JP2007161712A - 免疫アッセイに有用な６−モノアセチルモルヒネ誘導体 - Google Patents

免疫アッセイに有用な６−モノアセチルモルヒネ誘導体 Download PDF

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Abstract

【課題】６−ＭＡＭおよび６−ＭＡＣを認識する抗体の開発ならびに６−ＭＡＭおよび６−ＭＡＣの検出のための免疫アッセイ法において有用な結合体の産生において有用な化学アナログを提供すること。
【解決手段】以下の構造を有する化合物であって、
【化１】

ここで、Ｒは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子を含む飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｌは、０〜２の置換または非置換芳香環を含むリンカー基であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、活性化エステルである、化合物。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、薬物モニタリングの分野、特に、免疫アッセイによって生物学的サンプル中の薬物の濫用を検出する分野に関する。より詳細には、本発明は、６−モノアセチルモルヒネ（６−ＭＡＭ）および６−モノアセチルコデイン（６−ＭＡＣ）を認識する抗体の開発ならびに６−ＭＡＭおよび６−ＭＡＣの検出のための免疫アッセイ法に有用な結合体の産生において有用なモルヒネの化学アナログに関する。
（発明の背景）
ヘロイン（ジアセチルモルヒネ）は、19世紀後半の間に鎮咳剤として開発されたオピオイドである。ヘロイン濫用は、すぐに問題となり、一世紀より長い後の現在も続いている。摂取の後、ヘロインは、すぐに６−モノアセチルモルヒネ（６−ＭＡＭ）に、次いでモルヒネに代謝され、次いで広範な代謝を受ける。
アセチルコデインは、街頭ヘロインには存在するが薬学的ジアセチルモルヒネには存在しない合成副産物であり、アヘン剤依存薬物使用者に対するヘロイン援助治療において使用される。アセチルコデイン（ＡＣ）は、違法なヘロイン使用の検出のための尿の生物マーカーとして調査された。アセチルコデインの検出は、ヘロイン維持プログラムに登録された常習者が、彼らの管理されたジアセチルモルヒネ用量を違法なヘロインで補われるかどうかを決定するのに重要な役割を果たし得た。
現在、先行技術によって未解決な問題は、合法な医薬処方、例えば、咳止めシロップ、または食物、例えば、ケシの実でさえに由来し得るモルヒネまたはコデインのような他のアヘン剤からの干渉なしに、ヘロイン濫用のマーカーとしての６−ＭＡＭまたは６−ＭＡＣの検出を可能にする抗体の入手不可能性である。本発明は、６−ＭＡＭおよび６−ＭＡＣを認識する抗体の開発ならびに６−ＭＡＭおよび６−ＭＡＣの検出のための免疫アッセイ法において有用な結合体の産生において有用な化学アナログを提供する。
すなわち、本発明の要旨は、以下の通りである。
［１］以下の構造を有する化合物であって、

ここで、Ｒは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子を含む飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｌは、０〜２の置換または非置換芳香環を含むリンカー基であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、活性化エステルである、化合物。
［２］以下の構造を有する化合物であって、

ここで、Ｒは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子の飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｌは、０〜２の置換または非置換芳香環からなるリンカー基であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、ＮＨ−Ｚであり、ここでＺは、担体または標識である、化合物。
［３］担体が、カサガイヘモシアニン、ウシチログロブリン、ウシ血清アルブミンおよびアミノデキストランからなる群から選択される、前記［２］記載の化合物。
［４］以下の構造を有する化合物であって、

ここで、Ｑが担体または標識である、化合物。
［５］担体が、カサガイヘモシアニン、ウシチログロブリン、ウシ血清アルブミンおよびアミノデキストランからなる群から選択される、前記［４］記載の化合物。
［６］以下の構造を有する化合物であって、

ここで、Ｒは、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、Ｌは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子を含む飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、活性化エステルである、化合物。
［７］以下の構造を有する化合物であって、

ここで、Ｒは、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、Ｌは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子を含む飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、ＮＨ−Ｚであり、ここで、Ｚは、担体または標識である、化合物。
［８］担体が、カサガイヘモシアニン、ウシチログロブリン、ウシ血清アルブミンおよびアミノデキストランからなる群から選択される、前記［７］記載の化合物。
本発明に従うと、６−ＭＡＭおよび６−ＭＡＣを認識する抗体の開発ならびに６−ＭＡＭおよび６−ＭＡＣの検出のための免疫アッセイ法において有用な結合体の産生において有用な化学アナログが提供され得る。
（発明の要旨）
本発明が先行技術に対する特定の明らかでない利点および進歩を提供することは上記の背景に反する。特に、発明者は、免疫アッセイに有用な６−モノアセチルモルヒネ誘導体の改良の必要を認識している。
本発明は、特定の利点または機能性に限定されないが、本発明が、６−モノアセチルモルヒネおよび６−モノアセチルコデインを認識する抗体の産生における使用のための免疫原を提供することは注目される。この免疫原は、６−モノアセチルモルヒネ分子のアナログのＣ−３位で誘導される。Ｃ−環において還元された二重結合を有する免疫原構造がまた、記載される。
本発明の１つの態様に従って、以下の構造を有する化合物が提供され、

ここで、Ｒは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子の飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｌは、０〜２の置換または非置換芳香環からなるリンカー基であり、Ｙは、活性化エステルまたはＮＨ−Ｚであり、ここでＺは、担体または標識であり、Ｘは、ＮＨまたはＯである。
本発明の別の態様に従って、以下の構造を有する化合物が提供され、

ここで、Ｒは、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、Ｌは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子の飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｙは、活性化エステルまたはＮＨ−Ｚであり、ここでＺは、担体または標識であり、Ｘは、ＮＨまたはＯである。
本発明の別の態様に従って、以下の構造を有する化合物が提供され、

ここで、Ｑは、担体または標識である。
本発明の別の態様に従って、６−モノアセチルモルヒネに対する特異性を有し、以下の構造を有する化合物に応答して産生される抗体が提供され、

ここで、Ｒは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子の飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｌは、０〜２の置換または非置換の芳香環からなるリンカー基であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、ＮＨ−Ｚであり、ここでＺは、担体である。
本発明の別の態様に従って、６−モノアセチルコデインに対する特異性を有し、以下の構造を有する化合物に応答して産生され得る抗体が提供され、

ここで、Ｑは、担体である。
本発明の別の態様に従って、６−モノアセチルモルヒネおよび６−モノアセチルコデインに対する特異性を有し、以下の構造を有する化合物に応答して産生され得る抗体が提供され、

