JP2005097307A - イムノアッセイに有用なプロテアーゼ阻害剤コンジュゲートおよび抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】 HIVプロテアーゼ阻害剤に対する免疫原を作製するのに有用な活性化ハプテン、並びにHIVプロテアーゼ阻害剤のイムノアッセイに有用な抗体および標識したコンジュゲートを提供する。
【解決手段】 以下の構造を有する化合物：I-X-(C=Y)_m-L-A（式中、Ｉは、HIVプロテアーゼ阻害剤アタザナビルのHIVプロテアーゼ阻害剤基であり、ＸはＯまたはNHであり、ＹはＯ、ＳもしくはNHであり、ｍは０または１であり、Ｌは、飽和または不飽和の直鎖または分枝鎖に配置される０〜40個の炭素原子からなり、さらに2つ以下の環構造と０〜20個のヘテロ原子（ただし、３個以上のヘテロ原子が連続して結合されることはない）を含むリンカーであり、Ａは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、酸無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基およびアルデヒドからなる群より選択される活性化された官能基である）。

Description

本発明は、イムノアッセイに有用な新規のプロテアーゼ阻害剤コンジュゲートおよび抗体に関する。さらに具体的には、本発明は、HIVプロテアーゼ阻害剤に対する免疫原を生成するのに有用な新規の活性化ハプテン、HIVプロテアーゼ阻害剤に対する抗体を産生するのに有用な新規の免疫原、並びにHIVプロテアーゼ阻害剤のイムノアッセイに有用な新規の抗体および標識したコンジュゲートに関する。

HIVプロテアーゼ阻害剤は、1995年に、最初の阻害剤であるサキナビルが市場に導入されて以来、AIDS患者の健康管理に大きな影響をもたらした重要な新規クラスの薬物である。その他の阻害剤の例として、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビル、ロピナビル、リトナビル、およびアタザナビルが挙げられる。これらは、逆転写酵素阻害剤のようなその他の抗HIV薬と、あるいは、これ以外のHIVプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて用いれば特に効果的である。これら新規の治療薬の注目に値する成功にもかかわらず、治療薬の試験方法をプロテアーゼ阻害剤の濃度のモニタリングに利用することができれば、結果はさらに向上するであろうという指摘がかなりある。すべての患者がプロテアーゼ阻害剤組合せ治療に最適に応答するわけではない。応答する患者であっても、よく知られているように、高い比率でHIVウイルスの突然変異が起こるために、あとで薬物耐性が生じる可能性がある。しかし、プロテアーゼ阻害剤の血漿レベルと、ウイルス負荷量の減少およびCD4細胞数の増加に基づく治療効力との間には、はっきりとした関係があることがわかっている。薬物が十分に代謝されると、複雑な薬物−薬物相互作用を受けやすいことに一つの問題がある。その結果は極めて複雑な薬物速度論となり、ひいては、特定の患者について特定時間での投与量と、それによる薬物レベルとの間に予測不能という強い要因が存在する。治療薬のモニタリングにより、投薬量を患者に対して個別化することができ、ウイルスを抑制する可能性がはるかに高くなる。しかし、プロテアーゼ阻害剤の通常の治療薬モニタリングでは、ハイスループット臨床分析装置用に適合可能な単純な自動化試験が使用できなければならない。現在、プロテアーゼ阻害剤の治療薬モニタリングに関するほとんどの報告では、HPLC法が用いられているが、この方法は、低速で、労力を要し、しかも高価である。近年、サキナビルのラジオイムノアッセイ（RIA）法が報告されている（Wilshireら、Analytical Biochemistry 281, 105-114, 2000）。しかし、このような方法は、ハイスループットな治療薬モニタリングに適合可能ではなく、すべてのRIA法と同様に、アッセイに用いる放射性同位元素標識に関する規制、安全性および廃棄物処理問題といった欠点を抱えている。治療薬モニタリングのための最も望ましいアッセイフォーマットは、非放射性同位元素イムノアッセイであるが、HIVプロテアーゼ阻害剤をモニタリングするためのこのような方法はこれまで知られていない。

前述したように、HPLCはHIVプロテアーゼ阻害剤をモニタリングするための好適な方法であった。文献に最近報告された２つの論文は、ヒト血漿中の数種のプロテアーゼ阻害剤を同時測定するためのHPLCアッセイを記載している：Poirierら、Therapeutic Drug Monitoring 22, 465-473, 2000およびRemmelら、Clinical Chemistry 46, 73-81, 2000。

化学および生物学的アッセイは、一般に、目的の被検体を予め定めた量の１種以上のアッセイ試薬と接触させ、得られた生成物（検出生成物）の１以上の特性を測定した後、測定値と、元のサンプルに存在する被検体の量との相関関係を求めることを含み、この相関は、典型的には、試験しようとするサンプルに予想される範囲内にある既知量の被検体を含む標準または検定サンプルから決定された関係を用いて求める。典型的に、検出生成物は、１種以上のアッセイ試薬により得られる１以上の検出可能な標識を含む。通常用いられる標識の例を以下に挙げる：機能性マイクロ粒子、放射性同位元素標識（例：¹²⁵Iおよび³²P）、酵素（例：ペルオキシダーゼおよびβガラクトシダーゼ）および酵素基質標識、蛍光標識（例：フルオレセインおよびローダミン）、電子スピン共鳴標識（例：ニトロオキシド遊離基、免疫反応性標識（例：抗体および抗原）、結合対の一メンバーである標識（例：ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジン）、並びに電気化学発光標識（例：ルテニウムビピリジル部分を含むものなど）。サンドイッチアッセイは、典型的に、最後に分離に用いる１種のアッセイ試薬（例えば、抗体、抗原）または結合対の一メンバーと、検出可能な標識を提供する第２のアッセイ試薬とで、目的の被検体を挟んでなる、複合体を形成することを含む。競合アッセイは典型的に、目的の被検体と被検体の類似体の両方が、別の試薬（例えば、抗体）上の結合部位について競合する系を含み、その際、被検体、類似体もしくは結合試薬のいずれかが検出可能な標識を有する。

譲受人が本出願と同じである、2000年11月14日に提出された同時係属中の米国特許出願第09/712,525号（2002年５月22日に欧州特許第1 207 394号として公開された）には、HIVプロテアーゼ阻害剤の非同位体元素イムノアッセイが記載されており、このアッセイは、阻害剤を含むサンプルを、阻害剤またはこの阻害剤の代謝物に特異的な受容体と一緒に、さらに、阻害剤の類似体と非同位体元素シグナル発生部分からなるコンジュゲートと一緒にインキュベートすることを含む。受容体による阻害剤の結合の結果発生したシグナルを測定し、元のサンプル中のプロテアーゼ阻害剤の存在または量と相関させる。本発明のプロテアーゼ阻害剤コンジュゲートは、このようなアッセイにおいて特に有用である。

本発明は、HIVプロテアーゼ阻害剤に対する免疫原を生成するのに有用な新規の活性化ハプテンに関する。これらの活性化ハプテンは、次の一般式を有する：
I-X-(C=Y)_m-L-A
（式中、ＩはHIVプロテアーゼ阻害剤基であり、ＸはＯまたはNHであり、ＹはＯ、ＳもしくはNHであり、ｍは０または１であり、Ｌは、飽和または不飽和の直鎖または分枝鎖に配置される０〜40個の炭素原子からなり、かつ、2つ以下の環構造と０〜20個のヘテロ原子（ただし、３個以上のヘテロ原子が連続して結合されることはない）を含むリンカーであり、Ａは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基およびアルデヒドからなる群より選択される活性化された官能基である）。

本発明はまた、次の構造を有する新規の免疫原に関する：
[I-X-(C=Y)_m-L-Z]_n-P
（式中、ＩはHIVプロテアーゼ阻害剤基であり、ＸはＯまたはNHであり、ＹはＯ、ＳもしくはNHであり、ｍは０または１であり、Ｌは、飽和または不飽和の直鎖または分枝鎖に配置される０〜40個の炭素原子からなり、かつ、2つ以下の環構造と０〜20個のヘテロ原子（ただし、３個以上のヘテロ原子が連続して結合されることはない）を含むリンカーであり、Ｚは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、および

からなる群より選択される部分であり、Ｐは、ポリペプチド、多糖、もしくは合成ポリマーであり、ｎは、Ｐの50キロダルトン分子量当たり１〜50の数である）。

本発明はまた、次の構造を有する新規の標識コンジュゲートに関する：
[I-X-(C=Y)_m-L-Z]_n-Q
（式中、ＩはHIVプロテアーゼ阻害剤基であり、ＸはＯまたはNHであり、ＹはＯ、ＳもしくはNHであり、ｍは０または１であり、Ｌは、飽和または不飽和の直鎖または分枝鎖に配置される０〜40個の炭素原子からなり、かつ、2つ以下の環構造と０〜20個のヘテロ原子（ただし、３個以上のヘテロ原子が連続して結合されることはない）を含むリンカーであり、Ｚは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、および

からなる群より選択される部分であり、Ｑは、非同位元素標識であり、ｎは、Ｑの50キロダルトン分子量当たり１〜50の数である）。

本発明は、その他のプロテアーゼ阻害剤に対する交差反応性が10％より小さいサキナビル、ネルフィナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、並びにリトナビルに対する特定のモノクローナル抗体も包含する。最後に、本発明は、本発明の免疫原から作製した抗体、並びに本発明の抗体および標識コンジュゲートを用いるイムノアッセイ法および試験キットも包含する。

本明細書全体を通して、太字で表す数字は、図面に示した化学構造を指している。

本明細書で用いる被検体とは、その存在または量を測定しようとする物質、もしくは物質群を意味する。

抗体とは、被検体の特定の結合パートナーを意味し、これは、任意の物質、もしくは物質群であり、他の無関係の物質はほぼ除外して、被検体に対し特異的な結合親和力を有する。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗体フラグメントを包含する。

ハプテンは部分的または不完全な抗原である。ハプテンは、タンパク質を含まない物質であり、多くの場合、低分子量物質であって、抗体の形成を刺激することはできないが、抗体と反応もしない。抗体は、ハプテンを高分子量担体と結合させ、この結合した生成物をヒトまたは動物に注射することにより形成される。ハプテンの例としては、以下のものが挙げられる：治療薬、例えば、ジゴキシンおよびテオフィリン；乱用薬物、例えば、モルヒネおよびLSD；抗生物質、例えば、ゲンタマイシンおよびバンコマイシン；ホルモン、例えば、エストロゲンおよびプロゲステロン；ビタミン、例えば、ビタミンB12；並びに葉酸、チロキシン、ヒスタミン、セロトニン、アドレナリンおよびその他。

活性化ハプテンとは、誘導体コンジュゲートを合成するための活性化された基の結合、または供給などにより、反応に利用可能な部位を与えられたハプテン誘導体を意味する。

用語「リンカー」とは、ハプテンを担体、免疫原、標識、トレーサーまたは別のリンカーと結合させる化学的部分を意味する。リンカーは、直鎖または枝分かれした、飽和または不飽和の炭素鎖でよい。リンカーはまた、鎖内または鎖の末端に１個以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。ヘテロ原子とは、炭素以外の原子を意味し、酸素、窒素およびイオウからなる群より選択される。リンカーの使用は、特定のハプテンと担体の対によっては、有利なことも不利なこともあり、必要な場合も不要な場合もある。

本明細書で用いる「担体」とは、免疫原性物質、一般的にはタンパク質であり、ハプテンと結合することにより、ハプテンが免疫応答を刺激することができるようにする。担体物質としては、タンパク質、糖タンパク質、複合多糖および核酸が挙げられ、これらは異物として認識されるため、宿主からの免疫応答を誘発する。

本明細書で用いる用語「免疫原」および「免疫原の」とは、生物において免疫応答を引き起こすまたは生み出す能力がある物質を意味する。

用語「コンジュゲート」および「誘導体」とは、１以上の化学反応により親化合物または分子から調製された化合物または化学分子を意味する。

本明細書で用いる「検出分子」、「標識」または「トレーサー」とは、識別用の標識であり、担体物質または分子に結合させて被検体を検出するのに用いることができる。標識は、担体物質に直接、または結合成分もしくは架橋成分を用いて間接的に結合させることができる。標識の例として、酵素、例えば、βガラクトシダーゼおよびペルオキシダーゼ；蛍光化合物、例えば、ローダミンおよびフルオレセインイソチオシアネート（FITC）；発光化合物、例えば、ジオキセタンおよびルシフェリン；並びに放射性同位元素、例えば、¹²⁵Iが挙げられる。

用語「活性エステル」は、本発明で用いられる意味では、ペプチド、ポリアミノ酸、多糖、もしくは標識の遊離アミノ基（これに限定されない）のような求核基と、求核基担持物質の他の反応性基との妨害的な副反応が有効に起こらないような条件下で、反応することができる活性化エステル基を包含する。

本発明の目的は、HIVプロテアーゼ阻害剤に対する免疫原を生成するのに用いることができる新規の活性化ハプテンを提供することである。これらの活性化ハプテンは、次の一般構造を有する：
I-X-(C=Y)_m-L-A
（式中、ＩはHIVプロテアーゼ阻害剤基であり、ＸはＯまたはNHであり、ＹはＯ、ＳもしくはNHであり、ｍは０または１であり、Ｌは、飽和または不飽和の直鎖または分枝鎖に配置される０〜40個の炭素原子からなり、かつ、2つ以下の環構造と０〜20個のヘテロ原子（ただし、３個以上のヘテロ原子が連続して結合されることはない）を含むリンカーであり、Ａは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基およびアルデヒドからなる群より選択される活性化された官能基である）。

本明細書で用いられる「HIVプロテアーゼ阻害剤基」は、ヒドロキシル基またはアミノ基だけが欠けているインタクトな薬物、XH（この場合、ＸはＯまたはNHである）である。ＸおよびC=Y部分は、限定するものではないが、以下のものを含む：エステル（この場合、ＸはＯ、ＹはＯ、ｍは１である）、アミド（この場合、ＸはＮＨ、ＹはＯ、ｍは１である）、ウレタン（この場合、ＸはＯ、ＹはＯ、ｍは１、C=Yに隣接するＬにおける最初の原子はＮである）、尿素（この場合、ＸはNH、ＹはＯ、ｍは１、C=Yに隣接するＬ中の最初の原子はＮである）、チオ尿素（この場合、ＸはNH、ＹはＳ、ｍは１、C=Yに隣接するＬ中の最初の原子はＮである）、アミジン（この場合、ＸはNH、ＹはNH、ｍは１である）、エーテル（この場合、ＸはＯ、ｍは０である）、並びにアミン（この場合、ＸはNR（ＲはＨまたは低級アルキル）、ｍは０である）。「低級アルキル」とは、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピル基である。好ましい活性化ハプテンは、すべてのHIVプロテアーゼ阻害剤に共通の中央の非末端ヒドロキシル基と共に形成されたエステルまたはウレタンである。この中央ヒドロキシル基は、プロテアーゼ阻害剤の治療活性にとって機能的に重要であるだけでなく、誘導体化およびリンカー結合に好適なハンドルも提供する。さらに、プロテアーゼ阻害剤の代謝は一般に末端の残基で起こるため、中央ヒドロキシル基は、親薬物と代謝産物を識別する抗体を産生するように設計される免疫原にとって魅力的な部位である。本明細書で用いる「中央ヒドロキシル基」はHO^cのように示す。中央ヒドロキシル基の水素は、(C=Y)m-L-A基で置換され、残った結合酸素はO^cのように示す。

