering, for yderligere detaljeret analyse.

Ved denne måling anvendtes det samlede antiserum fra gruppe 1 indsamlet 7 uger efter den primære immunisering som standardantiserum. Mængden af antistof i un-30 dersøgelsesprøven opnået fra individuelle mus i den ellevete uge blev udtrykt som forholdet til den mængde antistof, der fandtes i antiserumstandarden, og som defineredes som én enhed. Serumstandardens titer var som følger. Ved assaybestemmelse med den følgende væskefase-35 radioimmunoassaymetode under anvendelse af C.CK-8 var dette serum (med 600 x fortyndihg) i stand til at binde 0,0015 pmol cholecystokinin (CCK-33).

I de antistoffer, der opnåedes fra musene i den

DK 158644B

40 første gruppe, og som ikke fik pentagastrin15-D-GL [vist som "o" i figuren], var mængden af antistof, der omsattes med CCK-8-P,og antistof, der omsattes med pen-tagastrin, næsten lige store. Det fandtes, at antistof-5 fer opnået fra de mus, der havde fået pentagastrin^-D-GL [dvs. den anden og tredje gruppe mus angivet med henholdsvis "Δ" og "®" i figuren], havde en meget lav titer af antistof, der var reaktivt med pentagastrin. Især havde antistoffer opnået fra musene i den tredje gruppe, 10 og som havde fået pentagastrin^-D-GL efter den primære immunisering, dvs. 3 dage inden de sekundære og tertiære immuniseringer, en ekstremt lav titer af antistof, der var reaktiv med pentagastrin.

Af disse resultater fremgår det, at ved anvendel-15 se af opfindelsen er der opnået et antistof med en specificitet over for en specifik aminosyresekvens i CCK-8,

- SO,H

dvs. i 3

Asp-Tyr-Met

Eksempel 7 20 Krydsreaktiviteterne af de ovenfor opnåede anti stoffer bestemtes med et væskefaseradioimmunoassaysystem, der tillod sameksistensen af CCK-8-P og pentaga- 125 strin. CCK-8-P mærkedes med I under anvendelse af

Bolton-Hunters reagens [H. Sankaran et al, J. Biol.

25 Chem., bind 254, 9349-9351 (1979)] og benævnes herefter 125 I-BH-CCK-8-P. Til små reagensglas indeholdende forskellige mængder ikke-mærket CCK-8-P sattes 50 μΐ 0,02 M phosphatpufferopløsning (pH = 8,0? indeholdende 1% gelatine) til etablering af en CCK-8-P-standardkurve. Se-30 parat blev der til et lille reagensglas sat 50 μΐ pufferopløsning indeholdende forskellige mængder pentagastrin til fremstilling af en pentagastrinstandardkurve.

I hvert tilfælde sattes der antiserum (50 \il) fortyndet med museserum til reagensglassene, hvortil der 35 sattes den samme phosphatpufferopløsning (50 μϋ) inde- 125 holdende I-BH-CCK-8 (ca. 5000 cpm), og opløsningen blandedes godt under anvendelse af en vortex-blander ef-

DK 158644 B

41 terfulgt af inkubation ved 4°C i 24 timer. Herefter sattes der 50 μ£ kaninantimus IgGFab-antistof fortyndet til 1:2 med den samme phosphatpuffer til reagensglassene, blandedes og inkuberedes ved 4°C i 24 timer. Herefter 5 centrifugeredes reagensglassene (3000 omdrejninger pr. minut) i 25 minutter. Den ovenstående væske .sugedes op, og radioaktiviteten af det udfældede stof blev talt i en tæller.

I stedet for standardopløsningerne af CCK-8-P og 10 pentagastrin anvendtes den samme phosphatpuffer til at 12 5 bestemme radioaktiviteten af total I-BH-CCK-8-P (tælling B , udtrykt som 100), og bindingsforholdene (B/Bn%) υ 125 υ af antistoffet med I-BH-CCK-8-P i nærværelse af CCK- 8-P eller pentagastrin ved forskellige koncentrationer 15 beregnedes.

De molære mængder af forskellige peptider, der kræves til 50%'s hæmning af binding af antistoffet med 125 *· 3I-BH-CCK-8-P er som følger.

I den første gruppe var CCK-8 1,1 pmol., og penta-20 gastrin var 20,1 pmol. Krydsreaktiviteten beregnet efter Abraham's metode var således 5,5% (1,1/20,1 x 100).

