JP4307252B2 - イムノアッセイにおいて有用なプロテアーゼインヒビターコンジュゲートおよび抗体 - Google Patents
イムノアッセイにおいて有用なプロテアーゼインヒビターコンジュゲートおよび抗体 Download PDFInfo
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Description
本発明は、イムノアッセイにおいて有用な新規プロテアーゼインヒビターコンジュゲートおよび抗体に関する。特に、本発明は、HIVプロテアーゼインヒビターに対する免疫原を作成するのに有用な新規活性化ハプテン、HIVプロテアーゼインヒビターに対する抗体を生成するのに有用な新規免疫原、ならびにHIVプロテアーゼインヒビターについてのイムノアッセイにおいて有用な新規抗体および標識化コンジュゲートに関する。
HIVプロテアーゼインヒビターは、最初のサキナビルが1995年に市場に導入されてから、AIDS患者の医療に有意な影響を与えてきた重要な新しいクラスの薬剤である。他のプロテアーゼインヒビターの例としては、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビル、ロピナビル、およびリトナビルが挙げられる。これらは、逆転写酵素インヒビターまたは他のHIVプロテアーゼインヒビター等の他の抗HIV薬剤と組み合せられると特に効果的である。これらの新規治療投薬計画での著しい成功にも関わらず、プロテアーゼインヒビターの濃度をモニターする治療薬テスト方法があれば、結果がより改善されるであろうという強い指摘がある。全ての患者が、プロテアーゼインヒビター組合せ療法に対して最適に応答するわけではない。実際に応答する患者でさえも、HIVウイルスの突然変異率が周知のごとく高いために、その後、薬剤耐性を発達し得る。しかし、ウイルス量の減少およびCD4細胞数の増加に基づき、プロテアーゼインヒビターの血漿中レベルと治療効力とに明確な関係性があることが示されてきた。１つの問題は、薬剤が広範囲で代謝され、複雑な薬剤-薬剤相互作用に供されるという事実にある。その結果、非常に複雑な薬物動態、および任意の特定の患者についての任意の特定の時間における投薬量と得られる薬剤レベルとの強い予測不可能要素が生じる。治療薬をモニタリングすれば、薬剤投薬量を患者に応じて個別化でき、ウイルスを監視下におく確率がはるかに高くなる。しかし、プロテアーゼインヒビターの日課的な治療薬モニタリングのためには、ハイスループット臨床分析器に適合可能な単純な自動化テストが利用可能である必要がある。プロテアーゼインヒビターの治療薬モニタリングについての現在のほとんどの報告では、遅く、労力が多く、費用のかかるHPLC法を使用している。最近、サキナビル用のラジオイムノアッセイ(RIA)法の報告がなされた(Wiltshireら, Analytical Biochemistry 281, 105-114, 2000)。しかし、このような方法は、ハイスループット治療薬モニタリングには適合可能ではなく、全てのRIA法と同様、アッセイで使用する放射性同位体標識に関する調節面、安全面、および廃棄処理面の課題を抱えているという欠点がある。治療薬モニタリングのために最も望ましいアッセイ形式は、非同位体イムノアッセイであり、このような方法は、HIVプロテアーゼインヒビターをモニタリングするためにはこれまでに未知であった。
上述したように、HPLCは、これまでHIVプロテアーゼインヒビターをモニタリングする際に選択される方法であった。最近の文献における２つの報告では、ヒト血漿中のいくつかのプロテアーゼインヒビターの同時測定のためのHPLCアッセイが記載されている(Poirierら, Therapeutic Drug Monitoring 22, 465-473, 2000、およびRemmelら, Clinical Chemistry 46, 73-81, 2000)。
化学的および生物学的アッセイは、一般的に、目的の被分析物を、所定量の１つ以上のアッセイ試薬と接触させ、得られる生成物(測定生成物)の１つ以上の性質を測定し、(典型的に、テストするサンプルについて予測される範囲内の既知量の目的の被分析物を含む標準または較正サンプルから決定される関係を使用して)測定した値を元のサンプルに存在する被分析物の量と相関させることを伴う。典型的に、検出生成物は、１つ以上のアッセイ試薬により得られる１つ以上の検出可能標識を取り込む。よく使用される標識の例としては、機能化微粒子、放射性同位体標識(125Iおよび32P等)、ペルオキシダーゼおよびβガラクトシダーゼ等の酵素、ならびに酵素基質標識、蛍光標識(フルオレセインおよびローダミン等)、電子スピン共鳴標識(ニトロキシド遊離基等)、免疫反応性標識(抗体および抗原等)、結合対(ビオチン-アビジンおよびビオチン-ストレプトアビジン等)の一方のメンバーである標識、ならびに電気化学発光標識(ルテニウムビピリジル(bipyridyl)部分を含むもの等)が挙げられる。サンドウィッチアッセイは、典型的に、目的の被分析物が、最終的に分離のために使用される１つのアッセイ試薬(例えば、抗体、抗原または結合対の一方のメンバー)と、標識可能な標識を提供する第２のアッセイ試薬との間に挟まれた複合体を形成することを伴う。競合アッセイは、典型的に、目的の被分析物、および被分析物の類似体の両方が、別の試薬(例えば、抗体)上の結合部位について競合する系(被分析物、類似体または結合試薬の１つが検出可能標識を有する)を伴う。
2000年11月14日に出願され、本出願と出願人が同じであり、2002年5月22日にEP 1 207 394として公開された、同時係属出願中の米国特許出願第09/712,525号は、HIVプロテアーゼインヒビターについての非同位体イムノアッセイを記載しており、これは、インヒビターを含むサンプルを、該インヒビターまたは該インヒビターの代謝物質に特異的な受容体とインキュベートし、さらに、該インヒビターの類似体および非同位体シグナル生成部分を含むコンジュゲートとインキュベートすることを含む。受容体とインヒビターとの結合によって生成されるシグナルを測定し、元のサンプル中のプロテアーゼインヒビターの有無または量と相関させる。本発明のプロテアーゼインヒビターコンジュゲートは、このようなアッセイにおいて特に有用である。
発明の概要
本発明は、HIVプロテアーゼインヒビターに対する免疫原を作成するのに有用な新規活性化ハプテンに関する。これらの活性化ハプテンは以下の一般構造：
I-X-(C=Y)m-L-A
［式中、IはHIVプロテアーゼインヒビター基であり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、SまたはNHであり、
mは、0または1であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結されないリンカーであり、
Aは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性化官能基(activated functionality)である］
を有する。
本発明は、HIVプロテアーゼインヒビターに対する免疫原を作成するのに有用な新規活性化ハプテンに関する。これらの活性化ハプテンは以下の一般構造：
I-X-(C=Y)m-L-A
［式中、IはHIVプロテアーゼインヒビター基であり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、SまたはNHであり、
mは、0または1であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結されないリンカーであり、
Aは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性化官能基(activated functionality)である］
を有する。
本発明はまた、以下の構造：
[I-X-(C=Y)m-L-Z]n-P
［式中、Iは、HIVプロテアーゼインヒビター基であり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、S、またはNHであり、
mは、0または１であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結されないリンカーであり、
Zは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、および
[I-X-(C=Y)m-L-Z]n-P
［式中、Iは、HIVプロテアーゼインヒビター基であり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、S、またはNHであり、
mは、0または１であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結されないリンカーであり、
Zは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、および
からなる群より選択される成分であり、
Pは、ポリペプチド、多糖、または合成高分子であり、ならびに
nは、Pの分子量50キロダルトンにつき、1〜50の数である］
を有する新規免疫原に関する。
Pは、ポリペプチド、多糖、または合成高分子であり、ならびに
nは、Pの分子量50キロダルトンにつき、1〜50の数である］
を有する新規免疫原に関する。
本発明はまた、以下の構造：
[I-X-(C=Y)m-L-Z]n-Q
［式中、Iは、HIVプロテアーゼインヒビター基であり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、S、またはNHであり、
mは、0または１であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結されないリンカーであり、
Zは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、および
[I-X-(C=Y)m-L-Z]n-Q
［式中、Iは、HIVプロテアーゼインヒビター基であり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、S、またはNHであり、
mは、0または１であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結されないリンカーであり、
Zは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、および
からなる群より選択される成分であり、
Qは、非同位体標識であり、
nは、Qの分子量50キロダルトンにつき、1〜50の数である］
を有する新規標識化コンジュゲートに関する。
Qは、非同位体標識であり、
nは、Qの分子量50キロダルトンにつき、1〜50の数である］
を有する新規標識化コンジュゲートに関する。
本発明は、他のプロテアーゼインヒビターには10％未満の交差反応性しか持たない、サキナビル、ネルフィナビルおよびインジナビルに対して特異的なモノクローナル抗体も包含する。最後に、本発明は、本発明の免疫原から生成された抗体、ならびに該抗体および本発明の標識化コンジュゲートを採用したイムノアッセイ方法およびテストキットを含む。
図面の簡単な説明
図１は、O-アシル化リトナビル活性化ハプテン、LPH免疫原、およびBSAコンジュゲートの合成についてのスキームを示す。
図１は、O-アシル化リトナビル活性化ハプテン、LPH免疫原、およびBSAコンジュゲートの合成についてのスキームを示す。
図２は、O-アシル化サキナビル活性化ハプテン、KLH免疫原、およびBSAコンジュゲートの合成についてのスキームを示す。
図３は、O-アシル化アンプレナビル活性化ハプテン、KLH免疫原、およびBSAコンジュゲートの合成についてのスキームを示す。
図４は、O-アシル化インジナビル活性化ハプテン、KLH免疫原、およびBSAコンジュゲートの合成についてのスキームを示す。
図５は、O-アシル化ネルフィナビル活性化ハプテン、KLH免疫原、およびBSAコンジュゲートの合成についてのスキームを示す。
図６は、O-アシル化ロピナビル活性化ハプテン、KLH免疫原、およびBSAコンジュゲートの合成についてのスキームを示す。
図７は、代替的なO-アシル化サキナビルおよびリトナビル活性化ハプテン、ならびに代替的なリトナビル免疫原の合成についてのスキームを示す。
図８は、N-アシル化アンプレナビル免疫原の合成についてのスキームを示す。
図９は、O-アルキル化ネルフィナビル免疫原の合成についてのスキームを示す。
図１０(ａ)および図１０(ｂ)は、O-カルバミル化サキナビル活性化ハプテンの合成についてのスキームを示す。
図１１は、O-カルバミル化ネルフィナビル活性化ハプテンの合成についてのスキームを示す。
図１２は、O-アシル化サキナビルマレイミド活性化ハプテンの合成についてのスキームを示す。
図１３は、ペプチドリンカーおよびマレイミド末端基を有するO-アシル化サキナビル活性化ハプテンの合成についてのスキームを示す。後者の活性化ハプテンから誘導されるKLH免疫原およびBSAコンジュゲートも示す。
図１４は、サキナビルおよびリトナビルのフルオレセインコンジュゲート、ならびにインジナビルのビオチンコンジュゲートの合成についてのスキームを示す。
図１５は、コンジュゲート2G、2W、2Dおよび2Sを使用して実施例74で生成された抗体力価を示す表である。
図１６は、実施例74で使用したコンジュゲートの構造を示す。
図１７は、実施例77に記載する、モノクローナル抗体<INDIN>M 1.158.8およびモノクローナル抗体<INDIN>M 1.003.12と、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビルおよびアンプレナビルとの交差反応を示すグラフである。
図１８は、Oar-MEM Oc-スクシンイミド-オキシカルボニルメチル-ネルフィナビルエーテルの合成についてのスキームを示す。
図１９は、Oc-スクシンイミド-オキシカルボニルメチル-サキナビルエーテルの合成についてのスキームを示す。
明細書を通じて、参照数字は、図面に示す化学構造を指すために使用する。
発明の詳細な説明
本明細書で使用する、被分析物とは、有無または量を決定すべき物質または物質群を指す。
本明細書で使用する、被分析物とは、有無または量を決定すべき物質または物質群を指す。
抗体は、被分析物の特異的な結合パートナーを意味し、他の無関係な物質を本質的に除き被分析物に対して特異的な結合親和性を有する任意の物質または物質群である。本用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗体フラグメントを含む。
ハプテンは、部分的または不完全な抗原である。抗体形成を刺激することはできないが、抗体とは反応する、タンパク質を含まない物質(大部分が低分子量の物質)である。抗体は、ハプテンを高分子量担体とコンジュゲートさせ、このコンジュゲート生成物をヒトまたは動物に注射することにより形成される。ハプテンの例としては、治療薬(ジゴキシンおよびテオフィリン)、乱用薬物(モルヒネおよびLSD等)、抗生物質(ゲンタマイシンおよびバンコマイシン等)、ホルモン(エストロゲンおよびプロゲステロン等)、ビタミン(ビタミンB12および葉酸等)、チロキシン、ヒスタミン、セロトニン、アドレナリン等が挙げられる。
活性化ハプテンとは、誘導体コンジュゲートを合成するための活性化基の結合または供給(furnishing)等により、反応のために利用可能な部位を得たハプテン誘導体を指す。
リンカーという用語は、ハプテンを、担体、免疫原、標識、トレーサー、または別のリンカーに結合させる化学部分を指す。リンカーは、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和炭素鎖であり得る。これらはまた、鎖内または鎖の末端において、１つ以上のヘテロ原子も含み得る。ヘテロ原子とは、酸素、窒素および硫黄からなる群より選択される炭素以外の原子を意味する。リンカーの使用は、具体的なハプテンと担体との対に応じて、有利なこともそうでないこともあり、または、必要であることもそうでないこともある。
本明細書で使用する用語としての担体は、ハプテンと結合してハプテンが免疫応答を刺激できるようにする免疫原性物質(一般的にはタンパク質)である。担体物質としては、外来物質として認識され、宿主から免疫応答を引き出す、タンパク質、糖タンパク質、複合多糖類および核酸が挙げられる。
本明細書中で使用する免疫原および免疫原性という用語は、生物中において免疫応答を引き起こすまたは生じさせることが可能な物質を指す。
コンジュゲートおよび誘導体という用語は、１つ以上の化学反応により、親化合物または分子から作られる化学化合物または分子を指す。
本明細書で使用する、検出分子、標識またはトレーサーは、担体物質または分子に結合した場合に被分析物を検出するのに使用できる識別タグである。標識は、連結または架橋部分により直接的または間接的に担体物質に結合され得る。標識の例としては、βガラクトシダーゼおよびペルオキシダーゼ等の酵素、ローダミンおよびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)等の蛍光化合物、ジオキセタンおよびルシフェリン等の発光化合物、ならびに125I等の放射性同位体が挙げられる。
本発明の意味において活性エステルという用語は、求核試薬担持物質の他の反応基との妨害的副反応が有意に生じない条件下で、ペプチドの遊離アミノ基、ポリアミノ酸、多糖類、または標識(ただしこれらに限定されない)等の求核試薬と反応できる活性化エステル基を包含する。
本発明の目的は、HIVプロテアーゼインヒビターに対する免疫原を作成するために使用できる新規活性化ハプテンを提供することである。これらの活性化ハプテンは、以下の一般構造：
I-X-(C=Y)m-L-A
［式中、Iは、HIVプロテアーゼインヒビター基であり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、S、またはNHであり、
mは、0または1であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結され得ないリンカーであり、
Aは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性化官能基である］
をとる。
I-X-(C=Y)m-L-A
［式中、Iは、HIVプロテアーゼインヒビター基であり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、S、またはNHであり、
mは、0または1であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結され得ないリンカーであり、
Aは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性化官能基である］
をとる。
本明細書で使用するHIVプロテアーゼインヒビター基とは、ヒドロキシル基またはアミノ基、すなわちXH(ここで、XはOまたはNH)のみを欠く無傷の薬物である。XおよびC=Y部分としては、エステル(ここで、XはO、YはO、およびmは1)、アミド(ここで、XはNH、YはO、およびmは1)、ウレタン(ここで、XはO、YはO、mは1、およびC=Yに隣接するLの一番目の原子はN)、尿素(ここで、XはNH、YはO、mは1、およびC=Yに隣接するLの一番目の原子はN)、チオ尿素(ここで、XはNH、YはS、mは1、およびC=Yに隣接するLの一番目の原子はN)、アミジン(ここで、XはNH、YはNH、およびmは1)、エーテル(ここで、XはO、およびmは0)、ならびにアミン(ここで、XはNR(RはHもしくは低級アルキル、およびmは0))が挙げられるがこれらに限定されない。「低級アルキル」とは、メチル、エチル、プロピル、およびイソプロピル基を意味する。好ましい活性化ハプテンは、全てのHIVプロテアーゼインヒビターに共通する中央(central)非末端ヒドロキシル基で形成されるエステルまたはウレタンである。この中央ヒドロキシル基は、プロテアーゼインヒビターの治療的活性のために機能的に重要であるが、誘導化およびリンカー結合のための都合の良いハンドルともなる。さらに、一般的に、プロテアーゼインヒビターの代謝は、末端残基において生じ、従って、中央ヒドロキシル基は、親薬剤と代謝物質とを区別する抗体を生成するように免疫原を設計するためには魅力的な部位である。本明細書で使用する場合、この中央ヒドロキシル基は、HOCと表記する。中央ヒドロキシル基の水素が(C=Y)m-L-A基により置き換えられる場合、残る結合酸素はOCと示す。
リンカーLは、末端活性化官能基AとHIVプロテアーゼインヒビター基との間の追加のスペーサー(一番目のスペーサーはXおよびC=Y基である)を提供する目的を果たす。リンカーの長さおよび組成は、免疫原応答およびコンジュゲートの性能に重要な影響を有することが当業者に周知である。市販のリンカーまたは簡単に合成されるリンカーの多くの例が、ヒドロキシルおよびアミノ基への結合についての文献において記載されている。この題目についての良い論文については、Bioconjugate Techniques, G. Hermanson, Academic Press, 1996を参照されたい。場合によっては、追加リンカーLは不要で、C=Y部分は活性化官能基Aに直接結合される。好ましいリンカー部分Lの一例は、-(CH2)x-NH-(ここで、xは1〜12)である。特に好ましいのは、x = 5と、C=Yとの組み合わせである(ここで、YはOである(すなわち、アミノカプロイルエステル))。このようなリンカーは、N保護アミノ酸(すなわち、アミノカプロン酸)でのHIVプロテアーゼインヒビターのアシル化により形成される。保護基は、HIVプロテアーゼインヒビター基中のX-C=Y結合または他の部分の完全性に影響しないような緩やかな塩基性または酸性の条件下で除去されるものであることが好ましい。緩やかな塩基性の条件下で除去されるN保護基の一例は、フルオレニルメチルオキシカルボニル(FMOC)である。酸で除去し易いN保護基の一例は、t-ブチルオキシカルボニル(BOC)である。多くの他の適切なN保護基が、当該分野で周知である(Organic Synthesis, 第二版, T. GreeneおよびP. Wuts, Wiley-Interscience, 1991に掲載の"Protective Groups"を参照)。
HIVプロテアーゼインヒビターのヒドロキシルまたはアミノ基とN-保護アミノ酸とのアシル化反応は、触媒と共にまたは無しで、カルボジイミド等の縮合試薬を使用して達成される。好ましい組合わせは、ジシクロヘキシルカルボジイミド、およびジメチルアミノピリジン(触媒)である。アシル化反応は、塩化メチレンなどの適切な溶媒中で、0〜35℃にて、典型的に0.5〜7日間にわたる時間で実行する。生成物を単離した後、N保護基を除去する。好ましいFMOC保護基のためには、これは、塩化メチレン中の10％ピペリジンの溶液で、0.5〜2時間処理することにより達成される。得られたアミノアシル-プロテアーゼインヒビターのアミノ基は、本発明が属する分野の当業者に周知の様々なカルボキシル活性化リンカー伸長(extension)または標識でのアシル化反応の影響を受け易い。リンカー伸長は、この段階で末端活性化基A(活性エステル、イソシアネートおよびマレイミド等)を生成するために行われることが多い。例えば、テレフタル酸等のビス-カルボン酸のホモ二官能基(homobifunctional)N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの一端とアミノアシルプロテアーゼインヒビターとの反応は、ポリペプチド、多糖類および標識上のアミンへのコンジュゲートのために有用な安定したN-ヒドロキシスクシンイミドエステル末端リンカー付加物を生成する。リンカー伸長は、マレイミドアルカン酸(alkanoic acid)N-ヒドロキシスクシンイミドエステル等のヘテロ二官能性(heterobifunctional)試薬で、ポリペプチドおよび標識上のチオール基へのその後のコンジュゲートのための末端マレイミド基を生成しても達成され得る。あるいはまた、アミノ末端リンカーは、一端でアミド結合を形成し、他端で遊離または保護されたチオールを形成するように反応するヘテロ二官能性チオール化試薬で伸長できる。当該分野で周知のこの種のチオール化試薬のいくつかの例としては、2-イミノチオレン(2-IT)、スクシンイミジルアセチルチオプロピオネート(SATP)、およびスクシンイミド2-ピリジルジチオプロピオネート(SPDP)が挙げられる。脱保護した後、初期(incipient)チオール基が利用可能になり、マレイミドまたはブロモアセチル化改変型免疫原または標識とチオールエーテルを形成する。さらに別の代替例としては、アミノ末端リンカーのアミノ基を、ジアゾニウム基に変換し、その後、例えば酸の存在下での亜硝酸アルカリ金属との反応により該物質をジアゾニウム塩に変換することである。ジアゾニウム塩はその後に適切な求核部分(例えば、ペプチド、タンパク質、ポリアミノ酸等のチロシン残基が挙げられるがこれらに限定されない)と反応することである。このようなジアゾニウム塩への変換用の適切なアミノ末端リンカーの例としては、芳香族アミン(アニリン)が挙げられるが、上記言及したアミノカプロン酸塩および同様の物質も挙げられ得る。このようなアニリンは、上述したプロテアーゼインヒビターのヒドロキシルとN保護アミノ酸とのカップリング反応において、アミノ基が芳香族アミン(すなわち、アニリン)からなる対応するアミノ酸を、(N-アセチルまたはN-トリフルオロアセチル基として)適切に保護され、その後当該分野で周知の方法を用いて脱保護されるアミンと置換することで得ることができる。ジアゾニウム塩に対する他の適切なアミン前駆体は、有機合成の分野の当業者は思いつくであろう。
別の好ましい種類のヘテロ二官能性リンカーは、スクシンイミド-オキシカルボニル-塩化ブチリル等の混合された活性エステル/酸塩化物である。リンカーの反応性がより高い酸塩化物末端は、HIVプロテアーゼインヒビター上のアミノまたはヒドロキシル基を優先的にアシル化して、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルリンカー付加物を直接生じる(アンプレナビルについては実施例40、およびリトナビルについては実施例８を参照のこと)。
