KR20100075455A - 약물 모니터링 분석법 - Google Patents

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KR20100075455A
KR20100075455A KR1020107006580A KR20107006580A KR20100075455A KR 20100075455 A KR20100075455 A KR 20100075455A KR 1020107006580 A KR1020107006580 A KR 1020107006580A KR 20107006580 A KR20107006580 A KR 20107006580A KR 20100075455 A KR20100075455 A KR 20100075455A
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패트리크 알비엔츠
진-미시 그레넷
레이너 힐렌브랜드
프랑소아 레가이
페터 마르바흐
세브린 마르로니
유디트 쉐퍼
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노파르티스 아게
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Abstract

모화합물의 특별한 유도체를 사용하여, 화합물의 제약상 불활성인 형태에 비해 더 고도의 특이성으로 화합물의 제약상 활성인 형태에 결합하는 1종 이상의 결합제를 수득하기 위한 방법이 기술된다. 본 발명은 또한 각각 생성되는 결합제 및 유도체에 관한 것이다. 또한, 상기 모화합물의 제약상 활성인 형태를 모니터링하기 위하여 상기 결합제를 사용하는 약물 모니터링 분석이 제공된다.

Description

약물 모니터링 분석법 {DRUG MONITORING ASSAY}
생명 과학의 여러 분야에서 정성 및 정량 분석은 대단히 중요하다. 본 발명은 일반적으로 생체액(biological fluid) 중 약물 화합물의 측정을 위한 시약 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 예컨대 샘플에 존재하는 제약 화합물과 같은 활성 성분의 양 또는 농도를 측정하기 위한 생물학적 분석이 제공된다. 또한, 화합물의 제약상 활성인 대사물을 인식하는 결합제를 수득하기 위한 방법이 제공된다. 각 결합제는 약물 모니터링 분석에 유용한 도구이다.
약학에서, 많은 약제들이 혈중 농도 또는 기타 체액에 대한 모니터링 없이 사용되고 있는데, 그 투약량이 일반적으로는 그 물질에 대하여 환자가 나타내는 임상적 반응에 따라 달라질 수 있기 때문이다. 그러나, 일부 약물에 있어서 이와 같은 접근법은 불가능하거나, 적어도 어려운데, 불충분한 약물 농도는 과소치료(undertreatment) 또는 내성으로 이어지게 되며, 과도한 농도는 독성이거나 및/또는 조직을 손상시킬 수 있기 때문이다. 치료 약물 모니터링은 혈액 또는 기타 생물학적 샘플에서의 약제 농도의 측정에 특화된 화학물질 화학의 분야이다. 그의 주요 관심사는 좁은 치료 지수(therapeutic index)를 가지는 약물, 즉 용이하게 과소- 또는 과다투여될 수 있는 약물에 있다. 따라서, 최적의 치료적 치료를 제공하기 위해서는, 각 약물을 모니터링하는 것이 유리하다. 보통 약물 모니터링을 필요로 하는 각 약물의 예로는 항-감염제 예컨대 젠타미신 및 반코마이신; 아미노글리코시드 항생제; 면역억제제 예컨대 시클로스포린, 에베롤리스무스; 항간질 약물; 항정신병제 예컨대 클로자핀 및 리튬, 항암 약물, 디곡신 등이 있다.
치료 효과를 달성하기 위해서는, 특히 효소 억제제로서 작용하는 약물이 관련 효소의 충분한 억제를 제공하는 투약량으로 투여되어야 한다. 그러나, 환자의 대사가 다르기 때문에, 투약량 요건 역시 환자마다 크게 달라질 수 있다. AEB071은 nM 범위의 ki 값을 가지는 전통 및 신규의 단백질 키나제 C (PKC) 동형(isoform)들에 대한 선택적이며 강력한 억제제이다.
전구약물은 제약 활성이 덜하거나 심지어는 없는 형태로 투여되는 제약 화합물이다. 일단 투여되고 나면, 전구약물은 생체내에서 활성인 화합물로 대사된다. 전구약물의 사용을 뒷받침하는 원리는 일반적으로 흡수, 분포, 대사 및 분비 (ADME) 최적화를 위한 것이다. 전구약물과 관련해서는, 종종 치료 효과를 얻기 위하여 충분한 양의 전구약물이 제약상 활성인 대사물로 전환되는지를 모니터링하는 것이 필요하다.
약물 모니터링의 맥락에서 "모약물(parent drug)"이라는 용어는 보통 그것이 환자에게 투여되는 시점에서의 약물의 분자 구조를 나타낸다. 일단 흡수되고 나면, 모약물은 생체내변환(biotransformation) (대사)으로 지칭되는 화학적 변화를 받을 수 있으며, 이는 대사물로 지칭되는 변경된 분자로 이어진다. 장관 벽 및 간은 세포의 소포체 내 소포에 농축되어 있기 때문에 종종 미소체 효소로 기술되는 대사 효소들을 매우 큰 농도로 함유한다. 그러나, 효소는 도처에 있어서, 무수한 다른 위치에서 생체내변환을 촉매촉진한다.
모약물 및 그의 대사물 모두가 활성 또는 불활성으로 명시되는 다양한 정도의 약학적 활성을 가질 수 있으며, 또한 그의 독성 잠재력에 있어서 다를 수 있다. 예를 들면, 모약물로서 활성인 진정제가 3종의 불활성인 대사물은 물론, 활성이며 진정작용을 하는 종, 그리고 활성이며 심장독성인 또 다른 종으로 전환될 수 있다. 또한, 이러한 분자 형태들 각각은 다양한 분포 및 제거 양상을 나타낼 수 있다. 이러한 대사적 변화는 약물 화합물의 제약 활성 농도의 검출을 어렵게 하는데, 불활성인 대사물이 모니터링 분석에서 인식될 경우 잘못된 결과로 이어질 수 있기 때문이다.
특히 소형 분자의 검출을 위한 모니터링/면역분석을 설계하는 것은 까다로울 수 있다. 그와 같은 소형 분자는 종종 항원성이 결핍되어 있어서, 예를 들면 그 소형 분자에 결합하는 항체를 생성시키는 것을 어렵게 한다. 소형분자의 면역원성을 증가시키기 위해서는, 단백질 또는 폴리펩티드와 같은 더 큰 항원성 화합물이 약물에 접합될 수 있다.
제약 화합물을 모니터링하기 위하여, 소정 농도에서 환자에서의 약물의 치료 효과를 모니터링하는 진단 도구들이 개발되어 왔다. 대부분의 알려져 있는 약물 모니터링 방법들은 환자 샘플에서 검출/모니터링하고자 하는 제약 화합물에 결합하는 항체를 사용한다. 그러나, 효율적인 모니터링은 매우 어려운데, 화합물의 치료적 활성 농도를 측정하기 위해서는 약물의 활성 형태와 예컨대 불활성 대사물 사이의 적정한 구분이 중요하기 때문이다. 불활성 대사물에 대한 각 교차-반응성과 관련된 문제점에 대해서는 선행 기술에 잘 알려져 있다 (예컨대 문헌 [Rentsch et al, 2006: Therapeutic drug monitoring der Immunsuppressiva] 참조).
본 발명의 목적은 약물 화합물 불활성 대사물의 검출 가능성이 낮은 약물 모니터링 분석법을 제공하는 것이다. 각 특이적 약물 모니터링 분석의 개발 방법, 특히 모니터링되는 화합물의 활성 형태를 특이적으로 인식하는 항체와 같은 적절한 결합제의 제조 방법을 제공하는 것 역시 본 발명의 목적이다. 화합물 AEB071의 제약상 활성인 형태에 특이적으로 결합할 가능성이 큰 적절한 결합제를 식별하여 제공하는 것 또한 본 발명의 목적이다. 각 결합제는 AEB071용 약물 모니터링 분석에 사용될 수 있다.
