JP2007528502A - エベロリムスのイムノアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
上記薬物の生体液中における濃度の測定および解釈として定義される薬物治療管理(TDM:Therapeutic Drug Monitoring)は、移植プロトコルにおける不可欠な要素となっており、器官反応の予測を最終的な課題目的としている。
Brignol N, et al. "High-throughput semi-automated 96-wellliquid/liquid extraction and liquid chromatography/mass spectrometric analysisof Certican (RAD001) and cyclosporin A (CsA)in whole blood." Rapid Communications in Mass Spectrometry 2002; 15: 1-10;
Streit F. et al. "Rapid liquid chromatography-tandem massspectrometry routine method for simultaneous determination of sirolimus, Certican, tacrolimus, and cyclosporin A in whole blood." Clinical Chemistry. 2002; 48 (6): 955-958.
nは0または1であり、
Xは、3-10個の炭素またはヘテロ原子から成るリンカー鎖であり、このリンカー鎖は置換鎖または非置換鎖でありえ、さらに直鎖または分岐鎖でありえ、
Yは、-C(O)-, -NH-, -S-, -CH2-および-O-から成るグループから選択され、
Zは抗原担体または標識である。
「類似物質(アナログ)」または「誘導体」という用語は、1つ以上の化学反応により親化合物または分子から生成された化学化合物または分子を示す。「活発化ハプテン」は、ハプテン誘導抱合体を、リンキンググループ(連結群)を連結(attach)することなどによって、合成するための反応に利用できる領域を備えるハプテン誘導体を示す。
触媒、発蛍光団、染料、化学発光剤、発光剤、感光剤、非磁性または磁性粒子状物質、固体担体、リポソーム、配位子、レセプタ、およびハプテン放射性同位体が挙げられる。
検出体の目的によっては、代謝物質に対する交差反応性をほとんど有さない(または、全く有さない)エベロリムスを対象に抗体を選択してもよく、あるいは、代替方法として、エベロリムスと同様に代謝物質且つ又は関連薬物の1つ以上を認識できる抗体を選択してもよい。人体の肝臓小胞体を採用して実施されたエベロリムスの生体内変化に関する包括的な研究により、ヒドロキシ-(24/25 OH RAD, 46 OH RAD)、開環化合物(RAD SA, RAD PSA)および40-ホスファチジルコリン-RAD(RAD PC)などの主な代謝物質とともに、エベロリムスのヒドロキシル化および脱メチル化に起因する少なくとも11種の代謝物質が認識されている(参照により本稿に援用されるBornsen KO, et al., Electrospray ionization and collisionally induced dissociationof RAD001 and related compounds and structural characterizationof RAD001 metabolites by nano-spray and micro liquid chromatography massspectrometry; Jacobson W, et al. Comparison of the in vitro metabolism of the macrolide immunosuppressants sirolimu and RAD. Transplantation Proceedings2001 ;33 : 614-615を参照)。
X1は1つ以上の原子から成るリンカー鎖であり、その各々は置換鎖または非置換鎖でありえ、さらに分岐鎖または非分岐鎖でありえ、Yは上記のように定義され、そして上に定義されるようにZが標識である。
X1はXであり、
Yは上記化学式IIで定義されるものであり、そして
Zは抗原担体である、
ことを特徴とする化学式IIIの化合物は、エベロリムス用に抗体を生成するのに用いる抗原化合物として適しているという共通認識がある。