本発明において有用なさらに別の種類の末端活性化基は、アルデヒド基である。アルデヒド基は、プロテアーゼインヒビターのヒドロキシルを、オメガ位置(遠端部)においてアセタル基等のマスクされたアルデヒド基で置換されたアルキルまたはアシル酸(1,3-ジオキソラン(dioxolan)-2-イルまたは1,3-ジオキサン-2-イル部分等)と、上記したのと同様の手法でカップリングさせ、その後当該分野で周知の方法を用いて基を脱マスクすることにより、生成され得る(例えば、T. GreeneおよびP. Wuts、前掲を参照)。あるいはまた、オメガ位置において、例えばアセトキシ部分等の保護されたヒドロキシにより置換されるアルキルまたはアリールカルボン酸がカップリング反応において使用されてもよく、その後、ヒドロキシの脱保護、および適切な溶媒(好ましくは塩化メチレン)中での重クロム酸ピリジニウム等の試薬での緩やかな酸化を行い、対応するアルデヒドを得る。アルデヒド末端化物質を生成する他の方法は、当業者に明らかであろう。
特定の場合には、リンカー組成物に極性を導入して、目的のアッセイにおける可溶性または性能特性を改善することが望ましい。この点で特に有用なのは、最適化のために多様な可能性を提供し、固相ペプチド合成または他の手段により容易に利用可能なペプチドリンカーである。
プロテアーゼインヒビターへの結合点においてウレタン、尿素またはチオ尿素結合を有するアシル化HIVプロテアーゼインヒビターを生成するために特に有用な別のアプローチは、プロテアーゼインヒビターのヒドロキシルまたはアミノ基を、リンカーイソシアネートまたはリンカーイソチオシアン酸塩と反応させることである。例えば、カルボキシル基上に保護基を有するかまたは持たないカルボキシアルキルイソシアネートを、プロテアーゼインヒビター上の標的ヒドロキシル基と直接反応させて、保護されたカルボキシアルキルウレタンまたはカルボキシアリールウレタンを得てもよい。保護されたカルボキシは、塩基性または酸性条件下で除去されるエステルであることが好ましい。遊離後、カルボキシル基を活性化させて、その後のコンジュゲートのための活性エステルを得るか、またはポリペプチド、多糖類および標識に直接コンジュゲートさせてもよい。あるいはまた、N-ヒドロキシスクシンイミジル-イソシアナートベンゾエート(isocyanatobenzoate)等の予め活性化されたカルボキシアルキルイソシアネートまたはカルボキシアリールイソシアネートを、プロテアーゼインヒビターのヒドロキシルまたはアミン基と直接反応させて、活性エステル末端を有するリンカー-アシル化プロテアーゼインヒビターを得てもよい。
HIVプロテアーゼインヒビターとの結合点におけるウレタン、尿素およびチオ尿素結合を生成するためのさらに別のアプローチは、まず標的ヒドロキシル官能基またはアミン官能基をホスゲンまたはチオホスゲンで処理して、塩化オキシカルボニルまたは塩化オキシチオカルボニルを得ることである。後者の中間体は、アミンと反応し易く、ウレタン、尿素またはチオ尿素を生じる。カルボニルジイミダゾールまたはジスクシンイミジル-カルボン酸塩等の代替的なホスゲン等価物も、同様に反応する。
中央ヒドロキシル基から、HIVプロテアーゼインヒビターのアルキル化誘導体を生成するためには、別のアプローチも有用である。例えば、プロテアーゼインヒビター(または正しく保護されたプロテアーゼインヒビター)を、適切な条件下で強力な塩基と反応させて、中央ヒドロキシル基を脱プロトン化させてもよい。これを、保護されたカルボン酸または適切に保護された官能基(フタルイミドとして保護されたアミノ基等)を担持する様々なハロアルキル試薬と反応させて、エーテル連結を形成してもよい。保護されたカルボキシル基は、酸性または塩基性条件下で除去されるエステルであることが好ましい。遊離カルボン酸基を活性化させて、その後のポリペプチド、多糖類および標識基へのコンジュゲートのための活性エステルを得てもよい。脱保護後、遊離アミノ基を、二官能性リンカーを、活性化カルボン酸基と共に用いて伸長してもよいし、または尿素連結基または同様の基によりポリペプチドにコンジュゲートさせてもよい。
アミジン付加物の生成のために、HIVプロテアーゼインヒビターのアミンを、イミドエステル(その多くがバイオコンジュゲート(bioconjugate)化学においてリンカーとして公知である)と反応させる(Hermanson、同書を参照)。
あるいはまた、イミデート(imidate)部分(イミドエステル；またはイミニウム(iminium)基)を活性化基として担持するリンカーで誘導化されたプロテアーゼインヒビターを、例えば、プロテアーゼインヒビターを適切に官能基化する際に、適切な前駆基(例えば、末端ニトリル基)を担持するリンカーを用いて得てもよい。例えば、末端ニトリルを担持する、ネルフィナビル等のOC-アルキル化誘導体もしくはOar-アルキル誘導体、またはアンプレナビル等のNar-アルキル誘導体を、上述したのと同様の手法で合成し、例えば、アルコールに入った塩化水素での処理等の当該分野で公知の方法によりニトリルをイミデート基に変換してもよい。Hermanson、同書；およびJerry March, Advanced Organic Chemistry, 第三版, John Wiley and Sons, 1985も参照のこと。イミドエステルを得るための他の方法は、当業者は思いつくであろう。
同じプロテアーゼインヒビター中に複数のヒドロキシ基を有する特定のプロテアーゼインヒビター(すなわち、インジナビルおよびネルフィナビル)、または同じプロテアーゼインヒビター中にヒドロキシ基およびアミノ基を有する特定のプロテアーゼインヒビター(すなわち、アンプレナビル)では、一方の基を保護して、専ら他方の官能基において反応させる必要があり得る。例えば、インジナビルインダンヒドロキシル基を、隣接するアミド窒素と架橋するイソプロピリデン基で保護できる(化合物4A、実施例4を参照)。本出願の目的のために、インダンヒドロキシル基を、HOinと表示して、HOCと区別する。伸長によるイソプロピリジン保護インジナビル HOinは、OinNin-イソプロピリジニルと称する。
別の例では、ネルフィナビル芳香族ヒドロキシル(本明細書で使用する場合にはHOar)は、中央ヒドロキシル基、すなわちHOCとの反応の前に、t-ブチルジメチルシリル(TBDMS)基で保護される(化合物5A、実施例5を参照)。ネルフィナビル芳香族ヒドロキシルはまた、メトキシエトキシメチルエーテル(MEM)基でも保護される(化合物5M、実施例31を参照)。アルコールおよびフェノールのための多くの他の適切な保護基が、当該分野で知られており、さらなる例としてGreeneおよびWuts、同書を同じく参照されたい。
別のケースでは、反応条件の調節により、他方の官能基に対して一方の官能基を選択することが可能になり、保護が必要でなくなる。後者のアプローチの一例は、アンプレナビルヒドロキシル基またはアミノ基の選択的アシル化である(実施例3および40を参照)。別の例は、非保護脂肪族中央ヒドロキシル基の存在下での、ネルフィナビルフェノールヒドロキシル基(HOar)の選択的アルキル化である(HOC、実施例36を参照)。
上記説明から、目的のHIVプロテアーゼインヒビターハプテン組成物中に活性化末端基Aを生じるリンカー技術の改変法が多くあることが明らかである。以下、これらの改変法の一部をより詳細に記載する。活性エステルは、最も好ましいＡ基である。本発明の活性エステルは、求核試薬、特に第一級アミンと、比較的低温度(一般的に0〜100℃)にて、様々な水性および非水性溶媒混合液中で、反応性を有する。アミドを得るための第一級または第二級アミンとの活性エステルのカップリングのための典型的な条件は、水が添加されたかまたはされていない、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)またはジメチルスルホキシド(DMSO)等の両性非プロトン性溶媒中での室温における反応である。緩衝液または第三級アミンを添加して、第一級アミン反応物質を脱プロトン化状態のままにするために必要な塩基pHを維持することが多い。典型的な活性エステルは、p-ニトロフェニルエステル、N-ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、1-ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステル、およびペンタフルオロフェニルエステルである。安定性、反応性、および副産物であるN-ヒドロキシスクシンイミドの除去が簡単なことのバランスから、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルが特に好ましい。他の活性エステルは、当業者に周知であり、同様に使用され得る。
カルボン酸で終わるプロテアーゼインヒビターリンカーのための代替的な活性化方法は、無水物のin situ調製である。クロロギ酸イソブチルなどのクロロギ酸アルキルで形成される混合カルボン酸無水物が特に好ましい。これらの混合無水物は、DMFまたはテトラヒドロフラン(THF)等の溶媒に入ったトリエチルアミンまたはN-メチルモルホリン等の第三級アミンの存在下で、５分間〜１時間の、カルボン酸とクロロギ酸アルキルとの反応により、典型的に-30℃〜+30℃、通常は-20℃〜0℃の範囲の温度にて容易に形成される。次に、混合無水物を、標識、免疫原および担体上のアミノ基と、典型的に５分〜１時間、0℃〜+30℃にて反応させて、安定したアミドコンジュゲートを得る。また、THF、DMFまたはジクロロメタン等の様々な溶媒中での、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)またはエチル-ジメチルアミノプロピル-カルボジイミド(EDAC)等のカルボジイミドとの、プロテアーゼインヒビターリンカーカルボン酸基の２つの等価物の反応により対称無水物を形成してもよい。活性化およびアミンへのカップリングは、典型的には、上記混合無水物カップリングと同様の条件下で行われる。
カルボン酸で終わるプロテアーゼインヒビターリンカーのさらに別の活性化方法は、カルボン酸基を、ホモシステインチオラクトン等の物質と結合させることにより、チオラクトン等のマスクされたチオール基へ変換することである(例えば、米国特許第5,302,715号を参照)。その後、得られたリンカー-チオラクトンを、緩やかな塩基でマスクを外して、末端チオールを得てもよく、これはその後、マレイミド-またはハロアセチル-改変型ペプチド、多糖類、ポリアミノ酸、標識等の上にあるようなマレイミド基またはブロモアセチルもしくはヨードアセチル基等の部分と反応して、先に記載したのと同様の手法によりチオ-マレイミドまたはチオ-アセチル付加物を生じる。
その他の有用なA基は、イソチオシアネートまたはイソシアネート部分である。イソチオシアネートは、第一級アミン等の求核試薬とも反応し易く、上記した活性エステル反応と同様の条件下でチオ尿素を生じる。一方、イソシアネートは、同様に反応して尿素を生じる。イソチオシアネートまたはイソシアネート反応のさらなる利点は、置換ではなく付加であること、従って、活性エステルの場合のように副産物を考慮する必要がないことである。例えばp-ニトロフェニルオキシカルボニルアミノ部分等のイソシアネート等価物は、第一級アミンと同様に反応して、尿素を生じる。
最後に、標的求核試薬がチオール基である場合、非常に緩やかな条件下(すなわち、周囲温度および中性pH)でチオールエーテルを迅速に形成することから、マレイミドが特に好ましい。あるいはまた、ヨードアセチルまたはブロモアセチル等の活性ハロアルキルA基も反応し易く、安定したチオールエーテルを形成する。
本発明の別の目的は、以下の構造：
[I-X-(C=Y)m-L-Z]n-P
［式中、IはHIVプロテアーゼインヒビター基であり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、SまたはNHであり、
mは、0または1であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結されないリンカーであり、
Zは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、および
[I-X-(C=Y)m-L-Z]n-P
［式中、IはHIVプロテアーゼインヒビター基であり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、SまたはNHであり、
mは、0または1であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結されないリンカーであり、
Zは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、および
からなる群より選択される成分であり、
Pは、ポリペプチド、多糖、または合成高分子であり、ならびに
nは、Pの分子量50キロダルトンにつき、1〜50の数である］
を有する新規免疫原を提供することである。
Pは、ポリペプチド、多糖、または合成高分子であり、ならびに
nは、Pの分子量50キロダルトンにつき、1〜50の数である］
を有する新規免疫原を提供することである。
免疫原について、本発明の好適な形態は、全てのHIVプロテアーゼインヒビターに共通する中央ヒドロキシル基から、アシル化反応により連結して、エステル結合を形成することである(すなわち、XはO、mは1、およびYはO)。多様なリンカーLおよび活性化官能基Aが、上述したように使用できる。したがって、I-X-(C=Y)m-L-Aタイプの活性化ハプテンを構築し、免疫原担持物質と反応させる。免疫原担体は、典型的に、10 kDを上回る分子量のポリペプチドまたは多糖である。好ましい免疫原担体は、100 kDを上回る分子量のポリペプチドである。好ましい担体物質の例は、スカシガイヘモシアニン(KLH)、カブトガニヘモシアニン(LPH)およびウシサイログロブリン(BTG)である。活性化ハプテンと担体上のアミノ基との反応は、典型的に、水とDMSO等の水混和性有機溶媒との緩衝化混合物中で、室温にて0.5〜5日間行われる。緩衝液のpHは、典型的に、活性化エステル、イソシアネートおよびイソチオシアネートについては6〜8、イミデートについては7〜10であり、担体アミノ基の既知の反応性および活性化官能性に応じて調節される。末端基Ａがマレイミドの場合、担体上の反応基はチオールである。チオール基は、担体に本来備わっているものであるか、または2-ITもしくはSATP等のチオール化試薬を用いて導入され得る。マレイミドをチオール基にコンジュゲートして、チオエーテルを得るための最適pHは、典型的に5〜7である。反応後、免疫原を、透析するか、またはサイズ排他クロマトグラフィーにかけて、コンジュゲートしていないハプテンおよび有機溶媒を除去する。
免疫原を得るための代替的な方法は、活性化ハプテン(Aはアルデヒド)を、担体タンパク質またはポリペプチドのアミノ基と反応させてシッフ塩基を形成し、その後、シアノボロ水素化物(cyanoborohydride)等の緩やかな還元剤で還元して、安定したアミン結合を形成することである。この最後のアプローチに対する変更も、本発明が属する分野の当業者は思いつくであろう。
本発明のさらに別の目的は、本発明の免疫原から生成された、HIVプロテアーゼインヒビターに対する抗体を提供することである。抗体を生成するために、免疫原を、凍結乾燥した免疫原を再水和し、免疫原の溶液または懸濁液を形成して、宿主動物への注射用に調製することができる。あるいはまた、免疫原を予め調製した液体溶液としてまたは緩衝液に入った懸濁液として使用してもよい。次いで、免疫原溶液を、フロイントアジュバント等のアジュバントと組み合わせて、免疫原混合液を形成する。免疫原は、様々な部位に、いくつかの用量で、１回以上、数週間かけて、投与され得る。
本発明の免疫原を使用するポリクローナル抗体の調製は、当業者に公知の従来技術のいずれに従ってもよい。一般的に、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモットまたはウマ等の宿主動物に、免疫原混合物を注射する。血清の抗体力価を評価しながら、最適な力価に到達したと決定されるまでさらなる注射を行う。その後、宿主動物から採血し、適切な容量の特異的な抗血清を産生する。所望の場合には、精製ステップを行い、抗血清がアッセイの実施において使用するのに適していると判断されるまで、非特異的抗体等の所望でない物質を除去する。
Methods in Enzymology 73 (Part B), pp. 3-46, 1981に記載される技術等のポリエチレングリコール方法を使用して、上述したように免疫化したマウスから得たマウスリンパ球と骨髄腫細胞とをハイブリダイズすることによりモノクローナル抗体を得てもよい。
ELISAアッセイの場合、ウシ血清アルブミン(BSA)にコンジュゲートしたプロテアーゼインヒビター誘導体がマイクロタイタープレートを被覆するのに好ましい。
本発明の別の目的は、以下の構造：
[I-X-(C=Y)m-L-Z]n-Q
［式中、Iは、HIVプロテアーゼインヒビター基であり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、S、またはNHであり、
mは、0または１であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結されないリンカーであり、
Zは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、
[I-X-(C=Y)m-L-Z]n-Q
［式中、Iは、HIVプロテアーゼインヒビター基であり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、S、またはNHであり、
mは、0または１であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結されないリンカーであり、
Zは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、
-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-からなる群より選択される成分であり、
Qは、非同位体標識であり、ならびに
nは、Qの分子量50キロダルトンにつき、1〜50の数である］
を有する新規標識化コンジュゲートを提供することである。
Qは、非同位体標識であり、ならびに
nは、Qの分子量50キロダルトンにつき、1〜50の数である］
を有する新規標識化コンジュゲートを提供することである。
HIVプロテアーゼインヒビターおよび非同位体標識のコンジュゲートの合成のために、免疫原を調製するのと同様の手順を採用する。
あるいはまた、活性化ハプテンを、酵素上のアミノまたはチオール基にコンジュゲートさせて、ELISA用途のための標識を調製してもよい。コンジュゲートが当該分野で周知であるELISA用の有用な酵素のいくつかの例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ、およびβ-ガラクトシダーゼである。酵素を含むタンパク質のコンジュゲートは、典型的に、水と水混和性有機溶媒との緩衝化混合液中で調製され、その後、免疫原の調製と同様の条件で透析する。ラテックス凝集アッセイの場合、10 kD〜300 kD、好ましくは40 kDの分子量を有するアミノ化デキストラン担体とのコンジュゲートが特に有用である。これらのコンジュゲートは、上述したように緩衝化溶媒混合液中で、またはトリエチルアミン等の第三級アミンを含むDMSO等の無水有機溶媒中で調製されて、反応を促進する。小分子量(すなわち1 kD未満)の標識の場合、標識の性質に応じて反応条件を調節する。特に好ましい標識の１つは、標識化アビジンまたはストレプトアビジンと組み合わせられるビオチンである。非同位体検出における(ストレプト)アビジン/ビオチン系の万能性は、バイオコンジュゲート化学の分野においては周知である(Hermanson, 同書を参照)。アビジンおよびストレプトアビジンの様々な酵素-および発蛍光団-標識化コンジュゲートは、市販されており、高親和性相互作用においてビオチン標識化物質を検出する。さらに、様々なビオチン化剤が市販されており、活性化官能基Aと反応する。例えば、ビオチン-アミン誘導体を、Ａが活性エステル、イソシアネートまたはイソチオシアネートである本発明の活性化ハプテンと反応させて、ビオチンアミド、尿素およびチオ尿素コンジュゲートをそれぞれ得てもよい。これらのカップリング反応は、典型的に、トリエチルアミン等の有機塩基を含む、DMFまたはDMSO等の両性非プロトン性溶媒中で、室温にて、0.5〜5日間行われる。ビオチンコンジュゲートは、逆相HPLC等のクロマトグラフィー方法により優先的に単離される。
他の好ましい標識は、フルオレセイン、ローダミン、TEXAS RED、ダンシルおよびシアニン染料(例えば、Cy-5)等の発蛍光団であり、そのうちの多くの活性化誘導体は市販されている。一般的に、これらのコンジュゲートは、第三級アミンを含む両性非プロトン化溶媒中でビオチンコンジュゲートと同様に調製され、その後クロマトグラフィーにより単離され得る。
検出系と間接的にカップリングされたリポーター基を標識として使用することも可能である。一例は、上述したようなビオチンである。別の例は、2001年1月4日に公表されたPCT公報WO 200101135に記載されるようなイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害のためのミコフェノール酸誘導体である。
HIVプロテアーゼインヒビター活性化ハプテン上の活性化基Aとの反応について、ルテニウムビピリジル誘導体等の電気化学発光標識、アクリジニウムエステル等の化学発光標識、電気化学伝達物質、ならびに標識上に適切な求核基を適切に導入した後に本発明のために使用できる様々な微粒子およびナノ粒子(例えば、アミンまたはチオール)を含めて、非同位体標識について他の可能性があることも当業者には明らかであろう。
以下の実施例では、参照数字は図中に示す対応する構造を指す。これらの実施例は、例示のためのみ提示されるものであり、本発明を限定することを意図したものではない。
プロテアーゼインヒビターのO-アシル化
O c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-リトナビル(1A)の合成
リトナビル(1、0.3605 g)、FMOC-アミノカプロン酸(0.1944 g、Advanced ChemTech, Louisville, KY)、ジメチルアミノピリジン(0.0672 g、Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)、およびジシクロヘキシルカルボジイミド(0.1238 g、Fluka Chemical Corp., Milwaukee, WI)を、無水塩化メチレン(5 mL)中で室温にて一晩攪拌した。混合液を濾過し、濾過液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲル(EM Science Cat. No. 9386-9、シリカゲル60、230-400メッシュASTM)クロマトグラフィーにより、窒素の正圧(3％メタノール含有クロロホルム溶出液)下で、直接精製して、Oc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-リトナビル(1A)を白い固体(0.5023 g、95％)として得た。M+H 1056.2。
リトナビル(1、0.3605 g)、FMOC-アミノカプロン酸(0.1944 g、Advanced ChemTech, Louisville, KY)、ジメチルアミノピリジン(0.0672 g、Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)、およびジシクロヘキシルカルボジイミド(0.1238 g、Fluka Chemical Corp., Milwaukee, WI)を、無水塩化メチレン(5 mL)中で室温にて一晩攪拌した。混合液を濾過し、濾過液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲル(EM Science Cat. No. 9386-9、シリカゲル60、230-400メッシュASTM)クロマトグラフィーにより、窒素の正圧(3％メタノール含有クロロホルム溶出液)下で、直接精製して、Oc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-リトナビル(1A)を白い固体(0.5023 g、95％)として得た。M+H 1056.2。
O c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-サキナビル(2A)の合成
Oc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-サキナビル(2A)を、より多くの塩化メチレン(75 mL)を使用し、反応液を２日間攪拌したこと以外は実施例１に記載の条件に従い、サキナビルメタンスルホネート(2, 0.1917 g)から調製した(A. Farese-Di Giorgio et al., Antiviral Chem. and Chemother. 11, 97-110, 2000)(0.2354 g, 94％)。M+H 1006.2
Oc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-サキナビル(2A)を、より多くの塩化メチレン(75 mL)を使用し、反応液を２日間攪拌したこと以外は実施例１に記載の条件に従い、サキナビルメタンスルホネート(2, 0.1917 g)から調製した(A. Farese-Di Giorgio et al., Antiviral Chem. and Chemother. 11, 97-110, 2000)(0.2354 g, 94％)。M+H 1006.2
O c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-アンプレナビル(3A)の合成
Oc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-アンプレナビル(3A)を、実施例１に記載の条件に従い、アンプレナビル(3)(0.1517 g)から調製した(0.2248 g; 89％)。M+H 841。
Oc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-アンプレナビル(3A)を、実施例１に記載の条件に従い、アンプレナビル(3)(0.1517 g)から調製した(0.2248 g; 89％)。M+H 841。
O c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-O in ,N in -イソプロピリジニル-インジナビル(4B)の合成