リンカーＬは、末端の活性化官能基ＡとHIVプロテアーゼ阻害剤基との間に追加のスペーサーを提供する役割を果たし、最初のスペーサーはＸおよびC=Y基である。リンカーの長さおよび組成が、免疫原応答およびコンジュゲート性能に重要な作用をもたらすことは、当業者によく知られている。ヒドロキシルおよびアミノ基と結合させるためのリンカーの例は、市販のもの、もしくは容易に合成できるものを含め、文献に多数挙げられている。これに関して優れた論文として、Bioconjugate Techniques, G. Hermason, Academic Press, 1996を参照されたい。また、追加リンカーＬが不要であり、C=Y部分が活性化官能基Ａに直接結合する場合もある。好ましいリンカー部分の一例として、-(CH₂)_x-NH-（ここで、ｘは１〜12）が挙げられる。特に、ｘ＝５と、Ｃ＝Ｙ（ここで、ＹはＯ）の組合せ（すなわち、アミノカプロイルエステル）が好ましい。このようなリンカーは、Ｎ保護アミノ酸（すなわち、アミノカプロン酸）でHIVプロテアーゼ阻害剤をアシル化することにより形成される。保護基は、HIVプロテアーゼ阻害剤基におけるX-C=Y結合またはその他の部分の結合性に影響を与えないように、温和な塩基性または酸性条件下で除去されるものが好ましい。温和な塩基性条件下で除去されるＮ保護基の例として、フルオレニルメチルオキシカルボニル（FMOC）がある。酸で容易に除去できるＮ保護基の例としては、t-ブチルオキシカルボニル（BOC）がある。これ以外にも多数の好適なＮ保護基が当業者によく知られている（Organic Synthesis、第２版、T. GreeneおよびP. Wuts, Wiley-Interscience, 1991中の"Protective Group"参照）。

HIVプロテアーゼ阻害剤のヒドロキシルまたはアミノ基のＮ保護アミノ酸によるアシル化反応は、触媒の存在下または不在下でカルボジイミドのような縮合試薬を用いることにより達成される。好ましい組合せは、ジシクロヘキシルカルボジイミドと、触媒としてのジメチルアミノピリジンである。アシル化反応は、塩化メチレンのような好適な溶剤中で、０〜35℃にて、典型的には0.5〜７日間にわたり実施する。生成物を単離した後、Ｎ保護基を除去する。好ましいFMOC保護基の場合は、これを、塩化メチレン中の10％ピペリジンの溶液で0.5〜２時間にわたり処理することにより達成する。得られたアミノアシル−プロテアーゼ阻害剤のアミノ基は、多種多様なカルボキシル活性化リンカー伸長剤または標識（本発明が属する分野の当業者にはよく知られている）によるアシル化反応を受けやすい。多くの場合、リンカー伸長をこの段階で実施することにより、末端活性化基Ａ（例えば、活性エステル、イソシアネートおよびマレイミド）を生成させる。例えば、アミノアシル−プロテアーゼ阻害剤と、ビス−カルボン酸（例えば、テレフタル酸）のホモ二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの一末端との反応により、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルが末端に付加された安定なリンカー付加物が生成され、これは、ポリペプチド、多糖および標識上のアミンにコンジュゲートさせるのに有用である。リンカー伸長はまた、ヘテロ二官能性試薬、例えば、マレイミドアルカン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて達成することもでき、この場合、ポリペプチドおよび標識上のチオール基への後続のコンジュゲーションに用いられる末端マレイミド基が生成される。これ以外にも、アミノ末端リンカーをヘテロ二官能性チオール化試薬で伸長することも可能であり、この反応からは、一方の末端にアミド結合、そして他方の末端に遊離または保護されたチオールが形成される。当分野でよく知られるこのタイプのチオール化試薬のいくつかの例として、2-イミノチオラン（2-IT）、スクシンイミジルアセチルチオプロピオネート（SATP）、並びにスクシンイミド2-ピリジルジチオプロピオネート（SPDP）が挙げられる。次に、脱保護後、チオール基を利用して、マレイミドまたはブロモアセチル化修飾免疫原もしくは標識とのチオールエーテルを形成することができる。さらに別の方法は、アミノ末端リンカーのアミノ基をジアゾニウム基に、従って、該物質をジアゾニウム塩に変換する方法であり、これは、例えば、酸の存在下で亜硝酸アルカリ金属塩と反応させ、次に、好適な求核成分、例えば、限定するものではないが、ペプチド、タンパク質、ポリアミノ酸などのチロシン残基と反応させることにより行う。このようなジアゾニウム塩への変換に好適なアミノ末端リンカーの例として、芳香族アミン（アニリン類）があるが、アミノカプロン酸および前述した類似物質も含まれる。このようなアニリン類は、前記のような、プロテアーゼ阻害剤のヒドロキシルとN-保護アミノ酸とのカップリング反応において、アミノ基が芳香族アミン（すなわち、アニリン）を構成する対応のアミノ酸を代わりに使用することにより得られる。その際、このアミンは、例えば、N-アセチルまたはN-トリフルオロアセチル基として好適に保護されており、その後、当業者には公知の方法を用いて脱保護される。ジアゾニウム塩へのその他の好適なアミン前駆体については、有機合成の分野の当業者には認識されるであろう。

別の好ましいタイプのヘテロ二官能性リンカーは、混合活性エステル／酸塩化物、例えば、スクシンイミド−オキシカルボニル−ブチリルクロリドである。このリンカーの反応性のより高い酸塩化物末端が、HIVプロテアーゼ阻害剤上のアミノまたはヒドロキシル基を優先的にアシル化して、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルリンカー付加物を直接生成させる（アンプレナビルについては実施例40、リトナビルについては実施例８を参照されたい）。

本発明で有用な別のタイプの末端活性化基は、アルデヒド基である。アルデヒド基は、以前に記載された方法と同様に、マスキングされたアルデヒド基、例えばアセタール基（例：1,3-ジオキソラン-2-イルまたは1,3-ジオキサン-2-イル部分）によりω位置（遠位末端）で置換されたアルキルまたはアリール酸と、プロテアーゼ阻害剤のヒドロキシルを結合した後、当業者には公知の方法を用いて上記基のマスキングを除去することにより生成することができる（例えば、T. GreeneおよびP. Wuts、前掲参照）。あるいは、保護ヒドロキシ、例えばアセトキシ部分によりω位置で置換されたアルキルまたはアリールカルボン酸を結合反応に用い、続いてヒドロキシの脱保護、次いで好適な溶剤（好ましくは、塩化メチレン）中での試薬（例えば、ピリジニウムジクロメート）による温和な酸化を実施することにより、対応するアルデヒドを得ることもできる。アルデヒド末端物質を生成するその他の方法は当業者には明らかであろう。

また、リンカー組成物に極性を導入することにより、目的とするアッセイにおける可溶性または性能特性を高めることが望ましい場合もある。これに関して、ペプチドリンカーが特に有用であり、これらは、最適化についての多岐にわたる可能性を提供するとともに、固相ペプチド合成またはその他の手段により容易に入手可能である。

プロテアーゼ阻害剤との結合点にウレタン、尿素またはチオ尿素結合を有するアシル化HIVプロテアーゼ阻害剤を調製するのに特に有用な別の手法は、プロテアーゼ阻害剤のヒドロキシルまたはアミノ基をリンカーイソシアネートまたはリンカーイソチオシアネートと反応させることである。例えば、カルボキシ基に保護基がある、またはないカルボキシアルキルイソシアネートを、プロテアーゼ阻害剤上の標的ヒドロキシル基と直接反応させることにより、保護されたカルボキシアルキルウレタンまたはカルボキシアリールウレタンを得ることができる。保護されたカルボキシは、好ましくは塩基性または酸性条件下で除去されるエステルである。いったん脱保護したら、カルボキシル基を活性化することにより活性エステルを生成して、後の結合に用いてもよいし、あるいは、これをポリペプチド、多糖および標識に直接結合させてもよい。この他にも、予め活性化させたカルボキシアルキルイソシアネートまたはカルボキシアリールウレタン、例えば、N-ヒドドキシスクシンイミジル−イソシアナトベンゾエートをプロテアーゼ阻害剤ヒドロキシルまたはアミノ基と直接反応させることにより、活性エステル末端を有するリンカー−アシル化プロテアーゼ阻害剤が得られる。

HIVプロテアーゼ阻害剤との結合点にウレタン、尿素およびチオ尿素結合を形成するためのさらに別の手法は、ホスゲンまたはチオホスゲンで標的ヒドロキシルまたはアミン官能基を処理することにより、塩化オキシカルボニルまたは塩化オキシチオカルボニルを得るものである。これらの中間体はアミンと容易に反応し、ウレタン、尿素またはチオ尿素を生成する。別のホスゲン同等物、例えば、カルボニルジイミダゾールまたはジスクシンイミジル−カーボネートも同様に反応する。

また、別の手法は、中央ヒドロキシル基からHIVプロテアーゼ阻害剤のアルキル化誘導体を生成するのに有用である。例えば、中央ヒドロキシル基を脱プロトン化するのに適した条件下で、プロテアーゼ阻害剤（もしくは適切に保護されたプロテアーゼ阻害剤）を強塩基と反応させることができる。これを、保護されたカルボン酸または好適に保護された官能基（例えば、フタルイミドとして保護されたアミノ基）を担持する多種のハロアルキル試薬と反応させてエーテル結合を形成することができる。保護されたカルボキシル基はエステルであるのが好ましく、これは酸性または塩基性条件下で除去される。遊離カルボン酸基を活性化すると活性エステルが得られ、続いてこれをポリペプチド、多糖および標識基との結合に用いることもできる。また、脱保護後の遊離アミノ基は、活性化カルボン酸基を有する二官能性リンカーを用いて伸長させたり、あるいは、尿素結合または類似基を用いてポリペプチドに結合させたりすることもできる。

アミジン付加物を調製するためには、HIVプロテアーゼ阻害剤のアミンをイミドエステルと反応させる。イミドエステルの多くは、バイオコンジュゲート化学においてリンカーとして知られている（Hermanson、同上参照）。

あるいは、活性化基としてイミデート部分（イミドエステル；またはイミニウム基）を担持するリンカーで誘導体化したプロテアーゼ阻害剤は、例えば、プロテアーゼ阻害剤を適切に官能基化するとき、好適な前駆体基、例えば、末端ニトリル基を担持するリンカーを用いることによって得られる。例えば、末端ニトリルを担持するネルフィナビルのO^c−アルキル化誘導体もしくはO^ar−アルキル誘導体、または、アンプレナビルのN^ar−アルキル誘導体を前記と類似した方法で合成し、その後公知の方法、例えば、アルコール中の塩化水素による処理によって、ニトリルをイミデート基に変換することができる。また、Hermanson、同上；およびJerry March, Advanced Organic Chemistry, 第3版、John Wiley & Sons, 1985参照。イミドエステルを取得するその他の方法は、当業者によって認識されるであろう。

複数のヒドロキシ基を有するプロテアーゼ阻害剤（すなわち、インジナビルおよびネルフィナビル）、または同じプロテアーゼ阻害剤中にヒドロキシル基とアミノ基を有するプロテアーゼ阻害剤（すなわち、アンプレナビル）では、その他の官能基でのクリーンな反応を実施するために、上記基の１つを保護する必要がある場合もある。例えば、インジナビルインダンヒドロキシル基は、隣接するアミド窒素と架橋結合するイソプロピリジン基で保護することができる（化合物4A、実施例４参照）。本発明の目的のために、インダンヒドロキシル基はHOⁱⁿのように表記することにより、HO^cと識別する。また、伸長によるイソプロピリジン保護インジナビルHOⁱⁿは、OⁱⁿNⁱⁿ−イソプロピリジニルのように表記する。

別の例では、ネルフィナビル芳香族ヒドロキシル（本明細書で用いるHO^ar）をt-ブチルジメチルシリル（TBDMS）基で保護した後、中央ヒドロキシル基HO^cと反応させる（化合物5A、実施例５参照）。ネルフィナビル芳香族ヒドロキシルはまた、メトキシエトキシメチルエーテル（MEM）基でも保護される（化合物5M、実施例31参照）。アルコールおよびフェノールについて好適なその他多くの保護基が当分野では知られており、さらに別の例については、再度GreeneおよびWuts（同上）を参照されたい。

他のケースでは、反応条件の調節により、１つの官能基を別のものに対して選択することができ、保護の必要がなくなる。このような手法の一例として、アンプレナビルヒドロキシル基またはアミノ基の選択的アシル化（実施例３および40を参照）が挙げられる。別の例としては、非保護脂肪族中央ヒドロキシル基（HO^c）の存在下でのネルフィナビルフェノール性ヒドロキシル基（HO^ar）の選択的アシル化がある(実施例36参照）。

以上の説明から、目的とするHIVプロテアーゼ阻害剤ハプテン組成物に活性化末端基Ａをもたらすリンカー技術に多くの変種があることは明らかである。これらの変種のいくつかについてさらに詳しく説明する。活性エステルは最も好ましいＡ基である。本発明の活性エステルは、様々な水性および非水性の混合溶剤中で比較的低い温度（一般に０〜100℃）にて求核基、特に第一アミンと反応性である。アミドの取得を目的とする第一または第二アミンと活性エステルとの結合のための典型的な条件は、室温で、水を添加したまたは添加しない、双極性非プロトン性溶剤、例えば、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）またはジメチルスルホキシド（DMSO）中での反応である。多くの場合、バッファーまたは第三アミンを添加することにより、第一アミン反応体を脱プロトン化状態に維持するのに必要な塩基性pHを維持する。典型的な活性エステルは、p-ニトロフェニルエステル、N-ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、1-ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステルおよびペンタフルオロフェニルエステルである。特に、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルは、安定性、反応性、並びに副産物であるN-ヒドロキシスクシンイミドの容易な除去という点で釣り合いが取れているために、好ましい。その他の活性エステルは当業者に公知であり、同様に用いることができる。

末端カルボン酸を有するプロテアーゼ阻害剤リンカーの別の活性化方法は、酸無水物のin situ調製である。特に、アルキルクロロホルメート（例えば、イソブチルクロロホルメート）により形成された混合無水炭酸である。このような混合酸無水物は、溶剤（例えば、DMFまたはテトラヒロドフラン（THF））中で第三アミン（例えば、トリエチルアミンまたはN-メチルモルホリン）の存在下に、カルボン酸とアルキルクロロホルメートを５分〜１時間反応させることにより、典型的には−30℃〜＋30℃、通常−20℃〜０℃の温度で容易に形成される。次に、この混合酸無水物を標識、免疫原および担体上のアミノ基と典型的には、０℃〜＋30℃で５分〜１時間反応させることにより、安定なアミドコンジュゲートが得られる。また、各種溶剤（例えば、THF、DMFもしくはジクロロメタン）中で２当量のプロテアーゼ阻害剤リンカーカルボン酸をカルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）またはエチルジメチルアミノプロピル−カルボジイミド（EDAC））と反応させることにより、対称酸無水物を形成することができる。活性化およびアミンとの結合は、典型的には、前記の混合酸無水物の結合と同様の条件下で実施する。

末端カルボン酸を有するプロテアーゼ阻害剤リンカーの別の活性化方法は、カルボン酸基をホモシステインチオラクトンのような物質と結合させることにより、マスキングされたチオール基、例えば、チオラクトンに変換することである（例えば、米国特許第5,302,715号を参照）。次に、得られたリンカー−チオラクトンを温和な塩基で脱マスキングすることにより末端チオールが得られ、これは、マレイミド基またはブロモアセチルもしくはヨードアセチル基のような基（例えば、マレイミド−またはハロアセチルで修飾されたペプチド、多糖、ポリアミノ酸、標識などに存在する基）と反応性であるため、前記の方法と同様にして、チオ−マレイミドまたはチオ−アセチル付加物が得られる。

