JP2015529197A - パリペリドンのハプテン - Google Patents

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Abstract

【化1】本発明は、式(I)の化合物(式中、L1、L2、及びL3は、本明細書中で定義される)に関し、新規のコンジュゲートとパリペリドンから誘導される免疫原との合成に有用である。本発明は、パリペリドンハプテンとタンパク質とのコンジュゲートにも関する。

Description

(関連出願の相互参照)
本出願は、2012年8月21日に出願された米国特許仮出願第61/691,459号の出願の優先権の利益を主張する。上述の関連する米国特許出願の全開示は、全ての目的において、本明細書中に参照として組み込まれる。
(発明の分野)
本発明は、ヒト体液中にパリペリドンが存在するかを判定するイムノアッセイの分野に関する。
精神分裂病は、世界人口の約0.45〜1%が罹患する、慢性かつ消耗性の精神疾患である(van Os,J.;Kapur,S.「Schizophrenia」Lancet 2009,374,635〜645)。治療の主要な目的は、精神病の症状の寛解の持続性達成、再発の危険性及び影響を削減し、患者機能及び全体的な生活の質を向上することである。精神分裂病の患者の多くは、入手可能な抗精神病薬によって症状の安定を得ることができるが、再発の主な原因は、毎日服用する経口薬の服薬アドヒアランスの欠如である。不遵守の結果を検討するいくつかの研究(Abdel−Baki,A.;Ouellet−Plamondon,C.;Malla,A.「Pharmacotherapy Challenges in Patients with First−Episode Psychosis」Journal of Affective Disorders 2012,138,S3〜S14)によって、定められたように服薬しない精神分裂病の患者では、再発率、入院率及び自殺率が高く、並びに死亡率が上昇することが示されている。精神分裂病の患者の40〜75%は、日常的な経口治療計画の遵守が困難であると見込まれている(Lieberman,J.A.;Stroup,T.S.;McEvoy,J.P.;Swartz,M.S.;Rosenheck,R.A.;Perkins,D.O.;Keefe,R.S.E.;Davis,S.M.;Davis,C.E.;Lebowitz,B.D.;Severe,J.;Hsiao,J.K.「Effectiveness of Antipyschotic Drugs in Patients with Chronic Schizophrenia」New England Journal of Medicine 2005,353(12),1209〜1223)。治療薬物モニタリング(TDM)は、治療をモニタリング及び最適化するための、抗精神病薬などの薬物の血清又は血漿濃度を定量化するものである。かかるモニタリングによって、例えば、投薬計画を遵守しない患者、治療用量を達成していない患者、治療用量において非反応である患者、認容性が最適ではない患者、薬物動態学的な薬物−薬物間相互作用を有する患者、又は、不適切な血漿濃度をもたらす異常代謝を呈する患者、の同定が可能となる。患者における抗精神病薬の吸収能力、分配能力、代謝能力、及び排出能力には、大きな個体差がある。かかる違いは、併発症、年齢、併用薬又は遺伝特性によって生じ得る。製剤の違いも、抗精神病薬の代謝に影響を与え得る。TDMによって、個別の患者において用量の最適化が可能となり、治療転帰及び機能的転帰が改善する。TDMによって、更に、処方する医師は、定められた服用量の服薬遵守及び有効血清中濃度の達成を確保することができる。
今日まで、抗精神病薬の血清及び血漿濃度のレベルを決定する方法は、紫外線検出又は質量分析検出による液体クロマトグラフィ(LC)、及びラジオイムノアッセイの使用を含む(例えば、以下を参照のこと:Woestenborghs et al.,1990「On the selectivity of some recently developed RIA’s」in Methodological Surveys in Biochemistry and Analysis 20:241〜246.Analysis of Drugs and Metabolites,Including Anti−infective Agents;Heykants et al.,1994「The Pharmacokinetics of Risperidone in Humans:A Summary」,J Clin Psychiatry 55/5,suppl:13〜17;Huang et al.,1993「Pharmacokinetics of the novel anti−psychotic agent risperidone and the prolactin response in healthy subjects」,Clin Pharmacol Ther 54:257〜268)。ラジオイムノアッセイは、リスペリドン及びパリペリドンのうちの1つ又は両方を検出する。Salamoneらの米国特許第8,088,594号は、リスペリドン及びパリペリドンの両方を検出するが、薬理学的に不活性な代謝産物を検出しない抗体を使用するリスペリドンの競合的イムノアッセイを開示している。競合的イムノアッセイに使用される抗体は、特定の免疫原に対して作製される。ID Labs Inc.(London,Ontario,Canada)は、別の抗精神病薬であるオランザピン用のELISAを販売しているが、これも競合的フォーマットを利用している。この取扱説明書には、このアッセイはスクリーニングを目的として設計されており、科学捜査又は研究における使用を意図し、特に治療用途を意図するものではないことが示されている。この説明書は、全陽性サンプルをガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC−MS)で確認すべきであることを推奨しており、使用される抗体は、オランザピン及びクロザピンを検出することを示している(ID Labs Inc.,「Instructions For Use Data Sheet IDEL−F083」,Rev.Date Aug.8,2011を参照のこと)。これらの方法のうちのいくつか、すなわちHPLC及びGC/MSは、高価で労働集約的でありうることから、一般的に、適切な設備を有する大規模又は専門的研究室に限って行われる。
抗精神病薬のレベルを決定する他の方法、特に処方医の診療所(この場合は、個々の患者の処置をより一層タイミングよく調節することができる)、及びLC又はGC/MS設備がないか、又は迅速に試験結果を必要とする他の医療機関において実施することができる方法が必要である。
パリペリドンは:
Figure 2015529197
である。
本発明は、抗精神病薬であるパリペリドンのレベルを決定するためのそのような改善された方法を可能にする化合物及びコンジュゲートを提供する。
本発明は、以下の式Iの化合物を含む:
Figure 2015529197
(式中
1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2nであり;
ここで、nは2、又は3であり;
2は、NHC(O)、
Figure 2015529197
であるか、又は存在せず;
3は、(CH2mCO2H、又は
Figure 2015529197
であり;
ここで、mは、0、1、2、又は3である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ない(m may only be 0 if L2 is absent)))。
本発明は、本発明の化合物とタンパク質などの免疫原性担体とのコンジュゲート、及び本発明の化合物と免疫原性担体とを接触させるプロセスによって生成された生成物、を含む。
ハイブリドーマ5−9から得られた競合的ELISAの結果を示しており。 ハイブリドーマ5−9から得られた競合的ELISAの結果を示しており。 リスペリドン/パリペリドンクローン2A5から得られた競合的ELISAの結果を示しており。 ラテラルフローアッセイデバイスで使用される競合的イムノアッセイフォーマットを示しており。 リスペリドン/パリペリドンクローン5−9から得られた典型的な用量反応曲線を示している。
本発明は、抗精神病薬のレベルの決定を可能にする化合物及びコンジュゲートを提供する。かかる方法によって、臨床医は、診察の際に、患者の症状悪化の原因が、服薬アドヒアランスの欠如でありうる可能性がどの程度かを客観的に評価することが可能となる。あるいは、服薬が遵守されているのであれば、臨床医は異なる治療選択を検討することができる。かかる方法によって可能となる治療薬物モニタリングは、最も有効な治療選択肢を特定する上で鍵となる。更には、臨床医は、かかるTDMは、患者との関係が全く異なったものに移行する、すなわち、治療を遵守していないのではないかという仮定的な議論から、治療計画を最適化するうえで患者に積極的に主導権をもたせることによって、より協力的な関係へと移行するのに役立つと考える。
この方法の開発には、タンパク質と連結する合成ハプテンを含む、いくつかの免疫原の合成が第一に必要である。ハプテンは、タンパク質などの大きな担体に結合すると、免疫応答を誘発することができる低分子である。ハプテンは、その大部分が低分子量であって、タンパク質を含まない物質であり、単独では抗体形成を刺激することはできないが、抗体と反応する。ハプテン−タンパク質コンジュゲートは、抗体の生成を刺激することができる。低分子に対して特異的な抗体の産生は、イムノアッセイの開発において有用である(Pharm Res.1992,9(11):1375〜9,Annali Dell'Istituto Superiore di Sanita.1991,27(1):167〜74,Annali Dell’Istituto Superiore di Sanita.1991,27(1):149〜54,Immunology Letters.1991,28(1):79〜83)。
本発明は、以下の式Iの化合物を含む:
Figure 2015529197
(式中
1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2n
ここで、nは、2、又は3であり;
2は、NHC(O)、
Figure 2015529197
であるか、又は存在せず;
3は、(CH2mCO2H、又は
Figure 2015529197
であり;
ここで、mは、0、1、2、又は3である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ない))。
本発明の別の実施形態では、
1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2nであり;
ここで、nは2、又は3であり;
2は、NHC(O)、
Figure 2015529197
であるか、又は存在せず;
3は、(CH2mCO2H、又は
Figure 2015529197
であり;
ここで、mは、0、1、又は2である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ない)。
本発明の別の実施形態は、以下である式Iの化合物である:
Figure 2015529197
本発明の別の実施形態は、以下である式Iの化合物である:
Figure 2015529197
本発明の別の実施形態は、式Iの化合物のコンジュゲートである:
(式中
1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2nであり;
ここで、nは2、又は3であり;
2は、NHC(O)、
Figure 2015529197
であるか、又は存在せず;
3は、(CH2mCO2H、又は
Figure 2015529197