硫酸インジナビル(4、0.3559 g)、カンファースルホン酸(0.1401 g、Aldrich Chemical Co.)、および硫酸マグネシウム(4 mg)を、ジメトキシプロパン(5 mL、A. Farese-Di Giorgioら, Antiviral Chem. and Chemother, 11, 97-110, 2000)中で、一晩環流させた。混合液を、塩化メチレンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液とに分割した。有機層を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製して(４％メタノール含有クロロホルム溶出液)、Oin,Nin-イソプロピリジル-インジナビル(4A)を無色の油として(0.2350 g; 72％)得た。M+H 654.4。
硫酸インジナビル(4、0.3559 g)、カンファースルホン酸(0.1401 g、Aldrich Chemical Co.)、および硫酸マグネシウム(4 mg)を、ジメトキシプロパン(5 mL、A. Farese-Di Giorgioら, Antiviral Chem. and Chemother, 11, 97-110, 2000)中で、一晩環流させた。混合液を、塩化メチレンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液とに分割した。有機層を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製して(４％メタノール含有クロロホルム溶出液)、Oin,Nin-イソプロピリジル-インジナビル(4A)を無色の油として(0.2350 g; 72％)得た。M+H 654.4。
Oc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-Oin, Nin-イソプロピリジニル-インジナビル(4B)を、実施例１に記載の条件に従い、Oin,Nin-イソプロピリジル-インジナビル(4A、0.1317 g)から調製した(0.1742 g；87％)。M+H 989.4。
O c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-O ar -TBDMS-ネルフィナビル(5B)の合成
ネルフィナビル(5、0.2839 g)および水素化ナトリウム(18 mg)を、DMF(3 mL)中で15分間攪拌した。塩化t-ブチルジメチルシリル(TBDMS)(0.1130 g)を添加し、反応液を一晩攪拌した。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(３％メタノール含有クロロホルム溶出液)、Oar-TBDMS-保護されたネルフィナビル(5A)を白い発泡体として(0.2857 g；84％)得た。M+H 682.4。
ネルフィナビル(5、0.2839 g)および水素化ナトリウム(18 mg)を、DMF(3 mL)中で15分間攪拌した。塩化t-ブチルジメチルシリル(TBDMS)(0.1130 g)を添加し、反応液を一晩攪拌した。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(３％メタノール含有クロロホルム溶出液)、Oar-TBDMS-保護されたネルフィナビル(5A)を白い発泡体として(0.2857 g；84％)得た。M+H 682.4。
Oc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-Oar-TBDMS-ネルフィナビル(5B)を、実施例１に記載の条件に従い、Oar-TBDMS保護されたネルフィナビル(5A、0.3297 g)から調製した(0.3385 g；69％)。M+H 1017.7。
O c -(N-FMOC-アミノカプロイル)-ロピナビル(6A)の合成
Oc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-ロピナビル(6A)を、実施例１に記載の条件に従い、ロピナビル(6、0.712 g)から調製した(0.500 g；45％)。M+H 964.4。
Oc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-ロピナビル(6A)を、実施例１に記載の条件に従い、ロピナビル(6、0.712 g)から調製した(0.500 g；45％)。M+H 964.4。
O c -[3-(4'-カルボキシフェニル)-プロピオニル)]-サキナビル(2H)の合成
3-(4'-カルボキシフェニル)-プロピオニル-サキナビル(2H)を、実施例１に記載の条件に従い、サキナビルメタンスルホネート(2、0.1534 g)および3-(4'-カルボキシフェニル)-プロピオン酸(0.0485 g、Lancaster Synthesis Inc., Windham, NH)から調製した(0.1041 g；61％)。M+H 847.4。生成物についてのスペクトルデータ(1H-NMR)は、アリールカルボキシよりもアルキルカルボキシにおけるエステル化に適合した。
3-(4'-カルボキシフェニル)-プロピオニル-サキナビル(2H)を、実施例１に記載の条件に従い、サキナビルメタンスルホネート(2、0.1534 g)および3-(4'-カルボキシフェニル)-プロピオン酸(0.0485 g、Lancaster Synthesis Inc., Windham, NH)から調製した(0.1041 g；61％)。M+H 847.4。生成物についてのスペクトルデータ(1H-NMR)は、アリールカルボキシよりもアルキルカルボキシにおけるエステル化に適合した。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル(1G)の合成
スクシンイミド-オキシカルボニル-塩化ブチリル、すなわち5-(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル-オキシ)-5-オキソ-塩化ペンタノイルを、Antonianら、EP 0 503 454に従い調製する。リトナビル(1、0.2163 g)およびスクシンイミド-オキシカルボニル-塩化ブチリル(0.0817 g)を、無水DMF(3 mL)中で50℃にて一晩攪拌させた。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(30％テトラヒドロフラン含有酢酸エチル溶出液)、Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル(1G)を白い固体(0.1220 g、44％)として得た。M+H 931.8。
スクシンイミド-オキシカルボニル-塩化ブチリル、すなわち5-(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル-オキシ)-5-オキソ-塩化ペンタノイルを、Antonianら、EP 0 503 454に従い調製する。リトナビル(1、0.2163 g)およびスクシンイミド-オキシカルボニル-塩化ブチリル(0.0817 g)を、無水DMF(3 mL)中で50℃にて一晩攪拌させた。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(30％テトラヒドロフラン含有酢酸エチル溶出液)、Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル(1G)を白い固体(0.1220 g、44％)として得た。M+H 931.8。
O-アシル化プロテアーゼインヒビターの脱保護
O c -(アミノカプロイル)-リトナビル(1B)の合成
実施例１で得たOc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-リトナビル(1A)(0.2113 g)を、10％ピペリジンを含む無水塩化メチレン(4 mL)中で、１時間、室温にて攪拌した。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(20〜25％メタノール含有クロロホルム勾配溶出液)、Oc-(アミノカプロイル)-リトナビル(1B)を白い固体(0.1525 g、91％)として得た。M+H 834。
実施例１で得たOc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-リトナビル(1A)(0.2113 g)を、10％ピペリジンを含む無水塩化メチレン(4 mL)中で、１時間、室温にて攪拌した。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(20〜25％メタノール含有クロロホルム勾配溶出液)、Oc-(アミノカプロイル)-リトナビル(1B)を白い固体(0.1525 g、91％)として得た。M+H 834。
O c -(アミノカプロイル)-サキナビル(2B)の合成
Oc-(アミノカプロイル)-サキナビル(2B)を、実施例９に記載の条件に従い、実施例２で得たO-(N-FMOC-アミノカプロイル)-サキナビル(2A)(0.7547 g)から調製した(0.5253 g；89％)。M+H 784.3。
Oc-(アミノカプロイル)-サキナビル(2B)を、実施例９に記載の条件に従い、実施例２で得たO-(N-FMOC-アミノカプロイル)-サキナビル(2A)(0.7547 g)から調製した(0.5253 g；89％)。M+H 784.3。
O c -(アミノカプロイル)-アンプレナビル(3B)の合成
Oc-(アミノカプロイル)-アンプレナビル(3B)を、実施例９に記載の条件に従い、実施例３で得たO-(N-FMOC-アミノカプロイル)-アンプレナビル(3A)(0.2523 g)から調製した(0.1160 g；63％)。M+H 619.3。
Oc-(アミノカプロイル)-アンプレナビル(3B)を、実施例９に記載の条件に従い、実施例３で得たO-(N-FMOC-アミノカプロイル)-アンプレナビル(3A)(0.2523 g)から調製した(0.1160 g；63％)。M+H 619.3。
O c -(アミノカプロイル)-インジナビル(4D)の合成
実施例４に記載されるように合成されるOc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-Oin,Nin-イソプロピリジニル-インジナビル(4B)(0.5869 g)を、50％トリフルオロ酢酸含有無水塩化メチレン(6 mL)中で室温にて一晩攪拌し、イソプロピリジニル保護基を除去した。混合液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、残留物を、塩化メチレンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液とに分割する。有機層を分離し、乾燥させ(硫酸ナトリウム)、淡黄色の発泡体(0.5329g)を得るまで蒸発させた。発泡体を、５％ピペリジン含有無水塩化メチレン(5 mL)に溶解し、一晩攪拌した。溶媒を除去し、オフホワイトの残留物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し(１％濃縮水酸化アンモニウム水溶液を含む5:1クロロホルム/メタノールで溶出)、Oc-(アミノカプロイル)-インジナビル(4D)(0.2866 g；全体の66％)を無色の油として得た。M+H 727.5。
実施例４に記載されるように合成されるOc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-Oin,Nin-イソプロピリジニル-インジナビル(4B)(0.5869 g)を、50％トリフルオロ酢酸含有無水塩化メチレン(6 mL)中で室温にて一晩攪拌し、イソプロピリジニル保護基を除去した。混合液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、残留物を、塩化メチレンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液とに分割する。有機層を分離し、乾燥させ(硫酸ナトリウム)、淡黄色の発泡体(0.5329g)を得るまで蒸発させた。発泡体を、５％ピペリジン含有無水塩化メチレン(5 mL)に溶解し、一晩攪拌した。溶媒を除去し、オフホワイトの残留物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し(１％濃縮水酸化アンモニウム水溶液を含む5:1クロロホルム/メタノールで溶出)、Oc-(アミノカプロイル)-インジナビル(4D)(0.2866 g；全体の66％)を無色の油として得た。M+H 727.5。
別の処理では、実施例４で得たOc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-Oin,Nin-イソプロピリジニル-インジナビル(4B)(0.2301 g)を、50％トリフルオロ酢酸を含む無水塩化メチレン(3 mL)中で室温にて２時間攪拌し、イソプロピリジニル保護基を除去した。混合液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(５％メタノール含有クロロホルム溶出液)、Oc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-インジナビル(4C)を白い発泡体として(0.1603 g、70％)得た。M+H 949.3。
O c -(アミノカプロイル)-ネルフィナビル(5C)の合成
実施例５で得たOc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-Oar-TBDMS-ネルフィナビル(5B)(0.1752 g)およびフッ化テトラエチルアンモニウム(0.2092 g)を、無水THF(10 mL)中で室温にて２時間攪拌し、TBDMSおよびFMOC保護基の両方をひとつのステップで除去した。混合液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、塩化メチレン中に再溶解させ、水で洗浄し、次いで塩化ナトリウム飽和水溶液(食塩水)で洗浄し、乾燥するまで蒸発させた。残留物を、シリカゲルクロマトグラフィー(2％〜10％メタノール含有クロロホルム勾配で溶出して先に流れた物質を除去し、次いで100％メタノールで生成物を溶出)で精製し、Oc-(アミノカプロイル)-ネルフィナビル(5C)を白い発泡体として(0.0711 g、75％)得た。M+H 681.3。
実施例５で得たOc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-Oar-TBDMS-ネルフィナビル(5B)(0.1752 g)およびフッ化テトラエチルアンモニウム(0.2092 g)を、無水THF(10 mL)中で室温にて２時間攪拌し、TBDMSおよびFMOC保護基の両方をひとつのステップで除去した。混合液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、塩化メチレン中に再溶解させ、水で洗浄し、次いで塩化ナトリウム飽和水溶液(食塩水)で洗浄し、乾燥するまで蒸発させた。残留物を、シリカゲルクロマトグラフィー(2％〜10％メタノール含有クロロホルム勾配で溶出して先に流れた物質を除去し、次いで100％メタノールで生成物を溶出)で精製し、Oc-(アミノカプロイル)-ネルフィナビル(5C)を白い発泡体として(0.0711 g、75％)得た。M+H 681.3。
O c -(アミノカプロイル)-ロピナビル(6B)
Oc-(アミノカプロイル)-ロピナビル(6B)を、シリカゲルクロマトグラフィー(10％メタノールを含む２％水酸化アンモニウム含有クロロホルム)による精製以外は実施例９に記載の条件に従い、実施例６のOc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-ロピナビル(6A、0.100 g)から調製した。生成物6B(0.043 g；56％)を得た。M+H 742.2。
Oc-(アミノカプロイル)-ロピナビル(6B)を、シリカゲルクロマトグラフィー(10％メタノールを含む２％水酸化アンモニウム含有クロロホルム)による精製以外は実施例９に記載の条件に従い、実施例６のOc-(N-FMOC-アミノカプロイル)-ロピナビル(6A、0.100 g)から調製した。生成物6B(0.043 g；56％)を得た。M+H 742.2。
塩化メチレンの代わりに10％ピペリジン含有水中で行った別の反応(0.300 gの(6A))により、上述したような蒸発およびシリカゲルクロマトグラフィーの後に生成物(0.150 g；65％)を得た。
O-アシル化プロテアーゼインヒビターのリンカー伸長による活性化ハプテンの生成
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビル(1C)の合成
実施例９で得たOc-(アミノカプロイル)-リトナビル(1B)(60.9 mg)、トリエチルアミン(10 μL)、およびスクシンイミド-オキシカルボニル塩化ブチリル(Antonian、同書、17.5 mg)を、無水THF(6 mL)中で２時間０℃にて攪拌した。混合液を 減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(30％THFを含む酢酸エチル溶出液)、Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビルを白い固体として(38.8 mg、51％)得た。M+H 1045.2。
実施例９で得たOc-(アミノカプロイル)-リトナビル(1B)(60.9 mg)、トリエチルアミン(10 μL)、およびスクシンイミド-オキシカルボニル塩化ブチリル(Antonian、同書、17.5 mg)を、無水THF(6 mL)中で２時間０℃にて攪拌した。混合液を 減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(30％THFを含む酢酸エチル溶出液)、Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビルを白い固体として(38.8 mg、51％)得た。M+H 1045.2。
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビル(1D)の合成
まず、テレフタル酸ジスクシンイミジル(disuccinimidyl terephthalate)を、Kopiaら、米国特許第5,667,764号の方法により調製した。テレフタル酸ジスクシンイミジル(21.6 mg)およびトリエチルアミン(8 μL)を含む無水塩化メチレン(8 mL)の攪拌溶液に、実施例９で得たOc-(アミノカプロイル)-リトナビル(1B)(48.0 mg)が入った無水塩化メチレン(8 mL)の溶液をゆっくりと添加した。混合液を、アルゴン下で、４時間室温にて攪拌した。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(30％THF含有酢酸エチル溶出液)、Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビルを白い固体(41.6 mg、67％)として得た。M+H 1079。
まず、テレフタル酸ジスクシンイミジル(disuccinimidyl terephthalate)を、Kopiaら、米国特許第5,667,764号の方法により調製した。テレフタル酸ジスクシンイミジル(21.6 mg)およびトリエチルアミン(8 μL)を含む無水塩化メチレン(8 mL)の攪拌溶液に、実施例９で得たOc-(アミノカプロイル)-リトナビル(1B)(48.0 mg)が入った無水塩化メチレン(8 mL)の溶液をゆっくりと添加した。混合液を、アルゴン下で、４時間室温にて攪拌した。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(30％THF含有酢酸エチル溶出液)、Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビルを白い固体(41.6 mg、67％)として得た。M+H 1079。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル(2C)の合成
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル(2C)を、5％〜10％メタノール含有クロロホルムの勾配をゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として使用したこと以外は実施例15に記載の条件に従い、実施例10のOc-(アミノカプロイル)-サキナビル(2B)(52.8 mg)から調製した(48 mg; 72％)。M+H 995.3。
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル(2C)を、5％〜10％メタノール含有クロロホルムの勾配をゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として使用したこと以外は実施例15に記載の条件に従い、実施例10のOc-(アミノカプロイル)-サキナビル(2B)(52.8 mg)から調製した(48 mg; 72％)。M+H 995.3。
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビル(2F)の合成
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビル(2F)を、実施例16に記載の条件に従い、ただし、２％メタノール含有クロロホルムをシリカゲルクロマトグラフィー精製の溶出液として使用して、実施例10のOc-(アミノカプロイル)-サキナビル(2B)(11 mg)から調製した(12 mg; 83％)。M+H 1029.3。
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビル(2F)を、実施例16に記載の条件に従い、ただし、２％メタノール含有クロロホルムをシリカゲルクロマトグラフィー精製の溶出液として使用して、実施例10のOc-(アミノカプロイル)-サキナビル(2B)(11 mg)から調製した(12 mg; 83％)。M+H 1029.3。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビル(3C)の合成
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビル(3C)を、実施例15に記載の条件に従い、ただし、攪拌を６時間とし、かつシリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として５％メタノール含有クロロホルムを使用して、実施例11のOc-(アミノカプロイル)-アンプレナビル(3B)(104.0 mg)から調製した(80 mg；57％)。M+Na 852.4。
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビル(3C)を、実施例15に記載の条件に従い、ただし、攪拌を６時間とし、かつシリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として５％メタノール含有クロロホルムを使用して、実施例11のOc-(アミノカプロイル)-アンプレナビル(3B)(104.0 mg)から調製した(80 mg；57％)。M+Na 852.4。
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル(3D)の合成
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル(3D)を、実施例16に記載の条件に従い、ただし４％メタノール含有クロロホルムをシリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として使用して、実施例11のOc-(アミノカプロイル)-アンプレナビル(3B)(86.5 mg)から調製した(70.3 mg; 58％)。M+Na 886.4。
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル(3D)を、実施例16に記載の条件に従い、ただし４％メタノール含有クロロホルムをシリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として使用して、実施例11のOc-(アミノカプロイル)-アンプレナビル(3B)(86.5 mg)から調製した(70.3 mg; 58％)。M+Na 886.4。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-インジナビル(4E)の合成
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-インジナビル(4E)を、実施例15に記載の条件に従い、ただし、攪拌を６時間とし、かつクロロホルム中メタノールの5％から17％に上がる勾配をシリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として使用して、実施例12のOc-(アミノカプロイル)-インジナビル(4D)(80.0 mg)から調製した(37.4 mg; 36％)。M+H 938.6。
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-インジナビル(4E)を、実施例15に記載の条件に従い、ただし、攪拌を６時間とし、かつクロロホルム中メタノールの5％から17％に上がる勾配をシリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として使用して、実施例12のOc-(アミノカプロイル)-インジナビル(4D)(80.0 mg)から調製した(37.4 mg; 36％)。M+H 938.6。
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-インジナビル(4F)の合成
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ベンゾイル)-アミノカプロイル]-インジナビル(4F)を、実施例16に記載の条件に従い、ただし５％メタノール含有クロロホルムをシリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として使用して、実施例12のO-(アミノカプロイル)-インジナビル(4D)(90.0 mg)から調製した(61.8 mg; 51％)。M+H 972.6。