これ以外の有用なＡ基は、イソチオシアネートまたはイソシアネート基である。イソチオシアネートは、第一アミンのような求核基と容易に反応して、前記の活性エステル反応と同様の条件下でチオ尿素を生成するのに対し、イソシアネートは同様に反応して尿素を生成する。イソチオシアネートまたはイソシアネート反応のもう一つの利点は、これが置換ではなく付加であるため、活性エステルの場合のように、副産物の心配がないことである。イソシアネート同等物、例えば、p-ニトロフェニルオキシカルボニルアミノ基は、第一アミンと同様に反応して尿素を生成する。

最後に、標的求核基がチオール基の場合には、非常に温和な条件、すなわち、周囲温度および中性pHでチオールエーテルを高速形成することから、マレイミドが特に好ましい。あるいは、活性ハロアルキルＡ基、例えば、ヨードアセチルまたはブロモアセチルも容易に反応して安定なチオールエーテルを形成する。

本発明の別の目的は、次の構造を有する新規の免疫原を提供することである：
[I-X-(C=Y)_m-L-Z]_n-P
（式中、ＩはHIVプロテアーゼ阻害剤基であり、ＸはＯまたはNHであり、ＹはＯ、ＳもしくはNHであり、ｍは０または１であり、Ｌは、飽和または不飽和の直鎖または分枝鎖に配置される０〜40個の炭素原子からなり、かつ、2つ以下の環構造と０〜20個のヘテロ原子（ただし、３個以上のヘテロ原子が連続して結合されることはない）を含むリンカーであり、Ｚは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、並びに

からなる群より選択される基であり、Ｐは、ポリペプチド、多糖もしくは合成ポリマーであり、ｎは、Ｐの50キロダルトン分子量当たり１〜50の数である）。

免疫原の場合、本発明の好ましい形態は、エステル結合を形成するためにアシル化反応により、すべてのHIVプロテアーゼ阻害剤に共通の中央ヒドロキシル基から結合させることである（すなわち、ＸはＯ、ｍは１、ＹはＯ）。前記のように、非常に多様なリンカーＬと活性化官能基Ａを用いることができる。従って、I-X-(C=Y)_m-L-Aのタイプの活性化ハプテンを構築してから、免疫原担体物質と反応させる。免疫原担体は、典型的に、分子量が10kDより大きいポリペプチドまたは多糖である。好ましい免疫原担体は、分子量が100kD以上のポリペプチドである。好ましい担体物質の例として、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、Limulus polyphemusヘモシアニン（LPH）およびウシチログロブリン（BTG）が挙げられる。活性化ハプテンと担体上のアミノ基との反応は、典型的に、水と水混和性有機溶剤（例：DMSO）との緩衝混合物中で室温にて0.5〜５日間実施する。バッファーのpHは典型的に、活性エステル、イソシアネートおよびイソチオシアネートの場合は６〜８、イミデートの場合には７〜10であり、担体アミノ基と活性化官能基との既知の反応性に応じて調節する。末端基Ａがマレイミドの場合には、担体上の反応基はチオールである。チオール基は、担体に固有のものであってもよいし、あるいは、チオール化試薬（例：2-ITまたはSATP）を用いて導入してもよい。チオール基にマレイミドを結合させてチオエーテルを得るための最適pHは、一般的に５〜７である。反応の後、免疫原を透析するか、またはサイズ排除クロマトグラフィーに供することにより、非結合ハプテンおよび有機溶剤を除去する。

免疫原を取得する別の方法は、活性化ハプテン（その際、Ａはアルデヒドである）を担体タンパク質またはポリペプチドのアミノ基と反応させることにより、シッフの塩基を形成させた後、温和な還元剤（例：シアノボロハイドライド）での還元により、安定なアミン結合を形成させるものである。この手法の変法も、本発明が属する分野の当業者には理解されるだろう。

本発明の別の目的は、本発明の免疫原から作製されたHIVプロテアーゼ阻害剤に対する抗体を提供することである。抗体を作製するためには、宿主動物に注射するための免疫原を、凍結乾燥した免疫原を再水和して免疫原の溶液または懸濁液を形成することにより調製する。あるいは、免疫原を、事前に調製したバッファー中の溶液または懸濁液として用いてもよい。次に、免疫原溶液にアジュバント（例：フロイントアジュバント）を添加することにより、免疫原混合物を形成する。免疫原は、何週間かにわたり、１回以上、いくつかの用量で、様々な部位に投与することができる。

本発明の免疫原を用いたポリクローナル抗体の調製は、当業者に知られている通常の方法のいずれかに従って行なうことができる。一般に、宿主動物（例：ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット、もしくはウマ）に免疫原混合物を注射する。最適力価が達成されたことが確認されるまで、抗体力価について血清を検定しながら、さらに注射を実施する。次に、宿主動物の採血を実施して、適量の特異的な抗血清を回収する。所望であれば、精製ステップを実施して、非特異的な抗体などの不要な材料を除去した後で、この抗血清はアッセイを行うのに適しているとみなすことができる。

ポリエチレングリコール法（例えば、Methods in Enzymology 73(Part B), pp.3-46, 1981に記載されている方法）を用いて、前記のように免疫化したマウスからのマウスリンパ球と骨髄腫細胞をハイブリダイズさせることにより、モノクローナル抗体を得ることができる。

ELISAアッセイの場合には、ウシ血清アルブミン（BSA）と結合させたプロテアーゼ阻害剤誘導体がマイクロタイタープレートのコーティングに好ましい。

本発明の別の目的は、次の構造を有する新規の標識したコンジュゲートを提供することである：
[I-X-(C=Y)_m-L-Z]_n-Q
（式中、ＩはHIVプロテアーゼ阻害剤基であり、ＸはＯまたはNHであり、ＹはＯ、ＳもしくはNHであり、ｍは０または１であり、Ｌは、飽和または不飽和の直鎖または分枝鎖に配置される０〜40個の炭素原子からなり、かつ、2つ以下の環構造と０〜20個のヘテロ原子（ただし、３個以上のヘテロ原子が連続して結合されることはない）を含むリンカーであり、Ｚは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、並びに

からなる群より選択される基であり、Ｑは非同位元素標識であり、ｎは、Ｑの50キロダルトン分子量当たり１〜50の数である）。

HIVプロテアーゼ阻害剤と非同位元素標識のコンジュゲートの合成のためには、免疫原の調製と同様の手順を使用する。

あるいは、活性化ハプテンを酵素上のアミノまたはチオール基に結合させて、ELISAで用いるための標識を調製することができる。ELISA（そのためのコンジュゲートは当分野でよく知られている）に有用な酵素のいくつかの例として、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼおよびβガラクトシダーゼが挙げられる。酵素を含むタンパク質のコンジュゲートは、典型的に、水と水混和性有機溶剤の緩衝混合物中で調製した後、免疫原の調製条件と類似した透析に供する。ラテックス凝集反応アッセイの場合には、分子量が10kD〜300kD、好ましくは、40kDのアミノ化デキストラン担体とのコンジュゲートが特に有用である。これらのコンジュゲートは、反応を促進するために第三アミン（例：トリエチルアミン）を含む前記の緩衝溶剤混合物または無水有機溶剤（例：DMSO）中で調製する。分子量が小さい、すなわち、１kDより小さい標識の場合には、標識の種類に応じて反応条件を調節する。特に好ましい標識として、標識したアビジンまたはストレプトアビジンと組み合わせたビオチンがある。非同位元素検出用の（ストレプト）アビジン／ビオチン系の用途の広さはバイオコンジュゲート化学の分野ではよく知られている（Hermanson、同上参照）。アビジンおよびストレプトアビジンの多様な酵素−および発蛍光団−標識コンジュゲートが市販されており、これらを用いて、高い親和力相互作用でビオチン標識物質を検出することができる。さらに、様々なビオチン化剤も市販されており、これらを利用して活性化官能基Ａと反応させることができる。例えば、ビオチン−アミン誘導体を本発明の活性化ハプテンと反応させることができ、その際、Ａは活性エステル、イソシアネートまたはイソチオシアネートであり、これによって、それぞれ、ビオチンアミド、尿素およびチオ尿素コンジュゲートが得られる。これらの結合反応は、典型的に、有機塩基（例：トリエチルアミン）を含む双極性非プロトン性溶剤（例：DMFまたはDMSO）中で室温にて0.5〜５日間実施する。クロマトグラフィー法（例：逆相HPLC）によりビオチンコンジュゲートを単離するのが好ましい。

その他の好ましい標識は、発蛍光団、例えば、フルオレセイン、ローダミン、TEXAS RED 蛍光染料（Molecular Probes, Inc.）、ダンシルおよびシアニン染料（例：Cy-5）であり、これらの多くの活性化誘導体が市販されている。一般に、これらのコンジュゲートは、第三アミンを含む双極性非プロトン性溶剤中でビオチンコンジュゲートと同様に調製した後、クロマトグラフィー単離を実施することができる。

また、検出系に間接的に結合した標識としてリポーター基を用いることも可能である。１例として、前記のようなビオチンが挙げられる。別の例としては、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害のためのミコフェノール酸誘導体（2001年１月４日に公開されたPCT公開WO 200101135に記載されているものなど）がある。

前記以外にも、HIVプロテアーゼ阻害剤活性化ハプテン上の活性化基Ａとの反応のために、標識上の好適な求核基（例：アミンまたはチオール）を適切に導入後、非同位元素標識、例えば、電気化学発光標識（例：ルテニウムビピリジル誘導体）、化学発光標識（例：アクリジニウムエステル）、電気化学メディエーター、並びに各種のマイクロ粒子およびナノ粒子も本発明に使用可能であることは、当業者には明らかであろう。

以下に挙げる実施例において、太字の数字は、図面に示した対応する構造を指している。これらの実施例は、説明のために示すにすぎず、本発明を制限する意図はない。

プロテアーゼ阻害剤のO-アシル化
実施例１． O ^c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-リトナビル（1A）の合成
リトナビル（１、0.3605 g）、FMOC-アミノカプロン酸（0.1944 g、Advanced ChemTech, ルイスビル、KY）、ジメチルアミノピリジン（0.0672 g、Aldrich Chemical Co., ミルウォーキー、WI）およびジクロロヘキシルカルボジイミド（0.1238 g、Fluka Chemical Corp., ミルウォーキー、WI）を無水塩化メチレン（5 mL）中室温で一晩攪拌した。この混合物をろ過し、ろ過物を減圧下で蒸発乾固させた後、窒素の陽圧下で、シリカゲル（EM Science カタログ番号：9385-9、シリカゲル60、230-400メッシュASTM）クロマトグラフィー（溶出：クロロホルム中３％メタノール）で直接精製することにより、白色固体のO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-リトナビル(1A) （0.5023 g、95%）を回収した。M+H 1056.2。

実施例２． O ^c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-サキナビル（2A）の合成
使用する塩化メチレンを増量（75 mL）し、かつ、反応物の攪拌を２日間実施する以外は実施例１に記載した条件に従い、メタンスルホン酸サキナビル（２、0.1917 g）からO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-サキナビル(2A)を調製した（A. Farese-Di Giorgioら、Antiviral Chem. and Chemother. 11, 97-110, 2000）（0.2354 g, 94%）。M+H 1006.2。

実施例３． O ^c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-アンプレナビル（3A）の合成
実施例１に記載した条件に従い、アンプレナビル（３）（0.1517 g）からO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-アンプレナビル（3A）を調製した（0.2248 g；89%）。M+H 841。

実施例４． O ^c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-O ⁱⁿ ,N ⁱⁿ -イソプロピリジニル−インジナビル（4B）の合成
硫酸インジナビル（4、0.3559 g)、ショウノウスルホン酸（0.1401 g、Aldrich Chemical Co.）、および硫酸マグネシウム（4 mg）をジメトキシプロパン（５mL、A. Farese-Di Giorgioら、Antiviral Chem. and Chemother, 11, 97-110, 2000）中で一晩還流させた。得られた混合物を塩化メチレンと飽和重炭酸ナトリウム水溶液とに分配した。有機層を減圧下で蒸発乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：クロロホルム中４％メタノール）で直接精製することにより、無色油状のOⁱⁿ,Nⁱⁿ-イソプロピリジル−インジナビル（4A）（0.2350 g；72%）を回収した。M+H 654.4。

実施例１に記載した条件に従い、Oⁱⁿ,Nⁱⁿ-イソプロピリジル−インジナビル（4A、0.1317 g）からO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-Oⁱⁿ,Nⁱⁿ-イソプロピリジニル−インジナビル（4B）を調製した（0.1742 g；87%）。M+H 989.4。

実施例５． O ^c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-O ^ar -TBDMS-ネルフィナビル（5B）の合成
ネルフィナビル（５、0.2839 g）と水素化ナトリウム（18 mg）をDMF（３mL）中で15分攪拌した。t-ブチルジメチルシリル（TBDMS）クロライド（0.1130 g）を添加し、反応物を一晩攪拌した。得られた混合物を減圧下で蒸発乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：クロロホルム中３％メタノール）で直接精製することにより、白色のフォームの形態をしたO^ar-TBDMS-保護ネルフィナビル（5A）（0.2857 g；84%）を回収した。M+H 682.4。

実施例１に記載した条件に従い、O^ar-TBDMS-保護ネルフィナビル（5A、0.3297 g）からO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-O^ar-TBDMS-ネルフィナビル（5B）（0.3385 g；69%）を調製した。M+H 1017.7。

実施例６． O ^c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-ロピナビル（6A）の合成
実施例１に記載した条件に従い、ロピナビル（６、0.712 g）からO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-ロピナビル（6A）（0.500 g；45%）を調製した。M+H 964.4。

実施例７． O ^c -[3-(4'-カルボキシフェニル)-プロピオニル]]-サキナビル（2H）の合成
実施例１に記載した条件に従い、メタンスルホン酸サキナビル（２、0.1534 g）と3-(4'-カルボキシフェニル)-プロピオン酸（0.0485 g、Lancaster Synthesis Inc., ウィンダム、NH）から3-(4'-カルボキシフェニル)-プロピオニル-サキナビル（2H）（0.1041 g；61%）を調製した。M+H 847.4。この生成物のスペクトルデータ（¹H-NMR）は、アリールカルボキシではなく、アルキルカルボキシでのエステル化と適合した。

実施例８． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル（1G）の合成
スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリルクロリド、すなわち、5-(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル-オキシ)-5-オキソ-ペンタノイルクロリドを、Antonian ら、欧州特許第0 503 454号に従い調製する。リトナビル（1、0.2163 g）とスクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリルクロリド（0.0817 g）を無水DMF （３mL）中50℃で一晩攪拌した。得られた混合物を減圧下で蒸発乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：酢酸エチル中30％テトラヒドロフラン）で直接精製することにより、白色固体のO^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル（1G）(0.1220 g、44%)を回収した。M+H 931.8。

O-アシル化プロテアーゼ阻害剤の脱保護
実施例９． O ^c -(アミノカプロイル)-リトナビル（1B）の合成
実施例１から得たO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-リトナビル（1A）（0.2113 g）を無水塩化メチレン中10% ピペリジン（4 mL）中室温で１時間攪拌した。得られた混合物を減圧下で蒸発乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：クロロホルム中20〜25％メタノール勾配）で直接精製することにより、白色固体のO^c-(アミノカプロイル)-リトナビル（1B）（0.1525 g、91%）を回収した。M+H 834。

実施例10． O ^c -(アミノカプロイル)-サキナビル（2B）の合成
実施例９に記載した条件に従い、実施例２のO-(N-FMOC-アミノカプロイル)-サキナビル（2A）（0.7547 g）からO^c-(アミノカプロイル)-サキナビル（2B）（0.5253 g；89%）を調製した。M+H 784.3。