蛍光偏光免疫測定(FPIA)技術は、試料中の抗原/薬物間の競合的結合および標識抗原/薬物の既知濃度に基づくものである。FPIAは、本稿全体を通して援用される米国特許第4,593、089号に記述されている。アッセイ・システムにおいて、エベロリムスなどの試料抗原は、一定の数の抗体部位(sites)を獲得するためにフルオレセイン標識抗原または抗原類似物質と競合する。FPIA法システムにおける主成分は、i)抗原/薬物へ特異的に結合できる抗体、ii)抗原/薬物を含んでいる疑いのある試料、そして iii) 抗原/薬物またはフルオレセインで標識された類似物質である。溶液の分子の回転特性により、偏光度は分子の寸法に直接比例する。分子の大きさが増大するにつれて、偏光も増加する。
形式A:
一実施形態において、キットには、全血、溶血血液、血清または血漿中のエベロリムスの濃度を測定する免疫比濁法を行なう際に用いられる液体試薬セットが備えられている。
この技術において、エベロリムス抱合体(具体例として28-0活発化エベロリムス抱合体)は、微粒子(例えば、Seradyn社<インディアナ州インディアナポリス市>によって製造且つ又は販売されるあらゆる微粒子、但しポリスチレンまたはカルボン酸塩で修飾されたポリスチレンおよびストレプトアビジンでコーティングされ磁粉に限る)上に配置(搭載)される。
この実施形態は、エベロリムスと特異的に結合可能な抗体が微粒子上に配置(搭載)されるという点を除いて、上述の形式Aと同じようなものである。エベロリムス(具体例として28-O活発化エベロリムス)誘導体は、薬物抱合体を形成するのに最も好ましい高分子(例えば、ウシ血清アルブミン、オバルブミン、デキストランなど)に結合される。競合反応は、緩衝液中の薬物抱合体と患者試料中のエベロリムスとの間で生じ、微粒子に固定化された抗エベロリムス抗体へ結合する。患者試料中に薬物が存在する場合、それにより粒子状物質の凝集反応が阻害される。
CEDIA(R)(Roche社の商標)は、極めて精度の高い治療薬計量方法として証明されている。CEDIA(R)は、均一法の競合アッセイにかかる米国特許第4,708,929号、酵素ドナー断片をコード化するための組換えDNAの配列と同ベクターのためのホスト(宿主)にかかる米国特許第5,120,653号、酵素ドナー断片のアミノ酸配列にかかる米国特許第5,604,091号、およびCEDIA(R)アッセイ教育キットにかかる米国特許第5,643, 734号などを含む、さまざまな特許の主題として取り扱われているものである。
一実施形態において、化学発光微粒子イムノアッセイ(CMIA)技術を使用する競合アッセイは、エベロリムスと特異的に結合できて粒子状物質(特に、ろ過、堆積またはその他の手段による分離に適する特定の磁粉または粒子)に共役された抗体の使用を含む。適切な化学発光分子に結合されたエベロリムスから成る標識(例えばアクリジニウム・エステル)は、磁粉上の抗エベロリムス抗体を一定限度の量[獲得するために]患者試料中の遊離エベロリムスと競合する。非結合の標識を取り除くために一般的な洗浄を行った後に、(相対発光量<RLU>で示される)化学発光量が測定される。化学発光量は、患者試料中の遊離薬の量に反比例し、また、濃度は、薬物の概知数を用いて標準曲線を描くことにより決定される。
ここにおいて記述される誘導体、抗体、免疫原且つ又はその他の抱合体はまた、一連の検出体を伴うあらゆる数の均一・不均一法によるイムノアッセイでの使用に適している。なお、ここに提示される実施例は、限定するために記載されているのではない。
RAD-モノ-フォルマートの合成
100mL丸底フラスコを使って、RADをアルゴン(Aγ)環境下において、0.6gの2mLの乾性塩化メチレンに溶解し、1アリコート(~10μL)を、HPLCおよびTLCアッセイ用に保存した。反応溶液の入っている丸底フラスコを約−20℃の氷/NaClの中に浸して3-5分の間放置することにより反応用フラスコを冷やした。乾性ピリジン(0.25mL)を、金属針(15cm)のついたガラス製注射器(水分が完全に取り除かれているもの)を使ってすべて一度に追加した。約1/2-1分後に、金属針(15cm)のついたガラス製注射器(水分が完全に取り除かれているもの)を使って、0.35mLの乾性アリルクロロフォルマート(allylchloroformate)を追加した。その追加直後に、沈殿が生じたため、1時間の間攪拌した。5mLの飽和NaHCO3を追加することにより反応を停止し、その後、停止した反応を塩化メチレンで抽出した。有機相を混合した後に、乾燥して(Na2S04)、濾過した。濾液を250mLの丸底フラスコに移し(100-250mL)、揮発物を(+30℃以下の水浴中で)減圧蒸発させた。粗製生成物を、塩化メチレン中の40%酢酸エチルの中で、シリカクロマトグラフィーにより精製した。0.53gの最終生成物が収集された。