ここで、Ｒは、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、Ｌは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子の飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、ＮＨ−Ｚであり、ここで、Ｚは、担体である。
本発明のこれらのおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲と合わせて以下の発明の詳細な説明からより完全に理解される。特許請求の範囲の範囲は、その中の詳説によって規定され、本明細書中に示される特徴および利点の特定の議論によって規定されないことが注目される。
（発明の詳細な説明）
「好ましくは」、「一般に」、および「典型的には」のような用語は、特許請求される本発明の範囲を限定するためにも、特定の特徴が、特許請求される本発明の構造または機能に重大で、本質的で、または重要でさえあることを意味するためにも、本明細書中で使用されない。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の態様において使用され得るかまたは使用され得ない代替的な特徴またはさらなる特徴を強調するためだけに意図される。
本発明の記載および規定の目的のために、用語「実質的には」は、本明細書中で、任意の定量的比較、定量値、定量的測定または他の定量的表示にあるとされ得る不確実性の固有の度合いを示すために使用される。用語「実質的には」はまた、本明細書中で、定量的表示が、発行物において対象物の基本的機能の変化を生じることなく記述した参照から変化し得る程度を示すために使用される。
本明細書中で使用される場合、用語「分析物」は、その存在または量が決定されるべき物質または物質の群をいう。本明細書中で使用される場合、用語分析物は、用語「抗原」を包含し、抗原は、抗体に結合し得る任意の化合物をいう。
用語「抗体」は、分析物の特定の結合パートナーを意味し、分析物に対して特定の結合親和性を有し、他の関連しない物質を本質的に排斥する任意の物質または物質の群である。該用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗体フラグメントを含む。
用語「ハプテン」は、部分的な抗原または不完全な抗原をいう。ハプテンは、タンパク質を含まない物質であり、ほとんどは抗体形成を刺激し得ないが、抗体と反応する低分子量物質である。後者は、高分子量担体にハプテンを結合し、この結合産物をヒトまたは動物に注射することによって形成される。ハプテンの例は、６−モノアセチルモルヒネおよび６−モノアセチルコデインを含む。
用語「活性化ハプテン」は、例えば、ハプテンを担体、免疫原、標識、追跡子、または他の部分に結合するために使用され得る、反応部分を保持するリンカー基の付加によって、利用可能な反応部位を提供されるハプテンをいう。
用語「リンカー」は、ハプテンを担体、免疫原、標識、追跡子または別のリンカーに結合する化学的部分をいう。リンカーは、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和の炭素鎖であり得る。これらはまた、鎖内または鎖の末端に１つ以上のへテロ原子を含み得る。ヘテロ原子とは、酸素、窒素および硫黄からなる群から選択される炭素以外の原子を意味する。リンカーの使用は、特定のハプテンおよび担体対に依存して、有利であっても必要とされてもよいし、そうでなくてもよい。
該用語が本明細書中で使用される場合、「担体」は、ハプテンと結合し得、それによってハプテンが免疫応答を刺激し得る免疫原性物質、一般にタンパク質、または免疫アッセイに有用な結合体を形成し得る物質、例えば、アミノデキストランおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。担体物質は、外来物として認識され、それによって宿主から免疫学的応答を導き出すタンパク質、糖タンパク質、複合多糖類および核酸を含む。担体として有用なポリ（アミノ酸）は、カサガイヘモシアニン、ウシチログロブリンおよびウシ血清アルブミンを含む。
本明細書中で使用される場合、用語「免疫原」および「免疫原性」は、生物体において免疫応答を生じるかまたは起こし得る物質をいう。
用語「誘導体」は、親化合物から１つ以上の化学反応によって作製された化合物または分子をいう。
用語「結合体」は、２つの部分が一緒に結合することから形成される任意の物質をいう。本発明に従う代表的な結合体は、低分子とタンパク質のような巨大分子とが一緒に結合することによって形成された結合体を含む。用語結合体は、用語免疫原を包含する。
本明細書中で使用される場合、検出体分子、標識または追跡子は、担体物質または分子に結合される場合、分析物を検出するために使用され得る同定タグである。標識は、リンカー部分または架橋部分によって直接的または間接的に担体物質に結合され得る。標識の例としては、β−ガラクトシダーゼおよびペルオキシダーゼのような酵素、ローダミンおよびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のような蛍光化合物、ジオキセタンおよびルシフェリンのような発光化合物ならびに１２５Ｉのような放射性同位元素が挙げられる。
本発明の意味内での用語活性エステルは、求核試薬保持物質の他の反応性基との干渉的副反応が有用に生じ得ないような条件下で、求核試薬、例えば、限定されないが、ペプチドの遊離アミノ基、ポリアミノ酸、多糖類または標識と反応し得る活性化エステル基を含む。
本発明の目的は、以下の構造を有する化合物を提供することであり、

ここで、Ｒは、０〜１０の炭素またはヘテロ原子の飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｌは、０〜２の置換または非置換の芳香環からなるリンカー基であり、Ｙは、活性化エステルまたはＮＨ−Ｚであり、ここで、Ｚは、担体または標識であり、Ｘは、ＮＨまたはＯである。
本発明の別の目的は、以下の構造を有する化合物を提供することであり、

ここで、Ｒは、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、Ｌは、０〜１０の炭素またはヘテロ原子の飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｙは、活性化エステルまたはＮＨ−Ｚであり、ここでＺは、担体または標識であり、Ｘは、ＮＨまたはＯである。
本発明のなお別の目的は、以下の構造を有する化合物を提供することであり、

ここで、Ｑは、担体または標識である。
本発明のさらなる目的は、６−モノアセチルモルヒネに対して特異性を有し、以下の構造を有する化合物に応答して産生される抗体を提供することであり、

ここで、Ｒは、０〜１０の炭素またはヘテロ原子の飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｌは、０〜２の置換または非置換の芳香環からなるリンカー基であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、ＮＨ−Ｚであり、ここでＺは担体である。
本発明のさらなる目的は、６−モノアセチルコデインに対して特異性を有し、以下の構造を有する化合物に応答して産生され得る抗体を提供することであり、

ここで、Ｑは、担体である。
本発明のなおさらなる目的は、６−モノアセチルモルヒネおよび６−モノアセチルコデインに対して特異性を有し、以下の構造を有する化合物に応答して産生され得る抗体を提供することであり、