であり;
ここで、mは、0、1、2、又は3である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ず、免疫原性担体である))。
本発明の別の実施形態は、式Iの化合物のコンジュゲートである:
(式中
1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2nであり;
ここで、nは2、又は3であり;
2は、NHC(O)、
Figure 2015529197
であるか、又は存在せず;
3は、(CH2mCO2H、又は
Figure 2015529197
であり;
ここで、mは、0、1、又は2である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ず、免疫原性担体である))。
本発明の別の実施形態は、式Iの化合物のコンジュゲートである:
(式中
1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2nであり;
ここで、nは2、又は3であり;
2は、NHC(O)、
Figure 2015529197
であるか、又は存在せず;
3は、(CH2mCO2H、又は
Figure 2015529197
であり;
ここで、mは、0、1、2、又は3である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ず、タンパク質である))。
本発明の別の実施形態は、式Iの化合物のコンジュゲートである:
(式中
1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2nであり;
ここで、nは2、又は3であり;
2は、NHC(O)、
Figure 2015529197
であるか、又は存在せず;
3は、(CH2mCO2H、又は
Figure 2015529197
であり;
ここで、mは、0、1、又は2である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ず、タンパク質である))。
本発明の別の実施形態は、式Iの化合物のコンジュゲートである:
(式中
1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2nであり;
ここで、nは2、又は3であり;
2は、NHC(O)、
Figure 2015529197
であるか、又は存在せず;
3は、(CH2mCO2H、又は
Figure 2015529197
であり;
ここで、mは、0、1、2、又は3である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ず、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンであるタンパク質である))。
本発明の別の実施形態は:
Figure 2015529197
からなる群から選択される化合物と、
免疫原性担体とのコンジュゲートである。
本発明の別の実施形態は:
Figure 2015529197
からなる群から選択される化合物と、
タンパク質とのコンジュゲートである。
本発明の別の実施形態は:
Figure 2015529197
からなる群から選択される化合物と、
免疫原性担体とのコンジュゲートである。
本発明の別の実施形態は:
Figure 2015529197
からなる群から選択される化合物と、
タンパク質とのコンジュゲートである。
本発明の別の実施形態は:
Figure 2015529197
からなる群から選択される化合物と、
タンパク質とのコンジュゲートであって、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、サイログロブリン、又はオボアルブミンである。
本発明の別の実施形態は:
Figure 2015529197
からなる群から選択される化合物と、
タンパク質とのコンジュゲートであって、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、サイログロブリン、又はオボアルブミンである。
本発明はまた、上述の化合物と免疫原性担体とを接触させるプロセスから生成される生成物を提供する。
したがって、本発明の別の実施形態は、以下の式Iの化合物:
Figure 2015529197
(式中、
1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2nであり;
ここで、nは2、又は3であり;
2は、NHC(O)、
Figure 2015529197
であるか、又は存在せず;
3は、(CH2mCO2H、又は
Figure 2015529197
であり;
ここで、mは、0、1、2、又は3である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ず、免疫原性担体である))と、免疫原性担体とを接触させるプロセスによって生成される生成物である。
本発明の別の実施形態は、以下の式I化合物:
(式中、
1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2nであり;
ここで、nは2、又は3であり;
2は、NHC(O)、
Figure 2015529197
であるか、又は存在せず;
3は、(CH2mCO2H、又は
Figure 2015529197
であり;
ここで、mは、0、1、又は2である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ない))と、タンパク質とを接触させるプロセスによって生成される生成物である。
本発明の別の実施形態は、以下の式Iの化合物:
(式中、
1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2nであり;
ここで、nは2、又は3であり;
2は、NHC(O)、
Figure 2015529197
であるか、又は存在せず;
3は、(CH2mCO2H、又は
Figure 2015529197
であり;
ここで、mは、0、1、又は2である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ない))と、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンであるタンパク質とを接触させるプロセスによって生成される生成物である。
本発明の別の実施形態は、
Figure 2015529197
である化合物とタンパク質とを接触させるプロセスによって生成される生成物であり、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである。
本発明の別の実施形態は、
Figure 2015529197
である化合物とタンパク質とを接触させるプロセスによって生成される生成物であり、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである。
本発明の別の実施形態は、
Figure 2015529197
である化合物とタンパク質とを接触させるプロセスによって生成される生成物であり、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである。
本発明の別の実施形態は、
Figure 2015529197
である化合物とタンパク質とを接触させるプロセスによって生成される生成物であり、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである。
本発明の別の実施形態は、
Figure 2015529197
である化合物とタンパク質とを接触させるプロセスによって生成される生成物であり、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである。
略語
本明細書中及び本出願を通して、以下の略語が使用され得る。
Figure 2015529197
定義
用語「コンジュゲート」は、個別の部分が一緒に結合することで形成される任意の物質を指す。本発明による代表的なコンジュゲートとしては、式Iの化合物などの低分子と、担体又はポリアミンポリマー(特にタンパク質)などの高分子とを一緒に結合することで形成されるものが挙げられる。コンジュゲートにおいて、低分子は、高分子上の1つ以上の活性部位に結合し得る。
用語「ハプテン」は、部分的又は不完全な抗原を指す。ハプテンは、タンパク質非含有物質であり、抗体形成を刺激することはできないが、抗体と反応する。抗体は、ハプテンと高分子量の免疫原性担体とをカップリングした後、このカップリングした生成物(すなわち、免疫原)をヒト又は動物被検体に注射することで形成される。
用語「免疫原」は、生物において免疫応答を誘発、生成、又は産生させることができる物質を指す。
本明細書で使用するとき、「免疫原性担体」は、ハプテンと1つ以上の位置で結合することによって、これらのハプテンに特異的に結合し得る抗体を生成できる、一般的にはタンパク質である免疫原性物質である。免疫原性担体物質の例としては、限定されないが、異物であると認識され、それによって宿主の免疫応答を誘発する、タンパク質、糖タンパク質、ポリアミノ−多糖類複合体、粒子、及び核酸が挙げられる。ポリアミノ−多糖類は、本調製においては従来の既知の任意の手段を使用して、多糖類から調製され得る。
免疫原性担体として、アルブミン、血清タンパク質、リポタンパク質などの様々な種類のタンパク質を用い得るが、これらに限定されない。タンパク質の実例としては、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、卵オボアルボミン、ウシサイログロブリン、フラクションVヒト血清アルブミン、ウサギアルブミン、パンプキンシードグロブリン、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ボツリヌス毒素、サクシニル化タンパク質、及びポリリジンなどの合成ポリ(アミノ酸)が挙げられる。
免疫原性担体はまた、単糖類の縮合を繰り返すことによって構築される高分子量ポリマーであるポリアミノ−多糖類も含み得る。多糖類の例は、デンプン、グリコーゲン、セルロース、アラビアゴムなどの炭水化物ガム、寒天などである。多糖類は、ポリ(アミノ酸)残基及び/又は脂質残基も含む。
免疫原性担体は、ポリ(核酸)単体でありうるか、又は、上述のポリ(アミノ酸)又は多糖類のどちらか1つとコンジュゲートされていてもよい。
免疫原性担体は、固体粒子を含んでもよい。粒子の直径は、一般的には少なくとも約0.02マイクロメートル(μm)かつ約100μm以下であり、通常約0.05μm〜10μmである。粒子は、有機又は無機、膨潤性又は非膨潤性で、多孔質又は非孔質、最適には水に近い密度、一般的には約0.7〜1.5g/mLの粒子でありえて、透明であるか、部分的に透明又は不透明であり得る材料から構成されうる。粒子は、限定されないが、赤血球、白血球、血小板、ハイブリドーマ、連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌、及びウィルスのような細胞及び微生物などの生体物質であり得る。粒子は、有機又は無機ポリマー、リポソーム、ラテックス、リン脂質小胞、又はリポタンパク質からもなり得る。
用語「誘導体」は、1つ以上の化学反応により親化合物から作製される化合物又は分子を指す。
化合物の「類似体」という用語は、炭素原子の鎖及び参照化合物と同じ特定の官能基を含有する化合物を指すが、類似体の炭素鎖は、参照化合物の炭素鎖よりも長いか、又は短い。