본 발명의 제1 구현예에 따라서,
(a) 모화합물의 제약상 활성인 형태의 일부를 차폐(shielding)시켜, 상기 모화합물의 상기 제약상 활성인 형태의 1종 이상의 유도체를 제조하는 것;
(b) 상기 유도체를 사용하여 상기 유도체에 결합하는 결합제 군을 수득하는 것;
(c) 상기 결합제 군으로부터 상기 유도체 및 상기 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성 형태에 결합하는 1종 이상의 결합제를 선별하는 것
을 포함하는, 모화합물의 제약상 불활성인 형태에 비해 더 고도의 특이성으로 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성 형태에 결합하는 1종 이상의 결합제를 수득하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 일 양태는 제약 화합물의 제약상 활성인 형태에 특이적으로 결합하며, 더 낮은 불활성 대사물 결합 가능성을 가지는 1종 이상의 결합제를 제공하는 것에 관련된 것이다.
각각의 특이적 결합제를 수득하기 위하여, 본 발명은 각 결합제 수득/제조용으로 한정된 방법을 사용한다. 중요한 일 양태에 따르면, 상기 결합제를 수득하는 데에는 모화합물이 아닌 특별하게 설계된 그의 유도체가 대신 사용된다.
상기 유도체는 모화합물의 구조를 바탕으로 하여, 모화합물의 제약상 활성인 형태를 인식하게 되나 모화합물의 제약상 불활성인 대사물을 인식할 가능성은 가장 작게 가지는 결합제를 생성할 가능성을 가장 크게 가지도록 설계된다. 그와 같은 결과를 달성하기 위하여, 화합물의 소정 부분이 결합제의 결합으로부터 차폐된다. 각각의 차폐 구조를 사용하는 것에 의해, 분자의 차폐된 영역에는 결합제가 접근할 수 없다. 이는 분자의 차폐되지 않음으로써 접근가능한 부분을 표적으로 하는 결합제가 수득될 수 있는 효과를 가진다. 본 발명의 일 구현예에서는, 분자의 차폐되지 않은 상기 부분(들)이 대사 작용에 의해 화합물이 불활성화될 수 있는 분자 부위에 해당한다. 그에 의해, 분자의 활성인 화학적 구조에 해당하는 화학적 구조를 인식하는 결합제가 수득될 수 있다. 따라서, 대사 변화가 상기 결합제에 의해 인식되는 분자의 부분을 변경/변화시키는 경우에는, 결합제의 결합이 적어도 감소되거나, 또는 완전히 방지될 수 있다. 이와 같은 수단은 결합제가 결합제에 의해 인식되는 부위에서 활성인 화학적 구조에 더욱 특이적이 되도록 보장한다.
결합제에 의해 적어도 부분적으로 원하는 분자 부위가 인식된다는 것을 확인하기 위해서는, 원하는 대사 부위를 차폐하는 차폐 구조를 포함하는 유도체를 설계할 수 있다. 각 유도체는 결합제가 원하는 부위에 대하여 고도의 특이성을 가지는지를 분석하는 데에 사용될 수 있는데, 상기 대사 부위가 차폐되는 경우, 본 발명의 방법에 의해 수득되는 특이적 결합제는 상기 유도체에 결합하지 않아야 하거나, 또는 더 낮은 특이성으로 결합하게 되기 때문이다. 이와 같은 유도체는 매우 특이적인 결합제를 선별하기 위한 유용한 도구가 될 수 있다.
이후, 수득된 결합제 군으로부터 유도체는 물론 모화합물의 제약상 활성인 형태와도 결합하는 결합제들이 선별된다. 이와 같은 선별은 예컨대 차폐된 구조를 인식하며, 그에 따라 그 분자에 대하여 특이적이지 않은 결합제들을 제거하는 데에 중요하다. 각각의 선별은 예를 들면 하기에 더 상세하게 기술되는 바와 같은 경쟁 분석에 의해 수행될 수 있다. 이와 같은 방법은 표준 절차를 사용하여 소정 화합물, 특히 소형 화합물에 대하여 특이적인 결합제의 생성을 최적화하는 것을 가능케 한다.
모화합물 (전구약물의 경우와 같을 수 있음)의 한정된 활성 대사물에 대하여 특이적인 결합제를 제조하고자 하는 경우에는, 검출될 활성 대사물의 화학적 구조를 밀접하게 닮도록 하기 위하여 유도체를 설계할 때 모화합물의 화학적 구조가 변경될 수 있다. 이것은 결합제가 원하는 표적인 활성 대사물의 올바른 화학적 구조를 인식하도록 하여 준다. 신체에서 모화합물이 활성 대사물로 전환될 때 화학적으로 변경되는 분자의 해당 부분을 특이적으로 인식/결합하는 결합제가 생성되도록 하기 위하여, 활성 대사물의 화학적 구조를 닮은 이와 같은 변형 구조는 각 유도체에서 차폐되지 않고 그 대신 노출되며, 그에 따라 접근가능하다. 각각의 유도체를 사용하여 수득되는 결합제 군은 활성 대사물의 화학적 구조를 특이적으로 인식하나 (불활성인) 모화합물에 대해서는 그렇지 않은 결합제용으로 선별될 수 있다.
일반 도입부에서 개설된 바와 같이, 모화합물은 수 종의 서로 다른 대사물을 가질 수 있으며, 일부는 활성이고, 일부는 불활성일 수 있다. 일 구현예에 있어서, 선별된 결합제는 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태, 예를 들면 모화합물과 그의 1종 이상의 추가적인 활성 대사물을 인식한다. 그러나, 소정의 약물 또는 용도에 있어서는, 모화합물의 서로 다른 제약상 활성 형태들 사이, 그리고 그에 따라 예컨대 활성 모화합물과 그의 1종 이상의 추가적인 제약 활성 대사물 사이를 구분하는 것이 중요할 수 있다. 이와 같은 경우에는, 원하는 표적 (모화합물 또는 활성 대사물 중 어느 것)에 더 고도의 특이성으로 결합하도록 결합제가 선별된다. 이것은 예를 들면 경쟁 표적으로서 모화합물과 활성 대사물을 사용하는 경쟁적 결합 분석을 통하여 달성될 수 있다. 그에 의해, 원하는 표적에 대하여 원하는 선택성을 나타내는 결합제들이 선별될 수 있다.
대사 작용을 통하여 화합물이 불활성화될 수 있는 하나 이상의 부위를 가지는 모화합물의 경우, 2종 이상의 유도체가 생성될 수 있으며, 각 유도체는 서로 다른 분자 부위에서 결합으로부터 차폐된다. 상기 모화합물의 제약상 불활성인 형태에 비해 더 고도의 특이성으로 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성 형태에 결합하는 결합제를 수득하기 위하여, 잠재적 대사 부위의 수에 따라, 분자의 불활성화로 이어질 수 있는 대사 부위의 수로 유도체의 수가 조정될 수 있다.
"유도체"는 또 다른 원자 또는 원자단에 의한 일 원자의 치환에 의해 모화합물로부터 생성될 것으로 예상될 수 있는 화학적 화합물 또는 분자를 지칭한다. 유도체는 예를 들면 모화합물의 구조를 바탕으로 1종 이상의 화학 반응 (예컨대 링커의 부착)에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 변형 (예를 들면, 제약상 활성인 대사물을 흉내내기 위하여 모화합물의 기본적 화학 구조가 변형되는 경우)의 유형에 따라, 서로 다른 합성 경로가 필요할 수 있다. 본 발명에 따른 유도체들은 모화합물의 소정 부위가 차폐됨으로써, 보통 분자의 차폐된 부분을 인식하는 각 수득 결합제의 결합을 방지하는 변형을 포함한다.