実施例11． O ^c -(アミノカプロイル)-アンプレナビル（3B）の合成
実施例９に記載した条件に従い、実施例３のO-(N-FMOC-アミノカプロイル)-アンプレナビル（3A）（0.2523 g）からO^c-(アミノカプロイル)-アンプレナビル（3B）（0.1160 g；63%）を調製した。M+H 619.3。

実施例12． O ^c -(アミノカプロイル)-インジナビル（4D）の合成
実施例４で合成したO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-Oⁱⁿ,Nⁱⁿ-イソプロピリジニル-インジナビル（4B）（0.5869 g）を無水塩化メチレン（６mL）中50％トリフルオロ酢酸において室温で一晩攪拌することにより、イソプロピリジニル保護基を除去した。得られた混合物を減圧下で蒸発乾固させ、残留物を塩化メチレンと飽和重炭酸ナトリウム水溶液とに分配した。有機層を分離し、乾燥させた（硫酸ナトリウム）後、蒸発させることにより、薄黄色のフォーム（0.5329g）が得られた。このフォームを無水塩化メチレン（５mL）中５％ピペリジンに溶解させ、一晩攪拌した。溶剤を除去し、灰色がかった白色の残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／１％濃水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール５：１での溶出）で精製することにより、無色油状のO^c-(アミノカプロイル)-インジナビル（4D）（0.2866 g；合計66%）を得た。 M+H 727.5。

別の実験で、実施例４から得たO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-Oⁱⁿ,Nⁱⁿ-イソプロピリジニル-インジナビル（4B）（0.2301 g）を無水塩化メチレン（３mL）中50%トリフルオロ酢酸において室温で２時間攪拌することにより、イソプロピリジニル保護基を除去した。得られた混合物を減圧下で蒸発乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：クロロホルム中５％メタノール）で直接精製することにより、白色フォーム状のO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-インジナビル（4C）（0.1603 g, 70%）を回収した。M+H 949.3。

実施例13． O ^c -(アミノカプロイル)-ネルフィナビル（5C）の合成
実施例５で得たO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-O^ar-TBDMS-ネルフィナビル（5B）(0.1752 g)とフッ化テトラエチルアンモニウム（0.2092 g）を無水THF（10 mL）において室温で２時間攪拌することにより、一工程でTBDMSおよびFMOC保護基の両方を除去した。得られた混合物を減圧下で蒸発乾固させ、塩化メチレンに再溶解し、水、次に飽和塩化ナトリウム水溶液（ブライン）で洗浄した後、蒸発乾固させた。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム中２％〜10％メタノール勾配を用いた溶出により先に流出する物質を除去してから、100％メタノールで生成物を溶出させた）で直接精製することにより、白色フォーム状のO^c-(アミノカプロイル)-ネルフィナビル（5C）（0.0711 g、75%）を回収した。M+H 681.3。

実施例14． O ^c -(アミノカプロイル)-ロピナビル（6B）の合成
シリカゲルクロマトグラフィー（２％水酸化アンモニウムを含有するクロロホルム中10％メタノール）で精製する以外は、実施例９に記載した条件に従い、実施例６のO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-ロピナビル（6A、0.100 g）からO^c-(アミノカプロイル)-ロピナビル（6B）を調製することにより、生成物6B（0.043 g；56%）を得た。M+H 742.2。

これ以外に、塩化メチレンに代わり水中10％ピペリジンにおいて0.300 gの（6A）を反応させ、前記と同様の蒸発およびシリカゲルクロマトグラフィーの実施後、生成物（0.150g；65％）を得た。

活性化ハプテンを生成するためのO-アシル化プロテアーゼ阻害剤のリンカー伸長
実施例15． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビル（1C）の合成
実施例９のO^c-(アミノカプロイル)-リトナビル（1Ｂ）（60.9 mg）、トリエチルアミン（10 μL）、およびスクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリルクロリド（Antonian、同上、17.5 mg）を無水THF (6 mL) において０℃で２時間攪拌した。得られた混合物を減圧下で蒸発乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：酢酸エチル中30％THF）で直接精製することにより、白色固体のO^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビル（38.8 mg、51％）を回収した。M+H 1045.2。

実施例16． O ^c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビル（1D）の合成
最初に、Kopiaら、米国特許第5,667,764号の方法によりジスクシンイミジルテレフタレートを調製した。無水塩化メチレン（８mL）中のジスクシンイミジルテレフタレート（21.6 mg）およびトリエチルアミン（８μL）の溶液を攪拌しながら、これに無水塩化メチレン（８mL）中のO^c-(アミノカプロイル)-リトナビル（1B）（実施例９；48.0 mg）をゆっくり添加した。混合物を室温のアルゴン下で４時間攪拌した。得られた混合物を減圧下で蒸発乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：酢酸エチル中30％THF）で直接精製することにより、白色固体のO^c-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビル（41.6 mg、67%）を回収した。M+H 1079。

実施例17． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル（2C）の合成
シリカゲルクロマトグラフィー精製での溶出液としてクロロホルム中５％〜10％メタノールの勾配を用いた以外は実施例15に記載した条件に従い、実施例10のO^c-(アミノカプロイル)-サキナビル（2B）（52.8 mg）から、O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル（2C）を調製した（48 mg；72%）。M+H 995.3。

実施例18． O ^c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビル（2F）の合成
シリカゲルクロマトグラフィー精製での溶出液としてクロロホルム中２％メタノールを用いた以外は実施例16に記載した条件に従い、実施例10のO^c-(アミノカプロイル)-サキナビル（2B）（11mg）から、O^c-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビル（2F）を調製した（12 mg；83%）。M+H 1029.3。

実施例19． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビル（3C）の合成
攪拌を６時間実施し、シリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液としてクロロホルム中５％メタノールを用いた以外は実施例15に記載した条件に従い、実施例11のO^c-(アミノカプロイル)-アンプレナビル（3B）（104.0mg）から、O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビル（3C）を調製した（80 mg；57%）。M+Na 852.4。

実施例20． O ^c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル（3D）の合成
シリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液としてクロロホルム中４％メタノールを用いた以外は実施例16に記載した条件に従い、実施例11のO^c-(アミノカプロイル)-アンプレナビル（3B）（86.5mg）から、O^c-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル（3D）（70.3 mg；58%）を調製した。M+Na 886.4。

実施例21． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-インジナビル（4E）の合成
攪拌を６時間実施し、シリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液としてクロロホルム中５％から17％まで上昇するメタノール勾配を用いた以外は実施例15に記載の条件に従い、実施例12のO^c-(アミノカプロイル)-インジナビル（4D）（80.0mg）から、O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-インジナビル（4E）を調製した（37.4 mg；36%）。M+H 938.6。

実施例22． O ^c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-インジナビル（4F）の合成
シリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液としてクロロホルム中５％メタノールを用いた以外は実施例16に記載の条件に従い、実施例12のO-(アミノカプロイル)-インジナビル（4D）（90.0mg）から、O^c-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-インジナビル（4F）（61.8mg；51%）を調製した。M+H 972.6。

実施例23． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビル（5D）の合成
シリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液としてクロロホルム中２％から17％まで上昇するメタノール勾配を用いた以外は実施例15に記載の条件に従い、実施例13のO^c-(アミノカプロイル)-ネルフィナビル（5C）（60.0mg）から、O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビル（5D）を調製した（67.2 mg；85%）。M+H 892.5。

実施例24． O ^c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビル（5E）の合成
シリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液としてクロロホルム中５％メタノールを用いた以外は実施例16に記載の条件に従い、実施例13のO-(アミノカプロイル)-ネルフィナビル（5C）（61.8mg）から、O^c-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビル（5E）（43.3mg；52%）を調製した。M+H 926.6。

実施例25． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビル（6C）の合成
シリカゲルクロマトグラフィーによる精製（クロロホルム中５％メタノール）以外は実施例15に記載の条件に従い、実施例14のO^c-(アミノカプロイル)-ロピナビル（6B）（86mg）から、O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビル（6C）を調製した（68 mg；62%）。M+H 953.4。

実施例26． O ^c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビル（6D）の合成
シリカゲルクロマトグラフィーによる精製（酢酸エチル中50％テトラヒドロフラン）以外は実施例16に記載の条件に従い、実施例14のO-(アミノカプロイル)-ロピナビル（6B）（80mg）から、O^c-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビル（6D）（35mg；33%）を調製した。M+H 987.3。

実施例27． O ^c -3-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-プロピオニル]-サキナビル（2I）の合成
実施例38に記載した条件に従い、実施例７のO^c-3-[4'-(カルボキシフェニル)-プロピオニル)]-サキナビル（2H）からO^c-3-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-プロピオニル]-サキナビルを調製した（96%）。M+H 944.5。

実施例28． N-マレイミドプロピオニル-L-グルタミル-(γ-O ^c -サキナビル)-L-アラニン（2P）の合成
トリエチルアミン（202 mg）を含む10mL DMFにおいて、434 mg（1 mmol）のBoc-L-Glu(OBzl)OSu（Bachem）を182 mg (1 mmol) のL-Ala-O^tBu.HClと反応させる。室温で16時間攪拌した後、反応混合物を乾燥するまで回転蒸発させ、残留物を塩化メチレンに再溶解させ、水での洗浄、硫酸ナトリウムでの乾燥後、蒸発乾固させる。残留物を50mLのメタノールに再溶解させ、Parrフラスコに移す。50 mgの10% Pd/C触媒（Aldrich）を添加し、Parr振盪機上のフラスコに40 psi の水素ガスを充填する。水素の消費が認められなくなるまで、混合物を室温で２時間攪拌する。Parrフラスコを空にし、アルゴンガスを充填する。混合物をセライトでろ過し、ろ過物を回転蒸発させることにより、粗Boc-L-Glu-L-Ala-O^tBuを得た。

サキナビル（335 mg）、Boc-L-Glu-L-Ala-O^tBu（187 mg）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（103 mg）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（67.5 mg）、N-エチルモルホリン（57.5 mg）、およびジメチルアミノピリジン（61 mg）を無水THF（５mL）中で一晩攪拌した。反応物を酢酸エチルで希釈してからろ過した。ろ過物を2M HCl、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで洗浄した。有機層を減圧下で蒸発乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：塩化メチレン中５％メタノール）で直接精製することにより、灰色がかった白色のフォーム状のN-t-ブチルオキシカルボニル-L-グルタミル-(γ-O^c-サキナビル)-L-アラニンt-ブチルエステル（2N）（384 mg、75%）を回収した。M+H 1027。

N-t-ブチルオキシカルボニル-L-グルタミル-(γ-O^c-サキナビル)-L-アラニンt-ブチルエステル（2N、3.0 mg）を無水塩化メチレン（0.05 mL）中50％トリフルオロ酢酸で攪拌してから、減圧下で蒸発乾固させた。残留物を無水塩化メチレン（0.1 mL）に溶解させ、トリエチルアミン（1μL）およびスクシンイミジルマレイミドプロピオネート（Ede、TregearおよびHaralambidis, Bioconjugate Chem. 5, 373-378, 1994；0.9 mg）と一緒に30分攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固させ、分取TLC（展開：クロロホルム中25％メタノール）で直接精製することにより、白色固体のN-マレイミドプロピオニル-L-グルタミル-(γ-O^c-サキナビル)-L-アラニン（2P）（1.7 mg、57%）を回収した。M+H 1022.3。

実施例29． N-マレイミドプロピオニル-L-Ala-L-Glu-(γ-O ^c -サキナビル)（2Q）の合成
最初に、L-Ala-O^tBuの代わりにL-Glu(OBzl)-O^tBu（Bachem）、 Boc-L-Glu(OBzl)-OSuの代わりにBoc-L-Ala-OSu（Bachem）を用いて、実施例28のBoc-L-Glu-L-Ala-O^tBuの手順に従い、Boc-L-Ala-L-Glu-O^tBuを合成する。中間体2Nについて実施例28に記載した条件に従い、サキナビル（335mg）とBoc-L-Ala-L-Glu-O^tBu（187mg）からBoc-L-Ala-L-Glu(γ-O^c-サキナビル)-O^tBu（2O）を調製した。M+H 1027。

実施例28に記載した条件に従い、N-t-Boc-L-Ala-L-Glu(γ-O^c-サキナビル)-O^tBu（2O、3.0mg）からN-マレイミドプロピオニル-L-Ala-L-Glu-(γ-O^c-サキナビル)（2Q）を調製した。M+H 1022.3。

実施例30． O ^c -(マレイミド-プロピオニル-アミノカプロイル)-サキナビル)（2M）の合成
実施例10のO^c-(アミノカプロイル)-サキナビル（2B）（0.1098 g）、スクシンイミジルマレイミドプロピオネート（0.048g）およびトリエチルアミン（20μL）を無水塩化メチレン（1.5ｍL）中で45分攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：クロロホルム中４％メタノール）で直接精製することにより、無色油状のO^c-(マレイミド-プロピオニル-アミノカプロイル)-サキナビル（2M）（0.0647g、49％）を回収した。M+H 935.5。

中央ヒドロキシルでのプロテアーゼ阻害剤のアルキル化
実施例31． O ^ar -メトキシエトキシメチル-ネルフィナビル（5M）の合成
28 mg（0.70 mmol）のNaH（油中60％）に１mLのヘキサンを添加した。混合物を室温でアルゴン下に２〜３分攪拌し、ヘキサンをデカントした。残留物に、１mLの新しく蒸留したTHFと、0.5 mLの無水DMFを添加した後、50 mg（0.075 mmol）の固体ネルフィナビルメシレートをいくつかの部分に分けて添加した。アルゴン下で混合物を50℃で45分加熱した後、室温まで冷却させた。反応混合物に、12.5μL（0.10 mmol）の2-メトキシエトキシメチルクロリド（MEMクロリド）を添加してから、室温でアルゴン下に18時間攪拌した。この混合物に、１mLの50 mMリン酸カリウム（pH 7.5）を添加した後、混合物を減圧下で濃縮した。残留物に、25 mLのCHCl₃と15 mLの50 mM リン酸カリウム（pH 7.5）を添加した。有機層を分離し、水相をさらに4 x 25 mLのCHCl₃で抽出した。有機抽出物をすべて一緒にし、乾燥させた（無水Na₂SO₄）後、濃縮した。溶出液としてCHCl₃：MeOH 20：1を用いる分取薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、EM Scienceカタログ番号：5717-7）により、粗生成物を精製することにより、白色固体の43 mg（0.065 mmol、88％）のO^ar-メトキシエトキシメチル-ネルフィナビル（5M）を得た。M+H 656。

実施例32． O ^ar -MEM-O ^c -カルボキシメチル-ネルフィナビル（5N）の合成
14 mg（0.35 mmol）のNaH（油中60％）に１mLのヘキサンを添加した。混合物を室温でアルゴン下に２〜３分攪拌し、ヘキサンをデカントした。残留物に、２mLの新しく蒸留したTHFと、１mLの無水DMFを添加した。１mLの新しく蒸留したTHF中23mg（0.035 mmol）の5Mの溶液を反応混合物に添加した。反応混合物を50℃でアルゴン下に１時間加熱した後、室温まで冷却させた。反応混合物に、500μLの新しく蒸留したTHF中6.5μL（0.043 mmol）のブロモ酢酸t-ブチル（Aldrich Chemical Co.）の溶液を添加してから、反応混合物を室温でアルゴン下に18時間攪拌した。この反応混合物に、１mLの水を添加した後、混合物を減圧下で濃縮した。残留物に、20 mLのCHCl₃と15 mLの水を添加した。有機層を分離し、水相をさらに4 x 20 mLのCHCl₃で抽出した。有機抽出物をすべて一緒にし、乾燥させた（Na₂SO₄）後、濃縮した。溶出液としてクロロホルム中20％メタノールを用いる分取薄層クロマトグラフィー（シリカゲル）で粗生成物を精製することにより、22 mg（0.031 mmol、88％）の白色固体のO^ar-MEM-O^c-カルボキシメチル-ネルフィナビル（5N）を得た。M+H 714。