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ベンゾイル)-アミノカプロイル]-インジナビル(4F)を、実施例16に記載の条件に従い、ただし５％メタノール含有クロロホルムをシリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として使用して、実施例12のO-(アミノカプロイル)-インジナビル(4D)(90.0 mg)から調製した(61.8 mg; 51％)。M+H 972.6。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビル(5D)の合成
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビル(5D)を、クロロホルム中メタノールの２％から５％に上がる勾配をシリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として使用する以外は実施例15に記載の条件に従い、実施例13のOc-(アミノカプロイル)-ネルフィナビル(5C)(60.0 mg)から調製した(67.2 mg; 85％)。M+H 892.5。
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビル(5D)を、クロロホルム中メタノールの２％から５％に上がる勾配をシリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として使用する以外は実施例15に記載の条件に従い、実施例13のOc-(アミノカプロイル)-ネルフィナビル(5C)(60.0 mg)から調製した(67.2 mg; 85％)。M+H 892.5。
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビル(5E)の合成
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビル(5E)を、５％メタノールを含むクロロホルムをシリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として使用する以外は実施例16に記載の条件に従い、実施例13のO-(アミノカプロイル)-ネルフィナビル(5C)(61.8 mg)から調製した(43.3 mg; 52％)。M+H 926.6。
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビル(5E)を、５％メタノールを含むクロロホルムをシリカゲルクロマトグラフィー精製における溶出液として使用する以外は実施例16に記載の条件に従い、実施例13のO-(アミノカプロイル)-ネルフィナビル(5C)(61.8 mg)から調製した(43.3 mg; 52％)。M+H 926.6。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビル(6C)の合成
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビル(6C)を、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製(５％メタノール含有クロロホルム)以外は実施例15に記載の条件に従い、実施例14のOc-(アミノカプロイル)-ロピナビル(6B)(86 mg)から調製した(68 mg; 62％)。M+H 953.4。
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビル(6C)を、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製(５％メタノール含有クロロホルム)以外は実施例15に記載の条件に従い、実施例14のOc-(アミノカプロイル)-ロピナビル(6B)(86 mg)から調製した(68 mg; 62％)。M+H 953.4。
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビル(6D)の合成
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビル(6D)を、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製(50％テトラヒドロフラン含有酢酸エチル)以外は実施例16に記載の条件に従い、実施例14のO-(アミノカプロイル)-ロピナビル(6B)(80 mg)から調製した(35 mg；33％)。M+H 987.3。
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビル(6D)を、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製(50％テトラヒドロフラン含有酢酸エチル)以外は実施例16に記載の条件に従い、実施例14のO-(アミノカプロイル)-ロピナビル(6B)(80 mg)から調製した(35 mg；33％)。M+H 987.3。
O c -3-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-プロピオニル]-サキナビル(2I)の合成
Oc-3-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-プロピオニル]-サキナビルを、実施例38に記載の条件に従い、実施例７のOc-[3-(4'-カルボキシフェニル)-プロピオニル)]-サキナビル(2H)から調製した(96％)。M+H 944.5。
Oc-3-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-プロピオニル]-サキナビルを、実施例38に記載の条件に従い、実施例７のOc-[3-(4'-カルボキシフェニル)-プロピオニル)]-サキナビル(2H)から調製した(96％)。M+H 944.5。
N-マレイミドプロピオニル-L-グルタミル-(γ-O c -サキナビル)-L-アラニン(2P)の合成
Boc-L-Glu(OBzl)OSu(Bachem)(434 mg (1 mmol))を、L-Ala-OtBu. HCl(182 mg (1 mmol))と、10 mLのDMF含有トリエチルアミン(202 mg)中で反応させる。16時間室温にて攪拌した後、反応混合液をロータリーエバポレーターで乾燥させ、残留物を塩化メチレン中で再溶解させ、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させる。残留物を、メタノール(50 mL)中に再溶解させ、パー(Parr)フラスコに移す。10％Pd/C触媒(Aldrich)(50 mg)を添加し、パーシェーカー上でフラスコに40 psiの水素ガスを充填する。混合液を、室温にて、２時間またはそれ以上水素が消費されないと見とめられるまで振とうする。パーフラスコから気体を抜き、アルゴンガスを充填する。混合液を、セライト(Celite)に通して濾過し、濾過液をロータリーエバポレーターにかけて、粗Boc-L-Glu-L-Ala-OtBuを得る。
Boc-L-Glu(OBzl)OSu(Bachem)(434 mg (1 mmol))を、L-Ala-OtBu. HCl(182 mg (1 mmol))と、10 mLのDMF含有トリエチルアミン(202 mg)中で反応させる。16時間室温にて攪拌した後、反応混合液をロータリーエバポレーターで乾燥させ、残留物を塩化メチレン中で再溶解させ、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させる。残留物を、メタノール(50 mL)中に再溶解させ、パー(Parr)フラスコに移す。10％Pd/C触媒(Aldrich)(50 mg)を添加し、パーシェーカー上でフラスコに40 psiの水素ガスを充填する。混合液を、室温にて、２時間またはそれ以上水素が消費されないと見とめられるまで振とうする。パーフラスコから気体を抜き、アルゴンガスを充填する。混合液を、セライト(Celite)に通して濾過し、濾過液をロータリーエバポレーターにかけて、粗Boc-L-Glu-L-Ala-OtBuを得る。
サキナビル(335 mg)、Boc-L-Glu-L-Ala-OtBu(187 mg)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(103 mg)、ヒドロキシベンゾトリアゾール(67.5 mg)、N-エチルモルホリン(57.5 mg)、およびジメチルアミノピリジン(61 mg)を、無水THF(5 mL)中で一晩攪拌した。反応液を、酢酸エチルで希釈し、濾過した。濾過液を、2 M HCl、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、および食塩水で洗浄した。有機層を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(５％メタノールを含む塩化メチレン溶出液)、N-t-ブチルオキシカルボニル-L-グルタミル-(γ-Oc-サキナビル)-L-アラニン t-ブチルエステル(2N)をオフホワイトの発泡体(384 mg、75％)として得た。M+H 1027。
N-t-ブチルオキシカルボニル-L-グルタミル-(γ-Oc-サキナビル)-L-アラニン t-ブチルエステル(2N, 3.0 mg)を、50％トリフルオロ酢酸を含む無水塩化メチレン(0.05 mL)中で１時間攪拌し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物を、無水塩化メチレン(0.1 mL)中で溶解し、トリエチルアミン(1 μL)およびマレイミドプロピオン酸スクシンイミジル(Ede, TregearおよびHaralambidis, バイオコンジュゲート Chem. 5, 373-378, 1994；0.9 mgの方法により合成)と30分間攪拌した。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、分取用TLC(25％メタノール含有クロロホルム展開液)で直接精製して、N-マレイミドプロピオニル-L-グルタミル-(γ-Oc-サキナビル)-L-アラニン(2P)を白い固体として(1.7 mg、57％)得た。M+H 1022.3。
N-マレイミドプロピオニル-L-Ala-L-Glu-(γ-O c -サキナビル)(2Q)の合成
L-Ala-OtBuをL-Glu(OBzl)-OtBu(Bachem)に、およびBoc-L-Glu(OBzl)-OSuをBoc-L-Ala-OSu(Bachem)に置き換えて、実施例29のBoc-L-Glu-L-Ala-OtBuの手順を使用して、Boc-L-Ala-L-Glu-OtBuをまず合成する。Boc-L-Ala-L-Glu(γ-Oc-サキナビル)-OtBu(2O)を、中間体2Nについて実施例28に記載した条件に従い、サキナビル(335 mg)およびBoc-L-Ala-L-Glu-OtBu(187 mg)から調製した(84％)。M+H 1027。
L-Ala-OtBuをL-Glu(OBzl)-OtBu(Bachem)に、およびBoc-L-Glu(OBzl)-OSuをBoc-L-Ala-OSu(Bachem)に置き換えて、実施例29のBoc-L-Glu-L-Ala-OtBuの手順を使用して、Boc-L-Ala-L-Glu-OtBuをまず合成する。Boc-L-Ala-L-Glu(γ-Oc-サキナビル)-OtBu(2O)を、中間体2Nについて実施例28に記載した条件に従い、サキナビル(335 mg)およびBoc-L-Ala-L-Glu-OtBu(187 mg)から調製した(84％)。M+H 1027。
N-マレイミドプロピオニル-L-Ala-L-Glu-(γ-Oc-サキナビル)(2Q)を、実施例28に記載の条件に従い、N-t-Boc-L-Ala-L-Glu-(γ-Oc-サキナビル)-OtBu(2O、3.0 mg)から調製した(57％)。M+H 1022.3。
O c -(マレイミド-プロピオニル-アミノカプロイル)-サキナビル(2M)の合成
実施例10で得たOc-(アミノカプロイル)-サキナビル(2B)(0.1098 g)、マレイミドプロピオン酸スクシンイミジル(0.048 g)、およびトリエチルアミン(20 μL)を無水塩化メチレン(1.5 mL)中で45分間攪拌した。混合液を 減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(４％メタノールを含むクロロホルム溶出液)、Oc-(マレイミド-プロピオニル-アミノカプロイル)-サキナビル(2M)を無色の油として(0.0647 g、49％)得た。M+H 935.5。
実施例10で得たOc-(アミノカプロイル)-サキナビル(2B)(0.1098 g)、マレイミドプロピオン酸スクシンイミジル(0.048 g)、およびトリエチルアミン(20 μL)を無水塩化メチレン(1.5 mL)中で45分間攪拌した。混合液を 減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(４％メタノールを含むクロロホルム溶出液)、Oc-(マレイミド-プロピオニル-アミノカプロイル)-サキナビル(2M)を無色の油として(0.0647 g、49％)得た。M+H 935.5。
中央ヒドロキシルにおけるプロテアーゼインヒビターのアルキル化
O ar -メトキシエトキシメチル-ネルフィナビル(5M)の合成
28 mg(0.70 mmol)のNaH(60％油に)に、1 mLのヘキサンを添加した。混合液を、アルゴン下にて２〜３分間室温にて攪拌させ、ヘキサンを静かに注いだ。残留物に、1 mLの新しく蒸留したTHFおよび0.5 mLの無水DMFを添加し、その後、50 mg(0.075 mmol)のメシル酸ネルフィナビルを固体で数回に分けて添加する。混合液を、アルゴン下50℃にて45分間加熱し、室温まで冷ました。反応混合液に、12.5 μL(0.10 mmol)の2-塩化メトキシエトキシメチル(塩化MEM)を添加し、アルゴン下室温にて18時間攪拌させる。反応混合液に、1 mLの50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)を添加し、混合液を減圧下で濃縮した。残留物に、25 mLのCHCl3および15 mLの50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)を添加した。有機層を分離し、さらなる4 x 25 mL of CHCl3で水性層を抽出した。全ての有機抽出物を合わせ、乾燥させ(無水Na2SO4)、濃縮させた。粗生成物を、分取用薄膜クロマトグラフィー(シリカゲル、EM Science Cat. No. 5717-7)により20:1 CHCl3:MeOHを溶出溶媒として使用して精製し、43 mg(0.065 mmol, 88％)のOar-メトキシエトキシメチル-ネルフィナビル(5M)を白い固体として得た。M+H 656。
28 mg(0.70 mmol)のNaH(60％油に)に、1 mLのヘキサンを添加した。混合液を、アルゴン下にて２〜３分間室温にて攪拌させ、ヘキサンを静かに注いだ。残留物に、1 mLの新しく蒸留したTHFおよび0.5 mLの無水DMFを添加し、その後、50 mg(0.075 mmol)のメシル酸ネルフィナビルを固体で数回に分けて添加する。混合液を、アルゴン下50℃にて45分間加熱し、室温まで冷ました。反応混合液に、12.5 μL(0.10 mmol)の2-塩化メトキシエトキシメチル(塩化MEM)を添加し、アルゴン下室温にて18時間攪拌させる。反応混合液に、1 mLの50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)を添加し、混合液を減圧下で濃縮した。残留物に、25 mLのCHCl3および15 mLの50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)を添加した。有機層を分離し、さらなる4 x 25 mL of CHCl3で水性層を抽出した。全ての有機抽出物を合わせ、乾燥させ(無水Na2SO4)、濃縮させた。粗生成物を、分取用薄膜クロマトグラフィー(シリカゲル、EM Science Cat. No. 5717-7)により20:1 CHCl3:MeOHを溶出溶媒として使用して精製し、43 mg(0.065 mmol, 88％)のOar-メトキシエトキシメチル-ネルフィナビル(5M)を白い固体として得た。M+H 656。
O ar -MEM-O c -カルボキシメチル-ネルフィナビル(5N)の合成
14 mg(0.35 mmol)のNaH(油中60％)に、1 mLのヘキサンを添加した。混合液を、室温にてアルゴン下で２〜３分で攪拌させ、ヘキサンを静かに注いだ。残留物に、2 mLの新しく蒸留したTHF、および1 mL無水DMFを添加した。1 mLの新しく蒸留したTHFに入った23 mg(0.035 mmol)の5Mの溶液を、反応混合液に添加した。反応混合液を、アルゴン下で１時間50℃にて加熱し、室温まで冷却した。反応混合液に、500μLの新しく蒸留したTHFに入った6.5μL(0.043 mmol)のt-ブチルブロモ酢酸塩(Aldrich Chemical Co.)の溶液を添加し、反応混合液を室温にて18時間アルゴン下で攪拌させた。反応混合液に、1 mLの水を添加し、混合液を減圧下で濃縮した。残留物に、20 mLのCHCl3および15 mLの水を添加した。有機層を分離し、水性層をさらに4 x 20 mLのCHCl3で抽出した。全ての有機抽出物を合わせ、乾燥させ(Na2SO4)、濃縮した。粗生成物を、20％メタノール含有クロロホルムを溶出液として使用した分取用薄膜クロマトグラフィー(シリカゲル)により精製して、22 mg(0.031 mmol, 88 ％)のOar-MEM-Oc-カルボキシメチルネルフィナビル(5N)を白い固体として得た。M+H 714。
14 mg(0.35 mmol)のNaH(油中60％)に、1 mLのヘキサンを添加した。混合液を、室温にてアルゴン下で２〜３分で攪拌させ、ヘキサンを静かに注いだ。残留物に、2 mLの新しく蒸留したTHF、および1 mL無水DMFを添加した。1 mLの新しく蒸留したTHFに入った23 mg(0.035 mmol)の5Mの溶液を、反応混合液に添加した。反応混合液を、アルゴン下で１時間50℃にて加熱し、室温まで冷却した。反応混合液に、500μLの新しく蒸留したTHFに入った6.5μL(0.043 mmol)のt-ブチルブロモ酢酸塩(Aldrich Chemical Co.)の溶液を添加し、反応混合液を室温にて18時間アルゴン下で攪拌させた。反応混合液に、1 mLの水を添加し、混合液を減圧下で濃縮した。残留物に、20 mLのCHCl3および15 mLの水を添加した。有機層を分離し、水性層をさらに4 x 20 mLのCHCl3で抽出した。全ての有機抽出物を合わせ、乾燥させ(Na2SO4)、濃縮した。粗生成物を、20％メタノール含有クロロホルムを溶出液として使用した分取用薄膜クロマトグラフィー(シリカゲル)により精製して、22 mg(0.031 mmol, 88 ％)のOar-MEM-Oc-カルボキシメチルネルフィナビル(5N)を白い固体として得た。M+H 714。
O ar -MEM-O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチル)-ネルフィナビル(5O)の合成
活性化エステル(5O)を、実施例38に記載の手順に従い、(5N)から調製する。
活性化エステル(5O)を、実施例38に記載の手順に従い、(5N)から調製する。
O c -(カルボキシメチル)-サキナビル(2AA)の合成
65 mg(1.6 mmol)のNaH(油中60％)に、2 mLのヘキサンを添加した。混合液を、室温にてアルゴン下で２〜３分間攪拌させ、ヘキサンを静かに注いだ。残留物に、2 mLの新しく蒸留したTHFおよび1 mLの無水DMFを添加した。メシル酸サキナビル(2、112mg、0.14 mmol)をいくつかに分けて固体として反応混合液に添加した。反応混合液を、50℃にて１時間加熱し、室温まで冷却させた。反応混合液に、500μLの新しく蒸留したTHFに入った30μL(0.203 mmol)のt-ブチルブロモ酢酸塩の溶液を添加し、反応液を室温にてアルゴン下で18時間攪拌した。反応混合液に、1 mLの水を添加し、混合液を減圧下で濃縮した。残留物に、20mLの水を添加し、反応液のpHを、５％リン酸で6に調節した。反応混合液に、25 mLのCHCl3を添加した。有機層を分離し、さらに4×25 mLのCHCl3で水性層を抽出した。全ての有機抽出物を合わせ、乾燥させ(Na2SO4)、濃縮させた。残留物を、20:1 CHCl3:MeOHを溶出液として用いるフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)で精製し、68 mg(0.093 mmol、64 ％)のOc-(カルボキシメチル)-サキナビル(2AA)を白い固体として得た。M+H 729。
65 mg(1.6 mmol)のNaH(油中60％)に、2 mLのヘキサンを添加した。混合液を、室温にてアルゴン下で２〜３分間攪拌させ、ヘキサンを静かに注いだ。残留物に、2 mLの新しく蒸留したTHFおよび1 mLの無水DMFを添加した。メシル酸サキナビル(2、112mg、0.14 mmol)をいくつかに分けて固体として反応混合液に添加した。反応混合液を、50℃にて１時間加熱し、室温まで冷却させた。反応混合液に、500μLの新しく蒸留したTHFに入った30μL(0.203 mmol)のt-ブチルブロモ酢酸塩の溶液を添加し、反応液を室温にてアルゴン下で18時間攪拌した。反応混合液に、1 mLの水を添加し、混合液を減圧下で濃縮した。残留物に、20mLの水を添加し、反応液のpHを、５％リン酸で6に調節した。反応混合液に、25 mLのCHCl3を添加した。有機層を分離し、さらに4×25 mLのCHCl3で水性層を抽出した。全ての有機抽出物を合わせ、乾燥させ(Na2SO4)、濃縮させた。残留物を、20:1 CHCl3:MeOHを溶出液として用いるフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)で精製し、68 mg(0.093 mmol、64 ％)のOc-(カルボキシメチル)-サキナビル(2AA)を白い固体として得た。M+H 729。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチル)-サキナビル(2BB)の合成
活性化エステル(2BB)を、実施例38に記載の手順に従い(2AA)から調製した。
活性化エステル(2BB)を、実施例38に記載の手順に従い(2AA)から調製した。
中央ヒドロキシル以外の位置におけるプロテアーゼインヒビターの誘導化
エチルO ar -カルボキシプロピル-ネルフィナビル(5H)の合成
ネルフィナビル(5)フェノール(OHar)を、以下のように選択的にアルキル化した：ネルフィナビル(62.5 mg)および水素化ナトリウム(2.8 mg)を15分間無水DMF(1 mL)中で室温にて攪拌させた。4-ブロモ酪酸エチル(27.6 mg、Fluka Chemical Corp.)を添加し、混合液を３時間室温にて攪拌した。混合液を 減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(３％メタノール含有クロロホルム溶出液) エチルOar-カルボキシプロピル-ネルフィナビル(5H)を白い固体として得た(74.7 mg, 95％)。M+H 682.4。
ネルフィナビル(5)フェノール(OHar)を、以下のように選択的にアルキル化した：ネルフィナビル(62.5 mg)および水素化ナトリウム(2.8 mg)を15分間無水DMF(1 mL)中で室温にて攪拌させた。4-ブロモ酪酸エチル(27.6 mg、Fluka Chemical Corp.)を添加し、混合液を３時間室温にて攪拌した。混合液を 減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(３％メタノール含有クロロホルム溶出液) エチルOar-カルボキシプロピル-ネルフィナビル(5H)を白い固体として得た(74.7 mg, 95％)。M+H 682.4。
O ar -カルボキシプロピル-ネルフィナビル(5I)の合成
実施例31で得たエチルOar-カルボキシプロピル-ネルフィナビル(5H)(0.1440 g)および水酸化リチウム(0.0960 g)を一晩50％水性THF(10 mL)中で攪拌させた。反応混合液を落ち着かせ(二層)、有機層を分離し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。サンプルを、分取用RP-HPLC(C18；45％アセトニトリル-0.1％トリフルオロ酢酸含有水)により精製して、分析用サンプルを得た。残ったものを乾燥させ、Oar-カルボキシプロピル-ネルフィナビル(5I)を白い固体として得た(0.1234 g、89％)。これは1H-NMR分光法で極めて純粋な物質であることが示された。M+H 654.3
実施例31で得たエチルOar-カルボキシプロピル-ネルフィナビル(5H)(0.1440 g)および水酸化リチウム(0.0960 g)を一晩50％水性THF(10 mL)中で攪拌させた。反応混合液を落ち着かせ(二層)、有機層を分離し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。サンプルを、分取用RP-HPLC(C18；45％アセトニトリル-0.1％トリフルオロ酢酸含有水)により精製して、分析用サンプルを得た。残ったものを乾燥させ、Oar-カルボキシプロピル-ネルフィナビル(5I)を白い固体として得た(0.1234 g、89％)。これは1H-NMR分光法で極めて純粋な物質であることが示された。M+H 654.3
O ar -(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピル)-ネルフィナビル(5J)の合成
実施例37で得たOar-カルボキシプロピル-ネルフィナビル(5I)(0.1210 g、0.185 mmol)、N-ヒドロキシスクシンイミド(0.0426 g、0.37 mmol、2 mol.当量(equiv).; Aldrich Chemical Co.)およびエチルジエチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩(0.0710 g、0.37 mmol、2 mol.当量；Sigma Chemical Co)を、10％無水DMF-塩化メチレン(9 mL)中で２時間攪拌した。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー(３％メタノールの入ったクロロホルム溶出液)、その後分取用RP-HPLC(C18；45％アセトニトリル-0.1％トリフルオロ酢酸を含む水)により精製して、Oar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロポキシ)-ネルフィナビルを得た(5J、0.0681 g、49％)。M+H 751.3。