「標識」「検出分子」、又は「リポーター」は、検出可能なシグナルを生成するか、生成するのを誘導され得る。「標識」は、検体、免疫原、抗体、又はリガンド(特にハプテン又は抗体)などの受容体と結合し得る受容体又は分子などの別の分子とコンジュゲートされ得る。標識の非限定的な例としては、放射能アイソトープ(例えば、125I)、酵素(例えば、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ)、酵素フラグメント、酵素基質、酵素インヒビター、コエンザイム、触媒、蛍光物質(例えば、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート又はFITC、又はDylight 649)、染料、化学発光物質及び発光物質(例えば、ジオキセタン、ルシフェリン)、又は増感剤が挙げられる。
本明細書で使用するとき、「スペーサ」は、ハプテン、担体、免疫原、標識又は結合パートナーなどの下部構造のうちの2つ以上と、官能性連結基を介して連結する化学構造の一部分を指す。これらのスペーサは、典型的に有機化合物中で見られるような形で典型的に存在して組み立てられる原子によって構成されるため、「有機スペーシング基」とも称される。スペーサを組み立てるのに使用される化学的なビルディングブロックは、本出願中、以下で記載されるであろう。その中で、好ましいスペーサは、直鎖状又は分枝状の飽和又は不飽和の炭素鎖である。これらの炭素鎖は、鎖内に1つ以上のヘテロ原子を含んでもよく、1つ以上のヘテロ原子は、鎖中又は鎖の末端の任意の炭素原子における1つ以上の水素原子と代わる。「ヘテロ原子」は、酸素、窒素、リン及び硫黄からなる群から選択される、炭素以外の原子を意味しており、窒素、リン及び硫黄は、任意の酸化状態で存在してよく、炭素又は他のヘテロ原子が結合していてもよい。スペーサは、鎖の一部分として、又は鎖中の原子の1つにおける置換体として、環式基又は芳香族基を含んでもよい。
スペーシング基中の原子数は、水素以外の原子を計数することで決定される。スペーシング基内の鎖中の原子数は、連結される下部構造間の最短ルートに沿った水素以外の原子数を計数することで決定される。好ましい鎖長は、1〜20原子である。
「官能性連結基」は、ハプテン上に存在する反応基を指し、ハプテンと別の部分(標識又は担体など)とのコンジュゲートを生成するための共有化学結合を形成することで、ハプテン部分が別の部分と連結され得る使用可能な反応部位を提供するのに使用され得る。ハプテンは、このようにしてビオチンなどの部分と連結し、ハプテンの競合的結合パートナーを形成し得る。
スペーサ基は、ハプテンを担体に結合させるのに使用され得る。スペーサの長さが異なることによって、抗体形成プロセスが最適となるように免疫される動物又はヒトの免疫系に提示されるように、担体から異なる距離でハプテンを結合させることが可能となる。ハプテン分子中の異なる位置で結合することで、ハプテン上の特異的部位を免疫系に提示する機会が与えられ、抗体認識に影響を及ぼす。スペーサは、水性媒体中でより可溶性が高いハプテン誘導体を作成するために、親水性可溶化基を含有し得る。親水性可溶化基の例としては、ポリオキシアルキルオキシ基、例えば、ポリエチレングリコール鎖、ヒドロキシル基、カルボキシレート基及びスルホネート基が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「求核基」又は「求核剤」は、反応において化学結合を形成する電子対を供与する種を指す。用語「求電子基」又は「求電子物質」は、反応において化学結合を形成する電子対を受容する種を指す。
用語「置換された」は、親分子上の任意の位置で炭素原子上の水素原子の代わりに原子又は原子基が置換されることを指す。置換基の非限定的な例としては、ハロゲン原子、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、シアノ、アルコキシ、ニトロ、アルデヒド及びケトン基が挙げられる。
用語「アルキル」は、別途記載のない限り、最大で12個の炭素原子の直鎖状及び分枝鎖状ラジカルの両方を指し、特に、任意の度合い又はレベルの飽和を有するラジカルを含むことを意図している。アルキルとしては、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、オクチル、2,2,4−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル及びドデシルが挙げられる。
用語「アルケニル」は、例えば、限定はされないが、ビニル及びアリルのような、少なくとも1つの不飽和基を含有する最大で12個の炭素原子のアルキル基を指す。
用語「シクロアルキル」は、3〜10個の炭素原子から構成される、飽和又は部分的に飽和された単環式又は二環式の炭化水素環ラジカルを指す。アルキル置換基は、環上に任意で存在し得る。例としては、シクロプロピル、1,1−ジメチルシクロブチル、1,2,3−トリメチルシクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘキセニルが挙げられる。
用語「へテロ原子」は、任意の許容された酸化状態で存在しうる窒素原子、酸素原子、リン原子又は硫黄原子を指す。
用語「ヘテロアルキル」は、鎖内に1つ以上のヘテロ原子を含むアルキル基を指し、1つ以上のヘテロ原子は、鎖中又は鎖の末端の任意の炭素原子における1つ以上の水素原子と代わる。
用語「ヘテロシクリル」は、3〜7個の炭素原子、及びN、O又はSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子から構成される非芳香族(すなわち、飽和又は不飽和)環を指す。アルキル置換基は、環上に任意で存在し得る。例としては、テトラヒドロフリル、ジヒドロピラニル、ピペリジル、2,5−ジメチルピペリジル、モルホリニル、ピペラジニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、ピロリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、イミダゾリジニル及びイミダゾリニルが挙げられる。
用語「ヒドロキシアルキル」は、アルキル鎖に沿った任意の炭素原子と結合する少なくとも1つのヒドロキシル基を指す。
用語「アミノアルキル」は、アルキル鎖に沿った任意の炭素原子と結合する少なくとも1つの第一級又は第二級アミノ基を指す。
用語「アルコキシアルキル」は、アルキル鎖に沿った任意の炭素原子と結合する少なくとも1つのアルコキシ基を指す。
用語「ポリアルコキシアルキル」は、長鎖アルコキシ化合物を指し、及び単一分子量(discreet)又は単分散サイズのポリエチレングリコールを含む。
用語「チオアルキルは」、アルキル鎖に沿った任意の炭素原子と結合する少なくとも1つの硫黄基を指す。硫黄基は、任意の酸化状態であってよく、スルホキシド、スルホン及びサルフェートを含む。
用語「カルボキシアルキル」は、アルキル鎖に沿った任意の炭素原子と結合する少なくとも1つのカルボキシレート基を指す。用語「カルボキシレート基」としては、カルボン酸及びアルキル、シクロアルキル、アリール又はアラルキルカルボキシレートエステルが挙げられる。
用語「アルキルカルボニル」は、アルキル鎖に沿った任意の炭素原子と結合するカルボニル基を有する基を指す。
用語「ヘテロアリール」は、5〜7員の単環式、又は8〜10員の二環式芳香環ラジカルを指し、これらの環はいずれも、N、O、又はSから選択される1〜4個のヘテロ原子からなり、窒素及び硫黄原子は、許容される任意の酸化状態で存在し得る。例としては、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンズオキサゾリル、フリル、イミダゾリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、オキサゾリル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、キノリニル、チアゾリル及びチエニルが挙げられる。
用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリール置換基を有するC1〜6アルキル基を指す。例として、フリルエチル及び2−キノリニルプロピルが挙げられる。
用語「アルコキシ」は、別途記載のない限り、酸素原子と結合する最大で12個の炭素原子の直鎖状又は分枝鎖状ラジカルを指す。例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ及びブトキシが挙げられる。
用語「アリール」は、環中に6〜12個の炭素を含有する単環式又は二環式の芳香環ラジカルを指す。アルキル置換基は、環上に任意で存在し得る。例としては、フェニル、ビフェニル及びナフタレンが挙げられる。
用語「アラルキル」は、アリール置換基を含有するC1〜6アルキル基を指す。例として、ベンジル、フェニルエチル又は2−ナフチルメチルが挙げられる。
用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリール置換基を含有するC1〜6アルキル基を指す。例としては。フリルメチル及びピリジルプロピルが挙げられる。
用語「アリールオキシ」は、アリール置換基と結合する酸素原子を指す。例としては、フェノキシ及びベンジルオキシが挙げられる。
用語「アリールアルコキシ」は、アリール置換基に結合するアルコキシ基を指す。例としては、フェニルメチルエーテルが挙げられる。
用語「アシル」は、−C(O)Raを指し、式中、Raは、アルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロアラルキルである。「アシル化剤」は、分子に、−C(O)Ra基を付加する。
用語「スルホニル」は、−S(O)2aを指し、Raは、水素、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロアラルキルである。「スルホニル化剤」は、分子に、−S(O)2aを付加する。
ハプテンの担体部分への結合において、反応性官能性連結基を担持するスペーサは、様々な方法によって調製され得る。スペーサは、いずれかの末端の基によって異なるように官能化されるか又は活性化され、これによってハプテン及び担体と選択的に連続反応することができる基を用いて形成されうるが、両端で同じ反応部分を使用してもよい。ハプテンと、担体に結合する官能性連結基との反応において選択される基は、ハプテンと、ハプテンが結合する担体における官能基の種類によって決定される。スペーサ並びにハプテン及び担体との結合方法は、Brinkley,M.,A.,Bioconjugate Chem.1992,3:2〜13,Hermanson,Greg T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press,London,Amsterdam,Burlington,MA,USA,.2008及びThermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook;(Thermo Scientific 3747 N Meridian Rd,Rockford,IL USA 61101,ph 800−874−3723又は:http://www.piercenet.com/からのダウンロード又は印刷出力から入手可能)、及びその参考文献に記載されるものを含むが、これらに限定されない。スペーサ基の形成において、異なるように活性化される多くの分子は、例えば、Thermo Scientificなどの供給メーカーから市販されている。