"모화합물의 제약상 활성인 형태"라는 용어는 모화합물은 물론 제약상 활성인 대사물을 지칭한다. 이들 중 1종 이상, 예컨대 모화합물 또는 그의 활성 대사물은 결합제에 의해 인식될 필요가 있다. 활성 대사물을 특이적으로 인식하는 결합제를 개발하는 것은 전구약물의 활성을 모니터링하고자 하는 경우에 특히 유용할 수 있는데, 전구약물이 보통 불활성인 (또는 상당히 덜 활성인) 형태로 투여된 다음, 제약상 활성인 대사물로 대사되기 때문이다. 모화합물은 수 개의 서로 다른 분자 부위에서 불활성화될 수도 있다. 따라서, 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태가 결합제에 의해 인식된다. 이것은 부위 특이적일 수 있는데, 결합제가 분자의 일 부분만을 (항체의 경우 에피토프) 인식할 수도 있기 때문이다. 모분자가 - 결합제에 의해 인식/결합되지 않는 - 서로 다른 대사 부위에서 불활성화되는 경우, 이와 같은 불활성화는 각 결합제에 의해 인식되지 않을 수 있다. 이 경우, 불활성화가 발생할 수 있는 서로 다른 분자 부분을 인식하는 수 종의 결합제가 조합되어 사용될 수 있다. 그러나, 이것은 모화합물 및 어떻게 그것이 대사되는지에 따라 달라지며, 그에 따라 개별 경우를 기준으로 평가될 필요가 있다.
"제약상 활성인"은 구체적으로 화합물의 원하는 치료 효과를 지칭한다. 그러나, 상기 용어에는 예컨대 독성 효과와 같은 기타 중요 약학적 활성도 포함된다. 예컨대 환자에서 독성 대사물을 모니터링하는 일부 경우에서와 같이, 이것이 의도되고, 그에 따라 독성 대사물을 특이적으로 인식하는 특이적 결합제가 유용할 수 있다.
유도체를 수득하기 위한 모화합물의 차폐는 분자에 커플링되는 화학적 차폐 구조를 사용함으로써 달성될 수 있다. 이와 같은 차폐 구조는 차폐하고자 하는 분자의 부분을 차단하기에 적합한 화학적 기일 수 있다. 상기 차단 기는 모화합물의 제약상 활성인 형태의 하나 이상 히드록실, 아미노 또는 카르복실 기 (아미노락탐, 아미노락톤 등과 같은 그의 중간물 포함)에 결합될 때 이들 기에서 반응이 발생하는 것을 방지하는 임의의 기일 수 있다. 특히 상기 유도체가 결합제를 수득하는 데에 사용될 경우, 해당 차폐 부위에서는 결합제의 결합이 방지될 것으로 예상된다. 보통, 각각의 차폐 구조가 존재하는 경우, 결합제는 그 아래의 화학 구조가 아닌 차폐 구조를 공격/인식하게 된다. 적합한 차폐 구조는 차폐될 분자의 부위에 부착된 운반체를 포함할 수 있다.
상기 커플링은 링커 구조를 사용함으로써 수행될 수 있다. 적합한 링커는 상기 운반체의 아미노 기와 반응하는 아실화 기, 상기 운반체 상의 술피드릴 (메르캅토), 티오메틸, 이미다조 또는 아미노 기와 반응하는 알킬화 기, 가장 바람직하게는 말레이미드 기, 예컨대 단백질의 카르복실 기와 반응하는 에스테르 및 아미드 형성 기, 상기 펩티드 단위체 상의 술피드릴 기와 반응하는 디술피드 형성 기, 예컨대 5,5'-디티오비스 (2-니트로벤조에이트) 기, 오르소-피리딜 디술피드 및 알킬메르캅탄 기, 디카르보닐 기, 예컨대 시클로헥산디온 기, 및 기타 1,2-디케톤 기; 페놀계 기와 반응하는 디아조 기로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 링커는 예를 들면 2 내지 20개 C-원자, 바람직하게는 2 내지 10개 C-원자를 가지는 적절한 알킬 기에 의해 연장될 수 있다. 특히 적합한 링커는 유도체 A 및 B (하기 참조)에 사용되었는데, 이들은 다른 모화합물의 유도체를 수득하는 데에도 사용될 수 있다.
모화합물은 소형 분자일 수 있다. 도입부에서 개설된 바와 같이, 소형 분자의 검출을 위한 결합제를 수득하는 것은 특히 까다로운데, 소형 분자에 대한 결합제를 수득하는 것이 어렵기 때문이다. 이와 같은 이유로, 항체를 제조할 때 운반체를 사용하는 것이 유리하다.
모화합물은 면역억제제, 항-감염제, 항간질 약물, 항정신병제 및 항암 약물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 이들 약물은 특히 투여하기가 어려우며, 잘못된 투약량으로부터 야기되는 효과가 심각할 수 있다. 이는 특히 이식에서 사용되는 면역억제제에 해당된다. 따라서, 각 화합물을 모니터링하는 것이 특히 유리하다. 그러나, 일반적으로는 어떠한 제약 화합물도 본 발명의 방법에 의해 특이적 결합제를 수득하기 위하여 모니터링/사용될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 모화합물은 소형 분자이다. 도입부에서 개설된 바와 같이, 소형 분자는 모니터링하기 어렵다. 그러나, 본 발명은 소형 분자를 위한 특이적 결합제를 수득하는 것을 가능케 한다. 일 구현예에 있어서, 소형 분자는 단백질 키나제 C (PKC) 억제제이다. 역시 기술된 실시예에서 사용되는 일 구현예에서는, 모화합물 AEB071이 모니터링하고자 하는 모화합물로서 사용된다. 상기 화합물은 하기의 화학적 구조를 가진다:
Figure pct00001
상기 화합물 (PKC 억제제)은 향상된 치료 윈도우/프로필을 가지는 면역억제제이다.
샘플에서 AEB071을 모니터링하는 것을 가능케 하는 적합한 결합제를 수득하는 데에는, 하기의 화학적 구조를 가지는 1종 이상의 유도체가 사용될 수 있다:
Figure pct00002
운반체와 같은 차폐 구조는 예를 들면 위치 X1 및/또는 X2에 부착될 수 있다. 차폐 구조가 부착되지 않는 경우, X1 및/또는 X2는 수소일 수 있다. X1 및/또는 X2 중 하나 이상은 각 차폐 구조를 포함한다. 상기한 바와 같이, 커플링은 링커 구조를 통하여 이루어질 수 있다.
일 구현예에서는, 결합제를 생성시키기 위한 유도체로서 하기 유도체 A 및/또는 B가 사용된다:
유도체 A
Figure pct00003
유도체 B
Figure pct00004
이들 유도체는 본 발명에 따른 방법을 수행함에 있어서 모화합물 AEB071에 특이적인 결합제를 수득하는 데에 특히 유용하다.
모화합물의 제약상 활성인 형태에 결합할 가능성이 가장 높은 결합제가 선별되는 본 발명 방법에 따른 선별 단계 (c)는 바람직하게는 모화합물의 제약상 활성인 형태의 존재가 유도체에 대한 결합제의 결합을 억제하는지를 분석함으로써 선별된다. 각 분석을 수행하기 위한 적합한 방법은 상기 결합제를 위한 표적으로서의 모화합물의 제약상 활성인 형태와 경쟁하는 결합 상대자로서 유도체를 사용하는 경쟁적 결합 분석을 수행하는 것이다. 각 경쟁적 결합 분석을 수행하기 위한 일 구현예는 ELISA 분석과 같은 면역분석법이다. 그러나, 다른 면역분석법들 역시 이와 같은 분석을 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명 방법의 일 구현예에서는 결합제의 결합 특이성을 측정하기 위하여 면역분석이 수행된다.