実施例37で得たOar-カルボキシプロピル-ネルフィナビル(5I)(0.1210 g、0.185 mmol)、N-ヒドロキシスクシンイミド(0.0426 g、0.37 mmol、2 mol.当量(equiv).; Aldrich Chemical Co.)およびエチルジエチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩(0.0710 g、0.37 mmol、2 mol.当量；Sigma Chemical Co)を、10％無水DMF-塩化メチレン(9 mL)中で２時間攪拌した。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー(３％メタノールの入ったクロロホルム溶出液)、その後分取用RP-HPLC(C18；45％アセトニトリル-0.1％トリフルオロ酢酸を含む水)により精製して、Oar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロポキシ)-ネルフィナビルを得た(5J、0.0681 g、49％)。M+H 751.3。
上述したように、ただし5I(0.2764 g)を使用して別の反応を行い、その後シリカゲルクロマトグラフィー(３％メタノール含有クロロホルム溶出液)を行って、粗いが極めて純粋な生成物(5J, 0.3526 g)を油として得た。
O ar -(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ- co -グリシル-グリシル-プロピル)-ネルフィナビル(5K)の合成
Oar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-プロピル)-ネルフィナビル(5K)を、実施例41の条件に従い、実施例38のOar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロポキシ)-ネルフィナビル(5J, 0.32 g)から調製した(0.0657 g；32％)。M+H 950.4。
Oar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-プロピル)-ネルフィナビル(5K)を、実施例41の条件に従い、実施例38のOar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロポキシ)-ネルフィナビル(5J, 0.32 g)から調製した(0.0657 g；32％)。M+H 950.4。
N-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-アンプレナビル(3G)の合成
アンプレナビル(3、0.1517 g)およびスクシンイミド-オキシカルボニル塩化ブチリル(0.0817 g)を、無水DMF(3 mL)中で50℃にて一晩攪拌した。混合液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(15％THFを含む酢酸エチル溶出液)、N-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-アンプレナビル(3G)を白い固体として得た(0.1395 g, 61％)。M+Na 739.2。スペクトルデータ(1H-NMR)は、アニリン窒素における官能基と一致した。
アンプレナビル(3、0.1517 g)およびスクシンイミド-オキシカルボニル塩化ブチリル(0.0817 g)を、無水DMF(3 mL)中で50℃にて一晩攪拌した。混合液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(15％THFを含む酢酸エチル溶出液)、N-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-アンプレナビル(3G)を白い固体として得た(0.1395 g, 61％)。M+Na 739.2。スペクトルデータ(1H-NMR)は、アニリン窒素における官能基と一致した。
N-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ- co -グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビル(3H)の合成
(a) 実施例40で得たN-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピオニル)-アンプレナビル(3G)(131.5 mg)、およびグリシル-グリシル-4-アミノ酪酸(43.4 mg、Bachem California Inc., CA)を７時間25％水性ホウ酸塩(pH 10)含有THF(5 mL)中で攪拌させた。混合液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、分取用RP-HPLC(C18；45％アセトニトリル-0.1％トリフルオロ酢酸含有水)により直接精製して、N-(3-カルボキシプロピルアミノ-coグリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビルを白い固体として得た(98.2 mg、65％)。M-H 817.4。
(a) 実施例40で得たN-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピオニル)-アンプレナビル(3G)(131.5 mg)、およびグリシル-グリシル-4-アミノ酪酸(43.4 mg、Bachem California Inc., CA)を７時間25％水性ホウ酸塩(pH 10)含有THF(5 mL)中で攪拌させた。混合液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、分取用RP-HPLC(C18；45％アセトニトリル-0.1％トリフルオロ酢酸含有水)により直接精製して、N-(3-カルボキシプロピルアミノ-coグリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビルを白い固体として得た(98.2 mg、65％)。M-H 817.4。
(b) N-(4-カルボキシプロピルアミノ-coグリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビル(40.9 mg)、N-ヒドロキシスクシンイミド(11.5 mg)、およびエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド(19.2 mg)を、20％無水DMF含有塩化メチレン(2.5 mL)中で５時間攪拌させた。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製して(12％メタノール含有クロロホルム溶出液)、N-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビル(3H)を白い発泡体として産生させた(37.9 mg、83％)。M+H 938.4。
プロテアーゼインヒビターのウレタン誘導化
エチルO c -(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル(2J)の合成
サキナビルメタンスルホネート(2、76.7 mg)、エチルイソシアナト酢酸塩(23.0 mg、Aldrich Chemical Co.)、およびトリエチルアミン(30 μL)を、無水DMF(1 mL)中で５日間50℃にて攪拌させた。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(5％メタノール含有クロロホルム溶出液)、エチルOc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル(2J)を白い固体として得た(32.3 mg、40％)。M+H 800.4。
サキナビルメタンスルホネート(2、76.7 mg)、エチルイソシアナト酢酸塩(23.0 mg、Aldrich Chemical Co.)、およびトリエチルアミン(30 μL)を、無水DMF(1 mL)中で５日間50℃にて攪拌させた。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより直接精製し(5％メタノール含有クロロホルム溶出液)、エチルOc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル(2J)を白い固体として得た(32.3 mg、40％)。M+H 800.4。
O c -(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル(2K)の合成
実施例36で得たエチルOc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル(2J)(0.1600 g)、および水酸化リチウム(0.0960 g)を、50％水性THF(10 mL)中で１時間攪拌させた。有機層を単離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で乾燥するまで蒸発させて、Oc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル(2K)を白い発泡体として得た(0.1403 g, 91％)。M+H 772.3。
実施例36で得たエチルOc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル(2J)(0.1600 g)、および水酸化リチウム(0.0960 g)を、50％水性THF(10 mL)中で１時間攪拌させた。有機層を単離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で乾燥するまで蒸発させて、Oc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル(2K)を白い発泡体として得た(0.1403 g, 91％)。M+H 772.3。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチルアミノカルボニル)-サキナビル(2L)の合成
実施例43のOc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル(2K)(0.1930 g)、スクシンイミジルテトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩(0.1882 g, Aldrich Chemical Co.)およびジイソプロピルエチルアミン(0.15 mL)を、無水THF(10 mL)中で一晩攪拌させた。HPLC-MSにより、80％の反応完結度、生成物ピーク(2L)M+H 869.3が示された。
実施例43のOc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル(2K)(0.1930 g)、スクシンイミジルテトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩(0.1882 g, Aldrich Chemical Co.)およびジイソプロピルエチルアミン(0.15 mL)を、無水THF(10 mL)中で一晩攪拌させた。HPLC-MSにより、80％の反応完結度、生成物ピーク(2L)M+H 869.3が示された。
O c -[(4-メトキシカルボニルフェニル)-メチルアミノ- co -グリシル-カルボニル]-サキナビル(2W)の合成
実施例43で得たOc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル(2K)(0.1929 g)、およびスクシンイミジルテトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩(0.1505 g)を、無水テトラヒドロフラン(10 mL)含有ジイソプロピルエチルアミン(0.15 mL)中で攪拌させて、(2L)をin situで得た。メチル-4-アミノ安息香酸メチル塩酸塩(0.1008 g、Aldrich Chemical Co.)、およびジイソプロピルエチルアミン(0.15 mL)を添加し、３時間攪拌した。混合液を 減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲル分取用TLC(50％酢酸エチルおよび２％メタノール含有クロロホルム)により直接精製して、2Wを白い固体として得た(0.1905 g、83％)。M+H 919.4。
実施例43で得たOc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-サキナビル(2K)(0.1929 g)、およびスクシンイミジルテトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩(0.1505 g)を、無水テトラヒドロフラン(10 mL)含有ジイソプロピルエチルアミン(0.15 mL)中で攪拌させて、(2L)をin situで得た。メチル-4-アミノ安息香酸メチル塩酸塩(0.1008 g、Aldrich Chemical Co.)、およびジイソプロピルエチルアミン(0.15 mL)を添加し、３時間攪拌した。混合液を 減圧下で乾燥するまで蒸発させ、シリカゲル分取用TLC(50％酢酸エチルおよび２％メタノール含有クロロホルム)により直接精製して、2Wを白い固体として得た(0.1905 g、83％)。M+H 919.4。
O c -[(4-カルボキシフェニル)-メチルアミノ- co -グリシル-カルボニル]-サキナビル(2X)の合成
実施例45で得たOc-[(4-メトキシカルボニルフェニル)-メチルアミノ-co-グリシル-カルボニル]-サキナビル(2W)(0.232 g)を、メタノール(10 mL)中に溶解した。水酸化リチウム(0.154 g)および水(2.5 mL)を添加し、反応液を一晩攪拌した。反応混合液を塩化メチレンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(10％メタノールが入った２％酢酸含有クロロホルム)で精製して、2Xを白い固体として得た(0.100 g、44％)。M+H 772.3。
実施例45で得たOc-[(4-メトキシカルボニルフェニル)-メチルアミノ-co-グリシル-カルボニル]-サキナビル(2W)(0.232 g)を、メタノール(10 mL)中に溶解した。水酸化リチウム(0.154 g)および水(2.5 mL)を添加し、反応液を一晩攪拌した。反応混合液を塩化メチレンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(10％メタノールが入った２％酢酸含有クロロホルム)で精製して、2Xを白い固体として得た(0.100 g、44％)。M+H 772.3。
O c -[4-(スクシンイミド-オキシカルボニル-フェニル)-メチルアミノ- co -グリシル-カルボニル]-サキナビル(2Y)の合成
Oc-[(4-スクシンイミド-オキシカルボニル-フェニル)-メチルアミノ-co-グリシル-カルボニル]-サキナビル(2Y)を、実施例38に記載の条件に従い、実施例46で得たOc-[(4-カルボキシフェニル)-メチルアミノ-co-グリシル-カルボニル]-サキナビル(2X)(85 mg)から調製した。M+H 1002.3。
Oc-[(4-スクシンイミド-オキシカルボニル-フェニル)-メチルアミノ-co-グリシル-カルボニル]-サキナビル(2Y)を、実施例38に記載の条件に従い、実施例46で得たOc-[(4-カルボキシフェニル)-メチルアミノ-co-グリシル-カルボニル]-サキナビル(2X)(85 mg)から調製した。M+H 1002.3。
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-アミノカルボニル]-サキナビル(2U)の合成
5 mLの新しく蒸留したDMFに入った50 mg(65.2 μmol)のメシル酸サキナビル(2)、および9 μL(65.2 μmol)トリエチルアミンを、約10分間周囲温度にて、透明な溶液が得られるまで攪拌させた。236.1 mg(1.3 mmol)の4-イソシアナト塩化ベンゾイルを添加したところ、混合液は直ぐに赤に変わった。室温にて２時間放置させた後、溶液の１μLのサンプルを分析用HPLC(Vydac C18カラム、300Å、５μm、4.6×250 mm；溶出液Ａ：Millipore水/0.1％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸；60分かけて0％Ｂ含有Ａから60％Ｂ含有Ａへの勾配)に注入した。226 nmでのクロマトグラフィープロフィールは、抽出物のほぼ完全な誘導化(tr = 45.1分)、およびいくらかの副生成物を伴ったウレタンの形成(tr = 48.3分)を示した。
5 mLの新しく蒸留したDMFに入った50 mg(65.2 μmol)のメシル酸サキナビル(2)、および9 μL(65.2 μmol)トリエチルアミンを、約10分間周囲温度にて、透明な溶液が得られるまで攪拌させた。236.1 mg(1.3 mmol)の4-イソシアナト塩化ベンゾイルを添加したところ、混合液は直ぐに赤に変わった。室温にて２時間放置させた後、溶液の１μLのサンプルを分析用HPLC(Vydac C18カラム、300Å、５μm、4.6×250 mm；溶出液Ａ：Millipore水/0.1％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸；60分かけて0％Ｂ含有Ａから60％Ｂ含有Ａへの勾配)に注入した。226 nmでのクロマトグラフィープロフィールは、抽出物のほぼ完全な誘導化(tr = 45.1分)、およびいくらかの副生成物を伴ったウレタンの形成(tr = 48.3分)を示した。
22 mgの粗生成物を、分取用HPLC(Vydac C18カラム、300Å、15-20μm、50×250 mm；溶出液Ａ：Millipore水/0.1％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：80％アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸；140分間かけて0％Ｂ含有Ａから60％Ｂ含有Ａへの勾配)により混合液から単離した。約62〜65％のＢで溶出した適切な画分をプールし、凍結乾燥させ、第２のクロマトグラフィーステップに供した(改変型勾配：120分かけて0％のＢ含有Ａから75％Ｂ含有Ａへの勾配)。10 mg(18％)の僅かに赤い純生成物を、画分16および17から得た。精製したカルボン酸中間体2T。M+H 834、M+Na 856。
10 mg(12 μmol)のOc-(4-カルボキシフェニルアミノカルボニル)-サキナビル(2T)を、500μLの新しく蒸留したDMFおよび1.7 mg(15μmol)N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)に溶解し、2.9 mg(15 μmol)エチル-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(EDC)を添加した。溶液を室温にてアルゴン下で５時間攪拌し、再度1.7 mg(15μmol)NHSおよび2.9 mgEDCを添加した。混合液を、さらに攪拌して、2.5日間室温にて反応させた。HPLCは、NHSエステル2Uの形成を示し、これは単離せずin situでさらなる反応のために使用した。
エチルO c -(カルボキシメチルアミノカルボニル)-O ar -TBDMS-ネルフィナビル(5P)の合成
実施例５のOar-TBDMS-ネルフィナビル(5A)(0.102g)、エチル酢酸イソシアナト(42μL)、およびトリエチルアミン(55μL)を、無水DMF(2 mL)中で50℃にて3.5日間攪拌させた。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、まずシリカゲルクロマトグラフィー(2％メタノール含有クロロホルム)で精製し、その後分取用RP-HPLC(C18)(60％アセトニトリル-0.1％トリフルオロ酢酸含有水/30分間で70％アセトニトリル-0.1％トリフルオロ酢酸含有水)で精製して、回収した出発材料5A(0.0503 g；43％)を得て、その後、適切な画分の凍結乾燥により生成物5P(0.0623 g；45％)を得た。M+H 811.4。
実施例５のOar-TBDMS-ネルフィナビル(5A)(0.102g)、エチル酢酸イソシアナト(42μL)、およびトリエチルアミン(55μL)を、無水DMF(2 mL)中で50℃にて3.5日間攪拌させた。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、まずシリカゲルクロマトグラフィー(2％メタノール含有クロロホルム)で精製し、その後分取用RP-HPLC(C18)(60％アセトニトリル-0.1％トリフルオロ酢酸含有水/30分間で70％アセトニトリル-0.1％トリフルオロ酢酸含有水)で精製して、回収した出発材料5A(0.0503 g；43％)を得て、その後、適切な画分の凍結乾燥により生成物5P(0.0623 g；45％)を得た。M+H 811.4。
O c -(カルボキシメチルアミノカルボニル)-ネルフィナビル(5Q)の合成
3.5 mLの１：１：テトラヒドロフラン-水に入った実施例49のエチルOc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-Oar-TBDMS-ネルフィナビル(5P)(56.5 mg)、50 mgの水酸化リチウム一水和物、および反応液を４時間攪拌した。層を落ち着かせ、有機層を単離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。残留物を大部分、アセトニトリル(5 mL)中に再溶解させ、濾過させ、分取用RP-HPLC(C18)(35％アセトニトリルを含む0.1％トリフルオロ酢酸含有水)で精製して、Oar-脱保護生成物5Q(24.3 mg; 52％)を得た。M+H 669.2。
3.5 mLの１：１：テトラヒドロフラン-水に入った実施例49のエチルOc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-Oar-TBDMS-ネルフィナビル(5P)(56.5 mg)、50 mgの水酸化リチウム一水和物、および反応液を４時間攪拌した。層を落ち着かせ、有機層を単離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。残留物を大部分、アセトニトリル(5 mL)中に再溶解させ、濾過させ、分取用RP-HPLC(C18)(35％アセトニトリルを含む0.1％トリフルオロ酢酸含有水)で精製して、Oar-脱保護生成物5Q(24.3 mg; 52％)を得た。M+H 669.2。
O c -[(3-カルボキシプロピル)アミノ- co -グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル)-ネルフィナビル(5R)の合成
実施例50のOc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-ネルフィナビル(5Q)(20.4 mg)、スクシンイミジルテトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩(12.0 mg)、およびジイソプロピルエチルアミン(8μL)を一晩、THF(1.5 mL)中で5.5時間攪拌した。LC/MSにより、一部の出発材料と共に対応NHSエステルの存在が示された。グリシル-グリシル-4-アミノ酪酸(7.0 mg)を添加し、その後、透明な溶液が得られるまで50 mMリン酸緩衝液(pH 10)を添加した。一晩攪拌した後、反応液を約1 mLまで濃縮し、乳化残留物をアセトニトリルで希釈し、超音波処理して、透明な溶液を得て、これを分取用RP-HPLC(C18)(30％アセトニトリル含有水、30分間かけて30％〜45％アセトニトリル含有水、30分間かけて45％〜90％アセトニトリル(全て0.1％トリフルオロ酢酸を含有))により精製して、凍結乾燥後の主ピークから生成物5Rを得た(12.6 mg、48％)。M+H 868.4。
実施例50のOc-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-ネルフィナビル(5Q)(20.4 mg)、スクシンイミジルテトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩(12.0 mg)、およびジイソプロピルエチルアミン(8μL)を一晩、THF(1.5 mL)中で5.5時間攪拌した。LC/MSにより、一部の出発材料と共に対応NHSエステルの存在が示された。グリシル-グリシル-4-アミノ酪酸(7.0 mg)を添加し、その後、透明な溶液が得られるまで50 mMリン酸緩衝液(pH 10)を添加した。一晩攪拌した後、反応液を約1 mLまで濃縮し、乳化残留物をアセトニトリルで希釈し、超音波処理して、透明な溶液を得て、これを分取用RP-HPLC(C18)(30％アセトニトリル含有水、30分間かけて30％〜45％アセトニトリル含有水、30分間かけて45％〜90％アセトニトリル(全て0.1％トリフルオロ酢酸を含有))により精製して、凍結乾燥後の主ピークから生成物5Rを得た(12.6 mg、48％)。M+H 868.4。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ- co -グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル)-ネルフィナビル(5S)の合成
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル)-ネルフィナビル(5S)を、実施例41(b)の条件に従って、実施例51のOc-[(3-カルボキシプロピル)アミノ-co-グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル)-ネルフィナビル(5R)から合成する。M+H 964.4。