実施例33． O ^ar -MEM-O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチル)-ネルフィナビル（5O）の合成
実施例38に記載の手順に従うことにより、（5N）から活性化エステル（5O）を調製する。

実施例34． O ^c -(カルボキシメチル)-サキナビル（2AA）の合成
65 mg（1.6 mmol）のNaH（油中60％）に２mLのヘキサンを添加した。混合物を室温でアルゴン下に２〜３分攪拌し、ヘキサンをデカントした。残留物に、２mLの新しく蒸留したTHFと、１mLの無水DMFを添加した。固体のサキナビルメシレート（２、112mg、0.14mmol）を反応混合物にいくつかの部分に分けて添加した。反応混合物を50℃で１時間加熱した後、室温まで冷却させた。反応混合物に、500μLの新しく蒸留したTHF中30μL（0.203 mmol）のブロモ酢酸t-ブチルの溶液を添加してから、反応物を室温でアルゴン下に18時間攪拌した。この反応混合物に、１mLの水を添加した後、混合物を減圧下で濃縮した。残留物に、20 mLの水を添加し、５％リン酸で反応物のpHを６に調節した。反応混合物に25 mLのCHCl₃を添加した。有機層を分離し、水層をさらに4 x 25 mLのCHCl₃で抽出した。有機抽出物をすべて一緒にし、乾燥させた（Na₂SO₄）後、濃縮した。溶出液として20：1のCHCl₃：MeOHを用いるフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）で残留物を精製することにより、68 mg（0.093 mmol、64％）の白色固体のO^c-(カルボキシ-メチル)-サキナビル（2AA）を得た。M+H 729。

実施例35． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチル)-サキナビル（2BB）の合成
実施例38に記載の手順に従うことにより、（2AA）から活性化エステル（2BB）を調製する。

中央ヒドロキシル以外の位置でのプロテアーゼ阻害剤の誘導体化
実施例36． エチルO ^ar -カルボキシプロピル-ネルフィナビル（5H）の合成
ネルフィナビル（５）フェノール(OH^ar)を次のようにして選択的にアルキル化した。すなわち、ネルフィナビル（62.5 mg）と水素化ナトリウム（2.8 mg）を無水DMF（1 mL）において室温で15分攪拌した。4-ブロモ酪酸エチル（27.6 mg、Fluka Chemical Corp.）を添加し、混合物を室温で３時間攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：クロロホルム中３％メタノール）で直接精製することにより、白色固体のエチルO^ar-カルボキシプロピル-ネルフィナビル（5H）（74.7 mg、95%）を得た。M+H 682.4。

実施例37． O ^ar -カルボキシプロピル-ネルフィナビル（5I）の合成
実施例31のエチルO^ar-カルボキシプロピル-ネルフィナビル（5H）（0.1440g）と水酸化リチウム（0.0960g）を50％水性THF（10mL）中で一晩攪拌した。反応混合物を沈降させ（二層）、有機層を分離して減圧下で蒸発乾固させた。サンプルを分取RP-HPLC（C18；45％アセトニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸含有水）で精製することにより、分析用サンプルを得た。残りを乾燥させることにより、白色固体のO^ar-カルボキシプロピル-ネルフィナビル（5I）が得られ、¹H-NMR分光検査法により、かなり純粋な物質であることがわかった（0.1234 g、89%）。M+H 654.3。

実施例38． O ^ar -(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピル)-ネルフィナビル（5J）の合成
実施例37のO^ar-カルボキシプロピル-ネルフィナビル（5I）（0.1210 g、0.185 mmol）、N-ヒドロキシスクシンイミド（0.0426 g、0.37 mmol、２モル当量；Aldrich Chemical Co.）およびエチルジエチルアミノプロピルカルボジイミドヒドロクロリド（0.0710 g、0.37 mmol、２モル当量；Sigma Chemical Co）を10％無水DMF−塩化メチレン（９mL）中で２時間攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固させてから、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：クロロホルム中３％メタノール）、次に分取PR-HPLC（C18；45％アセトニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸含有水）で精製することにより、O^ar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピル)-ネルフィナビル（5J、0.0681 g、49%）が得られた。M+H 751.3。

5I（0.2764 g）を用いる以外は、上記と同じ反応を実施後、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：クロロホルム中３％メタノール）により、油状の粗くはあるが、かなり純粋な生成物（5J、0.3526 g）が得られた。

実施例39． O ^ar -(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ- ^co -グリシル-グリシル-プロピル)-ネルフィナビル（5K）の合成
実施例41の条件に従い、実施例38のO^ar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピル)-ネルフィナビル（5J、0.32 g）からO^ar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ-^co-グリシル-グリシル-プロピル)-ネルフィナビル（5K）が得られた（0.0657 g；32％）。M+H 950.4。

実施例40． N-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-アンプレナビル（3G）の合成
アンプレナビル（３、0.1517 g）とスクシンイミド-オキシカルボニルブチリルクロリド（0.0817 g）を50℃の無水DMF（３mL）中で一晩攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固させてから、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：酢酸エチル中15％THF）で直接精製することにより、白色固体のN-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-アンプレナビル（3G）（0.1395 g、61%）が得られた。M+Na 739.2。スペクトルデータ（¹H-NMR）は、アニリン窒素での官能基化と適合するものであった。

実施例41． N-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ- ^co -グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビル（3H）の合成
(a) 実施例40のN-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-アンプレナビル（3G）（131.5 mg）とグリシル-グリシル-4-アミノ酪酸（43.4 mg、Bachem California Inc., CA）をTHF（５ｍL）中25％ホウ酸塩水溶液（pH10）において７時間攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固させてから、PR-HPLC（C18；45％アセトニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸含有水）で直接精製することにより、白い固体のN-(3-カルボキシプロピルアミノ-^co-グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビル（98.2 mg、65％）を得た。M+H 817.4。

(b) N-(4-カルボキシプロピルアミノ-^co-グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビル（40.9 mg）、N-ヒドロスクシンイミド（11.5 mg）、およびエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（19,2 mg）を塩化メチレン中20％無水DMF（2.5 mL）において５時間攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固させてから、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：クロロホルム中12％メタノール）で直接精製することにより、白いフォーム状のN-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ-^co-グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビル（3H）（37.9 mg、83％）が得られた。M+H 938.4。

プロテアーゼ阻害剤のウレタン誘導体化
実施例42． エチルO ^c -(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル（2J）の合成
サキナビルメタンスルホネート（2、76.7 mg）、イソシアナト酢酸エチル（23.0 mg、Aldrich Chemical Co.）、およびトリエチルアミン （30 μL）を50℃の無水DMF（１mL）において５日間攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固させてから、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出：クロロホルム中５％メタノール）で直接精製することにより、白い固体のエチルO^c-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル（2J）（32.3 mg、40％）を得た。M+H 800.4。

実施例43． O ^c -(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル（2K）の合成
実施例42のエチルO^c-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル（2J）（0.1600 g）と水酸化リチウム（0.0960 g）を50％水性THF（10 mL）中で１時間攪拌した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で蒸発乾固させることにより、白いフォーム状のO^c-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル（2K）（0.1403 g、91%）を得た。M+H 772.3。

実施例44． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチルアミノカルボニル)-サキナビル（2L）の合成
実施例43のO^c-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル（2K）（0.1930 g）、スクシンイミジルテトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（0.1882 g、Aldrich Chemical Co.）およびジイソプロピルエチルアミン（0.15 mL）を無水THF（10 mL）中で一晩攪拌した。HPLC-MSにより、80％の完全反応、生成物ピーク（2L）が明らかになった。M+H 869.3。

実施例45． O ^c -[(4-メトキシカルボニルフェニル)-メチルアミノ- ^co -グリシル-カルボニル]-サキナビル（2W）の合成
実施例43のO^c-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル（2K）（0.1929 g）とスクシンイミジルテトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（0.1505 g）を、ジイソプロピルエチルアミン（0.15 mL）含有の無水テトラヒドロフラン（10 mL）中で一晩攪拌することにより、その場で（2L）を得た。メチル-4-アミノメチルベンゾエート塩酸塩（0.1008 g、Aldrich Chemical Co.）とジイソプロピルエチルアミン（0.15 mL）を添加し、３時間攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固させてから、シリカゲル分取TLC（クロロホルム中50％酢酸エチルおよび２％メタノール）で直接精製することにより、白色固体の2Wを得た（0.1905 g、83％）。M+H 919.4。

実施例46． O ^c -[(4-カルボキシフェニル)-メチルアミノ- ^co -グリシル-カルボニル]-サキナビル（2X）の合成
実施例45のO^c-[(4-メトキシカルボニルフェニル)-メチルアミノ-^co-グリシル-カルボニル]-サキナビル（2W）（0.232 g）をメタノール（10 mL）に溶解させた。水酸化リチウム（0.154 g）と水（2.5 mL）を添加し、反応物を一晩攪拌した。反応混合物を塩化メチレンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発乾固させた。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（２％酢酸を含むクロロホルム中10％メタノール）で精製することにより、白色固体の2Xを得た（0.100 g、44％）。M+H 772.3。

実施例47． O ^c -[4-(スクシンイミド-オキシカルボニル-フェニル)-メチルアミノ- ^co -グリシル-カルボニル]-サキナビル（2Y）の合成
実施例38の条件に従い、実施例46のO^c-[(4-カルボキシフェニル)-メチルアミノ-^co-グリシル-カルボニル]-サキナビル（2X）（85 mg）からO^c-[4-(スクシンイミド-オキシカルボニル-フェニル)-メチルアミノ-^co-グリシル-カルボニル]-サキナビル（2Y）を得た。M+H 1002.3。

実施例48． O ^c -[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-アミノカルボニル]-サキナビル（2U）の合成
５mLの新しく蒸留したDMF中50 mg（65.2μmol）のサキナビルメシレート（２）と９μL（65.1 μmol）のトリエチルアミンを周囲温度で約10分攪拌することにより、透明な溶液を得た。236.1 mg（1.3 mmol）の塩化4-イソシアナトベンゾイルを添加すると、混合物はすぐに赤色に変化した。室温で２時間静置した後、溶液の１μLサンプルを分析用HPLC（Vydac C18カラム、300Å、５μm、4.6 x 250 mm；溶出液Ａ：Millipore水／0.1％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：アセトニトリル／0.1％トリフルオロ酢酸；60分にわたり、Ａ中０％Ｂから、Ａ中60％Ｂまで上昇する勾配）に注入した。226 nmでのクロマトグラフィーの様相から、遊離体（t_r＝45.1分）のほぼ完全な誘導体化、並びに、いくらかの副産物と一緒にウレタン（t_r＝48.3分）の形成が明らかにされた。

分取HPLC（Vydac C18カラム、300Å、15〜20μm、50 x 250 mm；溶出液Ａ：Millipore水／0.1％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：80％アセトニトリル／0.1％トリフルオロ酢酸；140分にわたり、Ａ中０％Ｂから、Ａ中70％Ｂまで上昇する勾配）により、上記混合物から22 mgの粗生成物を単離した。約62〜65％Ｂで溶出する適切な画分をプールし、凍結乾燥させてから、第２のクロマトグラフィー工程（改変勾配：120分にわたり、Ａ中０％Ｂから、Ａ中75％Ｂまで上昇する勾配）に供した。画分16および17から10 mg（18％）のやや赤みを帯びた純粋な生成物が得られた。精製したカルボン酸中間体2TのMALDA-TOF MS。M+H 834、M + Na 856。

10 mg（12μmol）のO^c-(4-カルボキシフェニルカルボニル)-サキナビル（2T）を500μLの新しく蒸留したDMFに溶解させ、1.7 mg（15 μmol）のN-ヒドロキシクスシンイミド（NHS）と2.9 mg（15μmol）のエチル-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（EDC）を添加した。溶液を室温でアルゴン下に５時間攪拌した後、1.7 mg（15μmol）のNHSと2.9 mgのEDCを再度添加した。混合物をさらに攪拌し、室温で2.5日間反応させた。HPLCから、NHSエステル2Uの形成が明らかにされ、これは、単離せずに、後続の反応に用いた。

実施例49． エチルO ^c -(カルボキシメチルアミノカルボニル)-O ^ar -TBDMS-ネルフィナビル（5P）の合成
実施例５のO^ar-TBDMS-ネルフィナビル（5A）（0.102 g）、イソシアナト酢酸エチル（42μL）、およびトリエチルアミン（55μL）を50℃の無水DMF（２mL）中で3.5日間攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固させてから、最初にシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム中２％メタノール）、次に、分取RP-HPLC（C18）（60％アセトニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸含有水／30分、70％アセトニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸含有水まで30分かけて上昇）による精製によって、出発物質5A（0.0503 g；43%）を回収した後、適切な画分の凍結乾燥により生成物5P（0.0623 g；45％）を得た。M+H 811.4。

実施例50． O ^c -(カルボキシメチルアミノカルボニル)-ネルフィナビル（5Q）の合成
3.5 mLのテトラヒドロフラン−水１：１中の実施例49のエチルO^c-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-O^ar-TBDMS-ネルフィナビル（5P）（56.5 mg）を50 mgの水酸化リチウムで処理して、反応物を４時間攪拌した。これらの層を沈降させ、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させてから、蒸発させた。残留物をアセトニトリル（５mL）に十分に再溶解させ、ろ過した後、分取RP-HPLC（C18）（0.1％トリフルオロ酢酸含有水中35％アセトニトリル）による精製によって、O^ar-脱保護された生成物5Q（24.3 mg；52％）を得た。M+H 669.2。

実施例51． O ^c -[(3-カルボキシプロピル)アミノ- ^co -グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル]-ネルフィナビル（5R）の合成
実施例50のO^c-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-ネルフィナビル（5Q）（20.4 mg）、スクシンイミジルテトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（12.0 mg）、およびジイソプロピルエチルアミン（８μL）を無水THF（1.5 mL）中で5.5時間攪拌した。LC/MSにより、いくらかの出発物質と一緒に対応するNHSエステルの存在が認められた。グリシル-グリシル-4-アミノ酪酸（7.0 mg）、次に、50 mMリン酸バッファー（pH 10）を添加して、透明な溶液とした。一晩攪拌した後、反応物を約１mLまで濃縮し、乳濁した残留物をアセトニトリルで希釈し、超音波処理することにより、透明な溶液が得られたが、これを分取RP-HPLC（C18）（水中30％アセトニトリルを30分、水中30％〜45％アセトニトリルを30分、水中45％〜90％アセトニトリルを30分；これらはすべて0.1％トリフルオロ酢酸を含む）で精製することにより、凍結乾燥後、主ピークからの生成物5R（12.6 mg；48％）を得た。M+H 868.4。

実施例52． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ- ^co -グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル)-ネルフィナビル（5S）の合成
実施例41(b)の条件に従って、実施例51のO^c-[(3-カルボキシプロピル)アミノ-^co-グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル]-ネルフィナビル（5R）から、O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ-^co-グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル)-ネルフィナビル（5S）を合成する。M+H 964.4。

プロテアーゼ阻害剤と低分子量標識の結合
実施例53． O ^c -(フルオレセイニル-グリシンアミジル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル（2V）の合成
実施例17のO^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル（2C）（10.0 mg）とフルオレセイニルグリシンアミド（5.0 mg、Molecular Probes、OR）を３％トリエチルアミン−ピリジン（0.1 mL）中で一晩攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固させた後、分取RP-HPLC（C18；50％アセトニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸含有水）で直接精製することにより、O^c-(フルオレセイニル-グリシンアミジル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル（2V；7.6 mg、75％）を得た。M+H 1284.6。