ここで、Ｒは、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、Ｌは、０〜１０の炭素またはヘテロ原子の飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、ＮＨ−Ｚであり、ここでＺは、担体である。
モノアセチルモルヒネおよびモノアセチルコデインの免疫原および結合体のスクリーニングのための合成スキームは、図１〜図７に示される。
コデインは、水素ガスを使用して、好ましくは、圧力下で触媒として木炭上のパラジウムを使用して、ジヒドロコデインに還元される（図１を参照のこと）。水素化反応は、当該分野で周知であり、メタノール、エタノールまたは酢酸エチルのような溶媒中で、レーニーＮｉ、木炭上の水酸化パラジウム、アダムス触媒などのような多くの異なる触媒を使用して実施され得る。ジヒドロコデインの第二級水酸基は、酸化されカルボニル基に戻される。多くの文献参照によって、還流条件下で第二級水酸基のカルボニル官能基、例えば、シュウ酸クロリド／ＤＭＳＯ、クロロクロム酸ピリジニウムおよび酸化クロム／ピリジン、最も好ましくはベンゾフェノンおよびｔ−ブトキシドカリウムへの転化は公知であり、化合物３を与える。後者の中間体は、次いで、酢酸アンモニウムおよび還元剤、水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下で、好ましくはｐＨ６〜７で、還元的アミノ化を受け、アミノジヒドロコデイン（４）を生じ、次いで、２つのジアステレオマーの混合物（化合物４）を提供する。化合物４のアミノ基のアセチル化反応は、室温から還流条件の範囲の温度で、酢酸無水物およびピリジンを使用して実施され得る。この反応は、４−ジメチルアミノピリジンの存在下で、アセチル化剤としての酢酸無水物およびトリエチルアミンを使用する塩基を使用して実施される。アセチル化された生成物は、ジアステレオマーの混合物として得られ、カラムクロマトグラフィーまたは調製的ＨＰＬＣのいずれかによって分離され得る。ジアステレオマーを分離するためのクロマトグラフィー技術は、当該分野で周知である。所望される異性体（化合物５ｂ）は、ジメチル化され、フェノール性化合物６を与える（図２）。例えば、０℃〜室温にわたる温度で、ヨウ化トリメチルシリル、ナトリウムチオエトキシド、カリウムチオフェノキシド、ＤＭＳＯ中のシアン化ナトリウム、エタンチオール中の三臭化アルミニウム、塩化アルミニウム/ジメチルスルフィドおよび臭化水素酸三臭化ホウ素(Greene, T. and Wuts, P.,「Protective groups in organic synthesis」, 2nd edition, Wiley Intersciences, 1991)のような種々の脱メチル化反応が当該分野で公知である。好ましくは、化合物５ｂの脱メチル化は、室温でジクロロメタン中の三臭化ホウ素の存在下で、なされる。次いで、化合物５ｂのフェノ−ル性水酸基は、エーテル結合によって、保護化カルボキシ末端化リンカーで伸張される（図２）。フェノ−ル性水酸基はまた、エステル結合またはウレタン結合によってカルボキシル束縛化リンカーに転換され得る。
化合物７のｔ−ブチルエステル基は、カルボン酸官能基に脱保護され、その後、Ｎ−ヒドロキシスクシミドエステル（化合物９）に転化される。カルボキシル基の活性化は、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−Ｏ−スクシンイミジル−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸のようなカルボジイミドを使用する活性化工程によって達成され得る。タンパク質への結合体化は、免疫原（化合物１０）およびスクリーニング結合体を提供する。
フェノール性基の伸長はまた、保護アミノ基を有するアルキル化試薬またはアシル化試薬を使用してなされ得る（図３）。メチルアミンまたはヒドラジン下で切断され得るアミノ保護基の例は、フタルイミド基である。得られたアミノ束縛化生成物のアミノ基は、当業者に周知である広く種々のカルボキシル活性化リンカー伸長または標識を用いるアシル化反応に敏感に反応する。
リンカー伸長は、しばしば末端活性化基を生じるために実施される。テレフタル酸または４，４−ビフェニルジカルボン酸（ｂｉｐｅｎｙｌ ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（図３）のような二カルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなホモ二官能性リンカーを使用するリンカー伸長は、前述のアミノ基（化合物１４）との反応による単一の工程において活性化エステル（化合物１５）を生成するために使用され得る。リンカーの実体に対する優れた論文として、読者は、Hermanson, Greg T., “Bioconjugate Techniques”, Academic Press Inc., 1996を参照する。
化合物１５の６−ヒドロキシル基が、アセチル化される。アセチル化反応は、好ましくは、ピリジンおよび酢酸無水物を使用してなされ得る。得られた活性エステルは、スクリーニング結合体としての使用のためにタンパク質に結合体化される。
窒素の外に束縛化された免疫原は、開始物質としてジヒドロノルモルヒネ（化合物１８）を使用し得る。遊離フェノール性ヒドロキシル基の存在下でのアミノ基の保護は、当該分野で公知である。これらの反応は、保護基および反応条件の適切な選択によってなされ得る。穏やかな塩基性条件下で除去されるＮ保護基の例は、フルオロメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）である。酸で容易に除去されるＮ保護基の例は、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）である。中性水素化条件下で除去されるＮ保護基の例は、カルボベンジルオキシ基（ＣＢｚ基）である。この態様において、ジヒドロノルモルヒネの環状第二級アミンの好ましい保護は、この順序におけるカルボベンジルオキシ基の使用である（図４）。ＣＢｚ保護された誘導体（化合物１９）のフェノール基は、ベンジル基として保護され得る。次いで、第二級ヒドロキシル基は、アセチル基に転化される（化合物２１）。ヒドロキシル基の好ましいアセチル化反応の１つは、還流条件下でのピリジンおよび酢酸無水物の使用である。Ｎ−ＣＢｚおよびベンジル基の脱保護は、水素および木炭触媒上パラジウムを使用して一つの工程において達成され、化合物２２を与え得る。遊離第二級アミンは、ｐＨ６〜７でのコハク酸セミアルデヒドおよびシアノホウ素化水素ナトリウムを用いるスクシニル化反応または還元的アミノ化反応によってカルボキシル基に伸長される。次いで、化合物２２は、活性エステル（化合物２３）に転化される。カルボキシル基の活性化は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ＥＤＣ、またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−Ｏ−スクシンイミジル−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸のようなカルボジイミドを使用する活性化工程によって達成される。タンパク質への結合体化は、免疫原およびスクリーニング結合体を提供する。
異なる態様において、Ｎ−束縛化６−アセトアミド６−ＭＡＭタンパク質結合体がまた、作製され得る（図５および図６）。化合物６のフェノール性水酸基は、ベンジル基として保護され得る。環状第二級アミンのＮ−脱メチル化は、文献で周知であり、１−クロロエチルクロロギ酸その後のメタノールでの処理、臭化シアンその後のＺｎ塵での処理、またはクロロギ酸ビニルその後の臭化水素酸での処理のような種々の反応条件下で達成され得る。化合物２６のＮ−脱メチル化のために使用される好ましい反応は、１−クロロエチルクロロギ酸その後のメタノールでの処理であり、化合物２８を与える（図５）。ベンジル基の脱保護は、木炭上１０％水酸化パラジウムを使用する水素化条件下でなされる。還元アミノ化による窒素位置でのカルボキシ末端基への伸長（図５）その後のカルボキシル基活性化手順は、前述の記載の通りになされ得る。
ノル位置でのカルボキシ末端基への伸長はまた、化合物２８のスクシニル化によって達成され、化合物３３を与え得る（図６）。ベンジル基の脱保護その後のカルボキシル基官能基の活性化は、前述の記載の通りに達成され得る。
図７は、モノアセチルコデイン免疫原の調製を記載する。これは、６−モノアセチルコデインと交差反応性の６−ＭＡＭ抗体の調製のためのブースター抗体として使用され得る。１，２−ジクロロエタン中の１−クロロエチルクロロギ酸を使用する化合物５ｂのＮ−脱メチル化の間、化合物３８は、単一の工程において形成された。中間体Ｎ−（１−クロロエトキシ）カルボニル誘導体（３７）が反応条件下で加水分解を受け、化合物３８を与えることが予想された。
ノル位置でのカルボキシ末端官能基への伸長は、前述に記載されている。活性化の後に、免疫原調製のためのタンパク質への結合体化が続く（化合物４１）。