RAD-モノフォルマート0.4g、DMAP 9mg、ピメリン酸モノアリルエステル0.2gを撹拌棒を装備した50mL丸底フラスコ(水分が完全に取り除かれているもの)に入れ、5mLの乾性CH2Cl2をアルゴン下0℃の氷/水の中に浸された上記フラスコ中に追加した。該溶液を5-10分放置して冷した後、DCC 0.2gを素早く追加し、0℃で5時間放置して反応させた。沈殿したDCUをWhatman #1フィルタ上で収集した。フラスコと沈殿物を氷のように冷たい約10mLのCH2Cl2で共に洗浄し、有機質層を氷のように冷たい1MのHCl、飽和水性重炭酸ナトリウム、で洗浄し、Na2SO4上で乾燥した後上澄みを取り(または濾過し)、固形物質を2x5mLのCH2Cl2で洗浄し、粗製生成物を真空下で濃縮(凝縮)して0.45gを収集した。酢酸エチル/メチレン・クロロライド(1: 1)のシリカゲルカラムを用いたフラッシュクロマトグラフィーによって、さらなる精製を達成することができる。
0.362gの保護RADを、室温且つアルゴン下において、撹拌棒およびゴムシールを装備した(水分が完全に取り除かれている)琥珀製の丸底フラスコ中に入れた。結露を防ぐために、試薬を室温で少なくとも30分間放置して温めた。
前手順で得られたRAD酸0.281gを室温で温め、再度アルゴンで充填した。DMAP 3.1mg(0.1当量)、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)88mg(3当量)、DCC 79mg(1.5当量)を反応フラスコ内にすばやく加え、注射器を介して乾性塩化メチレン3.0mLを加えることにより反応を開始させた。アルゴン下、室温において1時間攪拌して反応作用を続行した。その後、氷/水浴に浸し、さらに2時間攪拌して反応させた。この手順の終わりに、1.5mLのヘキサンを追加し、攪拌を停止した。沈殿した尿素(DCU)を、毛細管ピペットを使って綿栓を通して濾過した。(氷のように冷たい)1.0MのHCl、飽和NaCl、飽和NaHCO3、飽和NaCI、蒸留水の順に、各々均等な量で有機相を抽出した。有機相を
Na2SO4を加えて乾燥させ、減圧濃縮した。粗製のRAD-822を約1mLのCH2Cl2中で溶解し、シリカゲルカラムに載せた。試料をヘキサン/アセトン(1: 1)によって溶出し、そして生成物を収集および真空濃縮した結果、46mgの収量を得ることができた。
100mL丸底フラスコの重量を測定し、ピペットを使って1mLのFAMCO-E溶液を適した大きさの丸底フラスコに移した。ロータリー・エバポレータを使って溶剤を減圧下で回転蒸発させた。プラスチック製キャップでふたをしたフラスコをアルミ箔で包み、磁気撹拌機を上記フラスコに取り付けた(追加した)。1mLのDMF溶液を、ピペットで上記フラスコへ移し、40-50分間室温で攪拌した。十分な量のRADを-78℃の冷凍庫から取り出し、室温に放置して溶かした。4mgのRAD 822の重量を秤量紙上で量り、FAMCO-E溶液の入っているフラスコにその粉末を入れた(移した)。磁気撹拌皿上で該フラスコを氷/水浴に浸し、アルゴン圧下で1時間の反応させた後、さらに室温で30-40分間引き続き反応させた(合計2時間以内)。溶剤を(高真空ポンプによる)減圧下で蒸発させた。粗製生成物(バッチサイズ1mgに対し0.5-2mL)を、メタノール(必要最低限の量)に溶解した。TLC溶剤を、85mLのCH2CL2および15 mLのMeOHを加えることにより調製した。プレートを作動中の換気フード内で少なくとも60分間空気乾燥させ、追跡子バンド(tracer band)を該プレートからこすり落とした(scraped)。粉末状物質を、30mL(孔隙率M)のブーフナー濾過漏斗に移し、100%メタノールで洗浄した。濾液を収集して適切な大きさの丸底フラスコに移した。濾液を乾燥状態になるまで濃縮し、メタノールに再度溶解した。その溶液を0.45μmフィルタを通して濾過し、その濾液を琥珀製の容器に収集した。