実施例54． O ^c -(フルオレセイニル-グリシンアミジル-ブチリル)-リトナビル（1I）の合成
実施例53に記載の条件に従って、実施例８のO^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル（1G）から、O^c-(フルオレセイニル-グリシンアミジル-ブチリル)-リトナビル（1I）を調製した。M+H 1221.4。

実施例55． O ^c -[4’-(1-ビオチニル-アミノ-3,6-ジオキサ-オクチルアミノ)-テレフタロイル-アミノカプロイル]-インジナビル（4I）の合成
実施例22から得た5.0 mgのO^c-[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル-インジナビル（4F）を5.0 mLの新しく蒸留したDMFに溶解させた。13.6 mgの1-ビオチニルアミノ-3,6-ジオキサ-オクタンアミン（ビオチン-DADOO, Roche Applied Science, カタログ番号1112074-103）と5.6μLのトリエチルアミンを添加し、得られた透明な溶液をアルゴン下で一晩攪拌した。HPLC操作により、20時間後に完全な反応が明らかにされた。DMFをロータベイパー（rotavapor）（１トル圧よりはるかに高真空、30℃水浴）で除去した。残った油状の生成物を0.5 mLのDMSOに溶解させ、ろ過した後、分取HPLCシステム（Vydac C18カラム、300Å、15〜20μm、50 x 250 mm；溶出液Ａ：Millipore水／0.1％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：80％アセトニトリル／0.1％トリフルオロ酢酸；140分にわたりＡ中０％ＢからＡ中60％Ｂまで上昇する勾配）に注入した。純粋な生成物を含む適切な画分をプールし、凍結乾燥させた。MALDA-TOF-MS（M=1231）により構造を確認した。収量：3.5 mg(2.84 μmol、理論的収量の55％)。

実施例56． O ^c -[4'-(1-ビオチニル-アミノ-3,6-ジオキサ-オクチルアミノ)-テレフタロイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル（3J）の合成
前記実施例55に記載した手順で、実施例20の活性化ハプテンO^c-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル-アンプレナビル（3D）を用いて、アンプレナビル−ビオチンコンジュゲート（3J、O^c-[4'-(1-ビオチニル-アミノ-3,6-ジオキサ-オクチルアミノ)-テレフタロイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル）を合成した。MALDI-TOF-MS（M=1123）により構造を確認した。収量：1.8 mg（1.60 μmol、理論的収量の31%）

実施例57． O ^c -[4'-(1-ビオチニル-アミノ-3,6-ジオキサ-オクチルアミノ)-テレフタロイル-アミノカプロイル]-ロピナビル（6G）の合成
前記実施例55に記載した手順で、実施例26の活性化ハプテンO^c-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル-ロピナビル（6D）を用いて、ロピナビル−ビオチンコンジュゲート（6G、O^c-[4'-(1-ビオチニル-アミノ-3,6-ジオキサ-オクチルアミノ)-テレフタロイル-アミノカプロイル]-ロピナビル）を合成した。MALDI-TOF-MS（M=1246）により構造を確認した。収量：0.6 mg（0.48 μmol、理論的収量の10%）

実施例58． O ^c -[4'-(1-ビオチニル-アミノ-3,6-ジオキサ-オクチルアミノ)-テレフタロイル-アミノカプロイル]-リトナビル（1J）の合成
前記実施例55に記載した手順で、実施例22の活性化ハプテンO^c-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル-リトナビル（1D）を用いて、リトナビル−ビオチンコンジュゲート（1J、O^c-[4'-(1-ビオチニル-アミノ-3,6-ジオキサ-オクチルアミノ)-テレフタロイル-アミノカプロイル]-リトナビル）を合成した。MALDI-TOF-MS（M=1338）により構造を確認した。収量：5.4 mg（4.03 μmol、理論的収量の87%）

プロテアーゼ阻害剤とタンパク質の結合
実施例59． N-マレイミドプロピオニル-L-アラニル-L-(γ-O ^c -サキナビル)-グルタミン酸と2-IT改変ウシ血清アルブミンのコンジュゲート（2S）の合成
ウシ血清アルブミン（30 mg）と塩酸2-イミノチオラン（2-IT）（0.5 mg、Pierce Biotechnology Inc., IL）を10 mMリン酸カリウム、0.1 M塩化ナトリウム、1 mM EDTA、pH 8.0（３mL）中に暗所で１時間静置した。10 mMリン酸カリウム、0.1 M塩化ナトリウム、1 mM EDTA、pH 8.0で溶出するPD-10カラム（Amersham-Pharmacia, NJ）でのゲルろ過により、混合物を脱塩した。適切な画分を回収し、pH 7.2に調節した後、メタノール（0.2 mL）に溶解させた実施例29のN-マレイミドプロピオニル-L-アラニル-L-(γ-O^c-サキナビル)-グルタミン酸（2Q）（1 mg）を添加した。混合物を暗所で２時間静置し、エチルマレイミド（0.5 mg, Sigma Chemical Co.）でクエンチした後、PD-10カラム（溶出：10 mMリン酸カリウム、0.1 M塩化ナトリウム、1 mM EDTA、pH 8.0）でのゲルろ過により脱塩した。クーマシーブルータンパク質アッセイ（Bio-Rad Laboratories, CA；改変Bradfordタンパク質アッセイ）によるタンパク質定量化から、4.3 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかにされた。UV差分光法により、ハプテンとBSAの比が１：１であることがわかった。

実施例60． N-マレイミドプロピオニル-L-グルタミル-(γ-O ^c -サキナビル)-L-アラニンとSATP-改変KLHのコンジュゲート（2R）の合成
キーホールリンペットヘモシアニン（CALBIOCHEM, CN Biosciences, サンディエゴ、CA；65％硫酸アンモニウム中のスラリー）を50 mMリン酸カリウムバッファー（pH 7.5） (＞８回のバッファー取替え；希釈率10¹⁰以上) に対して室温で（２〜３回のバッファー取替え）、次に４℃で十分に透析した。滞留物をほぼ乾燥するまで凍結乾燥させてから、適量の50 mMリン酸塩で再構成することにより、比較的高濃度の精製KLHが得られた。精製KLHの未使用部分を凍結し、必要になるまで−20℃で保存した。

精製されたキーホールリンペットヘモシアニン（20 mg）とN-スクシンイミジルS-アセチルチオプロピオネート（SATP、10 mg、Pierce Biotechnology, Inc.）を50 mM リン酸カリウム、１mM EDTA（pH 7.5）中に１時間静置し、50 mMリン酸カリウム、１mM EDTA（pH 7.5）で溶出するPD-10カラム（Amersham-Pharmacia）でのゲルろ過により脱塩した。誘導体化タンパク質（10 mg）を暗所にて50 mMリン酸カリウム、2.5 mM EDTA、50 mM塩酸ヒドロキシルアミン（pH 7.5）中で２時間静置した後、ゲルろ過（溶出：50 mM リン酸カリウム、5 mM EDTA、pH 7.2）により脱塩した。DMSO（1 mL）に溶解させた実施例28のN-マレイミドプロピオニル-L-グルタミル-(γ-O^c-サキナビル)-L-アラニン（2P）（６mg）を添加し、反応物を16時間攪拌した。エチルマレイミド（0.5 mg）を添加してから、反応物を８時間攪拌した。混合物を50 mMリン酸カリウム（pH 7.5）中の30%、20%、10%および０％DMSO に対して室温で順次透析した後、50 mMリン酸カリウム（pH 7.5）に対し４℃で透析した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、1.6 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。UV差分光法では、ハプテンによる25%までのリシン置換が示された。

実施例61． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビルとBSAのコンジュゲート（2D）の合成
ウシ血清アルブミン（30 mg）と実施例17のO^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル（2C）（１mg）を室温で50 mMリン酸カリウム（pH 7.5）（1.5 mL）中の30% DMSO中にて２日間攪拌した。混合物を１Lの50 mMリン酸カリウム（pH 7.5）中30%、20%、10%および０% DMSOに対し室温で順次透析した後、１Lの50 mMリン酸カリウム（pH 7.5）に対し４℃で透析した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、10.4 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。UV 差分光法により、ハプテンとBSAの比が１：１であることがわかった。

実施例62． O ^c -[(4’-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビルとBSAのコンジュゲート（2G）の合成
実施例61に記載の条件に従い、ウシ血清アルブミン（30 mg）と実施例18のO^c-[(4’-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビル（2F）（１mg）から、O^c-[(4’-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビル−BSAコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、10.4 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。UV 差分光法により、ハプテンとBSAの比が１：１であることがわかった。

実施例63． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビルとKLHのコンジュゲート（2E）の合成
実施例61に記載の一般的条件に従い、精製済キーホールリンペットヘモシアニン（30 mg）と実施例17のO^c-(-スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル（2C）（10 mg）から、O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル−KLHコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、10.9 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS, Sigma Chemical Co.）比色分析アッセイによるアミン定量から、60％のリシン改変が明らかになった。

実施例64． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビルとLPHのコンジュゲート（1E）の合成
実施例61に記載の一般的条件に従い、カブトガニヘモシアニン（LPH、30 mg；Sigma Chemical Co.）と実施例15のO^c-(-スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビル（1C）（７mg）から、O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビル−LPHコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、7.9 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。TNBS比色分析アッセイによるアミン定量から、26％のリシン改変が明らかになった。

実施例65． O ^c -[(4’-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビルとBSAのコンジュゲート（1F）の合成
実施例61に記載の条件に従い、ウシ血清アルブミン（30 mg）と実施例16のO^c-[(4’-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビル（1D）（１mg）から、O^c-[(4’-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビル−BSAコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、10.3 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。TNBS比色分析アッセイにより、ハプテンとBSAの比が２：１であることがわかった。

実施例66． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビルとKLHのコンジュゲート（1H）の合成
実施例61に記載の一般的条件に従い、精製済キーホールリンペットヘモシアニン（30 mg）と実施例８のO^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル（1G）（10 mg）から、O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル−KLHコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、11.9 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。TNBS比色分析アッセイによるアミン定量は、60％のリシン改変を示した。

実施例67． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビルとKLHのコンジュゲート（3E）の合成
実施例61に記載の一般的条件に従い、精製済キーホールリンペットヘモシアニン（30 mg）と実施例19のO^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビル（3C）（８mg）から、O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビル−KLHコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、6.8 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。TNBS比色分析アッセイによるアミン定量により、20％のリシン改変がわかった。

実施例68． O ^c -[(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ブチリル-アミノカプロイル]-インジナビルとKLHのコンジュゲート（4G）の合成
実施例61に記載の一般的条件に従い、精製済キーホールリンペットヘモシアニン（30 mg）と実施例21のO^c-[(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-アミノカプロイル]-インジナビル（4E）（９mg）から、O^c-[(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ブチリル-アミノカプロイル]-インジナビル−KLHコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、7.4 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。TNBS比色分析アッセイによるアミン定量では、20％のリシン改変を示した。

実施例69． O ^c -[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビルとBSAのコンジュゲート（3F）の合成
実施例61に記載の一般的条件に従い、ウシ血清アルブミン（30 mg）と実施例20のO^c-[(4’-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル（3D）（１mg）から、O^c-[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル−BSAコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、11.5 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。UV差分光法により、ハプテンとBSAの比２：１がわかった。

実施例70． O ^c -[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ベンゾイル)-アミノカプロイル]-インジナビルとBSAのコンジュゲート（4H）の合成
実施例61に記載の一般的条件に従い、ウシ血清アルブミン（30 mg）と実施例22のO^c-[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル（4F）（１mg）から、O^c-[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ベンゾイル)-アミノカプロイル]-インジナビルBSAコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、10.8 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。UV差分光法により、ハプテンとBSAの比が２：１であるとわかった。

実施例71． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビルとKLHのコンジュゲート（5F）の合成
実施例61に記載の一般的条件に従い、精製済キーホールリンペットヘモシアニン（30 mg）と実施例23のO^c-[(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビル（5D）（９mg）から、O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビル−KLHコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、9.7 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。TNBS比色分析アッセイによるアミン定量化では、36％のリシン改変を示した。

実施例72． O ^c -[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビルとBSAのコンジュゲート（5G）の合成
実施例61に記載の一般的条件に従い、ウシ血清アルブミン（30 mg）と実施例24のO^c-[(4’-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビル（5E）（１mg）から、O^c-[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビルBSAコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、10.9 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。UV差分光法では、ハプテンとBSAの比が２：１であるとわかった。

実施例73． O ^ar -(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ- ^co -グリシル-グリシル-プロポキシ)-ネルフィナビルとKLHのコンジュゲート（5L）の合成
実施例61に記載の一般的条件に従い、キーホールリンペットヘモシアニン（30 mg）と実施例39のO^ar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ-^co-グリシル-グリシル-プロポキシ)-ネルフィナビル（5K、10 mg）から、O^ar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ-^co-グリシル-グリシル-プロポキシ)-ネルフィナビル−KLHコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、14.6 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。TNBS比色分析アッセイによるアミン定量化では、57％のリシン改変を示した。

実施例74． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビルとKLHのコンジュゲート（6F）の合成
実施例61と同様に、キーホールリンペットヘモシアニン（40 mg）と、50 mMリン酸カリウム（pH 7.5）（3.4 mL）中の40％ジメチルスルホキシドにおける実施例25のO^c-[(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビル（6C）（16 mg）から、O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビルKLHコンジュゲートを調製した。これを50 mMリン酸カリウム（pH 7.5）中の40％、30%、20%、10%および０％DMSO に対し室温で順次透析した後、50 mMリン酸カリウム（pH 7.5）に対し４℃で透析した。。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、6.9 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。アミン定量化では、38％のリシン改変を示した。

実施例75． O ^c -[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビルとBSAのコンジュゲート（6E）の合成
実施例61に記載の一般的条件に従い、ウシ血清アルブミン（93 mg）と実施例26のO^c-[(4’-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビル（6D）（３mg）から、O^c-[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビル−BSAコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、11.1 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。UV差分光法では、ハプテンとBSAの比が２：１であるとわかった。

実施例76． N-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ- ^co -グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビルとKLHのコンジュゲート（3I）の合成
実施例61に記載の一般的条件に従い、精製済キーホールリンペットヘモシアニン（30 mg）と実施例41のN-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ-^co-グリシル-グリシル-グリタリル)-アンプレナビル（3H）から、N-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ-^co-グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビル−KLHコンジュゲートを調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量化から、8.7 mg/mLでのタンパク質の量的回収が明らかになった。TNBS比色分析アッセイによるアミン定量では、40％のリシン改変を示した。

プロテアーゼ阻害剤に対する抗体の作製
実施例77． サキナビルKLH免疫原に対する抗体応答
サキナビルKLH（2E）を用いて、C57ブラックおよびスイスウェブスターの２系統のマウスを免疫化した。免疫化の用量および経路は、両系統のマウスについて同じとした。免疫化スケジュールを表１に記載する。

最後の免疫化から13日後、眼窩後採血により各マウスから血液サンプルを採取した。この血液をただちに遠心分離し、血清を取り出し、0.02％チメロサール防腐剤を含むリン酸緩衝食塩水で10倍希釈してから、マイクロバイアルに保存した。