アミノ基を担持するハプテンにおいて、スペーサとハプテンとの結合様式は、ハプテン上のアミンと、ハロゲン化アシル又は活性エステルを担持するスペーサビルディングブロックとの反応を含む。「活性エステル」は、安定した結合を形成する穏やかな条件下で、例えばアミノ基のような求核基と反応するエステルとして定義される。安定した結合は、例えば、後に続く合成工程のような更なる使用条件、免疫原としての使用、又は生化学アッセイにおいて損傷を受けない結合として定義される。安定した結合の好ましい例は、アミド結合である。活性エステル及び形成方法は、Benoiton,N.L.によって、Houben−Weyl,Methods of Organic Chemistry,Thieme Stuttgart,New York,vol E22 section 3.2:443 and Benoiton,N.L.,Chemistry of Peptide Synthesis,Taylor and Francis,NY,2006に記載されている。好ましい活性エステルとしては、p−ニトロフェニルエステル(PNP)、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)及びテトラフルオロフェニルエステル(TFP)が挙げられる。ハロゲン化アシルは、例えば、カルボン酸と塩化チオニル又は塩化オキサリルとの反応(Fieser,L.F.and Fieser,M.Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons,NY,1967及びこの参考文献を参照のこと)のような、当業者に既知の多くの方法によって調製され得る。これらは、WuらによるOrganic Letters,2004,6(24):4407に記載されるように、活性二官能性スペーサにおいても使用され得るp−ニトロフェニルエステル(PNP)などの他の活性エステルに変換され得る。N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルは、国際特許第2012012595号の実施例35に記載されるように、無水条件下で、非プロトン性溶媒中トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基の存在下で、炭酸N,N−ジスクシンイミジル(CAS 74124−79−1)と化合物のカルボン酸との反応によって、又は、無水条件下で、N−ヒドロスクシンイミド及びジシクロヘキシカルボジイミド(DCC)又は他の脱水剤を使用することで調製され得る。テトラフルオロフェニルエステル(TFP)は、WilburらによってBioconjugate Chem.,2004,15(1):203で報告されるように、無水条件下で、非プロトン性溶媒中、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基の存在下で、カルボン酸と2,3,5,6−テトラフルオロフェニルトリフルオロ酢酸塩との反応により調製され得る。当業者は、表1に示されるスペーサは、特に、既知の方法を使用して得られ、反応条件のルーチンの最適化を用いてアミノ担持ハプテンと結合することができることを認識するであろう。これらのスペーサによって、ハプテンと担体上のチオール基の結合が可能となる。
Figure 2015529197
カップリング剤の存在下、ハプテン上のアミンとスペーサビルディングブロック上のカルボン酸官能基との直接的なカップリングは、1つの結合様式としても使用され得る。好ましい試薬は、典型的にはペプチド合成に使用される試薬である。ペプチドカップリング試薬としては、O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU,CAS #125700−67−6)(Pruhs,S.,Org.Process.Res.Dev.2006,10:441を参照のこと);カルボジイミド脱水剤を含むN−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT,CAS #2592−95−2)(例えば、N−N−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、又は1−エチル−3(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC))(Konig W.,Geiger,R.Chem.Ber.,1970,103(3):788を参照のこと);3−(ジエトキシホスホリルオキシ)−1,2,3−ベンゾトラジン−4(3H)−オン(DEPBT,CAS#165534−43−0)(Liu,H.et.al.,Chinese Chemical Letters,2002,13(7):601を参照のこと);ビス(2−オキソ−3−オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロリド;BOP−Cl(CAS 68641−49−6)(Diago−Meseguer,J, et.al.# Synthesis,1980,7:547〜51を参照のこと)、及び他の、BenoitonbによってChemistry of Peptide Synthesis,CRC Press,Boca Raton,FL,2005,Chapter 2に詳しく記載されており、技術告知は、Advanced Automated Peptide Protein Technologies(aapptec),6309 Shepardsville Rd.,Louisville KY 40228,ph 888 692 9111;www.aapptec.com,によって提供されるもの、及びこれらの参考文献が挙げられるが、限定されない。これらの方法は、ハプテンをスペーサに結合させる安定なアミド結合を生成する。既知の方法を使用して得られ、上述及び引用される方法を用いて反応条件のルーチンの最適化を利用してアミノ担持ハプテンに結合され得るスペーサの例を表2に示すが、表2に示されるものに限定されない。これらのスペーサによって、ハプテンと担体上のチオール基の結合が可能となる。
Figure 2015529197
スペーサはまた、担体への結合が可能である官能性連結基の形成工程などの、適切な化学基がハプテンに連続的に結合することによる、段階的な様式で構成され得る。以下の一般的な反応スキームにおいて実例を参照のこと。
更に、ハプテンが、例えば、チオール基、アミノ基又はヒドロキシル基のような、スペーサとの結合位置になる求核基を有する際、スペーサは、チオール、アミン又はヒドロキシル基のアルキル化によっても構成され得る。アルキルハライド、又はスルホン酸エステル(p−トルエンスルホネートなど)のような、置換反応を受けることができる部分で適切に置換される任意のアルキル基は、スペーサを結合させるのに使用され得る。アルキル化反応の多くの例が当業者に既知であって、具体例は、一般的な化学文献中で見出され、ルーチンな実験を通して最適化され得る。多くの参考文献におけるアルキル化反応の議論は、March's Advanced Organic Chemistry,Smith,M.B.,and March,J.,John Wiley & sons,Inc.NY,2001のチャプター10で見出すことができる。ハプテン上の例えばアミンのような求核部分とイソシアネートとの反応による尿素の形成、又はイソチオシアネートとの反応によるチオ尿素結合の形成などの他の結合も用いられ得る(Li,Z.,et.al.,Phosphorus,Sulfur and Silicon and the Related Elements,2003,178(2):293〜297を参照のこと)。イソシアネート基との反応を介して、ヒドロキシル基を担持するハプテンにスペーサを結合させて、カルバメート又はウレタン結合を形成してもよい。スペーサは、一方の末端上のイソシアネート官能基、及び担体と反応することができる官能性連結基によって異なるように活性化され得る(Annunziato,M.E.,Patel,U.S.,Ranade,M.and Palumbo,P.S.,Bioconjugate Chem.,1993,4:212〜218を参照のこと)。
カルボン酸基を担持するハプテンにおいて、ハプテンへのスペーサ部分の結合様式には、その調製が前述されているハロゲン化アシル又は活性エステル(その例を表3で示す)としてのカルボン酸基の活性化の後に、スペーサ部分上のアミノ(−NH2−)、ヒドラジノ(−NH−NH2−)、ヒドラジド(−C(O)−NH−NH2−)もしくはヒドロキシル基(−OH)との反応によるアミド、ヒドラジド、ジアシルヒドラジンもしくはエステル結合の形成、またはカルボン酸基とスペーサ部分上のアミノ基との直接カップリング、又は前述のペプチドカップリング試薬及び/又はカルボジイミド脱水試薬(その例を表4及び5で示す)による担体との直接カップリングが挙げられる。活性化エステルの形成及びペプチドカップリング剤の使用に関して上記で引用された参考文献で見られる手順は、反応条件のルーチンの最適化を用いて、カルボン酸担持ハプテンをスペーサビルディングブロック及び利用可能なアミノ基を含むタンパク質担体に結合させるために使用され得る。
Figure 2015529197
Figure 2015529197
Figure 2015529197
スペーサと結合させるために、他の求電子基、例えばハロゲン化スルホニル
Figure 2015529197
又は求電子亜リン酸基、例えば:
Figure 2015529197
(Malachowski,William P.,Coward,James K.,Journal of Organic Chemistry,1994,59(25):7616を参照のこと)
又は:
Figure 2015529197
cはアルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキルである求電子基がハプテン上に存在してもよい。
Aliouane,L.,et.al,TetrahedronLetters,2011,52(28):8681を参照のこと。
アルデヒド基又はケトン基を担持するハプテンは、限定されないが、スペーサ上のヒドラジド基H2N−NH−C(O)−との反応によるアシルヒドラゾンの形成を含む方法を使用してスペーサに結合され得る(Chamow,S.M.,Kogan,T.P.,Peers,D.H.,Hastings,R.C.,Byrn,R.A.and Askenaszi,A.,J.Biol.Chem.,1992,267(22):15916を参照のこと)。担体上でチオール基と結合することが可能な二官能性ヒドラジドスペーサの例が表6で示されている。
Figure 2015529197
ハプテンは、担体がチオールと反応しうる基を提供するように修飾されている場合には、担体と反応し得るチオール基を含有していてもよい。担体基は、担体上におけるアミノ基とマレイミド酢酸N−スクシンイミジル(AMAS,CAS# 55750−61−3)、ヨード酢酸スクシンイミジル(CAS# 151199−81−4)、又は表1で示される二官能性スペーサ基のいずれかとの反応によるマレイミド官能基を含有する基の結合、反応を受け得る基を組み込んでハプテンと担体との結合をもたらす方法によって修飾され得るが、これに限定されない。
担体との結合を形成することができる官能性連結基は、安定的な結合を形成することができる任意の基であってよく、担体上の多くの異なる基と反応性があってよい。官能性連結基は、好ましくは、担体上のアミノ基、カルボン酸基、又はチオール基、又はその誘導体と反応し得る。官能性連結基の非限定例としては、カルボン酸基、ハロゲン化アシル、活性エステル(上記で定義した通りである)、イソシアネート、イソチオシアネート、アルキルハライド、アミノ基、チオール基、マレイミド基、アクリレート基(H2C=CH−C(O)−)又はビニルスルホン基H2C=CH−SO2−)があり、Park,J.W.,et.al.,Bioconjugate Chem.,2012,23(3):350を参照のこと。官能性連結基は、ハプテンと段階的に反応し得る異なるように活性化されたスペーサビルディングブロックの一部として存在してもよく、生じたハプテン誘導体が、その後に担体と反応し得る。あるいは、ハプテンは、後続反応によって官能性連結基に変換され得る前駆体基を担持するスペーサによって誘導体化され得る。スペーサ上の官能性連結基がアミン又はカルボン酸基である際、担体上のカルボン酸基又はアミンとのカップリング反応は、これらの試薬に関して上記で引用される参考文献における手順に従って、ペプチドカップリング試薬を用いることにより直接行われうる。