모화합물이 대사 작용에 의해 불활성화될 수 있는 하나 이상의 대사 부위를 가지는 경우, 또는 화합물이 너무 커서 결합제를 위한 수 개의 에피토프를 제공하는 경우에 특히 적합한 일 구현예에서는, 그에 대한 유도체가 수득되는 해당 모화합물의 제약상 활성인 형태에 특이적으로 결합하며, 상기 제1 유도체와 다른 분자 부분은 차폐하나 제1 유도체와 동일한 분자 부분은 노출되도록 남긴 모화합물의 1종 이상의 다른 유도체에도 결합하는 1종 이상의 결합제가 단계 (c)에서 선별된다. 서로 다른 유도체들에 대한 결합제의 결합 양상의 비교 분석을 수행함으로써, 모분자의 제약상 활성인 형태의 어떤 특정 부분이 결합제에 의해 결합/인식되는지가 측정될 수 있는데, 사용되는 각 유도체에서 모분자의 서로 다른 부분이 결합으로부터 차폐되기 때문이다. 화합물의 결합 영역 (즉, 항체의 경우 에피토프)은 분자의 의도/예정된 대사 부위가 차폐된 유도체를 생성시키는 것에 의해 추가적으로 측정 또는 분석될 수 있다. 상기 차폐된 영역에 특이적인 결합제는 해당 유도체에 결합하지 않게 된다. 따라서, 대사 부위가 차폐된 해당 유도체는 수득된 결합제의 특이성을 확인하는 데에 사용될 수 있다.
일 구현예에서는, 분자 AEB071과 그의 활성 대사물 사이를 구분하며, 하기의 구조를 가지는 결합제가 단계 (c)에서 선별된다:
화합물 C
Figure pct00005
볼 수 있는 바와 같이, AEB071에는 존재하는 피페라진 고리의 메틸 기가 화합물 C에서는 빠져 있다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 적절한 결합제는 상기한 바와 같은 모화합물 AEB071과 화합물 C 사이의 경쟁 분석을 수행함으로써 선별될 수 있다.
적합한 결합제는 본 발명의 기술에 따라 제조된 유도체(들)에 결합하는 결합제들을 식별/수득하기 위하여 결합제 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 각 결합제 라이브러리의 예로는 예컨대 결합제들을 열거하고 있는 파지 또는 파지미드 라이브러리가 있다. 예컨대 생체외에서 항체를 수득하기 위한 방법에 대해서는 본원에 참조로써 개재되는 문헌 [Hudson, PJ and Souriau, C. (2003) Engineered antibodies. Nat. Med. 9, 129-134]에도 기술되어 있다.
결합제는 표적을 특이적으로 인식하여 결합할 수 있는 한 어떠한 구조도 가질 수 있다. 결합제는 항체, 항체 단편 또는 결합 기능을 가지는 그의 변형물, 예컨대 안티칼린(anticaline)과 같이 결합 기능을 제공하는 단백질 골격을 가지는 결합제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 항체와 유사한 결합 기능을 가지는 결합제의 개관에 대해서는 본원에 참조로써 개재되는 문헌 [Hey, et al: Artificial, non-antibody binding proteins for pharmaceutical and industrial application, Trends in Biotechnology, Vol 23 No. 10, October 2005 page 514-522]에 제시되어 있다. 항체 단편은 결합 성능을 아직 가지고 있는 상기 전체 항체 유래의 20개 이상의 아미노산, 바람직하게는 100개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 항체 단편이다. 바람직한 구현예에서 항체 단편은 Fab 단편, F(ab)2 단편, 다수의 결합 도메인을 포함하는 다분절체 예컨대 2분절체, 3분절체 또는 4분절체, 단일 도메인 항체 또는 어피바디(affibody)와 같은 항체의 결합 영역을 포함한다. 항체 변형물은 동일한 결합 기능을 가지나 예를 들면 변경된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 항체 단편의 유도체이다.
일 구현예에 있어서, 결합제는 항체이다. 항체의 사용은 예를 들면 상기 언급된 유도체를 동물에게 투여하여 상기 유도체에 대한 특이적 면역원성 반응을 야기하는 것에 의해 용이하게 생성될 수 있다는 장점을 가진다.
상기 동물은 마우스, 래트, 토끼, 닭, 기니 피그, 염소 및 양으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 항체는 단일클론 또는 다클론 항체일 수 있다. 각 항체를 수득하는 데에 적합한 방법에 대해서는 본원에 참조로써 개재되는 문헌 ["Antibodies - A laboratory Manual" by Ed Harlow and David Lane, 1988] 및/또는 ["Monoclonal antibody protocols" by W.C. Davies, 1995]에 기술되어 있다. 단일클론 항체의 고도의 특이성으로 인하여, 보통 단일클론 항체가 바람직하다. 단일클론 항체는 유도체를 사용하여 면역화된 동물로부터 1종 이상의 항체 생성 세포를 회수하고, 상기 항체 생성 세포를 무한증식화(immortalize)한 후, 무한증식화된 항체 생성 세포로부터 단일클론 항체를 단리하는 것에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 적합한 운반체에는 단백질, 당단백질, 복합 다당류, 및 입자들이 포함된다. 다양한 단백질들이 운반체로서 사용될 수 있다. 이러한 단백질에는 알부민 및 혈청 단백질, 예를 들면 글로뷸린, 수정체 단백질, 지단백질 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 단백질로는 소 혈청 알부민 (BSA), 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌 (KLH), 난 알부민(egg ovalbumin) (ova), 소 감마-글로뷸린 (BGG) 및 유사 단백질들이 포함된다. 합성 운반체 역시 사용될 수 있다. 적합한 다당류로는 예를 들면 전분, 글리코겐, 셀룰로스 또는 탄수화물 고무가 운반체로서 사용될 수 있다. 차폐를 위한 운반체의 사용은 소형 분자를 사용하여 동물을 면역화하고자 하는 경우에 특히 바람직한데, 운반체가 화합물의 면역원성을 증가시키기 때문이다.
상기한 방법에 의해, 해당 모화합물의 제약상 불활성인 형태에 비해 더 고도의 특이성으로 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태에 결합하는 적합한 결합제가 수득될 수 있다. 본 발명의 유일한 핵심 요소는 상기에서 상세하게 기술된 사용 유도체의 설계에 있다. 따라서, 각 결합제는 고도로 민감하고 신뢰성 있는 약물 모니터링 분석에 사용하기에 매우 적합하다. 본 발명에 따른 결합제는 주로 모화합물의 활성 형태에 결합하도록 설계/선별된다. 일부 구현예에서, 이들은 서로 다른 형태의 활성 대사물 사이까지도 구분할 수 있도록 설계된다. 이와 같은 특이성은 중요한 장점인데, 모화합물의 불활성인 대사물이 우연히 검출됨으로써 수득된 약물 모니터링 결과를 왜곡시킬 수 있는 것을 방지하기 때문이다.
추가적으로, 본 발명은 각각의 설계된 유도체 및 수득된 결합제를 제공한다. 상기 유도체는 모화합물을 불활성화하게 하는 관련 대사 작용이 없거나 발생하지 않는 모분자의 부분이 차폐되도록 모화합물을 변형시킴으로써, 기술된 바와 같이 수득될 수 있다. 이것은 화합물의 관련 부분에 대하여 결합제가 생성되는 효과를 가진다. 모화합물의 크기에 따라, 서로 다른 유도체들을 생성시킴으로써 모화합물의 모든 부분을 연속적으로 차폐하기 위한 수 종의 유도체들이 생성될 수도 있다. 대사 불활성화가 발생하는 부분은 보통 차폐되지 않고 남게 된다. 모든 유도체에서 접근가능한 (차폐되지 않는) 분자 부분에 대하여 특이적으로 결합하는 결합제는 상기 유도체에 대한 상기 결합제의 교차-반응성을 시험함으로써 선별될 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 하기의 기본 구조를 가지는 AEB071의 유도체를 제공하며:
Figure pct00006
여기서 X1 및/또는 X2는 차폐 구조의 커플링 지점 또는 수소를 나타낸다. X1 또는 X2 중 하나 이상의 부위는 차폐 구조를 보유한다. 예를 들어 상기한 바와 같이, 링커 구조를 통하여 화학적 골격에 대한 차폐 구조로서 운반체가 커플링될 수 있다. X1 및/또는 X2의 위치에서 모분자 AEB071을 차폐하는 것이 모화합물 및 그에 따라 제약상 활성인 화합물에 대하여 매우 특이적인 결합제의 생성을 가능케 하는 유도체로 이어진다는 것이 발견되었다. 이러한 유도체들의 한정된 차폐 양상으로 인하여, 링커 구조를 위한 부착 지점이 잠재적인 대사 부위를 접근가능하게 유지하도록 신중하게 선택될 경우, 이들 유도체는 모화합물에 대하여 특이적인 결합제를 생성시키기 위한 유용한 도구가 된다.