本発明がより容易に理解され得るために、本発明を例証することが意図されるが、その範囲を限定しない以下の実施例に対する参照がなされる。
（特定の態様）
以下に続く実施例において、太字の番号は、図面の対応する構造をいう。
実施例１．ジヒドロコデイン（２）の調製
４０ｍＬのメタノール中１．２ｇ（４．０ｍｍｏｌ）のコデインに、１００ｍｇの１０％ Ｐｄ−Ｃを添加した。得られた反応混合物を５０ｐｓｉの圧力下で水素化した。溶液を、ＣＥＬＩＴＥ(Celite Corporation)を通して濾過し、濾過物を濃縮し、白色固体として１．１２ｇ（３．７ｍｍｏｌ、９３％）のジヒドロコデインを与えた。ＥＳ（＋）ｍ／ｚ ３０１。
実施例２．ジヒドロコデイノン（３）の調製
５０ｍＬのベンゼン中１．２５ｇ（１１．１ｍｍｏｌ）のｔ−ブトキシドカリウムの混合物に、６．７８ｇ（３７ｍｍｏｌ）のベンゾフェノンおよび１．１２ｇ（３．７ｍｍｏｌ）のジヒドロコデインを添加し、２時間還流させた。反応混合物は黄色に変わった。反応混合物は、室温まで冷却され、５０ｍＬの２Ｎ ＨＣｌを添加した。得られた反応混合物を１０分間攪拌した。有機層を分離し、３×４０ｍＬの２Ｎ ＨＣｌで抽出した。有機層を捨て、水層を３×２０ｍＬのジクロロメタンで再度抽出した。水層を水性水酸化カリウム溶液でｐＨ１２まで塩基性化し、５×６０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過した。濾過物を濃縮し、黄色固体として６９１ｍｇ（２．３ｍｍｏｌ、５５％）の３を与えた。
実施例３．アミノジヒドロコデイン（４）の調製
７０ｍｌのメタノール中３．４６ｇ（１１．５ｍｍｏｌ）の化合物３に８．９２ｇ（１１５ｍｍｏｌ）の酢酸アンモニウムを添加し、それを室温で１５分間攪拌し、その時に澄んだ溶液を得た。反応混合物に、７２７ｍｇ（１１．５ｍｍｏｌ）のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの溶液を添加し、反応混合物のｐＨを濃ＨＣｌの添加によってｐＨ６〜７に調整した。反応混合物を室温で１８時間攪拌し、減圧下で濃縮し、黄色の油を与えた。この黄色の油に２５０ｍＬの水を添加し、再びｐＨを６Ｎ ＨＣｌで１に調整した。得られた水性反応混合物を、２×２５０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水性部分のｐＨを６Ｎ ＨＣｌで１に再調整し、３×２５０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮し、濃厚な黄色の油として３．２ｇ（１０．６ｍｍｏｌ、９２％）の４を与えた。この生成物を、次の工程で精製なしに使用した。ＨＲ−ＥＳ（＋）；Ｃ１８Ｈ２４Ｎ２Ｏ２に対する計算値、Ｍ＋Ｈ３０１．１９１１；実測値３０１．１９１３。
実施例４．アセトアミドジヒドロコデイン誘導体（５ｂ）の調製
１２５ｍＬのジクロロメタン中３．２ｇ（１０．６ｍｍｏｌ）のアミノジヒドロコデイン４に、８７ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジンおよび９ｍＬのトリエチルアミンを添加した。反応混合物を、０℃まで冷却し、７．１ｍＬ（７４ｍｍｏｌ）の酢酸無水物を添加した。反応混合物を室温まで温め、１８時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、黄色の油を得た。この黄色の油に１２５ｍＬの水を添加し、生成物を、４×１５０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水性溶液を、ｐＨを１０に調整し、溶液をクロロホルムで再抽出した。全ての有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮し、無色の粗油を与えた。ＬＣ−ＭＳ分析は、２つのジアステレオマーの形成を示した。粗生成物の半分を、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水を用いるグラジエント実行を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム）によって精製した。所望の異性体を含む画分を合わせ、濃縮し、凍結乾燥し、オフホワイトの粉として６１４ｍｇの生成物５を与えた。ＨＲ−ＥＳ（＋） Ｃ２０Ｈ２６Ｎ２Ｏ３に対する計算値、Ｍ＋Ｈ３４３．２０１６；実測値３４３．２０２２。
実施例５．アセトアミドジヒドロモルヒネ誘導体（６）の調製
６４４ｍｇ（１．８ｍｍｏｌ）のジヒドロコデイン誘導体（５ｂ）に、１２ｍＬのジクロロメタンを添加した。この溶液を２０ｍＬのジクロロメタン中１１．３ｍＬ（１１．２ｍｍｏｌ）の１Ｍ ＢＢｒ３の室温で磁気的に攪拌した溶液に添加した。反応混合物を室温で１時間攪拌し、６０ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液および３０ｇの氷に注いだ。反応混合物を１時間攪拌し、５×１００ｍＬのジクロロメタン中８０％エタノールで抽出した。有機層を合わせ、乾燥し、濃縮した。残渣を、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水を用いるグラジエント実行を使用して調製的ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。所望の生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、凍結乾燥して、オフホワイト固体として４８０ｍｇ（７８％、１．４６ｍｍｏｌ）の６を与えた。ＬＲ−ＥＳ（＋）Ｍ＋Ｈ ３２９。
実施例６．アセトアミドジヒドロモルヒネ酪酸ｔ−ブチルエステル誘導体（７）の調製
５０ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）のアセトアミドジヒドロモルヒネ誘導体（６）に、６ｍＬの無水アセトン、０．５ｍＬの無水ジメチルホルムアミド、１５０ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ）の炭酸カリウムおよび１４０μＬ（０．７８ｍｍｏｌ）のｔ−ブチルブロモ酪酸を添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で１８時間還流し、室温まで冷却し、濾過した。濾過物を減圧下で濃縮し、６０ｍＬのクロロホルムに再溶解し、２５ｍＬの水を添加した。有機部分を分離し、水性部分を、３×５０ｍＬのクロロホルムで抽出した。全ての有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。残渣をクロロホルム中の１０％メタノ−ルを使用するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、濃厚な無色の油として３５ｍｇ（４８％、０．０７４ｍｍｏｌ）の７を与えた。ＬＲ−ＭＳ−ＥＳ（＋）：Ｍ＋Ｈ ４７１。
実施例７．アセトアミドジヒドロモルヒネ酪酸誘導体（８）の調製
３５ｍｇ（０．０７４ｍｍｏｌ）のアセトアミドジヒドロモルヒネ酪酸誘導体（７）に、３ｍＬのジクロロメタンおよび１ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加した。反応混合物を、室温で３０分間攪拌し濃縮した。残渣に、１０ｍＬのジクロロメタンを添加し、濃縮した。残渣を、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水を用いるグラジエント実行を使用して調製的ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。所望の生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、その後、凍結乾燥し、白色粉末として１９ｍｇ（０．０４５ｍｍｏｌ、６３％）の所望の生成物８を与えた。ＨＲ−ＥＳ（＋）：Ｃ２３Ｈ３０Ｎ２Ｏ５に対する計算値；Ｍ＋Ｈ ４１５．２２２８；実測値４１５．２２２７。
実施例８．アセトアミドジヒドロモルヒネ酪酸ＮＨＳエステル（９）の調製
１７ｍｇ（０．０４１ｍｍｏｌ）のアセトアミドジヒドロモルヒネ酪酸（８）に、新しく蒸留した３ｍＬのＴＨＦを添加し、混合物を０℃まで冷却した。反応混合物に、２１．４μＬ（０．１２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを、その後、３７ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸を添加した。反応混合物を室温まで温め、室温で１８時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、残渣を、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水を用いるグラジエント実行を使用する調製的ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。所望の生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、その後、凍結乾燥し、白色固体として１３ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ、６２％）の９を与えた。ＬＲ−ＭＳ−ＥＳ（＋）：Ｍ＋Ｈ ５１２。