翌日、ELISAを実施して、存在する抗体の力価を確認した。ELISAは、各種のサキナビル−BSAコンジュゲートでコーティングしたマイクロタイタープレートから構成され、その濃度はすべて重炭酸塩バッファー中１μg/mLであった（0.1 M、pH 9.6、100μL/ウェル、4℃で一晩）。コーティングした後、プレートを空にし、Trisバッファー、１％ゼラチン加水分解物、２％スクロースおよび0.17％ TWEEN-20乳化剤（ICI Americas, Inc）からなる後コーティング溶液を200μL添加した。これを37℃で１時間インキュベートすることにより、ウェルの非コーティング領域をすべてブロックした。1000倍へのプレ希釈を行い、その後各カラムを１：３の比で連続的に希釈することにより、血清を試験した。各ウェルにおける希釈血清の量は100μlで、これを加湿容器に入れて37℃で１時間20分インキュベートした。次に、プレートをリン酸緩衝食塩水で洗浄し、100μLのヤギ抗マウスIgG-HRP（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）コンジュゲート（Zymed, Inc.、PBSで1:5000に希釈）を各ウェルに添加した。再度同じ条件下でプレートを２時間インキュベートしてから、また洗浄した。各ウェルに100μLのK-BLUE SUBSTRATE（Neogen Corporation）を添加し、室温の暗所で30分インキュベートして発色させた。各ウェルに100μLの1N HClを添加することにより発色を停止させた。各プレートの光学密度を450 nmにてマイクロプレートリーダーで読み取り、コンピューターに入力した。

免疫原と同じリンカー構造および位置を有するサキナビル−BSAコンジュゲート2Dに関して試験した際の血清力価は、それ以外のコンジュゲートより実質的に高かったが、このことは、ポリクローナル抗体集団にある程度のリンカー認識があることを示している。図15に示すように、力価は、リンカーの構造および位置が免疫原とは違ってくるほど低下した。図15は、サキナビルコンジュゲート2G、2W、2Dおよび2Sを用いたマウス#333血清の力価を示すグラフである（注：コンジュゲート2Wの調製は、前出の同時係属出願EP 1 208 394 A 2に実施例Vとして記載されている）。30分時点で読み取った450 nmでの光学密度をＹ軸に、また血清希釈率をＸ軸にプロットする。

これらの分析から、サキナビル−KLHコンジュゲートは、ポリクローナル抗体の産生に使用する上で好適であり、従って、モノクローナル抗体の作製にも使用できることが明らかである。

実施例78． サキナビルに対するモノクローナル抗体の作製
雌のスイスウェブスターマウス（少なくとも生後３ヶ月）を用いて免疫化した。KLH免疫原2Eを50％完全フロイントアジュバント、50％食塩水中に最終濃度0.75 mg/mlで乳化させた。各マウスに２回、すなわち、後腿部に10μlを皮下注射し、腹腔内に90μlを注射した。25日後、フロイント不完全アジュバントを用いると共に１mg/mlの濃度で、マウス１匹当たりの合計量を0.1mlとして、同様の注射を同じ経路で実施した。13日後、各マウスを眼窩後採血することにより、分析用の血清サンプルを取得した。49日後に、２回目の処方と同じく、３回目の免疫化を実施した。融合に用いるために選択されたマウスには、13日後、2回目および３回目の注射と同様に、追加免疫を実施した。４日後、マウスを細胞融合のために用いて、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製した。

免疫原と相同のリンカーを特徴とするコンジュゲート2Dは、最も優れた血清抗体の結合効力を示した。結合は、コンジュゲートリンカーの、免疫原のそれに対する相同性の程度と直接関係した。結合効力は、強いものから弱いものへの順に、2D＞2G＞2S＞2Wであった。前記の血清抗体の分析で行った観察結果に基づいて、リンカー相同性の効果を識別することができ、リンカー選択をほとんどまたはまったく示さないクローンだけを選択する、上記研究の融合段階でモノクローナル抗体をスクリーニングするための戦略を案出することが決定された。

この戦略は、２つの方法を特徴とする。第１に、前記分析により、血清抗体の最大結合より低い結合をもたらすことがわかったリンカーを用いて、抗体結合を試験する。第２に、同じコンジュゲートをコーティングした第２のウェル（400 ng/mLの遊離薬剤が含まれる）を用いて、結合に関する該薬剤の競合作用を評価する。この結果、遊離薬剤（すなわち、リンカーが結合されていない）と競合的に結合したモノクローナル抗体だけを選択することが可能になる。

融合用に選択したマウスを瀉血により死滅させた。膝窩、鼠径部、鎖骨下および深部鼠径リンパ節および脾臓を摘出し、プールした。組織を２枚の滅菌スライドガラスではさみ、リンパ球を放出させた。得られたリンパ球懸濁液の半分を用いて、F0骨髄腫細胞系（ATCC CRL 1646）と融合させ、残りの半分をP3骨髄腫（いずれの骨髄腫もATCCから入手）と融合させた。

融合は、リンパ球への骨髄腫細胞（リンパ球数の1/5）の添加、遠心分離による洗浄、無血清の温イスコーブ改変ダルベッコ培地（IMDM）、並びに再遠心分離からなる。得られたペレットを含む遠心分離管を軽くたたくことにより、細胞同士を離れさせてから、１mLの保温したPEG/DMSO溶液（Sigma Chemicals）を穏やかに混合しながらゆっくりと添加した。細胞を1.5分間保温してから、予熱しておいた無血清IMDMを次の速度：１ml/分、２ml/分、４ml/分、10 ml/分で添加して、管に50 mlまで充填し、密封した後、15分インキュベートした。細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカントした後、10％ウシ胎児血清を含むIMDMを添加した。細胞を再度遠心分離し、完全クローニング培地中に再懸濁させた。これは、IMDM、10％FCS、10％Condimed H1（Roche Molecular Systems）、４mMグルタミン、50μM 2-メルカプトエタノール、40μMエタノールアミン、pen/strep抗生物質からなるものであった。細胞を4 x 10⁵リンパ球／mlの密度で懸濁させ、滅菌した96-ウェルミクロ培養プレートに100μL/ウェルで配分した後、５％CO₂において37℃で24時間インキュベートした。翌日、100μLのヒポキサンチン−メトトレキセート−チミジン（HMT）選択培地（クローニング培地＋１：25 HMT補充物（Sigma Chemicals製））を添加した。インキュベートしてから６日目に、軽い真空源に接続された滅菌８箇所マニフォールドを用いて、各ウェルから約150μLの培地を抜き取った。次に、150μLのヒポキサンチン−チミジン（HT）培地を添加した。これは、クローニング培地＋１：50 HT補充物（Sigma Chemicals製）からなる。プレートをインキュベーターに戻し、増殖の徴候について毎日検査した。増殖が十分であると判断された場合には、ELISAにより抗体産生についてウェルをスクリーニングした。

0.1 M炭酸バッファー（pH 9.5）中１μg/mLのサキナビル−BSAコンジュゲート100μLで、マイクロプレートを37℃で（加湿）１時間コーティングした。次に、プレートを空にし、後コーティング溶液を充填した。プレートを37℃で（加湿）さらに１時間インキュベートした後、0.1％TWEEN 20含有のリン酸緩衝食塩水で洗浄した。次に、0.15M Tris（pH 7.2〜7.4）中の２％スクロース溶液をプレートに手早く充填した後、空にして、室温で空気乾燥させた。乾燥したら、乾燥剤ピロー袋をいくつか入れたジップロックバッグにプレートをパックし、密封して、使用するまで４℃で保存した。

増殖中のクローンを試験できると判断した場合には、ウェルから25μLの上清を取り出し、96ウェルの軟質プレートに移した。培地を各ウェルに添加することにより、培地サンプルの１：10希釈物を得た。２つのサキナビル−BSAコーティングウェルを、試験しようとする各培養ウェルに用いた。一方のウェルには50μLのPBSバッファーを入れ、他方には、800 ng/mlの濃度でサキナビル薬剤を含む50μLのPBSを入れた。50μLの希釈サンプルを両コーティングウェルの各々に移した。プレートを37℃で１時間インキュベート（被覆）した後、PBS-TWEENで洗浄した。次に、PBS-TWEENで１：5,000希釈したヤギ抗マウスIgG-HRPコンジュゲート（Zymed Labs）100μLをウェルに充填してから、プレートをさらに１時間インキュベートした。次にプレートを再度洗浄し、100μLのK-BLUE SUBSTRATE（Neogen Corp）を各ウェルに添加した。これを５〜15分間発色させ、100μLの1N HClの添加により反応を停止させた。マイクロプレートリーダーにより450 nmで色を読み取り、コンピューターにより収集して分析した。選択基準は、サキナビル−BSAコンジュゲートとの結合、並びに遊離薬剤による第２ウェルにおける結合の顕著な阻害であった。

融合培養プレートからのクローンの選択後、細胞を限界希釈による厳密なクローニングに供した。次に、顕微鏡検査により単一細胞が確認されたウェルから増殖するサブクローンを前記の方法により再試験した。抗体を示すウェルの数、結合のレベル、並びに増殖は示すが抗体をほとんどまたは全く示さないウェルの存在について、抗体発現の安定性を判断した。これらのうちいずれかが認められたら、高い抗体分泌を示すウェルを用いて、厳格なサブクローニングを繰り返した。これを必要に応じて繰り返すことにより、等量の抗体を分泌するサブクローンを100％取得した。選択したウェルからの細胞を培養して増やし、これらを用いて予備細胞バンクを用意した。その後、これらの培養物から得た上清を特異性分析に供した。

増やした培養物からの抗体含有培養上清を下記の手順により特異性分析に供した。第１に、希釈分析により、分析に適した力価を決定した。最大結合の約50％を達成する抗体の希釈率を選択して次のステップに進んだ。第２に、６種のプロテアーゼ阻害剤の可変量を存在させて、サキナビル−BSAコンジュゲートとの結合を前記抗体希釈率で試験した。データは、４パラメーターロジスティック関数にフィットする非線形回帰曲線による分析に供した。遊離薬剤の不在下での結合の50％に相当する遊離薬剤の濃度を表すパラメーターを該薬剤のED₅₀と称する。従って、抗体の特異性は、コグネート薬剤であるサキナビルのED₅₀、すなわちsaq ED₅₀を、下記の式（この例ではネルフィナビルのデータを使用）に従いデータからフィットされたその他の薬剤の値と比較することによって表すことができる：

使用した４パラメーターロジスティック関数を以下に示す：

上記式中、Ｓは曲率パラメーターであり、ODmaxは、薬剤濃度が０のときの光学密度であり、ODminは、装置のバックグラウンドの光学密度であり、ODxは、モル／リットル（M/l）で表した薬剤濃度Ｘで観察された光学密度である。

この分析による２つの抗サキナビル抗体の交差反応性を表３に示す。マウスハイブリドーマSAQ 10.2.1およびSAQ 14.1.1は、2002年１月18日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託し、それぞれATCC番号PTA-3973およびPTA-3974を与えられた。

実施例79． ネルフィナビルに対するモノクローナル抗体の作製
ネルフィナビルに対するモノクローナル抗体の作製に用いる手順は、サキナビルに用いたものと同様である。生後８週間の雌Balb/cマウスを、完全フロイントアジュバントで乳化させた100μgのコンジュゲート5Fで腹腔内注射により免疫化した。21日後、不完全フロイントアジュバントを用いて、同じ用量でもう一度免疫化した。さらに、約21日の間隔で、同じ用量を用いるがアジュバントをリビ（Ribi）アジュバントに代えて４回の注射を実施した。アジュバントはすべてSigma Chemical Co. から入手した。

最後の注射から４日後、マウスを瀉血および頚部脱臼により死亡させた。脾細胞を採取し、サキナビルと同じ手順によりF0骨髄腫系と融合させた。培養および供給も同じにした。

増殖ハイブリドーマのスクリーニングは、サキナビル−BSAおよび遊離サキナビルに代わり、それぞれネルフィナビル−BSA（5G）および遊離ネルフィナビルを用いた以外はサキナビルと同様に行なった。表４は、このようにして得られたスクリーニングデータの一部を示す。

安定性を確認するための手順をサキナビルモノクローナル抗体と同じ方法により実施した。同じ薬剤パネルを用い、ネルフィナビルによる競合結合を100％とみなして、特異性分析を行なった。表５は、表４に示す系列のサブクローンの特異性を示す。

マウスハイブリドーマNEL 5.4.1は、2002年６月25日にAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託し、ATCC番号PTA-4475が与えられた。

実施例80． インジナビルに対するモノクローナル抗体の作製
生後12週間の雌Balb/cマウスに対し、アジュバントCFA（完全フロイントアジュバント）と一緒に100μgインジナビルKLHコンジュゲート4Gを用いて一次腹腔内免疫化を実施した。６週間後、１ヶ月置きにさらに３回の腹腔内免疫化を実施した。その際、各マウスには、IFA（不完全フロイントアジュバント）と一緒に100μgインジナビルKLHコンジュゲート4Gを投与した。その後、融合の前々日および前日に、PBSバッファー中の100μgインジナビルKLHコンジュゲート4Gで最後の免疫化を静脈内に実施した。

前記のように免疫化したマウスの脾細胞をGalfre, Methods in Enzymology, Vol. 73, 3 (1981)に従って骨髄腫細胞と融合させた。免疫化マウスの約1 x 10⁸個の脾細胞を2 x 10⁷個の骨髄腫細胞（P3X63-Ag8-653、ATCC CRL 1580）と混合し、遠心分離した（300 Gおよび室温で10分）。次に、細胞をウシ胎児血清（FCS）を含まないRPMI 1640倍地で１回洗浄し、50 mLコニカルチューブに入れて400 Gで再度遠心分離した。次に、1 mL PEG （ポリエチレングリコール、分子量4000、Merck, Darmstadt）を添加し、穏やかな振盪により混合した。37℃の水浴中で１分後、FCSを含まない５mLのRPMI 1640を滴下しながら添加し、混合して、培地（RPMI 1640）を加えて30 mLにした後、遠心分離した。10 % FCSを含むRPMI 1640中に沈降した細胞を回収し、ヒポキサンチン−アゼセリン選択培地（RPMI 1640 + 10 % FCS中の100 mmol/l ヒポキサンチン、１μg/mLアゼセリン）にプレートした。増殖因子としてマウス由来のインターロイキン６（Roche Diagnostics GmbH、カタログ番号：1 444 581、50 U/ml）を培地に添加した。

約11日後、特異的抗体の合成について一次培養物を試験した。インジナビルとの陽性反応を示すが、サキナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよびアンプレナビルとの交差反応は全く示さない一次培養物をセルソーターにより96ウェル細胞培養プレートにおいてクローン化した。

表６に挙げる寄託された細胞系／クローンはこのようにして取得した。2002年6月18日に、マウスハイブリドーマ<INDIN>M 1.003.12および<INDIN>M 1.158.8をDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)に寄託し、それぞれDSM番号ACC2547およびACC2546が与えられた。

ハイブリドーマ細胞の培養上清に含まれる抗体の特異性を調べるために、組換えストレプトアビジン（MicroCoat Co. Penzberg, カタログ番号：148051001）をコーティングしたマイクロタイタープレートに500 ng/mLのインジナビル−ビオチンコンジュゲート4I（１ウェル当たり100μL、PBS/1.0％CROTEIN C/0.1％TWEEN 20で希釈；４℃で一晩インキュベーション）をコーティングした後、0.9％NaCl/0.1％TWEEN 20で３回洗浄した（CROTEIN Cは、加水分解コラーゲンタンパク質に対するCroda Colloids, Ltdの商標である）。

次に、100μg/mLのビオチンを用いたインキュベーション（１時間；振盪しながら室温で）により、遊離ストレプトアビジン結合部位をブロックした後、0.9 % NaCl/0.1 % TWEEN 20で３回洗浄した。