해당 유도체의 한정된 예로는 하기의 유도체 A 및 유도체 B가 있다:
유도체 A:
Figure pct00007
유도체 B:
Figure pct00008
본 발명의 교시에 의해 역시 제공되는 것은 하기의 구조를 가지는 AEB071의 변형물이다:
화합물 C:
Figure pct00009
이와 같은 변형물은 - 상기한 바와 같이 - 활성 대사물인 화합물 C에 비해 더 고도의 특이성으로 모화합물 AEB071에 결합하는 항체를 선별하기 위하여 사용될 수 있다. 각 시험을 수행하기 위하여, 이와 같은 화합물에는 예를 들면 검출가능한 표지 또는 운반체가 제공될 수 있다.
본 발명에 의해 역시 제공되는 것은 상기한 스크리닝 방법에 의해 수득되는 결합제이다. 모화합물 AEB071을 모니터링/검출하는 데에 특히 적합한 일 구현예에서는, 상기 한정된 AEB071의 유도체들 중 1종 - 특히 유도체 A 및/또는 유도체 B -를 사용함으로써 결합제가 선별된다. 일 구현예에서는, 모화합물 AEB071이 화합물 C에 비해 더 고도의 특이성으로 상기 결합제에 의해 결합된다. 바람직하게는, 상기 결합제는 2G8, 4G4, 3A3 또는 6B11로 이루어진 군에서 선택되는 항체이다. 본 발명에 있어서 바람직한 항체는 4G4, 3A3이다.
본 발명의 추가적인 양태에서는, 하기를 포함하는 약물 모니터링 분석법이 제공된다:
- 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태를 포함할 것으로 추정되는 샘플을 1종 이상의 결합제와 접촉시키는 것;
- 상기 화합물의 제약상 불활성인 형태에 비해 더 고도의 특이성으로 상기 모화합물의 제약상 활성인 형태에 결합하는 1종 이상의 결합제를 사용함으로써, 상기 모화합물의 상기 제약상 활성인 형태의 농도를 측정하는 것.
각 분석에 사용될 수 있는 적절한 결합제는 상기한 방법에 의해 수득될 수 있다. 상기에 상세하게 기술된 방법의 핵심 요소는 불활성화가 발생할 수 있는 분자의 대사적으로 중요한 부분(들)을 인식하는 결합제를 생성시키는 적합한 유도체의 인 실리코(in silico) 선험 설계, 경쟁 실험을 사용하는 것에 의한 모화합물의 유도체 및 제약상 활성 형태에 결합하는 결합제의 선별, 및 그에 의한 모화합물의 제약상 활성 형태를 인식하는 결합제의 수득이다.
본 발명에 따른 약물 모니터링 분석법에서는, 생물학적 샘플 (존재할 경우)에 존재하는 모화합물의 제약상 활성인 형태에 대한 상기 결합제의 결합과 경쟁하는 결합제용 결합 상대자로서 표적 화합물을 사용하여 농도를 측정하기 위한 경쟁 분석이 수행될 수 있다. 제약상 활성인 형태가 샘플에 존재하지 않는 경우에는, 관련 결합이 발생하지 않는다. 상기 샘플은 모니터링될 환자, 예를 들면 AEB071을 섭취한 이식 환자로부터 수득된 생물학적 샘플일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 샘플 중 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태의 농도는 표준 보정 곡선을 사용하여 결합 분석으로부터 수득된 결과를 비교함으로써 측정된다. 각 표준 곡선은 모화합물 또는 그의 활성 형태의 희석 시리즈를 사용하여 보정 곡선을 작성하는 것에 의해 수득될 수 있다. 생물학적 샘플에 대하여 수득된 값은 다음에 표준 곡선과 비교됨으로써, 샘플에 존재하는 모화합물의 제약상 활성인 형태의 농도 측정을 가능케 할 수 있다.
일 구현예에서는, 결합제에 의해 인식되는 모화합물의 제약상 활성인 형태 또는 그의 유도체가 검출가능한 표지에 접합되며, 해당 접합체는 결합제에 의한 결합에 대하여 샘플에 존재하는 상기 모화합물의 제약상 활성인 형태와 비교되도록 구성된다. 상기 표지는 상기 화합물이 치료 약물 모니터링 농도로 존재하는 경우 시험된 샘플 중 상기 모화합물의 상기 제약상 활성인 형태의 농도를 나타내는 신호를 제공한다. 해당 기술의 예로는 예컨대 형광 편광 면역측정법 (FPIA), 클로닝 효소 공여체 면역측정법 (CEDIA®), 화학발광 균일 면역측정법 (CMIA)가 있다. 물론, 기타 균일 또는 불균일 면역측정법들 역시 상기 샘플에서 모화합물의 농도를 측정하는 데에 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 예들은 비제한적인 것이다.
일 구현예에 있어서, 표적은 결합제를 수득하는 데에 사용되었던 유도체, 또는 동일한 특이성으로 결합제에 의해 인식되는 그의 변형물이다. 따라서, 분석될 샘플 중에서 결합제에 의한 결합에 대하여 모화합물의 제약상 활성인 형태와 경쟁하는 데에 사용되는 표적은 각 결합제를 수득하는 데에 사용되었던 유도체일 수 있다. 이것은 상기 경쟁 표적이 가장 고도의 특이성으로 결합제에 의해 결합되는 것을 보장한다. 그러나, 바람직하게는 동일한 특이성으로 결합제에 의해 인식되는 상기 유도체의 변형물을 사용하는 것 역시 가능하다. 변형물의 사용은 예를 들면 그것이 (예컨대 다른 운반체를 사용함으로써) 분석을 촉진하는 경우에 적합할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 경쟁 분석을 수행하는 데에 사용되는 결합제는 검출가능한 표지를 보유한다. 그에 따라, 샘플 중 모화합물의 제약상 활성인 형태의 농도는 예를 들면 샘플이 거기에 첨가된 직후 적절한 배양 및 세척 단계가 수행된 후에 샘플 중 표지의 감소를 측정하는 것에 의해 측정될 수 있다.
추가적인 구현예에 있어서, 결합제에 의한 결합에 대하여 모화합물과 경쟁하는 표적은 매트릭스 상에 고정된다. 상기 매트릭스는 예를 들면 칩, 다수의 웰을 포함하는 플레이트, 컬럼 또는 임의의 기타 적합한 매트릭스와 같이 모든 종류의 것일 수 있다. 예를 들면, 결합제를 수득하는 데에 사용되는 유도체, 또는 역시 결합되며 그에 따라 결합제에 의해 인식되는 그의 변형물이 상기 매트릭스 상에 고정될 수 있다. 제조된 각 매트릭스는 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태를 포함할 것으로 추정되는 샘플의 존재하에 결합제와 접촉된다. 다르게는, 분석이 거꾸로 될 수 있으며, 결합제가 매트릭스 상에 고정될 수 있다.
이후, 매트릭스 상에 고정된 유도체/표적에 대한 샘플 존재하의 상기 결합제의 결합이 검출된다. 검출을 위해서는, 제1 결합제를 인식하며 검출가능한 표지를 보유하는 제2 결합제가 첨가될 수 있다. 유도체/표적 대신 결합제가 고정되는 경우에는, 상기 유도체/표적이 분석에 첨가되고, 각각 검출된다. 검출은 상기 제2 결합제의 상기 검출가능한 표지를 검출함으로써 이루어진다.