実施例９．６−ＭＡＭ ＫＬＨ結合体（１０）の調製
１．２ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中３７ｍｇのカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）の溶液を、氷浴中冷却した。反応混合物に１．５ｍＬのＤＭＳＯを滴下し、反応温度を室温未満で維持した。次いで、１ｍＬのＤＭＦ中８ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）の９の溶液を、タンパク質溶液に滴下した。混合物を室温まで温め、室温で１８時間攪拌した。得られた結合体を、透析チューブ（１００００ＭＷカットオフ）に配置し、室温で５０ｍＭリン酸カリウム中１Ｌの７０％ ＤＭＳＯ（ｐＨ７．５、少なくとも３時間）に、室温で５０ｍＭリン酸カリウム中１Ｌの５０％ ＤＭＳＯ（少なくとも３時間）に、室温で５０ｍＭリン酸カリウム中１Ｌの３０％ ＤＭＳＯ（少なくとも３時間）に、室温で５０ｍＭリン酸カリウム中１Ｌの１０％ ＤＭＳＯ（少なくとも３時間）に、その後、５０ｍＭリン酸カリウムバッファ（６回、少なくとも６時間、各４℃）に透析した。タンパク質濃度を、ＢｉｏＲａｄクマシーブルータンパク質アッセイ(Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248, 1976)を使用して、２．２ｍｇ／ｍＬであると決定した。利用可能なリジン修飾の程度を、ＴＮＢＳ法(Habeeb AFSA, Anal. Biochem. 14, 328-34, 1988)によって４６％であると決定した。
実施例１０．１，１’−ビフェニル‐４，４’−ジカルボニルクロリド（１１）の調製
アルゴン下２００ｍＬの無水ＴＨＦ（Ｎａおよびベンゾフェノン上に蒸留された）中１０．０ｇ（０．０４１ｍｏｌ）の４，４’−ビフェニルジカルボン酸の混合物を、２５．０ｍＬ（０．２８６ｍｏｌ）のシュウ酸クロリド、その後０．１ｍＬの無水ＤＭＦで処理した。次いで、反応物を、減圧下で黄色の油まで濃縮した。これは、５回無水ＴＨＦではがされ、任意の残余シュウ酸クロリドを運び出し黄色固体として１１．５ｇの所望の生成物１１を得た。これを、精製せずに次の工程において使用した。ＭＳ：ｍ／ｅ ２７８（Ｍ＋）。
実施例１１．１，１’−ビフェニル‐４，４’−ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１２）の調製
アルゴン下５００ｍＬの無水ジクロロメタン中１１．５ｇ（０．０４１ｍｏｌ）の１１の溶液を、２５．０ｇ（０．２１７ｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、その後、２５ｍＬのトリエチルアミンで処理し、室温で一晩攪拌した。得られた沈殿を吸引濾過によって回収し、ジクロロメタンで洗浄し、白色固体として１０．７ｇの生成物を得た。濾過物を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタンで粉砕し、白色固体として３．８４ｇの第二の収穫物を得、１４．５ｇ（８１％）の所望の生成物１２の合わせた収量であった。ＭＳ：ｍ／ｅ ４３７（Ｍ＋）。
実施例１２．３−Ｏ−フタルイミドプロピルモルヒネ（１３）の調製
１．５ｇ（３７．５ｍｍｏｌ）のＮａＨ（鉱油中６０％分散物）を、２×２５ｍＬのヘキサンでリンスし、油を除去した。反応混合物に、１４０ｍＬの無水ＤＭＦ、その後、１０．１ｇ（３５ｍｍｏｌ）のモルヒネを添加した。この混合物を、窒素雰囲気下室温で３０分間攪拌し、１４．５ｇ（５３ｍｍｏｌ）のＮ−（３−ブロモプロピル）フタルイミドを添加した。反応混合物を、室温で１８時間攪拌した。反応を、反応が不完全であることを示す薄層クロマトグラフィー（シリカ、７：２：１：１、ＭｅＯＨ：ＥｔＡｃ：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ、Ｉ２可視化）によってモニターした。反応混合物に０．１５ｇ（３．７５ｍｍｏｌ）のＮａＨ（油中６０％）を添加し、混合物をさらに１．５時間攪拌した。混合物を３５０ｍＬの氷水に注ぎ、２５０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、水層を、２×２５０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、２×１５０ｍＬの水、１５０ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨおよび２×１５０ｍＬの水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。残渣をジエチルエーテルで結晶化し、白色固体として１２．９ｇ（２７．３ｍｍｏｌ、７７％）の所望の生成物１３を与えた。
実施例１３．３−Ｏ−アミノプロピルモルヒネ（１４）の調製
１４ｇ（２９．６ｍｍｏｌ）の３−Ｏ−フタルイミドプロピルモルヒネ（１３）に、１８８ｍＬの２Mエタノール性メチルアミンを添加し、反応混合物を、窒素下室温で３．５時間攪拌した。反応混合物を６５０ｍＬのクロロホルムおよび４２５ｍＬの冷水に注いだ。有機層を分離し、水層を３×９０ｍＬのクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を合わせ、２×１４０ｍLの１N ＨＣlで抽出した。水性抽出物を１４０mＬの２．５N NaOHで塩基性化し、３×３００mＬのクロロホルムで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濃縮した。残渣を、ジエチルエーテルで結晶化し、白色固体として８．９ｇ（２６ｍｍｏｌ、８８％）の１４を与えた。
実施例１４．モルヒネ３−Ｏ−アミノプロピルビフェニル N-ヒドロキシスクシンイミドエステルヒドロクロリド塩（１５）の調製
４００mＬ無水THF中６．４ｇ（１４．６ｍｍｏｌ）のビフェニルジ−N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（１２）の混合物に、４００mＬの無水THF中３．２ｇ（９．３ｍｍｏｌ）の３−Ｏ−アミノプロピルモルヒネ（１４）の溶液を、３０分間にわたって滴下した。反応混合物を室温で２時間攪拌し、濾過した。濾過物を濃縮し、残渣を２５０mＬのジクロロメタンに溶解した。これを、１５０mＬの飽和水性重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、まず酢酸エチルで溶出し、より高いRf不純物を除去し、その後、無水THFで溶出し、遊離塩基として所望の生成物を与えた。所望の生成物（Rf ０．１３）を含む全ての画分を合わせ、エーテル中１２mＬの１M ＨＣlで処理した。次いで、溶液を減圧下で濃縮し、白色固体として３．２ｇ（４９％、４．５ｍｍｏｌ）の１５を与えた。MS:ｍ/ｅ ６６４（M＋H）。
実施例１５．６−モノアセチルモルヒネ−３−Ｏ−アミノプロピルビフェニル N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（１６）の調製
５０ｍｇ（０．０７１ｍｍｏｌ）のモルヒネ３−Ｏ−アミノプロピルビフェニル N-ヒドロキシスクシンイミドエステルヒドロクロリド塩１５に、１mＬの無水DMF、７．１μLの酢酸無水物および６．１μLの無水ピリジンを添加した。反応混合物を１８時間攪拌した。分析的HPLCを、RP-HPLCカラム（C-18）を使用し、０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルおよび水を用いて実行し、反応の進行をモニターした。結果は、開始物質のみの存在を示した。反応混合物に、１４μLの酢酸無水物および１２μLのピリジンを添加した。混合物を、６時間攪拌し、HPLC分析は、反応なしを示した。反応混合物に２０μLの酢酸無水物を添加し、１８時間攪拌した。反応混合物に０．５mＬのピリジンおよび４０μLの酢酸無水物を添加した。反応混合物を室温で１８時間攪拌し、HPLC分析は、生成物の形成を示した。これを減圧下で濃縮し、黄色の油を与え、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水を用いるグラジエント実行を使用するRP-HPLC（C−18カラム）によって精製した。所望の異性体を含む画分を合わせ、濃縮し、その後、凍結乾燥し、白色固体として３２ｍｇ（６４％、０．０４ｍｍｏｌ）の所望の生成物１６を与えた。ＨＲ−ＥＳ（＋）：C40H39N3O9に対する計算値、M＋H ７０６．２７５９；実測値７０６．２７５８。
実施例１６．６−MAM BSA結合体（１７）の調製