I den anden gruppe, hvis mus havde fået pentaga-strin^,--D-GL inden den primære immunisering, var krydsreaktiviteten 2,7% (4 pmol/150 pmol x 100).

25 I den tredje gruppe, hvis mus havde fået pentaga- strin-^^-D-GL efter den primære immunisering, dvs. 3 dage inden de sekundære og tertiære immuniseringer, fandtes ingen krydsreaktivitet med gastrin. Dvs., der krævedes 1,7 pmol CCK-8-P til 50%'s hæmning, når det nævnte an-30 tistof anvendtes, men der fandtes ingen hæmning ved 10.000 pmol pentagastrin. Dette betyder, at pentagastrin faktisk ikke er i stand til at reagere med antistoffet, der produceres af musene i den tredje gruppe.

Af disse resultater fremgår det, at CCK-8-P kan 35 assaybestemmes specifikt uden signifikant virkning af sameksisterende pentagastrin under anvendelse af antistofferne fra musene i den tredje gruppe, der havde fået pentagastrin15-D-GL.

DK 158644 B

42

Eksempel 8

En procedure, der svarede til den, der er beskrevet i eksempel 6, blev gentaget bortset fra erstatning af musene med kaniner.

5 Under anvendelse af Freund's fuldstændige eller ufuldstændige adjuvans indeholdende 100 ug CCK-8-P-KLH og 10 ml saltopløsning indeholdende 10 mg pentagastrin^^” D-GL var de opnåede resultater i det væsentlige ensartede med de resultater, der opnåedes under anvendelse af 10 mus.

Eksempel 9

Den samme procedure fra eksempel 6 blev gentaget bortset fra, at pentagastrin^-D-GL erstattedes med pen-tagastrin^-D-GL med en molekylvægt på 115.000. De op-15 nåede resultater var i det væsentlige de samme som de resultater, der opnåedes i eksempel 6.

4. Kort beskrivelse af tegningen: I figuren angiver abscissen mængden af antistof omsat med pentagastrin, og ordinaten angiver mængden af 20 antistof omsat med CCK-8-P. Angivelsen "o" viser antistof fra de mus (den første gruppe), der ikke fik penta-gastrin^-D-GL. Angivelsen "A" viser mængden af antistof opnået fra de mus (den anden gruppe), der fik pentaga-strin15~D-GL inden den primære immunisering. Angivelsen 25 "·" viser antistof opnået fra de mus (den tredje gruppe), der fik pentagastrin^-D-GL efter den primære immunisering.

Hver værdi udtrykkes bekvemt som forholdet mellem hver antistofmængde og den, der er til stede i det samle-30 de serum indsamlet fra mus i den første gruppe 7 uger efter den primære immunisering.

DK 158644B

43

Eksempel 1 O

Fremstilling af stammer, der producerer specifikke anti-CCK-8-P-antistoffer.

A) Fremgangsmåde 8

Miltceller (hver gang 2 x 10 ) fra mus fra den 5 første (kontrol-)gruppe og den tredje gruppe (behandlet med pentagastrin-D-GL), som var immuniseret ved den i eksempel 6 (A) beskrevne fremgangsmåde, anvendtes hver gang som udgangsstoffer. I hvert enkelt tilfælde blev cellerne oplukket med P3-X63-Ag8-U1(P3U1)-tumorceller 10 (2 x 107) i polyethylenglycol 4000.

Cellemembranerne fjernedes, og der fortyndedes med en PEG-opløsning (1 ml) , der dråbevis tilsattes en blanding af 9 g PEG 4000 og 20 ml HANKS til opnåelse af en cellesuspension, som derpå henstilledes ved stue-15 temperatur i 8 minutter. Derefter sattes der langsomt MEM (15 ml) til cellesuspensionen inden for 5 minutter og derpå yderligere MEM til en totalmængde på 50 ml.

Cellerne centrifugeredes fra suspensionen og suspenderedes derefter igen i en 10%'s FCS-RPMI-opløsning og for-20 deltes i en dyrkningsbakke (1 ml/brønd) til dyrkning ved 37°C natten over under anvendelse af en befugtet C02~inkubator, som indeholdt 7% C02 i luft med en relativ fugtighed på 85-95%. Den næste dag sattes der HAT-medium (1 ml) til hver brønd. Hver morgen de næste to 25 dage blev HAT-medium (1 ml) opsuget fra brønden og erstattet med frisk HAT-medium (1 ml). Den samme udskiftning udførtes i de næste to uger med tre dages mellemrum. Derefter blev.dyrkningsblandingen udtaget og afprøvet til bestemmelse af antistofsekretionen, idet der 30 anvendtes fastfaseradioimmunoassay som beskrevet i eksempel 6 (B). Til stammedannelse underkastedes de positive dyrkningsmedier grænsefortynding under anvendelse af 10%'s FCS-RMPI, og dyrkningsblandingerne, som indeholdt stammer, afprøvedes efter den i eksempel 6 (B) 35 beskrevne fastfaseradioimmunoassay til bestemmelse af specificiteten af de af de således opnåede stammer

DK 158644 B

44 producerede antistoffer.