따라서 일 구현예에서는, 약물 모니터링 분석은 표지된 결합제를 포함하고/거나 여기에 제1 결합제를 인식하는 제2 결합제가 첨가되고, 여기서 상기 제2 결합제는 검출가능한 표지를 보유한다.
검출은 면역분석을 통하여 이루어질 수 있다. 각 면역분석을 수행하는 데에 적합한 형태는 ELISA이다.
약물 모니터링 분석법을 사용하여 모니터링될 수 있는 적합한 모화합물에 대해서는 상기한 바, 면역억제제, 항-감염제, 항간질 약물, 항정신병제 및 항암 약물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약물 모니터링 분석법을 사용하여, 소형 분자 역시 모니터링될 수 있다. 각각 모니터링될 수 있는 적합한 소형 분자 및 이와 같은 목적에 적합한 결합제에 대해서는 상기한 바; 상기 개시를 참조한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 모니터링될 모화합물은 소형 분자 PKC 억제제인 AEB071이다. 생물학적 샘플에서 상기 모화합물을 검출하는 데에는, 상기에서 일반적으로 기술된 바와 같은 AEB071의 유도체, 특히 유도체 A 및/또는 유도체 B가 사용될 수 있다. 상기 유도체는 본원에서 기술되는 바와 같이 매트릭스 상에 고정될 수 있다. 상기 유도체는 운반체 분자를 포함할 수 있다. 각 분석은 바람직하게는 1 내지 500 ng/ml, 또는 1 내지 300 ng/ml, 또는 2 내지 250 ng/ml의 작동 범위를 가진다.
상기한 방법에 의해 수득될 수 있으며, 본 발명의 분석에 사용되는 상기 결합제는 바람직하게는 2G8, 4G4, 3A3 또는 6B11로 이루어진 군에서 선택되는 항체이다.
역시 본 발명에 의해 제공되는 것은 샘플 중 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태의 농도를 측정하기 위한 진단 키트로서, 모화합물의 제약상 불활성인 형태에 비해 더 고도의 특이성으로 모화합물의 제약상 활성인 형태에 결합하는 1종 이상의 결합제, 및 임의로 상기 샘플 중 상기 모화합물의 상기 제약상 활성 형태의 농도를 측정하기 위한 시약을 포함한다.
적합한 결합제에 대해서는 상기 및 청구항에 기술되어 있다. 상기 진단 키트는 매트릭스를 포함할 수도 있으며, 상기 결합제를 위한 표적 또는 결합제가 상기 매트릭스 상에 고정되어 있다. 상기 및 청구항에 기술되어 있는 바와 같은 AEB071의 유도체, 또는 동일한 특이성으로 결합제에 의해 인식되는 그의 변형물이 상기 매트릭스 상에 고정될 수 있다.
진단 키트에 사용되는 상기 결합제 및/또는 경쟁 표적은 검출가능한 표지를 보유할 수 있다. 그러나, 상기 결합제 또는 경쟁 표적에 결합하며, 검출가능한 표지를 보유하는 제2 결합제가 사용될 수도 있다.
역시 제공되는 것은 청구항에 한정되어 있는 바와 같은 유도체 또는 청구항에 한정되어 있는 바와 같은 결합제가 거기에 고정되어 있는 매트릭스이다. 각 매트릭스는 기술된 약물 모니터링 분석에 유용하다.
본 발명의 기술에 따라 사용될 수 있는 표지는 검출가능한 신호를 생성시키거나 또는 생성시키도록 유도될 수 있는 임의의 분자이다. 상기 표지는 분석물, 면역원, 결합제, 예를 들면 상기한 방법에 의해 생성되는 결합제 또는 그에 따른 특이성을 가지는 제2 결합제, 또는 수용체 또는 리간드, 특히 부착소(hapten)와 같이 수용체에 결합할 수 있는 분자와 같은 또 다른 분자에 결합될 수 있다. 표지의 비제한적인 예에는 방사성 동위원소, 효소, 효소 단편, 효소 기질, 효소 억제제, 조효소, 촉매, 형광체, 염료, 화학발광제, 발광제, 감광제, 비-자성 또는 자성 입자, 고체 지지체, 리포좀, 리간드, 수용체 및 부착소 방사성 동위원소가 포함된다.
"샘플" 또는 "생물학적 샘플"이라는 용어는 모화합물의 제약상 활성인 형태를 포함할 것으로 추정되는 샘플을 지칭한다. 여기에는 생명체 또는 전에 생명체였던 것으로부터 유래하는 임의량의 물질이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그와 같은 생명체에는 인간, 마우스, 원숭이, 래트, 토끼, 말 및 기타 동물들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그와 같은 물질에는 혈액, 혈청, 소변, 눈물, 세포, 장기, 조직, 뼈, 골수, 림프, 림프 결절, 윤활 조직, 연골세포, 윤활 대식세포, 내피 세포 및 피부가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
역시 본 발명에 의해 제공되는 것은 샘플 중 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태의 농도를 측정하기 위한 진단 키트로서, 상기 샘플 중 모화합물의 상기 제약상 활성인 형태의 농도를 측정하기 위하여, 모화합물의 제약상 불활성인 형태에 비해 더 고도의 특이성으로 모화합물의 제약상 활성인 형태에 결합하는 1종 이상의 결합제를 포함한다.
결합제는 상기한 방법에 의해 수득될 수 있다. 적합한 결합제에 대해서는 청구항 제9항 내지 제12항에도 기술되어 있다. 상기 진단 키트는 적절한 버퍼, 시약 및 사용 지침을 포함할 수도 있다.
일 구현예에서는, 상기 진단 키트가 매트릭스를 포함하며, 상기 결합제를 위한 표적 또는 결합제 자체 중 어느 것이 상기 매트릭스 상에 고정되어 있다. 상기한 바와 같이, 결합제를 수득하는 데에 사용되었던 유도체가 표적으로서 사용될 수 있다. 다르게는, 동일한 특이성으로 결합제에 의해 인식되는 그의 변형물이 사용될 수 있다.
생물학적 샘플 중 모화합물의 농도를 검출하기 위한 수 종의 적합한 방법들이 상기에 기술되어 있다. 사용되는 검출 방법에 따라, 결합제, 경쟁 표적, 및/또는 결합제 또는 경쟁 표적 중 어느 것을 인식하는 제2 결합제는 검출가능한 표지를 보유한다. 진단 키트는 AEB071을 모니터링하는 데에 특히 유용하다. 적합한 구현예가 상기에 기술되어 있으며, 진단 키트에 사용될 수도 있다.
역시 본 발명에 의해 제공되는 것은 상기한 AEB071의 유도체, 특히 유도체 A (BJC) 및/또는 유도체 B (BJC), 또는 상기한 스크리닝 방법에 의해 수득되는 결합제 중 어느 것을 보유하는 매트릭스이다. 적합한 예에 대해서는 상기에 기술되어 있다. 상기 유도체는 임의로 적합한 운반체를 보유할 수 있다.
[실시예]
지금부터 약물 모니터링 분석을 확립하기 위하여 AEB071에 대한 적절한 결합제를 생성시키는 것을 이용한 실시예에 의해 본 발명을 더 상세하게 기술한다.
1. 유도체의 설계
적합한 결합제를 수득하기 위하여 본원에서는, 모화합물 AEB071의 활성 형태, 2종의 유도체인 유도체 A (BJC) 및 유도체 B (BJA)에 특이적으로 결합하는 항체를 생성시켰다 (구조는 하기 참조). 상기 2종의 유도체는 2개의 서로 다른 위치에 활성화된 링커를 가지는 변형된 AEB071 버젼이다. 양 유도체는 모화합물 AEB071을 인식하는 항체를 생성시킬 가능성이 가장 높고, AEB071의 제약상 불활성인 대사물을 인식할 가능성이 최소이기 때문에 선택되었다. 각 항체를 수득하기 위하여, 해당 부위에 KLH 운반체 단백질을 접합시켜 분자의 소정 부분을 차폐하였다. 상기 운반체는 차폐된 부분에 대한 항체의 생성을 방지하고, 면역원성을 증가시킨다. 이와 같은 원리를 사용함으로써, 적절하게 유도체를 설계하는 것에 의해, 관련 대사 작용이 이루어지는 화합물의 잠재적으로 중요한 부위에 대하여 미리 항체의 특이성이 설계될 수 있다. 유도체의 설계는 모화합물 상에서 접근가능한 가용 항원 결합 부위를 결정한다.