特定のジスルフィド基(例えば、ピリジルジスルフィド)は、担体上でチオール基との交換がなされ得るスペーサ上の官能性連結基として使用され、混合ジスルフィド結合が形成され得る(Ghetie,V.,et al.,Bioconjugate Chem.,1990,1:24〜31を参照のこと)。これらのスペーサは、アミン担持ハプテンと、限定はされないが、その例が表7に示されるものであるピリジルジスルフィド基を担持するスペーサに結合する活性エステルとの反応によって結合し得る。
Figure 2015529197
ほとんどの場合、担体はタンパク質であり、リジン残基のε−アミノ基は、アミン反応性官能性連結基との反応によって直接、あるいは、チオール含有基(S−アセチルチオ酢酸N−スクシンイミジル(SATA,CAS 76931−93−6)又はこれらの誘導体など)による誘導化後に、アセテート基をヒドロキシルアミンで開裂し、ハプテン上で官能性連結基と反応させるためにチオール基を露出することで、結合のために用いられうる。チオール基は、また、タンパク質担体内のジスルフィド結合を、限定はしないが、2−メルカプトエチルアミンなどの中程度の還元剤で還元することで担体に導入され得る(Bilah,M.,et.al.,Bioelectrochemistry,2010,80(1):49を参照のこと、ホスフィン試薬に関してはKirley,T.L.,Analytical Biochemistry,1989,180(2):231 or dithioerythritol(DTT,CAS 3483−12−3)Cleland,W.,Biochemistry,1964,3:480〜482を参照のこと。
一般的な反応スキーム
本発明の代表的な化合物は、以下に記載される一般的合成方法に従って合成することができる。式(I)の化合物は、当業者に既知の方法により調製することができる。以下の反応スキームは、本発明の実施例を表すことのみを意味し、決して本発明の限定であることを意味しない。
Figure 2015529197
式Iの化合物(式中、L1は、OC(O)(CH2nであり、L2は存在せず、R3は、CO2Hである)は、スキーム1に従って作成され得る。ピリジンなどの溶媒中、室温〜60℃までの範囲の温度で、約48時間、パリペリドンのハプテンと無水コハク酸又は無水グルタル酸などの環状無水化合物との反応を進行させる。
Figure 2015529197
式Iの化合物(式中、L1は、OC(O)(CH2nであり、L2は、NHC(O)であり、R3は、
Figure 2015529197
である)は、スキーム2に従って作成され得る。ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの脱水剤を使用して、グリシンなどの好適なboc保護アミノ酸とパリペリドンとの縮合を行う。反応は、N,N−ジメチル−4−ピリジンアミンなどの塩基を使用して、ジクロロメタンなどの非プロトン性溶媒中、室温で行われる。アミン基の脱保護は、トリフルオロ酢酸によって行われ、次いでマレイミド官能基が付加される。マレイミドは、当該技術分野で既知の任意の方法によって組み込まれ得る。例えば、ジクロロメタンなどの溶媒及びジイソプロピルエチルアミン及びシアノホスホン酸ジエチルなどのカップリング試薬中、N−マレオイル置換アルキルアミノ酸(スキーム2に示されるように)との反応によって、ハプテン上にマレイミド官能化リンカーを生じる。あるいは、2,5−ジオキソピロリジン−1−イル2−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロル−1−イル)酢酸塩などの他のマレイミド官能基を、DMFなどの溶媒、及びトリブチルアミンなどの塩基中で使用してもよい。
スキーム2の手順は、式I(式中、L1は、O(CH2nである)の化合物においても使用され得る。この場合、THFなどの溶媒中、ほぼ室温で、約6時間、パリペリドンを、適切なboc−保護アミノアルキルブロミド(boc−アミノプロピルブロミドなど)、18−クラウン−6、及び水素化ナトリウムと反応させる。その後のboc保護基の除去およびマレイミド官能基の導入は、スキーム2に記載されるように進行する。
Figure 2015529197
式Iの化合物(式中、L1は、O(CH2nであり、L2は存在せず、L3は、(CH2mCO2Hである)は、スキーム3に従って作成され得る。THFなどの溶媒中、18−クラウン−6及び水素化ナトリウムの存在下、約18時間、パリペリドンを、CO2H置換アルキルブロミドと反応させる。
Figure 2015529197
式Iの化合物(式中、L1は、O(CH2nであり、L2は、
Figure 2015529197
であり、L3は、(CH2mCO2Hである)は、スキーム4に従って作成され得る。スキーム3に記載されるようにして調製した、リンカー及びCO2Hで官能化したパリペリドンを、N−t−ブトキシカルボニルピペラジン、シアノホスホン酸ジエチル、及びジイソプロぴエチルアミンなどの塩基によって処理する。この反応は、ジクロロメタン中、約2時間室温で行われる。ピペラジニル基の脱保護を、スキーム2で記載したように無水トリフルオロ酢酸によって行い、その後、ジイソプロピルエチルアミンなどの好適な塩基の存在下、無水コハク酸又は無水マレイン酸などの適切な無水物と反応させる。あるいは、当業者は、脱保護されたピペラジニル基を、スキーム2に記載されるように、マレイミド官能基と合成してもよいことを認識するであろう。
Figure 2015529197
マレイミド官能化ハプテンは、スキーム5に示されるような方法に従って、タンパク質とコンジュゲートされ得る。ε−窒素をS−アセチルチオ酢酸N−スクシンイミジル(SATA)でアシル化することによるタンパク質リジン残基の活性化、次に続くヒドロキシルアミンによるS−アセチル基の加水分解により、求核性スルフヒドリル基が生成される。スルフヒドリル活性化タンパク質とマレイミド誘導体化ハプテン(一般的なスキーム2に記載されるように調製した)とのコンジュゲーションは、マイケル付加反応を介して進行する。好適なタンパク質は当業者に既知であり、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンが挙げられる。
Figure 2015529197
カルボン酸官能化ハプテンは、スキーム6に示される方法に従って、タンパク質とコンジュゲートされ得る。DMFなどの溶媒中、約20℃の温度で約18時間、N−ヒドロキシスクシンイミド及びジシクロヘキシルカルボジイミドなどの好適なカップリング剤、並びにトリブチルアミンなどの塩基と反応させることで、脱離基を有するカルボン酸を活性化する。活性化リンカー及びハプテンは、次に、pH 7.5のリン酸緩衝液などの溶媒中で、約20℃で約2.5時間、タンパク質とコンジュゲートされ得る。好適なタンパク質は当業者に既知であり、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンが挙げられる。
抗体生成
上述のコンジュゲートは、それらが産生される抗精神病薬(パリペリドン)と結合する抗体の生成に有用である。これらの抗体は、患者サンプル中の抗精神病薬の存在及び/又は量を検出するアッセイに使用され得る。かかる検出によって、治療薬物モニタリングがその利点を全て受けることが可能となる。抗精神病薬のレベルの検出は:リスペリドン、パリペリドン、クエチアピン、オランザピン、及びこれらの代謝産物からなる群から選択されるものなどである、他の抗精神病薬の検出と組み合わせた検出であって、かかる検出は、これらの抗精神病薬を同時に測定することが可能である;規定の療法に対する患者のアドヒアランス又は遵守の決定;患者を経口による抗精神病投薬計画から持続性注射剤による抗精神病投薬計画に変更すべきかどうかを決定する決定ツールとしての使用;有効又は安全な薬剤レベルを確実に達成又は維持するために、抗精神病薬抗精神病経口薬又は注射剤の投与レベル又は投与間隔を増加又は減少させるべきかを決定する決定ツールとしての使用;最小pKレベルが得られるという証拠を提供することで、抗精神病薬による療法の開始に役立つものとしての使用;複数の処方又は複数の源からの抗精神病薬の生物学的同等性を決定するための使用;多剤併用及び薬剤−薬剤間の潜在的な相互作用による影響を評価するための使用;並びに、患者を臨床治験から除外するか、又は参加させるかの指標としての使用、次いで臨床治験における投薬要求に対するアドヒアランスのモニタリングに役立つものとしての使用;などの多くの目的において有用であり得る。
本明細書中の化合物及び免疫原性担体を含む、本発明のコンジュゲートを提供することで、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及びヒト化抗体のような、抗精神病薬と結合する抗体が産生され得る。特に想定されるかかる抗体としては、モノクローナル及びポリクローナル抗体並びにこれらのフラグメント、例えば、抗原結合ドメイン及び/又はこれらの抗体に対する1つ以上の相補性決定領域を含有する組み換えタンパク質が挙げられる。好ましくは、抗体は薬剤及び所望の薬理学的活性代謝産物と結合するであろう。薬剤コンジュゲートにおいて、免疫原性担体の結合位置を変更することで、抗体に対する代謝産物及び/又は関連薬剤の選択性及び交差反応性を操作することができる。パリペリドン(9−ヒドロキシリスペリドン)に関して、リスペリドン又は、7−ヒドロキシリスペリドン及びN−デアルキルリスペリドンなどの他のリスペリドン代謝産物との交差反応性は妥当でありうるか、または妥当とは限らない。7−ヒドロキシリスペリドン又はN−デアルキルリスペリドンとは反応せず、リスペリドンとパリペリドンとに交差反応性がある抗体が望ましく、これによってリスペリドン及びその主要な薬理学的に活性な代謝産物であるパリペリドンを検出することができる。あるいは、抗体は、薬理学的に活性な代謝産物であるリスペリドン及びパリペリドンを個別に検出するが、不活性代謝産物である7−ヒドロキシリスペリドン及びN−デアルキルリスペリドンを検出しないことが妥当でありうる。これらの薬剤及び/又は代謝産物のうちの複数のものを検出する抗体が産生されるか、又は各々別個に検出する抗体が産生され得る(つまり、「特異的結合」特性を有する抗体と定義する)。抗体は、1つ以上の化合物の結合が等モル又は実質的に等モルで行われる場合、1つ以上の化合物に特異的に結合する。
かかる抗体の生成方法には、本発明の特徴を具体化するコンジュゲート(化合物及び免疫原である免疫原性担体)を接種することを含む。好適な宿主としては、限定はされないが、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ロバ、ウマ、サル、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、ヒト、及び、成熟免疫応答を開始することができる任意の種が挙げられる。免疫手順は、当該技術分野において確立しており、多くの学術論文及びDavid Wildによって編集された(Nature Publishing Group,2000)「The Immunoassay Handbook(第2版)」などの刊行物及び本明細書で引用される参照文献に記述されている。
好ましくは、本発明の特徴を具体化する免疫原は、アジュバントと組み合わせて、例えば、動物又はヒトのような宿主被検体に投与される。好適なアジュバンドとしては、限定されないが、フロイントアジュバント、粉末水酸化アルミニウム(ミョウバン)、百日咳菌を加えた水酸化アルミニウム、及びモノホスホリル脂質A合成トレハロースジコリノミコレート(MPL−TDM)が挙げられる。