５００ｍｇのウシ血清アルブミン（BSA）に、６mＬの５０mＭリン酸カリウムを添加し、溶液を０℃まで冷却した。反応混合物に６ｍLのDMSOを５分間の期間の間滴下した。１mＬの無水DMF中１３ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）の６−MAM NHSエステル誘導体（１６）の溶液を、反応混合物に０℃で滴下した。混合物を室温まで温め、室温で１８時間攪拌した。得られた結合体を、透析チューブ（１００００MWカットオフ）に配置し、室温で５０ｍＭリン酸カリウム中１Ｌの７０％ ＤＭＳＯ（ｐＨ７．５、３時間）に、室温で５０ｍＭリン酸カリウム中１Ｌの５０％ ＤＭＳＯ（少なくとも３時間）に、室温で５０ｍＭリン酸カリウム中１Ｌの３０％ ＤＭＳＯ（少なくとも３時間）に、室温で５０ｍＭリン酸カリウム中１Ｌの１０％ ＤＭＳＯ（少なくとも３時間）に、その後、５０ｍＭリン酸カリウムバッファ（６回、少なくとも６時間、各４℃）に透析した。タンパク質濃度を、ＢｉｏＲａｄクマシーブルータンパク質アッセイを使用して、１５ｍｇ／ｍＬであると決定した。利用可能なリジン修飾の程度を、ＴＮＢＳ法によって４６％であると決定した。
実施例１７．N-CBzノルジヒドロモルヒネ（１９）の調製
２００ｍｇ（０．７３ｍｍｏｌ）のジヒドロノルモルヒネ（１８）に、１２mＬのTHFおよび８mＬの水を添加する。反応混合物に３１０ｍｇ（２．９２ｍｍｏｌ）の炭酸ナトリウム、その後、０．１２ｍL（０．８４ｍｍｏｌ）のベンジルクロロギ酸を添加する。混合物を室温で１８時間攪拌し、減圧下で濃縮する。残渣に１０mＬの水を添加し、pＨを３N HClを使用して、２に調整する。これを、酢酸エチルで抽出し、乾燥し、濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、１９を生じる。
実施例１８．N-CBz―３―O-ベンジルノルジヒドロモルヒネ（２０）の調製
５mＬの無水DMF中１００ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）の化合物１９に、３３μｌ（０．２７ｍｍｏｌ）の臭化ベンジル、５５ｍｇ（０．３９ｍｍｏｌ）の炭酸カリウムを添加し、反応混合物を、６０℃で６時間加熱し、濾過し、濾過物を濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、２０を与えた。
実施例１９．６−アセチルN-CBz―３―O-ベンジルノルジヒドロモルヒネ（２１）の調製
１００ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）の２０に１．５ｍＬのピリジンおよび７４μL（０．７８ｍｍｏｌ）の酢酸無水物を添加する。反応混合物を攪拌し、９０℃で３時間加熱する。得られた反応混合物を室温まで冷却し、濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、２１を与える。
実施例２０．６−アセチルノルジヒドロモルヒネ（２２）の調製
１００ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）の化合物２１に３０ｍｌのエタノールおよび５０ｍｇの２０％ Pd(OH)2/Cを添加する。反応混合物を６０psiで６時間水素化する。反応混合物を、CELITEを通して濾過し、濾過物を濃縮し、化合物２２を与える。
実施例２１．６−アセチルジヒドロノルモルヒネN-酪酸（２３）の調製
１００ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）の６−アセチルジヒドロノルモルヒネ（２２）に、２５mＬの新しく蒸留したTHFを添加する。反応混合物を室温で攪拌する。２６６μｌ（０．３８ｍｍｏｌ）のコハク酸セミアルデヒド（水中１５重量％溶液）、その後２４ｍｇ（０．３８ｍｍｏｌ）のシアノホウ素化水素ナトリウムを添加する。反応混合物のpＨを６〜６．５の間に調整し、反応混合物を室温で６時間攪拌する。反応混合物を減圧下で濃縮し、５０ｍLのジクロロメタン、その後、２５ｍLの水を添加する。有機層を分離し、水層を２×５０ｍLのジクロロメタンで抽出する。合わせた有機層を、乾燥し濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、２３を与える。
実施例２２．６−アセチルジヒドロノルモルヒネN-酪酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（２４）の調製
１００ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）の６−アセチルジヒドロノルモルヒネN-酪酸（２３）に３０ｍLの新しく蒸留したTHFを添加し、混合物を０℃まで冷却する。反応混合物に、０．１０ｍｌ（０．５７ｍｍｏｌ）のN,N-ジイソプロピルエチルアミン、その後、１７１ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ）のO-(N-スクシンイミジル)−N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸を添加する。反応混合物を室温まで温め、室温で１８時間攪拌する。反応混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、２４を与える。
実施例２３．６−アセチルジヒドロノルモルヒネN-酪酸KLH結合体（２５）の調製
この結合体を化合物９から化合物１０への転化について記載される手順に従って、化合物２４から調製される。
実施例２４．６−アセトアミド−３-O-ベンジルジヒドロノルモルヒネ（２６）の調製
５００ｍｇ（１．５２ｍｍｏｌ）の６に、１２ｍLの無水DMF、その後２７０μL（２．２６ｍｍｏｌ）の臭化ベンジルおよび７３４ｍｇ（５．３ｍｍｏｌ）の無水炭酸カリウムを添加する。反応混合物を６０℃で１８時間加熱し、次いで、室温まで冷却し、濾過する。濾過物を濃縮し、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水を用いるグラジエント実行を使用する調製的RP-HPLCによって精製する。所望の生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、その後、凍結乾燥し、２６を与える。
実施例２５．６−アセトアミド−３-O-ベンジルN-[1-クロロエトキシカルボニル]ノルジヒドロモルヒネ（２７）の調製
２５０ｍｇ（０．５９ｍｍｏｌ）の２６に、５ｍLの１,２−ジクロロエタンを添加する。得られた溶液を攪拌し、６３６μL（５．８ｍｍｏｌ）の１−クロロエチルクロロギ酸を添加する。反応混合物を還流条件下で１８時間加熱し、さらに６４０μL（５．９ｍｍｏｌ）の１−クロロエチルクロロギ酸を添加する。反応物を１８時間還流して加熱し、濃縮する。残渣を精製せずに次の工程において使用する。
実施例２６．６−アセトアミド−３-O-ベンジルノルジヒドロモルヒネ（２８）の調製
上記[６−アセトアミド−３-O-ベンジルN-[1-クロロエトキシカルボニル]ノルジヒドロモルヒネ（２７）]の全てに、５ｍLのメタノールを添加し、混合物を６時間還流して加熱する。反応混合物を濃縮し、残渣を０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水を用いるグラジエント実行を使用する調製的RP-HPLCによって精製する。所望の生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、その後凍結乾燥し、２８を与える。
実施例２７．６−アセトアミド−３-OH-ノルジヒドロモルヒネ（２９）の調製
エタノール中１００ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）の２８の溶液に、１０％ Pd-Cを添加し、混合物を６０psiで１２時間水素化する。反応混合物を濾過し、濾過物を濃縮し、２９を与える。
実施例２８．６−アセトアミド−３-OH-ノルジヒドロモルヒネN-酪酸誘導体（３０）の調製
化合物３０を、化合物２３の調製について記載されるような手順に従って、化合物２９から調製する。
実施例２９．６−アセトアミド−３-OH-ノルジヒドロモルヒネN-酪酸NHSエステル誘導体（３１）の調製
この活性エステルを、酸２３を活性エステル２４に転化するために使用される手順に従って、化合物３０から調製する。
実施例３０．６−アセトアミド−３-OH-ノルジヒドロモルヒネN-酪酸KLH結合体（３２）の調製
この結合体は、結合体１０について記載される手順に従って調製される。
実施例３１．６−アセトアミドノルジヒドロコデイン（３８）の調製
２５０ｍｇ（０．７３ｍｍｏｌ）の５ｂに、５ｍLの１，２−ジクロロエタンを添加した。得られた溶液を攪拌し、６３６μL（５．８ｍｍｏｌ）の１−クロロエチルクロロギ酸を添加した。反応混合物を１８時間還流して加熱し、さらに６４０μL（５．９ｍｍｏｌ）の１−クロロエチルクロロギ酸を添加した。反応混合物を還流条件化でさらに１８時間加熱し、濃縮した。残渣を、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水を用いるグラジエント実行を使用して調製的RP-HPLCによって精製した。所望の生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、その後、凍結乾燥し、白色固体として７５ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ、３１％）の３８（M＋H ３２９）を与えた。[注意：中間体６−アセトアミド−N-(1-クロロエトキシ)ノルジヒドロコデイン]誘導体（３７）は、反応条件下で形成されることが期待され、反応条件下で加水分解された。]