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル)-ネルフィナビル(5S)を、実施例41(b)の条件に従って、実施例51のOc-[(3-カルボキシプロピル)アミノ-co-グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル)-ネルフィナビル(5R)から合成する。M+H 964.4。
低分子量標識へのプロテアーゼインヒビターのコンジュゲーション
O c -(フルオレセインイル-グリシンアミジル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル(2V)の合成
実施例17で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル(2C)(10.0 mg)、およびフルオレセインイルグリシンアミド(5.0 mg、Molecular Probes, OR)を、3％トリエチルアミン-ピリジン(0.1 mL)中で一晩攪拌する。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、分取用RP-HPLC(C18；50％アセトニトリル-0.1％トリフルオロ酢酸含有水)で直接精製して、Oc-(フルオレセインイル-グリシンアミジル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビルを得た(2V；7.6 mg、75％)。M+H 1284.6。
実施例17で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル(2C)(10.0 mg)、およびフルオレセインイルグリシンアミド(5.0 mg、Molecular Probes, OR)を、3％トリエチルアミン-ピリジン(0.1 mL)中で一晩攪拌する。混合液を、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、分取用RP-HPLC(C18；50％アセトニトリル-0.1％トリフルオロ酢酸含有水)で直接精製して、Oc-(フルオレセインイル-グリシンアミジル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビルを得た(2V；7.6 mg、75％)。M+H 1284.6。
O c -(フルオレセインイル-グリシンアミジル-ブチリル)-リトナビル(1I)の合成
Oc-(フルオレセインイル-グリシンアミジル-ブチリル)-リトナビル(1I)を、実施例53に記載の条件に従い、実施例８のOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル(1G)から調製した(8.4 mg; 69％)。M+H 1221.4。
Oc-(フルオレセインイル-グリシンアミジル-ブチリル)-リトナビル(1I)を、実施例53に記載の条件に従い、実施例８のOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル(1G)から調製した(8.4 mg; 69％)。M+H 1221.4。
O c -[4'-(1-ビオチニル-アミノ-3,6-ジオキサ-オクチルアミノ)-テレフタロイル-アミノカプロイル]-インジナビル(4I)の合成
実施例22で得た5.0 mgのOc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-インジナビル(4F)を、5.0 mLの新しく蒸留したDMFに溶解した。13.6 mgの1-ビオチニルアミノ-3,6-ジオキサ-オクタンアミン(ビオチン-DADOO、Roche Applied Science, Cat. No. 1112074-103)および5.6μLトリエチルアミンを添加し、得られた透明の溶液をアルゴン下で一晩攪拌した。HPLC対照は、20時間後に完全な反応を示した。DMFを、ロータリーエバポレーター(rotavapor)(高真空、１トール圧よりはるかに低い、水浴30℃)上で除去した。残った油性生成物を、0.5 mL DMSOに溶解し、濾過し、分取用HPLC系(Vydac C18カラム、300Å、15-20μm、50×250 mm；溶出液Ａ：Millipore水/0.1％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：80％アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸；140分かけて0％Ｂ含有Ａから70％Ｂ含有Ａへの勾配)に注入し、純粋な生成物を含む適切な画分をプールし、凍結乾燥させた。構造をMALDI-TOF-MS(M=1231)により確認した。収量：3.5 mg (2.84μmol、理論的収量の55％)。
実施例22で得た5.0 mgのOc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-インジナビル(4F)を、5.0 mLの新しく蒸留したDMFに溶解した。13.6 mgの1-ビオチニルアミノ-3,6-ジオキサ-オクタンアミン(ビオチン-DADOO、Roche Applied Science, Cat. No. 1112074-103)および5.6μLトリエチルアミンを添加し、得られた透明の溶液をアルゴン下で一晩攪拌した。HPLC対照は、20時間後に完全な反応を示した。DMFを、ロータリーエバポレーター(rotavapor)(高真空、１トール圧よりはるかに低い、水浴30℃)上で除去した。残った油性生成物を、0.5 mL DMSOに溶解し、濾過し、分取用HPLC系(Vydac C18カラム、300Å、15-20μm、50×250 mm；溶出液Ａ：Millipore水/0.1％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：80％アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸；140分かけて0％Ｂ含有Ａから70％Ｂ含有Ａへの勾配)に注入し、純粋な生成物を含む適切な画分をプールし、凍結乾燥させた。構造をMALDI-TOF-MS(M=1231)により確認した。収量：3.5 mg (2.84μmol、理論的収量の55％)。
タンパク質へのプロテアーゼインヒビターのコンジュゲーション
N-マレイミドプロピオニル-L-アラニル-L-(γ-O c -サキナビル)-グルタミン酸と2-IT改変型ウシ血清アルブミンとのコンジュゲート2Sの合成
ウシ血清アルブミン(30 mg)および2-イミノチオレン(2-IT)塩酸塩(0.5 mg、Pierce Biotechnology Inc., IL)を、10 mMリン酸カリウム、0.1 M塩化ナトリウム、1 mM EDTA、pH 8.0 (3 mL)中、暗所にて１時間静置させた。混合液を、PD-10カラム(Amersham-Pharmacia, NJ)上で、10 mMリン酸カリウム、0.1 M塩化ナトリウム、1 mM EDTA(pH 8.0)で溶出して、ゲル濾過により脱塩した。適切な画分を回収し、pH 7.2に調節し、メタノール(0.2 mL)に溶解した実施例29で得たN-マレイミドプロピオニル-L-アラニル-L-(γ-Oc-サキナビル)-グルタミン酸(2Q)(1 mg)を添加した。混合液を、暗所にて２時間静置し、エチルマレイミド(0.5 mg、Sigma Chemical Co.)で抑制(quench)し、PD-10カラム上でゲル濾過により脱塩した(10 mM リン酸カリウム、0.1 M塩化ナトリウム、1 mM EDTA、pH 8.0、溶出液)。クーマシーブルータンパク質アッセイ(Bio-Rad Laboratories, CA；改変型ブラッドフォード(Bradford)タンパク質アッセイ)によるタンパク質定量から、4.3 mg/mLにおいてタンパク質の定量的回収が示された。UV差分光法から、ハプテン対BSAが１：１であることが示された。
ウシ血清アルブミン(30 mg)および2-イミノチオレン(2-IT)塩酸塩(0.5 mg、Pierce Biotechnology Inc., IL)を、10 mMリン酸カリウム、0.1 M塩化ナトリウム、1 mM EDTA、pH 8.0 (3 mL)中、暗所にて１時間静置させた。混合液を、PD-10カラム(Amersham-Pharmacia, NJ)上で、10 mMリン酸カリウム、0.1 M塩化ナトリウム、1 mM EDTA(pH 8.0)で溶出して、ゲル濾過により脱塩した。適切な画分を回収し、pH 7.2に調節し、メタノール(0.2 mL)に溶解した実施例29で得たN-マレイミドプロピオニル-L-アラニル-L-(γ-Oc-サキナビル)-グルタミン酸(2Q)(1 mg)を添加した。混合液を、暗所にて２時間静置し、エチルマレイミド(0.5 mg、Sigma Chemical Co.)で抑制(quench)し、PD-10カラム上でゲル濾過により脱塩した(10 mM リン酸カリウム、0.1 M塩化ナトリウム、1 mM EDTA、pH 8.0、溶出液)。クーマシーブルータンパク質アッセイ(Bio-Rad Laboratories, CA；改変型ブラッドフォード(Bradford)タンパク質アッセイ)によるタンパク質定量から、4.3 mg/mLにおいてタンパク質の定量的回収が示された。UV差分光法から、ハプテン対BSAが１：１であることが示された。
N-マレイミドプロピオニル-L-グルタミル-(γ-O c -サキナビル)-L-アラニンとSATP-改変型KLHとのコンジュゲート2Rの合成
スカシガイヘモシアニン(CALBIOCHEM、CN Biosciences, San Diego, CA； 65％硫酸アンモニウム中に懸濁(slurry))を、50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)( 緩衝液を８回未満変える；1010を上回る希釈係数)に対して、室温にて(２〜３回緩衝液を変え)続いて４℃にて徹底的に透析した。残留物(retentate)をほぼ乾燥するまで凍結乾燥させ、次に、適切な容量の50 mMリン酸塩で再生させて、精製KLHを比較的高い濃度で得る。精製KLHの未使用の部分を凍結させ、必要になるまで-20℃で保存した。
スカシガイヘモシアニン(CALBIOCHEM、CN Biosciences, San Diego, CA； 65％硫酸アンモニウム中に懸濁(slurry))を、50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)( 緩衝液を８回未満変える；1010を上回る希釈係数)に対して、室温にて(２〜３回緩衝液を変え)続いて４℃にて徹底的に透析した。残留物(retentate)をほぼ乾燥するまで凍結乾燥させ、次に、適切な容量の50 mMリン酸塩で再生させて、精製KLHを比較的高い濃度で得る。精製KLHの未使用の部分を凍結させ、必要になるまで-20℃で保存した。
精製したスカシガイヘモシアニン(20 mg)およびN-スクシンイミジルS-アセチルチオプロピオネート(SATP、10 mg、Pierce Biotechnology, Inc.)を、50 mM リン酸カリウム、1 mM EDTA(pH 7.5)中で１時間静置させ、PD-10カラム(Amersham-Pharmacia)上で、50 mMリン酸カリウム、1 mM EDTA(pH 7.5)で溶出して、ゲル濾過により脱塩した。誘導化タンパク質(10 mg)を、50 mMリン酸カリウム、2.5 mM EDTA、50 mM塩酸ヒドロキシルアミン(pH 7.5)中で暗所にて２時間静置させ、ゲル濾過(50 mMリン酸カリウム、5 mM EDTA(pH 7.2)溶出液)により脱塩した。DMSO(1 mL)に溶解した実施例28で得たN-マレイミドプロピオニル-L-グルタミル-(γ-Oc-サキナビル)-L-アラニン(2P)(6 mg)を添加し、反応液を16時間攪拌した。エチルマレイミド(0.5 mg)を添加し、反応液を８時間攪拌した。混合液を、順番に30％、20％、10％および0％のDMSO含有50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)に対して室温にて透析し、その後50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)に対して４℃にて透析した。クーマシーブルーによるタンパク質定量は、1.6 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることを示した。UV差分光法は、最大25％までリシンがハプテンにより置換されていることを示した。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビルとBSAとのコンジュゲート(2D)の合成
ウシ血清アルブミン(30 mg)、および実施例17で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル(2C)(1 mg)を、30％DMSO含有50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)(1.5 mL)中で室温にて２日間攪拌した。混合液を、順番に30％、20％、10％および0％のDMSOを含む１リットル50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)に対して、室温にて透析し、その後１リットル50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)に対して、４℃にて透析した。クーマシーブルーによるタンパク質定量は、10.4 mg/mLのタンパク質の定量的回収を示した。UV差分光法は、ハプテン対BSAの比率が１：１であることを示した。
ウシ血清アルブミン(30 mg)、および実施例17で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル(2C)(1 mg)を、30％DMSO含有50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)(1.5 mL)中で室温にて２日間攪拌した。混合液を、順番に30％、20％、10％および0％のDMSOを含む１リットル50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)に対して、室温にて透析し、その後１リットル50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)に対して、４℃にて透析した。クーマシーブルーによるタンパク質定量は、10.4 mg/mLのタンパク質の定量的回収を示した。UV差分光法は、ハプテン対BSAの比率が１：１であることを示した。
O c -[(4'-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビルとBSAとのコンジュゲート(2G)の合成
Oc-[(4'-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビルBSAコンジュゲートを、実施例58に記載の条件に従い、ウシ血清アルブミン(30 mg)、および実施例18で得たOc-[(4'-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビル(2F)(1 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量により、10.4 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。UV差分光法から、ハプテン対BSAの比率が１：１であることが示された。
Oc-[(4'-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビルBSAコンジュゲートを、実施例58に記載の条件に従い、ウシ血清アルブミン(30 mg)、および実施例18で得たOc-[(4'-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビル(2F)(1 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量により、10.4 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。UV差分光法から、ハプテン対BSAの比率が１：１であることが示された。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビルとKLHとのコンジュゲート(2E)の合成
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従い、精製されたスカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例17で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル(2C)(10 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、10.9 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS、Sigma Chemical Co.)比色アッセイによるアミン定量から、60％のリシンが修飾されていることが示された。
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従い、精製されたスカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例17で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル(2C)(10 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、10.9 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS、Sigma Chemical Co.)比色アッセイによるアミン定量から、60％のリシンが修飾されていることが示された。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビルとLPHとのコンジュゲート(1E)の合成
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビルLPHコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従い、カブトガニ(horseshoe crab)ヘモシアニン(LPH, 30 mg; Sigma Chemical Co.)、および実施例15で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビル(1C)(7 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量により、7.9 mg/mLのタンパク質の定量的回収が示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量から、26％のリシンが修飾されていることが示された。
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビルLPHコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従い、カブトガニ(horseshoe crab)ヘモシアニン(LPH, 30 mg; Sigma Chemical Co.)、および実施例15で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビル(1C)(7 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量により、7.9 mg/mLのタンパク質の定量的回収が示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量から、26％のリシンが修飾されていることが示された。
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビルとBSAとのコンジュゲート(1F)の合成
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビルBSAコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従って、ウシ血清アルブミン(30 mg)、および実施例16で得たOc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビル(1D)(1 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、10.3 mg/mLのタンパク質の定量的回収が示された。TNBS比色アッセイは、ハプテン対BSAの比率が２：１であることを示した。
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビルBSAコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従って、ウシ血清アルブミン(30 mg)、および実施例16で得たOc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビル(1D)(1 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、10.3 mg/mLのタンパク質の定量的回収が示された。TNBS比色アッセイは、ハプテン対BSAの比率が２：１であることを示した。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビルとKLHとのコンジュゲート(1H)の合成
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載した全般的な条件に従って、精製されたスカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例８で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル(1G)(10 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、11.9 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量から、60％のリシンが修飾されていることが示された。
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載した全般的な条件に従って、精製されたスカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例８で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル(1G)(10 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、11.9 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量から、60％のリシンが修飾されていることが示された。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビルとKLHとのコンジュゲート(3E)の合成
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載した全般的な条件に従って、精製されたスカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例19で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビル(3C)(8 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、6.8 mg/mLのタンパク質の定量的回収が示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量から、20％のリシンが修飾されていることが示された。
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載した全般的な条件に従って、精製されたスカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例19で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビル(3C)(8 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、6.8 mg/mLのタンパク質の定量的回収が示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量から、20％のリシンが修飾されていることが示された。
O c -[(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ブチリル-アミノカプロイル]-インジナビルとKLHとのコンジュゲート(4G)の合成
Oc-[(4'-スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-アミノカプロイル]-インジナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載した全般的な条件に従って、精製されたスカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例21で得たOc-[(-スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-アミノカプロイル]-インジナビル(4E)(9 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、7.4 mg/mLのタンパク質の定量的回収が示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量により、20％のリシンが修飾されていることが示された。