ポリクローナル抗体は、任意でアジュバントと一緒に投与され得る1回以上の免疫原の注射によって、哺乳類宿主中で作製され得る。典型的には、免疫原又は免疫原とアジュバントとの組み合わせを、1回又は複数回の皮下注射又は腹腔内注射によって哺乳類宿主に注射する。好ましくは、免疫プログラムは、少なくとも1週間にわたって、より好ましくは2週間以上にわたって実行される。このようにして生成されたポリクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法を用いて単離及び精製され得る。
モノクローナル抗体は、Kohler及びMilsteinの確立されたハイブリドーマ法(例えば、Nature 256:495〜497(1975))によって生成され得る。ハイブリドーマ法は、典型的には、宿主又は宿主のリンパ球を免疫すること、モノクローナル抗体分泌リンパ球または分泌能を有するリンパ球を採取すること、リンパ球を不死化細胞に融合すること、及び所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択することを含む。
宿主を免疫すると、免疫原に対して特異的な抗体を生成するか、又は生成することができるリンパ球を誘発することができる。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化される。ヒト細胞が望ましい場合、末梢血リンパ球が使用され得るが、脾臓細胞又は他の哺乳類源からのリンパ球が好ましい。
リンパ球を不死化細胞株と融合するとハイブリドーマ細胞を形成することができ、そのプロセスは、例えばポリエチレングリコールのような融合剤を使用することで促進され得る。実例として、形質転換によって不死化された変異体げっ歯類、ウシ、又はヒト骨髄腫細胞が使用され得る。非融合不死化細胞とは対照的に、実質的に純粋なハイブリドーマ細胞の集団が好ましい。したがって、融合後、例えば、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスファーゼ(HGPRT)を欠いた変異体骨髄腫細胞を使用することで、非融合の不死化細胞の成長又は生存を阻害する好適な培地で細胞は成長することができる。このような例において、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを培地(HAT培地)に添加すると、HGPRT−欠損細胞の成長が阻止されつつも、ハイブリドーマの成長は可能となる。
好ましくは、効果的に融合した不死化細胞は、HATなどの培地中での選択によって混合集団から単離され、安定した高レベルでの抗体発現を支持することができる。好ましい不死化細胞株としては、American Type Culture Collection,Manassas,VAから入手可能な骨髄腫細胞株が挙げられる。
ハイブリドーマ細胞は、典型的には抗体を細胞外に分泌することから、培地を抗精神病薬に対して特異的なモノクローナル抗体の存在に関してアッセイすることができる。例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)酵素結合のようなインビトロ結合アッセイによる免疫沈降は、モノクローナル抗体の結合特異性を測定するのに使用され得る。
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ細胞は、限界希釈法及び継代培養することで、単一クローンとして単離され得る。好適な培地としては、限定されないが、ダルベッコ変法イーグル培地、RPMI−1640、及び、例えばUltra DOMA PF又はHL−1のようなポリペプチド非含有、ポリペプチド還元された、又は無血清の培地(Biowhittaker,Walkersville,MDから入手可能)が挙げられる。又は、ハイブリドーマ細胞は、生体内で腹水として成長し得る。
モノクローナル抗体は、限定はされないが、ポリペプチドA−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、硫酸アンモニウム沈殿、及びアフィニティクロマトグラフィなどの従来の免疫グロブリン(Ig)精製法によって培養培地又は腹水から単離及び/又は精製され得る。
モノクローナル抗体は、米国特許第4,166,452号に記載されるような組み換え法によっても生成され得る。好ましくは、抗精神病薬に対して特異的な抗体を分泌するモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株から単離されたDNAをプロービングするために、従来の手順を使用して、例えば、ネズミの重鎖及び軽鎖抗体遺伝子、と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを使用して、モノクローナル抗体をコードするDNAを単離及びシークエンスすることができる。
イムノアッセイ
このようにして生成された抗体は、抗精神病薬を認識/結合し、それによって患者サンプル中の薬剤の存在及び/又は量を検出することができるイムノアッセイに使用され得る。好ましくは、アッセイフォーマットは、競合的イムノアッセイフォーマットである。かかるアッセイフォーマット及び他のアッセイは、他所でも記載されている(Hamptonら(Serological Methods,A Laboratory Manual,APS Press,St.Paul,MN 1990)及びMaddoxら(J.Exp.Med.158:12111,1983))。
上述されるように、抗体を含む試薬キットも提供され得る。代表的な試薬キットは、抗精神病薬であるパラペリドンに結合する抗体、標識部分に連結された抗精神病薬の類似体又はそれらの誘導体を含む複合体を含み、既知の量の抗精神病薬又は関連標準物質を含む1つ以上のキャリブレータを1つ以上含んでもよい。
上述のように、試薬キットは、測定される既知量の検体を含むキャリブレータ及び/又は対照物質を含み得る。検体の濃度は、サンプルについて得られた結果と、標準物質について得られた結果とを比較することで算出され得る。較正曲線を作成して、これを用いて、一連の結果を関連付けて、サンプル中の検体の濃度を決定することができる。
例えば、抗精神病薬のような検体を含有すると思われる任意のサンプルは、現状好ましい実施形態の方法に従って、分析され得る。所望であれば、サンプルは前処理されてよく、アッセイに影響を与えない任意の従来の培地で調製され得る。好ましくは、サンプルは、宿主からの体液などの水性媒体、最も好ましくは血漿または血清を含む。
以下の同時継続出願:題目「Haptens of Aripiprazole」(代理人整理番号:PRD3265USPSP号、代表発明者名:Remmerie)、題目「Haptens of Olanzapine」(代理人整理番号:PRD3266USPSP号、代表発明者名:Remmerie)、題目「Haptens of Paliperidone」(代理人整理番号:PRD3267USPSP号、代表発明者名:Remmerie)、題目「Haptens of Quetiapine」(代理人整理番号:PRD3268USPSP号、代表発明者名:Remmerie)、題目「Haptens of Risperidone and Paliperidone」(代理人整理番号:PRD3269USPSP号、代表発明者名:Remmerie)、題目「Antibodies to Aripiprazole Haptens and Use Thereof」(代理人整理番号:CDS5128USPSP号、代表発明者名:Hryhorenko)、題目「Antibodies to Olanzapine Haptens and Use Thereof」(代理人整理番号:CDS5132USPSP号、代表発明者名:Hryhorenko)、題目「Antibodies to Paliperidone Haptens and Use Thereof」(代理人整理番号:CDS5126USPSP号、代表発明者名:Hryhorenko)、題目「Antibodies to Quetiapine Haptens and Use Thereof」(代理人整理番号:CDS5134USPSP号、代表発明者名:Hryhorenko)、題目「Antibodies to Risperidone Haptens and Use Thereof」(代理人整理番号:CDS5130USPSP号、代表発明者名;Hryhorenko)、題目「Antibodies to Aripiprazole and Use Thereof」(代理人整理番号:CDS5129USPSP号、代表発明者名:Hryhorenko)、題目「Antibodies to Olanzapine and Use Thereof」(代理人整理番号:CDS5133USPSP号、代表発明者名:Hryhorenko)、題目「Antibodies to Paliperidone and Use Thereof」(代理人整理番号:CDS5127USPSP号、代表発明者名:Hryhorenko)、題目「Antibodies to Quetiapine and Use Thereof」(代理人整理番号:CDS5135USPSP号、代表発明者名:Hryhorenko)、題目「Antibodies to Risperidone and Use Thereof」(代理人整理番号:CDS5131USPSP号、代表発明者名:Hryhorenko)は、全て本明細書と同時に出願され、その内容は全て本明細書に組み込まれる。
本発明の代表的な化合物は、以下に記載される一般的合成方法に従って合成することができる。式(I)の化合物は、当業者に既知の方法により調製することができる。以下の実施例は、本発明の実施例を表すことのみを意味し、決して本発明を限定することを意図しない。
(実施例1)
4−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)−4−オキソ酪酸
Figure 2015529197
パリペリドン(10g、23.45ミリモル)をN,N−ジメチル−4−ピリジンアミン(0.5g、4.09ミリモル)及び無水コハク酸(18.3g、182.86ミリモル)とともにピリジン(100mL)中に溶解した。混合物を、アルゴン雰囲気下、60℃で4時間及び室温で48時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、ジクロロメタン/メタノール(100mL/10mL)及び水(100mL)を溶解した。水相をジクロロメタン/メタノール(100mL/10mL)で5回抽出した。有機層を合わせて、Na2SO4で乾燥し、真空下で蒸発させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製(溶出勾配:クロロホルム/エタノール=80/20〜70/30)した。生成物をイソプロパノール(50mL)中に溶解し、生じた沈殿物を濾過し、イソプロパノール(10mL)で洗浄した。沈殿物を真空下で乾燥して、白色固体として表題化合物を得た。ESI−MS(M+1)528。1H NMR:(DMSO−d6,360 MHz):δ ppm 1.75〜2.75(m,23H),δ 3.5〜4.0(m,3H),δ 5.74(m,1H),δ 7.28(td,J=9.15,2.20Hz,1H),δ 7.69(dd,J=8.96,2.01Hz,1H),δ 8.02(dd,J=8.78,5.12Hz,1H)。
(実施例2)
工程A
3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル3−ピバルアミドプロパノエート
Figure 2015529197