2. 유도체에 특이적인 항체의 제조
표준 절차 (상기 참조)에 따라, 각 유도체 접합체를 토끼 및 마우스의 개별적인 면역화에 사용하였다.
토끼에서 다클론 항혈청 (pAb)를 생성시키고, 유도체 접합체에 대한 반응성을 개별적으로 부양한 후 시험하였다. 최종 부양물을 고정된 화합물 상에서의 친화성 정제에도 적용하였다.
유사하게, 접합체에 대하여 단일클론 마우스 항체 (mAb)를 생성시켰다. 선택된 클로닝된 하이브리도마(hybridoma) 세포주로부터 항체를 제조하였다. 양 유도체에 대하여 pAb 및 mAb를 생성시켰다.
pAb 혈청, 하이브리도마 상청액은 물론, 정제된 pAb 및 mAb를 직접 ELISA법에 의해 항원에 대한 특이적 결합의 분석에 적용하였다.
3. AEB071 특이적 항체의 선별
추가적인 시험을 위하여, 고도 희석에서 모화합물 AEB071의 접합된 유도체는 물론 모화합물 자체에도 특이적으로 결합하는 항체들을 선별하였다. 수득된 데이터는 mAb 및 pAb가 해당 화합물들에 대한 결합 분석을 위한, 특히 AEB071의 약물 모니터링 분석에 그것을 사용하기 위한 고도로 강력한 특이적 도구라는 것을 나타낸다.
선별 및 정제 단계 동안, 모화합물 AEB071에 대한 결합을 시험하였다. 이것은 BJC 또는 BJA 접합체에 결합하는 항체의 유리 약물 AEB071에 의한 억제를 시험함으로써 수행되었다. 고도의 백분율로 유리 약물 AEB071에 의한 억제를 나타내는 항체가 발견되어 개별적으로 선별되었다. mAb에 대하여, 서로 다른 결합 특성 및 각 억제 특성을 가지는 일련의 항체들을 추가 평가용으로 선별하였다.
유리 약물 AEB071에 의한 억제는 항체가 유도체 또는 운반체를 포함하는 그의 접합체뿐만 아니라 유리 약물, 및 그에 따라 활성인 모화합물도 인식한다는 것을 나타낸다. 이것은 AEB071 모니터링 분석, 특히 활성 화합물에 대하여 특이적인 면역분석을 개발하는 데에 있어서 중요하다.
유리 약물에 의해 결합이 거의 완전히 억제되는 항체들을 선별하는 것은 대부분의 항체가 유도체의 링커 또는 운반체 단백질보다는 모화합물을 인식하는 것을 보장한다. 따라서, AEB071에 의한 다르게 접합되거나 표지된 BJC 또는 BJA 유도체에 대한 결합의 경쟁을 바탕으로 하는 모니터링 분석이 실행가능하다. 각 경쟁 방법의 적합한 예에 대해서는 상기에 기술되어 있으며, 또한 잘 알려져 있다.
서로 다른 억제 특성을 가지는 항체의 생성은 광범위한 AEB071 농도의 분석을 가능케 하는 분석의 개발을 위한 항체의 선별을 가능케 한다. 또한, 다양한 해당 항체를 제조하는 것 역시 모화합물과 서로 다른 활성 대사물들 사이를 구분할 수 있는 항체를 선별하는 것을 가능케 한다.
유리 약물에 의한 관찰된 억제와 조합되어 수행된 직접 접합체 결합 분석은 알려져 있는 AEB071의 농도를 기준으로 보정 곡선과 비교하여 정량될 동물 또는 환자로부터의 샘플에서의 유리 약물 또는 밀접하게 관련된 화합물에 의한 항-BJC 또는 항-BJA 항체의 결합의 억제를 바탕으로 하는 분석의 실행가능성을 보여준다. 샘플 중 화합물의 실제 농도는 이와 같은 방식으로 신뢰성 있게 측정될 수 있다.
항체에 대하여 수행된 접합 전략 및 선별 전략과 함께 AEB071 유도체의 선택에 의해, 샘플 중 문제의 화합물에 의해 경쟁되는 표적에 대한 항체의 결합을 바탕으로 하는 새로운 모니터링 분석 (특히 면역분석)의 개발을 위한 유용한 분석 도구가 수득되었다. 물론, 다른 경쟁 분석 체제 역시 사용될 수 있으며, 그들 중 많은 것이 선행 기술에 알려져 있다.
단일클론 및 다클론 항- AEB071 항체에 대한 특이성 시험
항체를 생성시키는 데에 사용된 유도체를 플레이트의 빈 웰에 고정시킨 면역분석을 구성하였다. 이후, 선별된 항체를 모분자 AEB071과 함께 첨가하였다. 적절한 세척 단계 후, 항-종(anti-species) PO (퍼옥시다제), 항체 및 해당 기질 OPD (오르소페닐디아민)를 첨가하는 것을 사용하여, 고정된 유도체에 대한 항체의 결합을 검출하였다. 실험 설정은 하기와 같았다:
NUNC 맥시소르브(MaxiSorb) 74981 플레이트를 난 알부민 운반체 (ova)를 보유하는 유도체 BJA를 고정하는 데에 사용하였다. 이것은 pH 7.4에서 ova-BJA를 1 ㎍/ml의 PBS 버퍼와 혼합함으로써 수행되었다. 상기 혼합물을 4 ℃에서 밤새 방치하였다. 상기 혼합물을 플레이트의 빈 웰에 첨가하였다. 200 ㎕의 피어스(Pierce) PBS 슈퍼블록(SuperBlock)을 첨가하고, 해당 플레이트를 실온에서 1시간 동안 암중 진탕하였다. 다음에, 300 ㎕의 세척 용액을 사용하여 상기 플레이트를 3회 세척하였다.
항체 및 AEB071과 조합된 항체를 웰에 첨가하고 (100 ㎕), 15 내지 30분 동안 배양하였다. 하기의 항체들을 사용하였다: 폴리 항체 (토끼): 항-BJA 및 항-BJC, 모노 항체 (마우스): 항-BJA (2G8 및 4G4) 및 항-BJC (3A3, 6B11). 다음에, 암중 진탕하 실온에서 2시간 동안 배양을 수행하였다. 이후, 300 ㎕의 세척 용액을 사용하여 상기 샘플을 3회 세척하였다. 이후, 100 ㎕의 항-종-PO 항체를 첨가하고, 암중 진탕하 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 300 ㎕의 세척 용액을 사용하여 상기 샘플을 3회 세척하였다.
이후, 기질 OPD (100 ㎕)를 첨가하였다. 1 정제를 20 ml의 증류수에 용해시켰다.
배양은 진탕하 암중 실온에서 20분 동안 이루어졌다.
이후, 100 ㎕의 중지 용액 H2SO42N을 첨가하였다.
용액의 OD는 490 nm에서 측정하였다.
하기의 설정을 사용하였다:
Figure pct00010
하기의 결과를 수득하였다:
Figure pct00011
상기 분석 결과를 도 1에도 나타내었는데, 여기에는 ％ OD로 나타낸 AEB071에 의한 억제가 표시되어 있다 (AEB071 없음 = 100 ％ OD). 소형 분자 AEB071을 사용한 코팅은 실행가능하지 않은 것으로 밝혀졌는데, 화합물이 플레이트에 적절하게 부착되지 않게 되었기 때문이다 (데이터 나타내지 않음). 그러나, 운반체 (예컨대 난 알부민)를 보유하는 원래의 유도체를 사용한 코팅은 적합하였다. 따라서, 유도체 - 여기에서는 ova-BJA -를 플레이트에 부착하였다.