Oc-[(4'-スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-アミノカプロイル]-インジナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載した全般的な条件に従って、精製されたスカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例21で得たOc-[(-スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-アミノカプロイル]-インジナビル(4E)(9 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、7.4 mg/mLのタンパク質の定量的回収が示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量により、20％のリシンが修飾されていることが示された。
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビルとBSAとのコンジュゲート(3F)の合成
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビルBSAコンジュゲートを、実施例58に記載した全般的な条件に従って、ウシ血清アルブミン(30 mg)、および実施例20で得たOc-[(4'-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル(3D)(1 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量により、11.5 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。UV差分光法から、ハプテン対BSAが２：１であることが示された。
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビルBSAコンジュゲートを、実施例58に記載した全般的な条件に従って、ウシ血清アルブミン(30 mg)、および実施例20で得たOc-[(4'-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル(3D)(1 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量により、11.5 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。UV差分光法から、ハプテン対BSAが２：１であることが示された。
O c -[(4'-スクシンイミド-オキシカルボニル-ベンゾイル)-アミノカプロイル]-インジナビルとBSAとのコンジュゲート(4H)の合成
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-インジナビルBSAコンジュゲートを、実施例58に記載した全般的な条件に従って、ウシ血清アルブミン(30 mg)、および実施例22で得たOc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ベンゾイル)-アミノカプロイル]-インジナビル(4F)(1 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量により、10.8 mg/mLのタンパク質の定量的回収が示された。UV差分光法から、ハプテン対BSAが２：１であることが示された。
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-インジナビルBSAコンジュゲートを、実施例58に記載した全般的な条件に従って、ウシ血清アルブミン(30 mg)、および実施例22で得たOc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ベンゾイル)-アミノカプロイル]-インジナビル(4F)(1 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量により、10.8 mg/mLのタンパク質の定量的回収が示された。UV差分光法から、ハプテン対BSAが２：１であることが示された。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビルとKLHとのコンジュゲート(5F)の合成
Oc-[(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従って、精製されたスカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例23で得たOc-[(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビル(5D)(9 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、9.7 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量により、36％のリシンが修飾されていることが示された。
Oc-[(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従って、精製されたスカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例23で得たOc-[(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビル(5D)(9 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、9.7 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量により、36％のリシンが修飾されていることが示された。
O c -(4'-[スクシンイミド-オキシカルボニル]-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビルとBSAとのコンジュゲート(5G)の合成
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビルBSAコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従って、ウシ血清アルブミン(30 mg)、および実施例24で得たOc-[(4'-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビル(5E)(1 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量により、10.9 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。UV差分光法から、ハプテン対BSAが２：１であることが示された。
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビルBSAコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従って、ウシ血清アルブミン(30 mg)、および実施例24で得たOc-[(4'-スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビル(5E)(1 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量により、10.9 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。UV差分光法から、ハプテン対BSAが２：１であることが示された。
O ar -(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ- co -グリシル-グリシル-プロポキシ)-ネルフィナビルとKLHとのコンジュゲート(5L)の合成
Oar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-プロポキシ)-ネルフィナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従って、スカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例39で得たOar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-プロポキシ)-ネルフィナビル(5K、10 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、14.6 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量により、57％のリシンが修飾されていることが示された。
Oar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-プロポキシ)-ネルフィナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従って、スカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例39で得たOar-(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-プロポキシ)-ネルフィナビル(5K、10 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、14.6 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量により、57％のリシンが修飾されていることが示された。
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビルとKLHとのコンジュゲート(6F)の合成
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビルKLHコンジュゲートを、実施例58と同様の手法で、40％ジメチルスルホキシド含有50 mMリン酸カリウム中(pH 7.5)(3.4 mL)で、スカシガイヘモシアニン(40 mg)、および実施例25で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビル(6C)(16 mg)から得て、その後40％、30％、20％、10％および0％DMSO含有50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)に対して室温にて順番に透析し、そして50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)に対して４℃にて透析した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、6.9 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。アミン定量から、38％のリシンが修飾されていることが示された。
Oc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビルKLHコンジュゲートを、実施例58と同様の手法で、40％ジメチルスルホキシド含有50 mMリン酸カリウム中(pH 7.5)(3.4 mL)で、スカシガイヘモシアニン(40 mg)、および実施例25で得たOc-(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビル(6C)(16 mg)から得て、その後40％、30％、20％、10％および0％DMSO含有50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)に対して室温にて順番に透析し、そして50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)に対して４℃にて透析した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、6.9 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。アミン定量から、38％のリシンが修飾されていることが示された。
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビルとBSAとのコンジュゲート(6E)の合成
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビルBSAコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従い、ウシ血清アルブミン(93 mg)、および実施例26で得たOc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビル(6D)(3 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、11.1 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。UV差分光法から、ハプテン対BSAが２：１であることが示された。
Oc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビルBSAコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従い、ウシ血清アルブミン(93 mg)、および実施例26で得たOc-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビル(6D)(3 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量から、11.1 mg/mLでタンパク質が定量的に回収されていることが示された。UV差分光法から、ハプテン対BSAが２：１であることが示された。
N-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ- co -グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビルとKLHとのコンジュゲート(3I)の合成
N-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従って、精製されたスカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例41から得たN-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビル(3H)(9 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量は、クーマシーブルーによるタンパク質定量から、8.7 mg/mLのタンパク質の定量的回収が示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量から、40％のリシンが修飾されていることが示された。
N-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビルKLHコンジュゲートを、実施例58に記載の全般的な条件に従って、精製されたスカシガイヘモシアニン(30 mg)、および実施例41から得たN-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ-co-グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビル(3H)(9 mg)から調製した。クーマシーブルーによるタンパク質定量は、クーマシーブルーによるタンパク質定量から、8.7 mg/mLのタンパク質の定量的回収が示された。TNBS比色アッセイによるアミン定量から、40％のリシンが修飾されていることが示された。
プロテアーゼインヒビターに対する抗体の構築
サキナビルKLH免疫原に対する抗体応答
サキナビル-KLH(2E)を使用して、C57 BlackおよびSwiss Webster系統の両方のマウスを免疫化した。免疫化の用量および経路は、両方の系統のマウスについて同じであった。免疫化スケジュールを表１に示す。
サキナビル-KLH(2E)を使用して、C57 BlackおよびSwiss Webster系統の両方のマウスを免疫化した。免疫化の用量および経路は、両方の系統のマウスについて同じであった。免疫化スケジュールを表１に示す。
最後の免疫化から13日後に、眼窩部採血により、各マウスから血液サンプルを採取した。血液をすぐに遠心分離にかけ、血清を抽出し、0.02％チメロサール保存料と共にリン酸緩衝化生理食塩水で10回希釈したあと、微小バイアルに保存した。
翌日、ELISAを行って、存在する抗体の力価を定めた。ELISAは、全て重炭酸緩衝液中に１μg/mLで、異なるサキナビル-BSAコンジュゲートで被覆されたマイクロタイタープレートで構成した(0.1 M(pH 9.6)、100μl/ウェル、４℃、一晩)。被覆後、プレートを空にし、Tris緩衝液、１％ゼラチン加水分解物、２％スクロース、および0.17％TWEEN-20からなる200μlの被覆後溶液を添加した。これを37℃にて１時間インキュベートして、ウェルの被覆されていない領域をブロックした。1000分の１への予備希釈、そして各カラムで１：３の比率での連続希釈を行うことにより、血清をテストした。各ウェル中の希釈血清の容量は100μlであり、加湿容器中で37℃にて１時間および20分間インキュベートさせた。次いで、プレートをリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、100μlのヤギ抗マウスIgG-HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)コンジュゲート(Zymed, Inc.、PBS中に1:5000で希釈)を、各ウェルに添加した。プレートを再度２時間同じ条件下でインキュベートした後、再度洗浄した。100μlのK-BLUE SUBSTRATE(Neogen Corp.)を各ウェルに添加し、暗所にて室温で30分間インキュベートすることにより発色を行なった。100μlの1N HClを各ウェルに添加することにより、発達を止めた。各プレートの光学濃度を、マイクロプレートリーダーにより450 nmにおいて読み取り、コンピュータに保存した。
免疫原と同じリンカー構造および位置を有するサキナビル-BSAコンジュゲート2Dに関して検査した際の血清力価は、他のコンジュゲートよりも実質的に高く、ポリクローナル抗体集合においていくらかのリンカー認識があることが示された。図１４に示すように、力価は、リンカーの構造および位置が免疫原と異なっているほど低下した。図１４は、サキナビルコンジュゲート2G、2W、2Dおよび2Sを用いたマウス#333血清の力価のグラフである。(付記：コンジュゲート2Wの調製は、先に引用した同時係属出願のEP 1 207 394 A2に実施例Ｖとして記載されている)。30分して読み取った450 nmでの光学濃度をＹ軸上にプロットし、血清希釈をＸ軸上にプロットする。
これらの分析から、サキナビル-KLHコンジュゲートが、ポリクローナル抗体を生じるのに適しており、従ってモノクローナル抗体の構築にも使用できることが明らかになった。
サキナビルに対するモノクローナル抗体の構築
少なくとも３月齢のメスSwiss-Websterマウスを免疫化のために使用した。KLH免疫原2Eを、50％完全フロイントアジュバント、50％生理食塩水中で、0.75 mg/mlの最終濃度で乳化させた。各マウスに対して、後部大腿部に10μlを２回皮下注射、そして90μlを腹腔注射した。25日後、フロイントの不完全アジュバントおよび1 mg/mlの濃度を用いて(各マウスにつき合計容量は0.1 mlであった)同様の注射を同じ経路で施した。13日後、各マウスを眼窩部採血して、分析用の血清サンプルを得た。第３の免疫化を、第２の処方と同じ処方で、49日後に施した。融合のために選択したマウスには、13日後、第２および第３の注射と同じ処方で、追加免疫を施した。４日後、マウスを細胞融合のために使用して、モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを構築した。
少なくとも３月齢のメスSwiss-Websterマウスを免疫化のために使用した。KLH免疫原2Eを、50％完全フロイントアジュバント、50％生理食塩水中で、0.75 mg/mlの最終濃度で乳化させた。各マウスに対して、後部大腿部に10μlを２回皮下注射、そして90μlを腹腔注射した。25日後、フロイントの不完全アジュバントおよび1 mg/mlの濃度を用いて(各マウスにつき合計容量は0.1 mlであった)同様の注射を同じ経路で施した。13日後、各マウスを眼窩部採血して、分析用の血清サンプルを得た。第３の免疫化を、第２の処方と同じ処方で、49日後に施した。融合のために選択したマウスには、13日後、第２および第３の注射と同じ処方で、追加免疫を施した。４日後、マウスを細胞融合のために使用して、モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを構築した。
免疫原と相同なリンカーを特徴とするコンジュゲート2Dは、血清抗体の結合について最大の効力を示した。結合は、免疫原とコンジュゲートリンカーとの相同の程度と直接相関していた。結合の効力は、最強のものから最弱のものまで、2D > 2G > 2S > 2Wであることが分かった。上記血清抗体を分析する際に行った観察に基づいて、リンカー相同性の影響が区別でき、ほとんどまたは全くリンカー優先を示さないクローンのみが選択されるような実験の融合期におけるモノクローナル抗体のスクリーニングのための戦略を考察することにした。
戦略は２つの方策を特徴とした。第１に、血清抗体の最大結合を下回ることが上記分析により示されたリンカーを使用して、抗体結合をテストした。第２に、400 ng/mLの遊離薬剤を含む、同じコンジュゲートで被覆された第２のウェルを用いて、結合に対する薬剤の競合的影響を推定した。この結果により、遊離薬剤と競合的に結合する(すなわち、リンカーが結合していない)モノクローナルのみの選択が可能になる。
融合のために選択したマウスを放血により屠殺した。膝窩、鼡径、鎖骨下および深鼡径リンパ節、ならびに脾臓を回収し、プールした。組織を、２枚の滅菌スライドガラスの間ですりつぶして、リンパ球を放出させた。得られたリンパ球懸濁液の半分を、F0骨髄腫細胞系(ATCC CRL 1646)と融合させるために使用し、残りの半分をP3骨髄腫と融合させるために使用した(両方の骨髄腫ともATCCから得たもの)。
融合は、骨髄腫細胞(リンパ球の数の1/5)をリンパ球に添加し、遠心分離を介して洗浄し、血清を含まない温かいイスコーブ(Iscove)改変型ダルベッコ培地(IMDM)中での再懸濁、および再度の遠心分離により行った。得られたペレットを含む遠心分離管を、軽く叩いて細胞を緩めてから、緩やかに混合しながら1 mLの温めたPEG/DMSO溶液(Sigma Chemicals)をゆっくりと添加した。細胞を1.5分間温かいままにし、その後予め温めた血清を含まないIMDMを以下の速度で添加した：すなわち、1 ml/分、2 ml/分、4 ml/分、10 ml/分。その後、管を50 mlまで満たし、密封して、15分間インキュベートした。細胞懸濁液を遠心分離にかけ、上清を静かに注ぎ、10％ウシ胎仔血清を含むIMDMを添加した。細胞を再度遠心分離にかけ、完全クローニング培地中に再懸濁させた。これは、IMDM、10％FCS、10％調合(Condimed)H1(Roche Molecular Systems)、4 mMグルタミン、50μM 2-メルカプトエタノール、40μMエタノールアミン、pen/strep抗生物質からなっていた。細胞を、4×105リンパ球/mlの密度で懸濁し、96ウェル滅菌微小培養プレートに100μl/ウェルで分配し、５％CO2中37℃にて24時間インキュベートした。翌日、100μlのヒポキサンチン-メトトレキセート-チミジン(HMT)選択培地(クローニング培地＋1:25 HMTサプリメント(Sigma Chemical製))を添加した。インキュベーション６日目に、真空光源(light vaccum source)に連結した滅菌８箇所連結管を用いて、各ウェルから約150μlの培地を抜いた。その後、150μlのヒポキサンチン-チミジン(HT)培地を添加した。これは、クローニング培地＋1:50 HTサプリメント(Sigma Chemicals)により構成された。プレートをインキュベーターに戻し、成長の徴候について毎日検査した。成長が十分であると判断された際に、ELISAにより抗体産生しているかについてウェルをスクリーニングした。
サキナビル-BSAコンジュゲートを1μg/mLにて含有する0.1 M炭酸緩衝液(pH 9.5) 100μlを用いて、１時間37℃にて(加湿下)マイクロプレートを被覆した。次いで、プレートを空にし、被覆後溶液で満たした。プレートをさらに１時間37℃(加湿下)にてインキュベートし、その後、0.1％TWEEN20を含むリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。その後、プレートを、0.15 M Trisに入った２％スクロース溶液(おおまかにpH 7.2〜7.4)で満たし、その後空にして、室温にて通気乾燥させた。乾燥したら、プレートを、いくつかの乾燥剤クッションを含むジップロックバッグにパッキングして、密封し、使用時まで４℃にて保存した。
成長させたクローンがテストのために用意できたと判断されたら、ウェルから25μlの上清を採り、96ウェルフレキシブルプレートに移す。培養培地を各ウェルに添加して、培地サンプルの1:10希釈液を得た。テストする各培養ウェルについて、２つのサキナビル-BSA被覆ウェルを使用した。一方のウェルには50μlのPBS緩衝液を加え、他方には800 ng/mlの濃度で50μlのサキナビル剤を含むPBSを加えた。50マイクロリットルの希釈サンプルを、上記２つの被覆ウェルのそれぞれに移した。プレートを覆って１時間37℃にてインキュベートし、その後PBS-TWEENで洗浄した。次いで、PBS-TWEEN中で1:5,000希釈された100μlのヤギ抗マウスIgG-HRPコンジュゲート(Zymed Labs)でウェルを満たし、プレートを１時間再度インキュベートした。プレートを再度洗浄し、100μlのK-BLUE基質(Neogen Corp)を各ウェルに添加した。これを、5〜15分間発色させ、100μlの1 N HClを加えて反応を止めた。マイクロプレートリーダーを介して450 nmにて色を読み取り、コンピュータにより分析用に収集した。選択の基準は、サキナビル-BSAコンジュゲートに対する結合、および第２のウェルにおける遊離薬剤による結合の有意な阻害とした。