テフロン(登録商標)でコーティングされた磁気撹拌棒を備える100mL丸底フラスコを使用し、室温および強力な攪拌条件の下に、RAD 822(27.2mg)のDMSO(6.8mL)溶液をBSA:PBS(10mL, 20 mM PBS pH 7.2)の溶液中に滴下させてゆっくりと混合(追加)させた。その結果、その溶液は徐々に濁りだした。丸底フラスコをアルミ箔で覆い、さらに2時間室温下で攪拌した後、冷凍室(cold room)において50mM PBS緩衝液pH 7.5に対して、ベローズ(蛇腹)状透析チューブ(Pierce社)内を通してで5回透析を行った。最終量は45 mLだった。該溶液を、Amicon社製の心式限外濾過器 セントリプレップ(Centriprep)(ロット番号874710、10 kD MWCO)を使用して、9 mL(〜8mg/mL)に濃縮した。該溶液をよく混ぜて均質性を保証するようにした。
エベロリムス溶液(+23℃の乾性ピリジン3.0 mL中の290mg)に160mgのカルボキシメトキシルアミンヘミ塩酸(carboxymethoxylamine hemihydrochloride)を加え、撹拌棒を備えた丸底フラスコの中で不活性雰囲気下にて反応させた。5-6時間反応溶液を撹拌した後に、該容量を〜25 mLの塩化メチレンで薄め、その後、同量の1.2Mの低温HC1、飽和重炭酸ナトリウム、および飽和塩化ナトリウムで連続的に抽出した。ここで得られる有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し真空下で濃縮した後、次の活性化ステップでそのまま使用した。
(前手順から得られた)エベロリムス-O-カルボキシメチル-27-オキシム309mg、乾性N,N-ジメチルアミノピリジン(DMAP)7mg、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)124mg、およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)173mgをすべて一緒に混合し、乾性塩化メチレンに溶解して0℃に冷却する。不活性雰囲気下において約6時間撹拌した後に、そこで得られた懸濁液を濾過し、1.2MのHCI、飽和重炭酸ナトリウム、飽和塩化ナトリウムで連続的に抽出した。結果として得られた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ヘキサン/アセトン(3/2)、ヘキサン/アセトン(1/1)、ヘキサン/アセトン(2/3) (すべてv/v)の溶媒混合液を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィによる分離を連続的に行った。主な生成物含有分留(fractions)を混合して真空濃縮した結果、116mgの活発化エステルが収集された。ヘキサン中の40%酢酸エチル、4%メタノールを移動相として使用して2mL/分で行われた(Regis Technologiesによる)「シリカ」定常期のHPLC分析(280nmにおけるUV検出)の結果は、該反応により異性核(EおよびZ)が生成される(基準となる分解能は設定されていない)ことを示している。
多クローン性抗エベロリムス抗体は従来方式によって調製することができる。実施例-Iの作製工程において、被験動物はエベロリムス免疫原(RAD/BSA 822)で免疫化された。予防接種(免疫化)のスケジュールとして、初回注入時には、0.5mLの完全フロイントアジュバント混合の免疫原0.5mLが注入された。初回以降の注入に関しては、0.5mLの不完全フロイントアジュバント混合の免疫原0.5mLを注射した。各被験動物は通常、2週間に一回のスケジュールで該予防接種を受けた。血清をRAD 822:FAMCO-E追跡子を使ってFPIA法にて検診(スクリーニング)した。3匹のウサギからの隔月の生産ブリード(各ブリードごと〜20 mL)を共にプールした。濾過および稀釈前の、プールされた合計量は約500mLである。ウサギから採取した抗血清を0.2um酢酸セルロースフィルタで真空濾過し、アジ化ナトリウムと塩化ナトリウムを伴うリン酸緩衝液でpH7.5に薄めた。最終量は約1000mLである。
EXAMPLE III -- RAD 822:FAMCO-E 追跡子を用いての蛍光偏光法によるイムノアッセイ:
本実施例においては、エベロリムスを対象とする代表的な蛍光偏光法によるイムノアッセイ(FPIA)について記述する。