パリペリドン(1.0g、2.34ミリモル)のジクロロメタン溶液(20mL)を、Boc−b−Ala−OH(443.65mg、2.34ミリモル)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(483.79mg、2.34ミリモル)及びN,N−ジメチル−4−ピリジンアミン(14.32mg、0.117ミリモル)で処理した。アルゴン雰囲気下、室温で反応物を撹拌した。18時間後、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液(20mL)に注入し、水層をジクロロメタンで(20mLで3回)抽出した。合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、濾過及び濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製(ジクロロメタン/メタノール(95/5)で溶出)し、表題化合物を得た。ESI−MS(M+1)598。
工程B
3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル3−(3−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロル−1−イル)プロパンアミド)プロパノエート
Figure 2015529197
工程Aに記載されるようにして調製した3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル3−ピバルアミドプロパノエート(901.5mg、1.15ミリモル)のジクロロメタン(20mL)及びトリフルオロ酢酸(5.7mL)の溶液を室温で1時間撹拌した。この混合物に、N−マレオイル−3−アミノプロピオン酸(233.8mg、1.38ミリモル)、ジイソプロピルエチルアミン(13.94mL)、シアノホスホン酸ジエチル(306.57μL、1.81ミリモル)及びジクロロメタン(2mL)をゆっくりと加えた。アルゴン雰囲気下、反応混合物を1時間室温で撹拌した。反応混合物を水(20mL)に注入し、水層をジクロロメタン(20mLで3回)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過及び濃縮した。粗混合物をHPLCで精製して表題化合物を得た。ESI−MS(M+1)649。
(実施例3)
工程A
N−(3−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)プロピル)ピバルアミド
Figure 2015529197
パリペリドン(746.26mg、1.75ミリモル)のTHF溶液(15mL)を、3−(Boc−アミノ)プロピルブロミド(500mg、2.10ミリモル)、18−クラウン−6(231.25mg、0.874ミリモル)及び水素化ナトリウム(60w/w%、139.97mg、3.5ミリモル)で処理した。混合物を室温で6時間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、ジクロロメタン/水(50mL/50mL)中に溶解し、水層をジクロロメタン(50mLで3回)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過及び濃縮して表題化合物を得て、これを更に精製することなく次の工程で使用した。
工程B
9−(3−アミノプロポキシ)−3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−4−オン
Figure 2015529197
工程Aに記載されるようにして調製したN−(3−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)プロピル)ピバルアミド(1.482g、2.54ミリモル)のジクロロメタン(10mL)及びトリフルオロ酢酸(5mL)の溶液を、室温で1時間撹拌した。反応混合物をPorapak CXカラムで精製して表題化合物を得て、これを更に精製することなく次の工程で使用した。
工程C
3−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロル−1−イル)−N−(3−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)プロピル)プロパンアミド
Figure 2015529197
工程Bに記載されるようにして調製した9−(3−アミノプロポキシ)−3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−4−オン(0.303g、0.627ミリモル)のジクロロメタン溶液(5mL)を、ジイソプロピルエチルアミン(218.54μL、1.25ミリモル)、N−マレオイル−3−アミノプロピオン酸(163.88mg、0.940ミリモル)及びシアノホスホン酸ジエチル(159.19μL、0.940ミリモル)でアルゴン下で処理した。18時間後、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液(20mL)に注入し、水層をジクロロメタンで(20mLで3回)抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過及び濃縮した。粗混合物をHPLCで精製して表題化合物を得た。ESI−MS(M+1)635。
(実施例4)
6−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)ヘキサン酸
Figure 2015529197
パリペリドン(1.0g、2.34ミリモル)のTHF溶液(15mL)を、アルゴン下、18−クラウン−6(309.88mg、1.17ミリモル)、6−ブロモヘキサン酸エチル(628.76μL、3.52ミリモル)及び水素化ナトリウム(60w/w%、937.80mg、23.45ミリモル)で処理した。18時間後、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液(20mL)に注入し、水層を酢酸エチルで(20mLで3回)抽出した。水層を酢酸で酸性化し、2−メチルTHFで(20mLで3回)抽出した。合わせた有機2−メチルTHF層をNa2SO4で乾燥し、濾過及び濃縮した。残渣をHPLCで精製して、表題化合物を得た。ESI−MS(M+1)541。1H NMR:(CDCl3,360 MHz):δ ppm 1.35〜2.00(m,11H),δ2.10〜2.30(m,8H),δ 2.40〜2.80(m,8H),δ 3.20〜4.00(m,5H),δ 4.24〜4.30(m,1H),δ 7.07(td,J=8.97,1.83Hz,1H),δ 7.24(d,J=1.83Hz,1H),δ 7.76(dd,J=8.60,4,94Hz,1H)。
(実施例5)
工程A
tert−ブチル−4−(6−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)ヘキサノイル)ピペラジン−1−カルボキシレート
Figure 2015529197
実施例4(200mg、0.37ミリモル)のジクロロメタン溶液(10mL)を、N−t−ブトキシカルボニルピペラジン(89.57mg、0.48ミリモル)及びジイソプロピルエチルアミン(77.42μL、0.44ミリモル)でアルゴン下で処理した。この撹拌溶液に、シアノホスホン酸ジエチル(72.06μL、0.43ミリモル)を加えた。室温で2時間撹拌した後、反応混合物を水(20mL)に注入し、水層をジクロロメタンで抽出(20mLで3回)した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過及び濃縮した。粗混合物を、更に精製せずに次の工程に使用した。(408mg、ESI−MS(M+1)709)
工程B
3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−9−((6−オキソ−6−(ピペラジン−1−イル)ヘキシル)オキシ)−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−4−オン
Figure 2015529197
工程Aに記載されるように調製したtert−ブチル4−(6−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)ヘキサノイル)ピペラジン−1−カルボキシレート(408mg、0.58ミリモル)のジクロロメタン溶液(5mL)を、トリフルオロ酢酸(435.62μL、5.8ミリモル)でアルゴン下で処理した。室温で72時間撹拌した後、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液(5mL)に注入し、水層をジクロロメタンで抽出(5mLで3回)抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過及び濃縮した。粗生成物を、更に精製せずに次の工程に使用した。(ESI−MS(M+1)609)
工程C
4−(4−(6−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)ヘキサノイル)ピペラジン−1−イル)−4−オキソ酪酸
Figure 2015529197
工程Bに記載されるようにして調製した3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−9−((6−オキソ−6−(ピペラジン−1−イル)ヘキシル)オキシ)−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−4−オン(239mg、0.39ミリモル)のジクロロメタン溶液(5mL)を、無水コハク酸(43.15mg、0.43ミリモル)及びジイソプロピルエチルアミン(68.35μL、0.39ミリモル)でアルゴン下で処理した。室温で2時間撹拌した後、反応混合物を水(5mL)に注入し、水層をジクロロメタン/メタノール(95/5、5mLで3回)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過及び濃縮した。残渣をHPLCで精製し、ジイソプロピルエーテルで粉砕して表題化合物を得た。(ESI−MS(M+1)709);1H NMR:(CDCl3,360MHz):δ ppm 1.10〜2.80(m,31H),δ3.20〜4.00(m,13H),δ 4.24〜4.30(m,1H),δ 7.07(td,J=8.97,1.83 Hz,1H),δ 7.24(d,J=1.83Hz,1H),δ 7.76(dd,J=8.60,4,94Hz,1H)
(実施例6)
3−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロル−1−イル)−N−(3−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)プロピル)プロパンアミド−キーホールリンペットヘモシアニン−コンジュゲート
キーホールリンペットヘモシアニン(KLH、18.0mg、0.18μモル)の100mMリン酸緩衝液溶液(0.46M塩化ナトリウム、pH 7.4)(4.22mL)に、S−アセチルチオ酢酸N−スクシンイミジル(SATA、25mg/mL、2.1mg、9.0μモル)のDMF溶液(83.2μL)を加えた。生じた溶液を20℃で1時間、ローラー式攪拌機でインキュベートした。反応液を、100mMリン酸緩衝液(0.46塩化ナトリウム、5mM EDTA、pH 6.0)を使用して、Sephadex G−25カラムで精製した。KLH−SATA(17.1mg、0.171μモル)溶液(9.37mL)に、937μLの2.5Mヒドロキシルアミン及び50mM EDTA(pH 7.0)を加えた。生じた溶液を20℃で40分間、ローラー式攪拌機でインキュベートした。この反応を、マレイミド活性化ハプテンとのコンジュゲーション反応においてそのまま使用した。