코팅이 사용되지 않은 경우 (NS1), 유의성 있는 신호가 수득되지 않는다. 따라서, 배경값(background)이 낮다. 또한, 항종 접합된 항체 (B0 및 NS2)는 분석에 비특이적으로 결합하지 않는다. 배경값을 방지하기 위해서는, 이것 역시 중요하다.
AEB071이 첨가되는 경우, 고정된 유도체에 대한 모든 선별된 항체들의 결합이 억제되었다. 이것은 사용된 항체들이 모두 AEB071에 대하여 특이적이라는 것을 증명한다. 최고의 특이성은 항체 4G4에서 수득되었다.
미지 샘플 (예를 들면 생물학적 샘플)에서 AEB071의 농도를 측정하기 위한 표준으로서 사용될 수 있는 보정 곡선을 확립하기 위하여, 하기 표 (웰에서의 최종 농도)에 의해 기술된 바와 같이 일련의 희석을 수행하였다. 버퍼 중에서의 4G4 및 3A3에 대한 AEB071의 억제 곡선을 하기와 같이 작성하였다:
Figure pct00012
최종 농도는 웰에서 하기와 같았다:
Figure pct00013
이와 같은 희석 시리즈를 사용함으로써, OD를 측정할 때 도 2에 기술된 바와 같은 보정 곡선을 수득하였다.
곡선 A는 항체 4G4 대 AEB071에 대하여 수득된 결과를 나타낸다. 곡선 B는 항체 3A3 대 AEB071에 대하여 수득된 결과를 나타낸다.
이와 같은 도 2에 대한 범례는 하기와 같이 해독된다:
Figure pct00014
상기 결과는 본 발명의 방법에 의해 수득되는 항체가 샘플에서 AEB071을 특이적으로 검출하는 데에 적합하다는 것을 증명한다. 항체 4G4가 역시 허용가능한 특이성을 나타내는 3A3에 비해 한층 더 특이적인 것으로 보인다.

Claims (20)

  1. (a) 모화합물의 제약상 활성인 형태의 일부를 차폐시켜, 상기 모화합물의 상기 제약상 활성인 형태의 1종 이상의 유도체를 제조하는 것;
    (d) 상기 유도체를 사용하여 상기 유도체에 결합하는 결합제 군을 수득하는 것;
    (e) 상기 결합제 군으로부터 상기 유도체 및 상기 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성 형태에 결합하는 1종 이상의 결합제를 선별하는 것
    을 포함하는, 모화합물의 제약상 불활성인 형태에 비해 더 고도의 특이성으로 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성 형태에 결합하는 1종 이상의 결합제를 수득하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유도체의 일부가 상기 모화합물의 상기 제약상 활성 형태의 하나 이상의 부분이 결합제에 대하여 접근가능하도록 차폐 구조에 의해 화학적으로 변형되며, 여기서 상기 모화합물의 상기 제약상 활성 형태는 포유동물에서 대사되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결합제를 수득하기 위한 2종 이상의 유도체를 제조하며, 각 유도체는 다른 유도체와 다른 분자 부위에 차폐 구조를 보유하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모화합물이 AEB071인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 결합제를
    (a)
    Figure pct00015

    (여기서 X1 및/또는 X2는 독립적으로 차폐 구조를 위한 커플링 지점 또는 수소를 나타내며, X1 또는 X2 중 하나 이상은 차폐 구조를 보유함),
    (b) BJC
    Figure pct00016
    ,
    (c) BJA
    Figure pct00017

    의 화합물 군에서 선택되는 유도체를 사용하여 수득하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 단계 (c)를 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태의 존재가 상기 유도체에 대한 결합제의 결합을 경쟁적으로 억제하는지를 분석하여 수행하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 단계 (c)에서
    (a) - 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태,
    - 결합제가 수득되는 유도체, 및
    - 모화합물로부터 생성되며, 모화합물의 다른 부분이 차폐되어 있는 1종 이상의 제2 유도체
    에 결합하는 결합제;
    (b) - 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태,
    - 결합제가 수득되는 유도체
    에 결합하나,
    - 모화합물로부터 생성되며, 모화합물의 다른 부분이 차폐되어 있는 1종 이상의 제2 유도체
    에는 결합하지 않는 결합제
    의 군으로부터 1종 이상의 결합제를 선별하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 모화합물을 불활성화할 수 있는 모화합물의 각 잠재적 대사 부위에 대하여 유도체를 생성하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 결합제.
  10. (a) 제13항에 정의된 1종 이상의 유도체를 사용하여 상기 유도체에 결합하는 결합제 군을 수득하는 단계,
    (b) 상기 결합제 군으로부터 상기 유도체 및 AEB071의 1종 이상의 제약상 활성인 형태에 결합하는 결합제를 선별하는 단계
    에 의해 수득가능한, 샘플 중 AEB071의 제약상 활성인 형태를 모니터링하기 위한 결합제.
  11. 제10항에 있어서,
    모화합물 AEB071
    Figure pct00018
    , 및
    대사물 화합물 C
    Figure pct00019
    , 및
    임의로 제13항에 정의된 1종 이상의 유도체에 결합하는 결합제.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 동일한 에피토프를 인식하는 2G8, 4G4, 3A3 또는 6B11 또는 이들의 유도체 또는 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 항체인 결합제.
  13. (a)
    Figure pct00020

    (여기서 X1 및/또는 X2는 독립적으로 차폐 구조를 위한 커플링 지점 또는 수소를 나타내며, X1 또는 X2 중 하나 이상은 차폐 구조를 보유함),
    (b) BJC
    Figure pct00021
    ,
    (c) BJA
    Figure pct00022

    로 이루어진 군에서 선택되는 AEB071의 유도체.
  14. - 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태를 포함할 것으로 추정되는 샘플을 1종 이상의 결합제와 접촉시키는 것;
    - 상기 모화합물의 상기 제약상 활성인 형태의 농도를 측정하는 것
    을 포함하며, 상기 모화합물의 제약상 불활성인 형태에 비해 더 고도의 특이성으로 상기 모화합물의 제약상 활성인 형태에 결합하는 1종 이상의 결합제가 상기 농도를 측정하는 데에 사용되는 것인, 약물 모니터링 분석법.
  15. 제14항에 있어서, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 결합제를 포함하는 약물 모니터링 분석법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 결합제에 의해 인식되는 모화합물 또는 상기 모화합물의 유도체가 검출가능한 표지에 접합되며, 상기 접합된 모화합물 또는 그의 유도체는 결합제에 의한 결합에 대하여 샘플에 존재하는 상기 모화합물의 제약상 활성인 형태와 경쟁하도록 구성되고, 표지는 상기 모화합물의 상기 제약상 활성인 형태의 농도를 나타내는 신호를 제공하는 것인 약물 모니터링 분석법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 모화합물이 AEB071인 약물 모니터링 분석법.
  18. 제17항에 있어서, 경쟁 표적으로 사용되는 유도체가 동일한 특이성으로 결합제에 의해 인식되는 제13항에 따른 유도체 또는 그의 변형물인 약물 모니터링 분석법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 모화합물 AEB071 및/또는 그의 제약상 활성인 형태를 인식하는 결합제가 사용되며, 1 내지 500 또는 1 내지 250 ng/ml의 작동 범위를 갖는 약물 모니터링 분석법.
  20. 모화합물의 제약상 불활성인 형태에 비해 더 고도의 특이성으로 모화합물의 제약상 활성인 형태에 결합하는 1종 이상의 결합제, 및 임의로 샘플 중 상기 모화합물의 상기 제약상 활성 형태의 농도를 측정하기 위한 시약을 포함하는, 샘플 중 모화합물의 1종 이상의 제약상 활성인 형태의 농도를 측정하기 위한 진단 키트.
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