実施例３２．６−アセトアミドノルジヒドロコデインN-酪酸（３９）の調製
化合物３９を、化合物２３の調製について記載されるような手順に従って化合物３８から調製される。
実施例３３．６−アセトアミドノルジヒドロコデインN-酪酸NHSエステル（４０）の調製
この活性エステルは、酸２３を活性エステル２４に転化するために使用される手順に従って化合物３９から調製される。
実施例３４．６−アセトアミドノルジヒドロコデインN-酪酸KLH結合体（４１）の調製
この結合体は、結合体１０について記載される手順に従って４０から調製される。
本発明を詳細に記載し、その特定の態様に参照することによって、改変およびバリエーションは、添付の特許請求の範囲に規定される発明の範囲から逸脱することなく可能であることが明らかである。より具体的には、本発明のいくつかの局面が本明細書中で好ましいまたは特に有利であるとして同定されているが、本発明は本発明のこれらの好ましい局面に限定される必要がないことが企図される。
実施例３５．６−モノアセチルモルヒネに対するモノクローナル抗体の開発
少なくとも３ヶ月齢の雌のBalb-cマウスを、免疫化のために使用した。１マウスあたり実施例９由来の１００μｇの６―MAM KLH 免疫原を含む免疫原を、５０％の等張食塩水および５０％のフロイントのアジュバント中に乳化した。フロイントの完全アジュバントを、初期腹腔内（ip）免疫化のために使用し、フロイントの不完全アジュバントを、残りの免疫化に使用した。マウスを、最初の免疫化後、３０日、８４日および１１４日に再免疫化した。融合に選択されたマウスに、第一の免疫化の５０９日後２〜４回の免疫化と同一のブースター免疫化を与えた。４日後、免疫化マウスを屠殺し、その脾細胞を、細胞融合に使用し、モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを産生した。
融合に選択されたマウスを、全採血および頚部転位によって殺し、脾臓を無菌的に摘出し、２つの滅菌スライドガラスの間ですりつぶし、リンパ球を放出した。得られたリンパ球懸濁物をP3X63Ag8.653（ATCC細胞株番号CRL1580）骨髄腫株と融合した。
生存能力のあるリンパ球を計数し、その数の２０％の骨髄腫細胞を、マウスリンパ球を含むチューブに添加した。細胞を、血清を含まない暖かいイスコブの改変ダルベッコ培地（IMDM）中で、遠心分離、再懸濁および再遠心分離によって洗浄した。得られたペレットを含む遠心チューブを、穏やかに軽くたたき、ペレット化した細胞をくずした。次いで、１ｍｌの温めたPEG/DMSO溶液（Sigma Chemicals）を、ゆっくりと細胞に添加し、その一方で、穏やかに混ぜた。血清を含まない前もって温めたIMDMを以下の速度：１ml／分、２ml／分、４ml／分および８ml／分で添加し、その後、細胞を３７℃で１．５分間インキュベートした。チューブを５０ｍｌまで満たし、蓋をし、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞懸濁物を遠心分離し、上清を捨て、細胞をHMT培地に再懸濁した。HMT培地は、コンディムド（77.9% IMDM、10% FCS、10% コンディムド H1、1% L-glut、1% L-glut-pen/strep、50μM 2-メルカプトエタノール、40μM エタノールアミン)および1×に希釈される50X HMT）を含む完全IMDMからなる。細胞を２×１０５リンパ球/ｍｌの濃度で再懸濁し、２００μｌを、３０．５滅菌カバー付９６ウェルミクロ培養プレートの各ウェルにピペットで入れた。プレートを５％ CO2組織培養インキュベーター中３７℃で５日間インキュベートした。６日目に、上清の１５０μｌを、各ウェルから抜き取り、１５０μｌのHT救助培地と置き換えた。HT救助培地は、コンディムドおよび１×に希釈される５０×HT補充物を含む完全IMDMからなる。プレートをインキュベーターに戻し、増殖のサインについて毎日視察した。細胞コロニーが十分大きい場合、ウェルを、ELISAを使用して抗体産生についてスクリーニングした。
９６ウェルマイクロタイタープレートを、３７℃（加湿）で１時間、０．１M炭酸バッファｐＨ９．５中１μｇ/ｍｌで、実施例１６由来の５０μｌの６−MAM-BSA結合体でコートした。プレートを空にして、ｐH7.4のTrisバッファ、１％ゼラチン加水分解物、２％スクロースおよび０．１８％ TWEEN 20からなる２００μｌの二次コート溶液を添加した。
プレートを、３７℃で１時間（加湿）インキュベートした。プレートを空にした後、２００μｌの０．１５M Tris ｐH７．４中２％スクロース溶液を添加した。プレートを室温で約５分間立て、次いで、空にし、室温で一晩空気乾燥した。乾燥した際、プレートを、いくつかの乾燥剤枕を含むジプロック式の袋中に包み、封をし、使用まで４℃で保存した。
クローンが試験のために準備が出来た場合、細胞の増殖を示す各ウェルから２０μｌの上清を取り、９６ウェルの弾性プレートに移した。PBST(リン酸緩衝化生理食塩水、ｐH７．０および０．２％ TWEEN ２０)を、各ウェルに添加し、上清試料の１：１０希釈を提供した。２つの６−MAM-BSAコートウェルを、試験された各培養物ウェルについて使用した。１つのウェルが２５μｌのPBSTバッファを受容し、もう１つは８００ｎｇ/ｍｌの濃度で６−MAMを含む２５μｌのPBSTを受容した。２５μｌの希釈された試料を、各ウェルの対に移し、遊離薬物（６−MAM）の有り無しで、上清抗体結合をアッセイした。プレートを加湿チャンバー中３７℃で１時間インキュベートし、その後、これらをPBSTで洗浄した。次いで、ウェルに５０μｌの適切に希釈されたヤギ抗−マウスIgG−HRP結合体を満たし、再度１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、５０μｌのK-ブルー基質を添加した。色が顕れる５分間のインキュベーションの後、反応を５０μｌの１N HCｌの添加によって停止した。色を、４５０ｎｍでマイクロプレートリーダーで読み取り、データを解析のためにコンピューターに移した。６−MAM-BSA結合体（ウェル中に色を示す）を結合し、遊離薬物の存在下で結合の有意な阻害を示す上清を、正と考え、対応するクローンをサブクローニングした。総計４０クローンをサブクローニングのために選択した。
サブクローニングを、限定希釈を介するストリンジェントクローニングによって達成した。簡単に、元のウェルからの細胞を計数し、１２０の細胞が１０％コンディムドを含む４０ｍｌの完全IMDMに添加されるように希釈した。次いで、これらの細胞を、２つの滅菌された９６ウェルプレートに１ウェルあたり２００μｌで分配した。単一の細胞から成長したように見えるコロニーを含むウェルを、任意の遊離薬物の非存在下およびモルヒネまたはコデイン（各８００ｎｇ/ｍｌで）の存在下で、６−MAMコートされたELISAプレート上で結合についてスクリーニングした。次いで、選択されたウェル（６−MAM-BSAについて正）由来のクローンを、培養物中で増殖し、細胞バンクをつくるために凍結した。
実施例３６：６−MAMを定量するための６−MAM ９．３モノクローナル抗体の使用
６−MAM ９．３は、元の融合プレートにおいて同定された第９番目のクローンから選択された第３のサブクローンであった。６−MAM ９．３から回収された上清を、０．１μｇ/ｍｌで６−MAM-BSAでコートされた９６ウェルプレート上で滴定した。最大ODの９０％を提供する上清の希釈は１：２７０であった。次いで、１：２７０に希釈された６−MAM ９．３の上清を、０．１μｇ/ｍｌの６−MAM-BSAでコートされた９６ウェルプレート上で、異なる濃度の遊離６−MAMをウェルに添加してアッセイし、図８に示す阻害曲線を生成した。ED50を１．２２E-08であると決定した。遊離薬物非存在下の５０％の結合に対応する遊離薬物の濃度を記載するこのパラメーターは、薬物のED50といわれる。
（図面の簡単な説明）
発明の態様の以下の詳細な記載は、以下の図面と共に解釈される場合、最高に理解され得る。
図１は、６−アセトアミドコデイン中間体の合成の概略図である。 図２は、３位からの６−ＭＡＭアナログ免疫原の合成の概略図である。 図３は、３位からの６−ＭＡＭスクリーニング結合体の合成の概略図である。 図４は、免疫原としての６−ＭＡＭ ３−Ｏ−アセチル−Ｎ−位アルキル化結合体の合成の概略図である。 図５は、免疫原としての６−ＭＡＭ−３−Ｎ−アセトアミド−Ｎ−位 Ｎ−アルキル化結合体の合成の概略図である。 図６は、６−ＭＡＭアナログ−Ｎ−位 Ｎ−アシル化免疫原の合成の概略図である。 図７は、６−ＭＡＣアナログ Ｎ−位免疫原の合成の概略図である。 図８は、モノクローナル抗体ＭＡＭ９．３を使用し、遊離６−ＭＡＭの濃度を変化させて作成した阻害曲線である。