融合培養プレートからのクローンの選択後、限定希釈を介して、細胞をストリンジェントなクローニングに供した。単一細胞であることが顕微鏡により確認されたウェルから成長したサブクローンを、上記方法により再度テストした。抗体発現の安定性を、抗体を示すウェルの数、結合のレベル、および成長は示すがほとんどまたは全く抗体を示さないウェルの存在で判断した。後者がひとつでも見つかれば、高い抗体分泌を示すウェルを使用して、ストリンジェントなサブクローニングを繰り返した。これを、必要に応じて繰り返して、等量の抗体を分泌するサブクローンを100％得た。選択したウェルから得た細胞を、培養液中で拡張させ、予備細胞バンクを調製するために使用した。次いで、これらの培養液の上清を、特異性分析に供した。
拡張培養液 (expansion culture) から得た、抗体を含む培養上清を、以下の手順により特異性分析に供した。第１に、分析に適した力価を希釈分析により決定した。最大結合の約50％を提供する抗体の希釈を、次のステップに進むために選択した。第２に、サキナビル-BSAコンジュゲートへの結合を、上記抗体希釈にて、様々な量の６種のHIVプロテアーゼインヒビターの存在下において、調査した。データを、4-パラメータロジスティック関数に合致する非線状回帰曲線による分析に供した。遊離薬剤の不在下における結合の50％に対応する遊離薬剤の濃度を表すパラメータを、該薬剤についてのED50と呼ぶ。従って、抗体の特異性は、以下の等式により、同族薬剤であるサキナビルのED50、すなわちsaq ED50と他の薬剤についての他の値(この例ではネルフィナビルのデータを使用)とを、下記の式に当てはめて比較することにより、表すことができる：
％交差反応性＝ (saqED50/nelED50) X 100
使用する４パラメータロジスティック関数は：
ODx = (ODmax/(1+(ED50/X)s) - ODmin
［式中、Sは回帰パラメータ (curvature parameter) であり、ODmaxは薬剤濃度が０のときの光学濃度であり、ODminは機器のバックグラウンドの光学濃度であり、そしてODxは薬剤濃度Ｘ(モル/リットル(M/I)で表す)において観測される光学濃度である］
である。
％交差反応性＝ (saqED50/nelED50) X 100
使用する４パラメータロジスティック関数は：
ODx = (ODmax/(1+(ED50/X)s) - ODmin
［式中、Sは回帰パラメータ (curvature parameter) であり、ODmaxは薬剤濃度が０のときの光学濃度であり、ODminは機器のバックグラウンドの光学濃度であり、そしてODxは薬剤濃度Ｘ(モル/リットル(M/I)で表す)において観測される光学濃度である］
である。
この分析により、２つの抗サキナビル抗体の交差反応性を表３に示す。マウスハイブリドーマSAQ 10.2.1およびSAQ 14.1.1を、2002年1月18日にAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託し、それぞれにATCC No. PTA-3973およびATCC No. PTA-3974が付与された。
ネルフィナビルに対するモノクローナル抗体の構築
ネルフィナビルに対するモノクローナルの構築について使用した手順は、サキナビルについて使用したものと同様であった。８週齢のメスBalb/cマウスを、完全フロイントアジュバント中で乳化させた100μgのコンジュゲート5Fで、腹腔内注射により免疫化した。21日後、不完全フロイントアジュバント中で同じ容量の別の免疫化を行った。さらに４回の注射を、同じ投与量で、リビ(Ribi)アジュバントと交互に、約21日間の間隔で行った。全てのアジュバントが、Sigma Chemical Co.のものであった。
ネルフィナビルに対するモノクローナルの構築について使用した手順は、サキナビルについて使用したものと同様であった。８週齢のメスBalb/cマウスを、完全フロイントアジュバント中で乳化させた100μgのコンジュゲート5Fで、腹腔内注射により免疫化した。21日後、不完全フロイントアジュバント中で同じ容量の別の免疫化を行った。さらに４回の注射を、同じ投与量で、リビ(Ribi)アジュバントと交互に、約21日間の間隔で行った。全てのアジュバントが、Sigma Chemical Co.のものであった。
最後の注射から４日後、マウスを放血および頸部脱臼により屠殺した。脾臓細胞を採取し、サキナビルの場合と同じ手順によりF0骨髄腫系統に融合させた。培養および供給も同様であった。
成長したハイブリドーマのスクリーニングは、サキナビル-BSAおよび遊離サキナビルをネルフィナビル-BSA(5G)および遊離ネルフィナビルとそれぞれ置き換えたこと以外は、サキナビルの場合と同様であった。表４は、このようにして得たスクリーニングデータの一部を示す。
安定性を確実にするためのさらなる過程は、サキナビルモノクローナル抗体についてのものと同じ方法により行った。同じ薬剤パネルを使用し、ネルフィナビルによる競合結合を100％として特異性分析を行った。表５は、表４に示す系統のサブクローンの特異性を示す。
マウスハイブリドーマNEL 5.4.1を、2002年6月25日にAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託し、ATCC No. PTA-4475が付与された。
インジナビルに対するモノクローナル抗体の抗体
12週齢メスBalb/cマウスに、アジュバントCFA(完全フロイントアジュバント)と共に、100μgインジナビルKLHコンジュゲート4Gで、腹腔内初回免疫化を施した。この６週間後、ひと月間隔で、さらに３回の腹腔内免疫化を行った。この際には、それぞれのマウスに、IFA(不完全フロイントアジュバント)と共に、100μgインジナビルKLHコンジュゲート4Gを投与した。その後、最後の免疫化を、融合の二日前および前日に、PBS緩衝液に入った100μgインジナビルKLHコンジュゲート4Gで行った。
12週齢メスBalb/cマウスに、アジュバントCFA(完全フロイントアジュバント)と共に、100μgインジナビルKLHコンジュゲート4Gで、腹腔内初回免疫化を施した。この６週間後、ひと月間隔で、さらに３回の腹腔内免疫化を行った。この際には、それぞれのマウスに、IFA(不完全フロイントアジュバント)と共に、100μgインジナビルKLHコンジュゲート4Gを投与した。その後、最後の免疫化を、融合の二日前および前日に、PBS緩衝液に入った100μgインジナビルKLHコンジュゲート4Gで行った。
上述したように免疫化したマウスの脾臓細胞を、Galfre, Methods in Enzymology, Vol. 73, 3(1981)に従い、骨髄腫細胞と融合させた。免疫化マウスの約1×108の脾臓細胞を、2×107の骨髄腫細胞(P3X63-Ag8-653、ATCC CRL 1580)と混合し、遠心分離にかけた(300 G、室温にて10分間)。次いで、ウシ胎仔血清(FCS)を含まないRPMI 1640培地で細胞を一度洗浄し、400 Gにて50 mL円錐管中で再度遠心分離にかける。その後、1 mL PEG (ポリエチレングリコール、分子量4000、Merck、Darmstadt)を添加し、緩やかに振とうしながら混合した。37℃の水浴中にて１分間した後、FCSを含まない5 mL RPMI 1640を滴下し、混合し、培地(RPMI 1640)と共に30 mLまでにし、その後遠心分離にかけた。沈殿した細胞を、10％ FCSを含むRPMI 1640培地に採り、ヒポキサンチン-アザセリン選択培地(100 mmol/lヒポキサンチン、1μg/mLアザセリン含有RPMI 1640 + 10％ FCS)に塗末した。マウスから得たインターロイキン６(Roche Diagnostics GmbH、カタログ番号1 444 581、50 U/ml)を、成長因子として、培地に添加した。
約11日後、一次培養液を特異的抗体合成についてテストした。インジナビルと陽性反応を示し、サキナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよびアンプレナビルとは交差反応を示さなかった一次培養液を、セルソーターにより96-ウェル細胞培養プレート中でクローニングした。
表６に一覧した寄託した細胞系統/クローンは、このように得た。マウスハイブリドーマ<INDIN>M-1.003.12および<INDIN>M-1.158.8を、2002年6月18日付けでDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)に寄託し、それぞれにDSM No. ACC2547およびDSM No. ACC2546が付与された。
ハイブリドーマ細胞の培養上清中の抗体の特異性を決定するために、組換えストレプトアビジン(MicroCoat Co. Penzberg、カタログ番号148051001)で被覆されたマイクロタイタープレートを、500 ng/mLのインジナビルビオチンコンジュゲート4Iで被覆した(PBS/1.0％ CROTEIN C/0.1％ TWEEN 20中に希釈したものを１ウェルにつき100μL；４℃にて一晩インキュベートする)、その後0.9 ％ NaCl/0.1 ％ TWEEN 20で３回洗浄した。
遊離ストレプトアビジン結合部位を、次いで、100μg/mLのビオチンとのインキュベーションによりブロックし(振とうしながら、１時間；周囲温度)、その後、0.9 ％ NaCl/0.1 ％ TWEEN 20で３回洗浄した。
次に、0〜25μg/mL(PBS(+ 1.0％ CROTEIN C、0.1％ TWEEN 20)中に希釈)の一連の濃度の、交差反応についてテストする50μLの被分析物を、検査する50μLの抗体溶液(培養上清)と共に被覆ウェルに添加し、振とうしながら室温にて１時間インキュベートした。0.9％塩化ナトリウム/0.1 ％ TWEEN 20で３回洗浄した後、マウスFc(pab<MOUSE FC Γ>S-Fab-POD、Roche；25 mU/ml)に対するヒツジ由来ポリクローナル抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識Fabフラグメント100μLを、各ウェルに添加して、サンプルから結合抗体を検出し、振とうしながら室温にて１時間インキュベートし、その後0.9％塩化ナトリウム/0.1％ TWEEN 20で３回洗浄した。
最後に、100μL/ウェルABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH、カタログ番号1684302)を添加し、405/492 nmにおける吸光度を30分後に室温にて、TECAN製のSLTスペクトル画像マイクロプレートリーダー中で測定した。
上述したテスト系を用いたところ、モノクローナル抗体<INDIN> M 1.158.8および<INDIN> M 1.003.12の、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビルおよびアンプレナビルとの交差反応性は10％未満であることが示された。図１７は、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビルおよびアンプレナビルと、mab<INDIN> M 1.158.8およびmab <INDIN> M 1.003.12との交差反応のグラフを示す。
商標および商用名
以下の登録商標および商用名は本開示を通して大文字を使用して識別される。
以下の登録商標および商用名は本開示を通して大文字を使用して識別される。
Claims (9)
- 以下の構造：
I-X-(C=Y)m-L-A
［式中、Iは、リトナビル、サキナビル、インジナビル、ネルフィナビル、およびロピナビルからなる群より選択され、中央非末端ヒドロキシル基のみを欠いているHIVプロテアーゼインヒビター、または、アンプレナビルであって、中央非末端ヒドロキシルまたはアミノ基のみを欠いているHIVプロテアーゼインヒビターであり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、SまたはNHであり、
mは、0または1であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結され得ないリンカーであり、
Aは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性化官能基である］
を有する化合物であって、該化合物が、以下の、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビル、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビル、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビル、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビル、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビル、
O c -3-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-プロピオニル]-サキナビル、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチルアミノカルボニル)-サキナビル、
O c -(マレイミド-プロピオニル-アミノカプロイル)-サキナビル、
N-マレイミドプロピオニル-L-グルタミル-(γ-O c -サキナビル)-L-アラニン、
N-マレイミドプロピオニル-L-Ala-L-Glu-(γ-O c -サキナビル)、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-アミノカルボニル]-サキナビル、
O c -[4-(スクシンイミド-オキシカルボニル-フェニル)-メチルアミノ- co -グリシル-カルボニル]-サキナビル、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチル)-サキナビル、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビル、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビル、
N-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ- co -グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビル、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-インジナビル、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-インジナビル、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビル、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビル、
O ar -MEM-O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチル)-ネルフィナビル、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ- co -グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル)-ネルフィナビル、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビル、および
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビル
からなる群から選択される、上記化合物。 - 以下の構造：
[I-X-(C=Y)m-L-Z]n-P
［式中、Iは、リトナビル、サキナビル、インジナビル、ネルフィナビル、およびロピナビルからなる群より選択され、中央非末端ヒドロキシル基のみを欠いているHIVプロテアーゼインヒビター、または、アンプレナビルであって、中央非末端ヒドロキシルまたはアミノ基のみを欠いているHIVプロテアーゼインヒビターであり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、S、またはNHであり、
mは、0または１であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結されないリンカーであり、
Zは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、および
Pは、ポリペプチド、多糖類、および合成高分子からなる群より選択され、
nは、Pの分子量50キロダルトンにつき、1〜50の数である］
を有する化合物であって、該化合物が、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -3-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-プロピオニル]-サキナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチルアミノカルボニル)-サキナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(マレイミド-プロピオニル-アミノカプロイル)-サキナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
N-マレイミドプロピオニル-L-グルタミル-(γ-O c -サキナビル)-L-アラニンと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
N-マレイミドプロピオニル-L-Ala-L-Glu-(γ-O c -サキナビル)と上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-アミノカルボニル]-サキナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4-(スクシンイミド-オキシカルボニル-フェニル)-メチルアミノ- co -グリシル-カルボニル]-サキナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチル)-サキナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
N-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ- co -グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-インジナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-インジナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O ar -MEM-O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチル)-ネルフィナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ- co -グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル)-ネルフィナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物、および
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビルと上記Pとのコンジュゲーションにより得られる化合物
からなる群から選択される、上記化合物。 - 以下の構造：
[I-X-(C=Y)m-L-Z]n-Q
［式中、Iは、リトナビル、サキナビル、インジナビル、ネルフィナビル、およびロピナビルからなる群より選択され、中央非末端ヒドロキシル基のみを欠いているHIVプロテアーゼインヒビター、または、アンプレナビルであって、中央非末端ヒドロキシルまたはアミノ基のみを欠いているHIVプロテアーゼインヒビターであり、
Xは、OまたはNHであり、
Yは、O、S、またはNHであり、
mは、0または1であり、
Lは、0〜40個の炭素原子を含む、飽和または不飽和の直鎖状または分枝鎖状のリンカーであって、さらに最大２つまでの環式構造および0〜20個のヘテロ原子を含むが、ただし２個以下のヘテロ原子しか並んで連結されないリンカーであり、
Zは、-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C=NH)-、-N=N-、-NH-、および
Qは、非同位体標識であり、ならびに
nは、Qの分子量50キロダルトンにつき、1〜50の数である］
を有する化合物であって、該化合物が、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-リトナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-リトナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル)-リトナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-サキナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-サキナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -3-[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-プロピオニル]-サキナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチルアミノカルボニル)-サキナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(マレイミド-プロピオニル-アミノカプロイル)-サキナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
N-マレイミドプロピオニル-L-グルタミル-(γ-O c -サキナビル)-L-アラニンと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
N-マレイミドプロピオニル-L-Ala-L-Glu-(γ-O c -サキナビル)と上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-フェニル-アミノカルボニル]-サキナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4-(スクシンイミド-オキシカルボニル-フェニル)-メチルアミノ- co -グリシル-カルボニル]-サキナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチル)-サキナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-アンプレナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-アンプレナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
N-(スクシンイミジル-オキシカルボニル-プロピルアミノ- co -グリシル-グリシル-グルタリル)-アンプレナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-インジナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-インジナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ネルフィナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ネルフィナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O ar -MEM-O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-メチル)-ネルフィナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-プロピルアミノ- co -グリシル-グリシル-グリシル-カルボニル)-ネルフィナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、
O c -(スクシンイミド-オキシカルボニル-ブチリル-アミノカプロイル)-ロピナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物、および
O c -[4'-(スクシンイミド-オキシカルボニル)-ベンゾイル-アミノカプロイル]-ロピナビルと上記Qとのコンジュゲーションにより得られる化合物
からなる群から選択される、上記化合物。 - HIVプロテアーゼインヒビターIに対して特異的な結合親和性を有する、請求項２に記載の化合物に対する抗体。
- マウスハイブリドーマSAQ 10.2.1（ATCC No. PTA-3973）。
- マウスハイブリドーマSAQ 14.1.1（ATCC No. PTA-3974）。
- マウスハイブリドーマNEL 5.4.1（ATCC No. PTA-4475）。
- マウスハイブリドーマ<INDIN>M-1.003.12（DSMZ No. ACC2547）。
- マウスハイブリドーマ<INDIN>M-1.158.8（DSMZ No. ACC2546）。
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