B) Resultater

Ved anvendelse af miltceller fra mus fra den 5 første gruppe opnåede man 18 stammer, med hvilke der kunne produceres anti-CCK-8-P-antistoffer. Alle på denne måde opnåede antistoffer reagerede såvel med CCK-8-P som med pentagastrin. Det blev derfor fastslået, at der for de på denne måde opnåede antistoffers vedkommen-10 de var tale om monoklonale antistoffer, der var specifikke over for pentagastrindelen af CCK-8-P. På den anden side opnåedes der under anvendelse af miltceller fra den tredje gruppe 15 stammer, der kunne producere anti-CCK-8-P-antistoffer. Blandt disse 15 stammer kunne 15 12 stammer producere anti-CCK-8-P-antistoffer, der ikke reagerede med pentagastrin og andre beslægtede peptider og reagerede specifikt over for CCK-8-P, medens de af de resterende 3 stammer producerede antistoffer var krydsreaktive med pentagastrin. Ved anvendelse af milt-20 celler fra mus behandlet ifølge opfindelsen med penta-gastrin-D-GL er det derfor muligt at opnå et større antal stammer, der producerer de ønskede specifikke anti-CCK-8-P-antistoffer, end ved anvendelse af på sædvanlig måde behandlede miltceller. De på denne måde opnåede 25 specifikke anti-CCK-8-P-antistoffer viste ingen krydsreaktivitet med pentagastrin.

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et antistof eller antiserum med høj specificitet over for et første antigen, der har en ønsket antigen determinant ved ringe krydsreaktivitet med mindst ét andet antigen, som indeholder 5 mindst én antigen determinant, der er strukturelt beslægtet med den ønskede antigene determinant på det første antigen, ved immunisering af et pattedyr eller dyrkning af til antistofproduktion egnede pattedyrsceller fra dette pattedyr efter dets immunisering, kende- 10. e g n e t ved, at man indgiver pattedyret en copolymer af D-glutaminsyre og D-lysin, som er koblet med det andet antigen, og efter inducering af en tydelig immunologisk tolerance immuniserer pattedyret med det første antigen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at copolymeren har en molekylvægt på fra ca. 27000 til ca. 120000.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at molforholdet mellem D-glutamin- 20 syre og D-lysin i copolymeren andrager fra ca. 70:30 til ca. 30:70.

4. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det andet antigen er et steroid, catecholamin, peptid, 1-propranolol eller 25 1- eller d-cyclazocin eller, når det er hensigtsmæssigt, en underenhed eller et fragment af disse stoffer.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at steroidet er valgt blandt testosteron, 5a-dihydrotestosteron, androsteron, etiocholanolon, 30 progesteron, 17a-hydroxy-progesteron, pregnenolon, de-hydroepiandrosteron, estradiol, estron, estriol, aldo-steron, deoxycorticosteron, cortisol, cortison, cortico-steron, 11-deoxycortisol, cholsyre, deoxycholsyre, litho-cholsyre samt konjugerede forbindelser deraf.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendeteg net ved, at catecholaminen er valgt blandt dopamin, norepinephrin og epinephrin samt derivater deraf. DK 158644 B

7. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at peptidet er valgt blandt gastrin, chole-cystokinin-pancreozymin, insulin, proinsulin, glucagon, follikelstimulerende hormon (FSH), luteiniseringshormon 5 (LH), humant choriongonadotrophin (HCG), somatostatin, thyroidstimulerende hormon (TSH) eller en underenhed og dermed beslægtede peptider.

8. Anvendelse af fremgangsmåden ifølge et vilkårligt af kravene 1-7 til opnåelse af pattedyrsceller, 10 der er i stand til at producere et antistof ifølge krav 1.

9. Anvendelse af det ifølge et vilkårligt af kravene 1-7 eller ved hjælp af pattedyrsceller ifølge krav 8 fremstillede antistof eller antiserum til immu- 15 noassay.