次に、交差反応について試験しようとする被検体50μLを０〜25μg/mLの濃度系列（PBSと1.0％CROTEIN C、0.1％TWEEN 20で希釈）で、試験すべき抗体溶液（培養上清）50μLと一緒に、コーティングしたウェルに添加し、室温で振盪しながら１時間インキュベートした。0.9％塩化ナトリウム／0.1％TWEEN 20で３回洗浄した後、マウスFc（pab＜マウスFc γ＞S-Fab-POD、Roche；25 mU/ml）に対するヒツジ由来のポリクローナル抗体のセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識Fabフラグメント100μLを、サンプルからの結合抗体を検出するために各ウェルに添加し、室温で振盪しながら１時間インキュベートした後、0.9％塩化ナトリウム／0.1％TWEEN 20で３回洗浄した。

最後に、100μL／ウェルのABTS溶液（Roche Diagnostics GmbH、カタログ番号：1684302）を添加し、30分後室温にて、TECAN製のSLTスペクトルイメージマイクロプレート読取装置で405/492 nmでの吸光度を測定した。

前記の試験系を用いて、モノクローナル抗体<INDIN> M 1.158.8および<INDIN> M 1.003.12が、10％に満たないインジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、およびアンプレナビルとの交差反応を示すことがわかった。図17に、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、およびアンプレナビルとのmab <INDIN> M 1.158.8 およびmab <INDIN> M 1.003.12の交差反応のグラフを示す。

実施例81． アンプレナビルに対するモノクローナル抗体の作製
実施例80に記載した免疫化、融合、培養、およびクローニング方法を用いて、アンプレナビルに対するモノクローナル抗体を作製した。O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビルとKLHのコンジュゲート（3E）を免疫原として用いた。

アンプレナビル−ビオチン（3J）を用いて、ELISAスクリーニングを実施した。2003年9月16日にマウスハイブリドーマ<AMPREN>M 1.1.52をDSMZに寄託し、DMS番号ACC 2612が与えられた。

実施例80に記載したように特異性を調べた。モノクローナル抗体<AMPREN>M 1.1.52は、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビルおよびロピナビルとの交差反応が10％に満たないことがわかった。図20に、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビルおよびロピナビルとmab <AMPREN>M 1.1.52との交差反応のグラフを示す。

実施例82． ロピナビルに対するモノクローナル抗体の作製
実施例80に記載した免疫化、融合、培養、およびクローニング方法を用いて、ロピナビルに対するモノクローナル抗体を作製した。O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビルとKLHのコンジュゲート（6F）を免疫原として用いた。

ロピナビル−ビオチン6Gを用いて、ELISAスクリーニングを実施した。2003年9月16日にマウスハイブリドーマ<LOPIN>M 1.1.85をDSMZに寄託し、DMS番号ACC 2611が与えられた。

実施例80に記載したように特異性を調べた。モノクローナル抗体<LOPIN>M 1.1.85は、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビルおよびアンプレナビルとの交差反応が10％に満たないことがわかった。図21に、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビルおよびアンプレナビルとmab <LOPIN>M 1.1.85との交差反応のグラフを示す。

実施例83． リトナビルに対するモノクローナル抗体の作製
実施例80に記載した免疫化、融合、培養、およびクローニング方法を用いて、ロピナビルに対するモノクローナル抗体を作製した。O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビルとLPHのコンジュゲート（1F）を免疫原として用いた。

リトナビル−ビオチン（1D）を用いて、ELISAスクリーニングを実施した。2003年9月16日にマウスハイブリドーマ<RITON>M 1.5.44をDSMZに寄託し、DMS番号ACC 2613が与えられた。

実施例80に記載したように特異性を調べた。モノクローナル抗体<RITON>M 1.5.44は、インジナビル、ネルフィナビル、ロピナビル、サキナビルおよびアンプレナビルとの交差反応が10％に満たないことがわかった。図22に、インジナビル、ネルフィナビル、ロピナビル、サキナビルおよびアンプレナビルとのmab <RITON>M 1.5.44の交差反応のグラフを示す。

実施例84． O ^c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-アタザナビル（7A）の合成
実施例１と同様に、乾燥塩化メチレン（40 mL）中でアタザナビル（７、0.20 g）、FMOC-アミノカプロン酸（0.010 g、１当量）、DCC（0.059 g、１当量）、およびDMAP（0.038 g、１当量）を攪拌することにより、O^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-アタザナビル（7A）を調製したが、ここでは、室温で一晩攪拌後、さらに0.5当量のFMOC-アミノカプロン酸と0.5当量のDCCを添加し、攪拌をさらに３日間継続した。実施例１に記載したのと同様の後処理および精製により、白色固体の生成物（7A）（210 mg；71％）が得られた。M+H 1040.5。

実施例85． O ^c -(アミノカプロイル)-アタザナビル（7B）の合成
実施例９に記載の条件に従い、実施例84のO^c-(N-FMOC-アミノカプロイル)-アタザナビル（7A）（0.092 g）から、O^c-(アミノカプロイル)-アタザナビル（7B）を調製したが、２つのシリカゲルクロマトグラフィー精製（第１カラムでは酢酸エチル（EtOAc）中40％メタノールを用い、第２カラムではEtOAc中20％メタノールを用いた）を実施することにより、固体の生成物（7B）（0.070 g、97％）が得られた。M+H 818.4。

別の実験では、分取RP-HPLC（C18、0.1％TFA含有水中の0.1％TFA含有アセトニトリルの５％から100％までの勾配）による精製後、トリフルオロ酢酸（TFA）塩の形態で7Bを単離した。

実施例86． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アタザナビル（7C）の合成
TFA塩の形態のO^c-(アミノカプロイル)-アタザナビル（7B）（0.070 g）、トリエチルアミン（22μL）、およびスクシンイミド−オキシカルボニルブチリルクロリド（0.0195 g）を乾燥THF中で約０℃（氷水浴）にて３時間攪拌した。反応物を蒸発乾固させ、酢酸エチル中15％THFに再溶解させてから、シリカゲルクロマトグラフィー（EtOAc中30％THFによる溶出；カラムは、数カラム容量のEtOAc中15％THFで前洗浄した）で精製した。生成物を含む画分を一緒にし、蒸発させ、乾燥塩化メチレン（CH₂C₁₂）に再溶解させた後、再蒸発させる（数回繰り返す）ことにより、固体のO^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アタザナビル（7C）（24 mg、31％）を得た。M+H 1029.4。

実施例87． O ^c -[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アタザナビル（7D）の合成
２mLの乾燥DMF中に溶解したO^c-(アミノカプロイル)-アタザナビル（7B、0.054 g）の溶液を、4.5 mLの乾燥DMF中のジクスシンイミジルテレフタレート（0.0228 g）の攪拌冷却溶液（氷水浴）にゆっくりと添加した。手早く攪拌した後、トリエチルアミン（50μL）を添加し、反応物を一晩攪拌した。HPLCによる分析から、反応がほぼ完了したことがわかった。高真空下（25℃より低い温度）での回転蒸発により溶剤を除去し、残留物をアセトニトリル−水に再溶解させ、分取RP-HPLC（C18、0.1％TFA含有水中の0.1％TFA含有アセトニトリルの５％から100％までの勾配）で精製することにより、アセトニトリルの蒸発、さらに凍結および凍結乾燥後の主ピークから、生成物O^c-[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アタザナビル（7D）（トリフルオロ酢酸塩の形態をしている）が２つのカット（0.036 gと0.007 g、合わせて0.043 g、55％）で得られた。M+H 1063.5（遊離塩基）。

実施例88． O ^c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アタザナビルとKLHのコンジュゲート（7E）の合成
反応を40％DMSO中で実施する以外は、実施例61に記載した一般的条件に従い、精製済キーホールリンペットヘモシアニン（60 mg）と実施例86のO^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アタザナビル（7C）（17 mg）からO^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アタザナビル−KLHコンジュゲートを調製した。クーマシーブルータンパク質アッセイによる滞留物のタンパク質定量化から、10.8 mg/mL、92％タンパク質回収（KLH標準／対照）が明らかにされた。TNBS比色分析アッセイによるアミン定量化では、56％のリシン改変が示された。

実施例89． O ^c -[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アタザナビルとBSAのコンジュゲート（7F）の合成
反応を40％DMSO中で実施する以外は、実施例61に記載した一般的条件に従い、ウシ血清アルブミン（100 mg）と、実施例87のTFA塩形態のO^c-[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アタザナビル（7D）（３mg）から、O^c-[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アタザナビル−BSAコンジュゲートを調製した。クーマシーブルータンパク質アッセイによるタンパク質定量化から、10.0 mg/mL（BSA標準／対照）でのタンパク質の量的回収が明らかにされた。UV差分光法では、ハプテンとBSAの比が１：1.7であることがわかった。

O-アシル化リトナビル活性化ハプテン、LPH免疫原およびBSAコンジュゲートの合成スキームを示す。 O-アシル化サキナビル活性化ハプテン、KLH免疫原およびBSAコンジュゲートの合成スキームを示す。 O-アシル化アンプレナビル活性化ハプテン、KLH免疫原およびBSAコンジュゲートの合成スキームを示す。 O-アシル化インジナビル活性化ハプテン、KLH免疫原およびBSAコンジュゲートの合成スキームを示す。 O-アシル化ネルフィナビル活性化ハプテン、KLH免疫原およびBSAコンジュゲートの合成スキームを示す。 O-アシル化ロピナビル活性化ハプテン、KLH免疫原およびBSAコンジュゲートの合成スキームを示す。 別のO-アシル化サキナビルおよびリトナビル活性化ハプテンと、別のリトナビル免疫原の合成スキームを示す。 N-アシル化アンプレナビル免疫原の合成スキームを示す。 O-アシル化ネルフィナビル免疫原の合成スキームを示す。 O-カルバミル化サキナビル活性化ハプテンの合成スキームを示す。 O-カルバミル化サキナビル活性化ハプテンの合成スキームを示す。 O-カルバミル化ネルフィナビル活性化ハプテンの合成スキームを示す。 O-アシル化サキナビルマレイミド活性化ハプテンの合成スキームを示す。 ペプチドリンカーおよびマレイミド末端基を有するO-アシル化サキナビル活性化ハプテンの合成スキームを示す。また、該活性化ハプテンから誘導されたKLH免疫原およびBSAコンジュゲートも示す。 サキナビルおよびリトナビルのフルオレセインコンジュゲートと、インジナビルのビオンチンコンジュゲートの合成スキームを示す。 コンジュゲート2G、2W、2Dおよび2Sを用いて、実施例77で得られた抗体力価を示すグラフである。 実施例77で用いたコンジュゲートの構造を示す。 実施例80に記載するように、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビルおよびアンプレナビルとモノクローナル抗体<INDIN>M 1.158.8およびモノクローナル抗体<INDIN>M 1.003.12との交差反応を示すグラフである。 O^ar-MEMO O^c-スクシンイミド-オキシカルボニルメチル-ネルフィナビルエーテルの合成スキームを示す。 O^c-スクシンイミド-オキシカルボニルメチル-サキナビルエーテルの合成スキームを示す。 実施例81に記載するように、インジナビル、サキナビル、リトナビル、ロピナビルおよびネルフィナビルとモノクローナル抗体<AMPREN>M 1.1.52との交差反応を示すグラフである。 実施例82に記載するように、インジナビル、サキナビル、リトナビル、アンプレナビルおよびネルフィナビルとモノクローナル抗体<LOPIN>M 1.1.85との交差反応を示すグラフである。 実施例83に記載するように、インジナビル、サキナビル、アンプレナビル、ロピナビルおよびネルフィナビルとモノクローナル抗体<RITON>M 1.5.44との交差反応を示すグラフである。 O-アシル化アタザナビル活性化ハプテン、KLH免疫原、およびBSAコンジュゲートの合成スキームを示す。

Claims (17)

1. 以下の構造を有する化合物。
   I-X-(C=Y)_m-L-A
   （式中、Ｉは、HIVプロテアーゼ阻害剤アタザナビルのHIVプロテアーゼ阻害剤基であり、ＸはＯまたはNHであり、ＹはＯ、ＳもしくはNHであり、ｍは０または１であり、Ｌは、飽和または不飽和の直鎖または分枝鎖に配置される０〜40個の炭素原子からなり、さらに2つ以下の環構造と０〜20個のヘテロ原子（ただし、３個以上のヘテロ原子が連続して結合されることはない）を含むリンカーであり、Ａは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、酸無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基およびアルデヒドからなる群より選択される活性化された官能基である。）
2. 化合物O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アタザナビル（7C）。
3. 化合物O^c-[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アタザナビル（7D）。
4. 以下の構造を有する化合物。
   [I-X-(C=Y)_m-L-Z]_n-P
   （式中、Ｉは、HIVプロテアーゼ阻害剤アタザナビルのHIVプロテアーゼ阻害剤基であり、ＸはＯまたはNHであり、ＹはＯ、ＳもしくはNHであり、ｍは０または１であり、Ｌは、飽和または不飽和の直鎖または分枝鎖に配置される０〜40個の炭素原子を含み、さらに2つ以下の環構造と０〜20個のヘテロ原子（ただし、３個以上のヘテロ原子が連続して結合されることはない）を含むリンカーであり、Ｚは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、および
   

   

   からなる群より選択される基であり、Ｐは、ポリペプチド、多糖および合成ポリマーからなる群より選択され、ｎは、Ｐの50キロダルトン分子量当たり１〜50の数である。）
5. 化合物O^c-[4’-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アタザナビルとBSAとのコンジュゲート（7F）。
6. 化合物：O^c-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アタザナビルとKLHとのコンジュゲート（7E）。
7. 以下の構造を有する化合物。
   [I-X-(C=Y)_m-L-Z]_n-Q
   （式中、Ｉは、HIVプロテアーゼ阻害剤アタザナビルのHIVプロテアーゼ阻害剤基であり、ＸはＯまたはNHであり、ＹはＯ、ＳもしくはNHであり、ｍは０または１であり、Ｌは、飽和または不飽和の直鎖または分枝鎖に配置される０〜40個の炭素原子を含み、さらに2つ以下の環構造と０〜20個のヘテロ原子（ただし、３個以上のヘテロ原子が連続して結合されることはない）を含むリンカーであり、Ｚは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、および
   

   

   からなる群より選択される基であり、Ｑは非同位元素標識からなる群より選択され、ｎは、Ｑの50キロダルトン分子量当たり１〜50の数である。）
8. 化合物O^c-[4’-(1-ビオチニル-アミノ-3,6-ジオキサ-オクチルアミノ)-テレフタロイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル（3J）。
9. 化合物O^c-[4’-(1-ビオチニル-アミノ-3,6-ジオキサ-オクチルアミノ)-テレフタロイル-アミノカプロイル]-ロピナビル（6G）。
10. 化合物O^c-[4’-(1-ビオチニル-アミノ-3,6-ジオキサ-オクチルアミノ)-テレフタロイル-アミノカプロイル]-リトナビル（1J）。
11. 化合物O^c-[4’-(1-ビオチニル-アミノ-3,6-ジオキサ-オクチルアミノ)-テレフタロイル-アミノカプロイル]-インジナビル（4I）。
12. サキナビル、ネルフィナビル、インジナビル、リトナビルおよびロピナビルとの交差反応性が10％より小さい、アンプレナビルに特異的なモノクローナル抗体。
13. サキナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、リトナビルおよびインジナビルとの交差反応性が10％より小さい、ロピナビルに特異的なモノクローナル抗体。
14. サキナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、インジナビルおよびロピナビルとの交差反応性が10％より小さい、リトナビルに特異的なモノクローナル抗体。
15. DSMZ番号ACC2612を有するマウスハイブリドーマ<AMPREN>M 1.1.52。
16. DSMZ番号ACC2611を有するマウスハイブリドーマ<LOPIN>M 1.1.85。
17. DSMZ番号ACC2613を有するマウスハイブリドーマ<RITON>M 1.5.44。

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