Claims (8)

  1. 以下の構造を有する化合物であって、

    ここで、Ｒは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子を含む飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｌは、０〜２の置換または非置換芳香環を含むリンカー基であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、活性化エステルである、化合物。
  2. 以下の構造を有する化合物であって、

    ここで、Ｒは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子の飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｌは、０〜２の置換または非置換芳香環からなるリンカー基であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、ＮＨ−Ｚであり、ここでＺは、担体または標識である、化合物。
  3. 担体が、カサガイヘモシアニン、ウシチログロブリン、ウシ血清アルブミンおよびアミノデキストランからなる群から選択される、請求項２記載の化合物。
  4. 以下の構造を有する化合物であって、

    ここで、Ｑが担体または標識である、化合物。
  5. 担体が、カサガイヘモシアニン、ウシチログロブリン、ウシ血清アルブミンおよびアミノデキストランからなる群から選択される、請求項４記載の化合物。
  6. 以下の構造を有する化合物であって、

    ここで、Ｒは、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、Ｌは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子を含む飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、活性化エステルである、化合物。
  7. 以下の構造を有する化合物であって、

    ここで、Ｒは、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、Ｌは、０〜１０の炭素原子またはヘテロ原子を含む飽和または不飽和、置換または非置換、直鎖または分枝鎖であり、Ｘは、ＮＨまたはＯであり、Ｙは、ＮＨ−Ｚであり、ここで、Ｚは、担体または標識である、化合物。
  8. 担体が、カサガイヘモシアニン、ウシチログロブリン、ウシ血清アルブミンおよびアミノデキストランからなる群から選択される、請求項７記載の化合物。

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