工程1からのKLH−SH(10.3mL、0.171μモル)に、3−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロル−1−イル)−N−(3−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)プロピル)プロパンアミド(実施例3に記載されるようにして調製、10mg/mL、12.1μモル)のDMF溶液(770μL)を加えた。生じた混濁混合物20℃で4時間、ローラー式攪拌機でインキュベートした。反応液を、0.2μmシリンジフィルターを通して濾過した後、100mMリン酸緩衝液(0.46M塩化ナトリウム、pH 7.4)を使用してSephadex G−25カラムで精製した。
(実施例7)
6−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)ヘキサン酸−ウシサイログロブリン−コンジュゲート
6−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)ヘキサン酸(実施例4に記載されるようにして調製、5.0mg、9.3μモル)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS、3.9mg、34.2μモル)及びN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、7.1mg、34.2μモル)のDMF(300μL)及びトリブチルアミン(3μL)の溶液を、20℃で18時間撹拌した。生じた溶液の30μLアリコート(30μL、9.3μモル)を、ウシサイログロブリン(BTG、7.6mg、0.011μモル)の100mMリン酸緩衝液(pH 7.5)の溶液(1.52mL)に加えた。生じた混濁混合物を20℃で3時間、ローラー式攪拌機でインキュベートした。反応液を、0.45μmシリンジフィルターを通して濾過した後、100mMリン酸緩衝液(0.14M塩化ナトリウム、pH 7.4)を使用してSephadex G−25カラムで精製した。
(実施例8)
4−(4−(6−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)ヘキサノイル)ピペラジン−1−イル)−4−オキソ酪酸−キーホールリンペットヘモシアニン−コンジュゲート
4−(4−(6−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)ヘキサノイル)ピペラジン−1−イル)−4−オキソ酪酸(実施例5に記載されるようにして調製、10.6mg、15.0μモル)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS、6.4mg、55.5μモル)及びN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、11.5mg、55.5μモル)のDMF(400μL)及びトリブチルアミン(4μL)の溶液を、20℃で18時間撹拌した。生じた溶液の81μLアリコート(3.0μモル)を、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH、12.0mg、0.12μモル)の100mMリン酸緩衝液溶液(0.46塩化ナトリウム、pH 7.4)の溶液(2.75mL)に加えた。生じた混濁混合物を20℃で2.5時間、ローラー式攪拌機でインキュベートした。反応液を、0.45μmシリンジフィルターを通して濾過した後、100mMリン酸緩衝液(0.46M塩化ナトリウム、pH 7.4)を使用してSephadex G−25カラムで精製した。
(実施例9)
4−(4−(6−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)ヘキサノイル)ピペラジン−1−イル)−4−オキソ酪酸−ウシサイログロブリン−コンジュゲート
4−(4−(6−((3−(2−(4−(6−フルオロベンゾ[d]イソオキサゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル)エチル)−2−メチル−4−オキソ−6,7,8,9−テトラヒドロ−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−9−イル)オキシ)ヘキサノイル)ピペラジン−1−イル)−4−オキソ酪酸(実施例5に記載されるようにして調製、17.1mg、24.1μモル)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS、10.3mg、89.3μモル)及びN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、18.4mg、89.3μモル)のDMF(600μL)及びトリブチルアミン(6μL)の溶液を、20℃で18時間撹拌した。生じた溶液の462μLアリコート(18.4μモル)を、ウシサイログロブリン(BTG、15.0mg、0.023モル)の100mMリン酸緩衝液(pH 7.5)の溶液(3.0mL)に加えた。生じた混濁混合物を20℃で2.5時間、ローラー式攪拌機でインキュベートした。反応液を、0.45μmシリンジフィルターを通して濾過した後、100mMリン酸緩衝液(0.14M塩化ナトリウム、pH 7.4)を使用して、Sephadex G−25カラムで精製した。
(実施例10)
パリペリドンの競合的イムノアッセイ
パリペリドン/リスペリドン免疫原による一連の免疫後、マウス尾出血を、ELISAを使用して、反応性に関して試験した。ハイブリドーマ上清も試験を行い、以下の表1及び表2で示されるELISAのデータは、いくつかのハイブリドーマの反応性を示している(融合パートナーは、NSO細胞であった)。表2に示されるように、ハイブリドーマ2A5及び5G11の反応性が認められた。
Figure 2015529197
Figure 2015529197
ELISA反応性によってクローンを同定した後、類似の化合物との親和性及び交差反応性を近似するために、競合的ELISAを行った。図1及び2は、ハイブリドーマサブクローン5−9から得られたELISA交差反応性を示している。データは、リスペリドン、並びに代謝産物であるパリペリドン及び7−ヒドロキシリスペリドンに対する反応性を示している。次に、競合的ELISAによって上清も試験し、シグナルが、リスペリドン若しくはパリペリドンのいずれに対して特異的であるかを決定した。図3は、ハイブリドーマサブクローン2A5から得られた結果を示している。データは、リスペリドン及びパリピリドンの両方に対する反応性を示している。
図4は、ラテラルフローアッセイデバイスに使用される競合的イムノアッセイフォーマットを示しており、このデバイスにおいて、捕捉抗体であるリスペリドン/パリペリドンクローン5−9がフルオロフォアにコンジュゲートされたリスペリドンからなる検出コンジュゲートと共にチップに入っている。図4で示されるこの競合的フォーマットでは、検体(パリペリドン)のレベルが低いと高いシグナルを生じ、検体(パリペリドン)のレベルが高いと低いシグナルを生じる。サンプルにおけるパリペリドンの量は、薬剤が存在しない対照サンプルと比較した蛍光の喪失によって算出され得る。リスペリドン/パリペリドンクローン5−9について得られた典型的な用量反応曲線を図5に示す。

Claims (26)

  1. 式Iの化合物、
    Figure 2015529197
    (式中、
    1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2nであり;
    ここで、nは、1、2、又は3であり;
    2は、NHC(O)、
    Figure 2015529197
    であるか、又は存在せず;
    3は、(CH2mCO2H、又は
    Figure 2015529197
    であり;
    ここで、mは、1、2、又は3である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ない))。
  2. 1は、OC(O)(CH2n、又はO(CH2nであり;
    ここで、nは、1、2、又は3であり;
    2は、NHC(O)、
    Figure 2015529197
    であるか、又は存在せず;
    3は、(CH2mCO2H、又は
    Figure 2015529197
    であり;
    ここで、mは、1、又は2である(但し、L2が存在しない場合、mは0でしかあり得ない)、請求項1に記載の化合物。
  3. Figure 2015529197
    である、請求項1に記載の化合物。
  4. Figure 2015529197
    である、請求項1に記載の化合物。
  5. 請求項1に記載の化合物と、免疫原性担体とのコンジュゲート。
  6. 前記免疫原性担体はタンパク質である、請求項5に記載のコンジュゲート。
  7. 前記タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである、請求項6に記載のコンジュゲート。
  8. 請求項3に記載の化合物と、免疫原性担体とのコンジュゲート。
  9. 前記免疫原性担体はタンパク質である、請求項8に記載のコンジュゲート。
  10. 前記タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである、請求項9に記載のコンジュゲート。
  11. 請求項4に記載の化合物と、免疫原性担体とのコンジュゲート。
  12. 前記免疫原性担体はタンパク質である、請求項11に記載のコンジュゲート。
  13. 前記タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである、請求項12に記載のコンジュゲート。
  14. 請求項1に記載の化合物と免疫原性担体とを接触させるプロセスによって生成される生成物。
  15. 前記免疫原性担体はタンパク質である、請求項14に記載の生成物。
  16. 前記タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである、請求項15に記載の生成物。
  17. Figure 2015529197
    である化合物と、タンパク質とを接触させるプロセスによって生成される生成物。
  18. 前記タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである、請求項17に記載の生成物。
  19. Figure 2015529197
    である化合物と、タンパク質とを接触させるプロセスによって生成される生成物。
  20. 前記タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである、請求項19に記載の生成物。
  21. Figure 2015529197
    である化合物と、タンパク質とを接触させるプロセスによって生成される生成物。
  22. 前記タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである、請求項21に記載の生成物。
  23. Figure 2015529197
    である化合物と、タンパク質とを接触させるプロセスによって生成される生成物。
  24. 前記タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである、請求項23に記載の生成物。
  25. Figure 2015529197
    である化合物と、タンパク質とを接触させるプロセスによって生成される生成物。
  26. 前記タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、又はオボアルブミンである、請求項25に記載の生成物。
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