このアッセイは単にトラフ試料を対象にして特徴づけられたものである。EDTAで処理された全血が各アッセイに使用される。各アッセイには、一般的な無菌静脈穿刺技術を使用してガラス製もしくはプラスチック製のEDTAチューブの中に収集された全血600ゲルが用いられる。具体例として、患者試料を2-8℃にて最大24時間まで保管しえる。24時間以上保管する必要がある場合、全血を-20℃以下に冷凍することにより、最大28日間は試験に使用できる。具体例として、冷凍された試料を使用する際には、使用前に試料を完全に溶かし、くまなくかき混ぜる。試料抽出を行なう前には、(冷凍の場合も、採取直後に使用される場合も)全試料の容器をゆっくりと丁寧に逆さにするという動作を複数回繰り返すことにより、試料をくまなくかき混ぜる。
抗体試薬(5mL)・・・安定剤としてタンパク質を、そして防腐剤として<0.1%アジ化ナトリウム含んでいる、緩衝液中の<5% のウサギ抗血清。 図6(RAD 822: BSA)に示される免疫原を用い、実施例-IIと一貫した方法で多クローン性抗体試薬を生成した。
バイアルキャップの標識は「B」。
A.試料抽出手順:
試料(較正物質、患者試料、および対照群)を器具によって分析直前に抽出する。
分析の対象となっている較正物質、対照、または試料を、各々600μlずつ、ピペットを使って適切な遠心分離管へ入れる。700μlのメタノールをそれぞれの試料に加え、試料とメタノールの入っている遠心分離管の各々に100μlの沈澱剤を加える。蒸発を防ぐため、その後すぐに各遠心分離管にふたをして、それから少なくとも10秒間最高スピードで激しく混合(渦運動による混合)する。その後、少なくとも8分間、13,400 x gで遠心分離機により分離する。上記遠心処理後、各々の上澄み(少なくとも300μl)を回転荷台に載せ、試料カートリッジへピペットで移し、試料蒸発を最小限に抑えるために直ちに該当する器具を作動させる。
各患者試料と対照用に、2個のカートリッジと2個のキュベットをアッセイ用回転荷台に配置する。試料抽出手順の上澄みを少なくとも300μl、ピペットを使って泡が入らないように上手に各試料へ入れる。試料の入っている容器をゆっくりと丁寧にひっくり返してかき混ぜる。バイアルキャップを取り除き、試薬セットおよびアッセイ用回転荷台を分析装置にセットした後、速やかに(すぐに)アッセイ工程を開始する。
アッセイシステムの具体例として定量法が挙げられる。エベロリムス濃度は、TDx(R)/TDxFlx(R)分析装置の印刷出力にng/mLの単位で記録される。アッセイの感度よりも低い患者試料の結果は、「<2.00ng/mL」として報告されるものとする。ほとんどの試料中のエベロリムス濃度はアッセイ範囲内である。
1. スパイクされた試料の回復
エベロリムスに対して陰性の全血の標本を、アッセイ範囲にわたりエベロリムスでスパイクした後、n=3にて異なる3機の分析装置上で分析した。その平均値はLC/MS値と比較され、パーセント回復が計算された。その結果を表1に示す。
エベロリムス治療を受けている患者から採取した全血試料について、本発明の実施形態によるTDx(R)のアッセイシステムによって測定された濃度をLC/MSによって測定されたものと比較した。
2件の参考検査室による腎臓移植患者に関する試験結果(「Passing Bablock線形回帰分析法」により分析されたデータ)を、本発明の実施形態によるアッセイシステムとLC/MSを比較して図10に示す。
本発明の実施形態によるアッセイシステムは、パーセント稀釈および回復の間でアッセイ範囲にわたって比例関係を示す。
結果を表2に下に示す。
主なエベロリムス代謝物質に対する抗体試薬「A」の交差反応性を検討するための研究を実施した。(以下表3に一覧される)化合物を、5ng/mLの割合で、通常のプール・ヒト全血(治療域の下限側(約4ng/mL)でスパイクされたエベロリムスを含むもの)に加え、本発明の実施形態によるアッセイシステム(定量法)で試験を実施した。エベロリムスでスパイクされた通常のヒト全血は、対照群として試験を実施した。
本発明の実施形態によるアッセイシステムは、干渉する可能性のある化合物に対して試験を行った。表4(表A〜表4C)に一覧される物質を(12ng/mLのエベロリムスを含む)ヒト全血に加えると、試験が臨床的に妥当とされるレベルを上回る濃度で行われた場合には、5%未満の交差反応性を示した。
以下表5に一覧される化合物を、治療域の下限で(または下限以下で)、エベロリムスを含む通常のヒト全血に加えたときに、本発明の実施形態によるアッセイシステムによるエベロリムスの計量(定量)に≦10%の誤差(エラー)が生じた。
複数再現間のアッセイ間CVが≦20%であるところのヒト全血中最低濃度として定義されるところの本発明の実施形態によるアッセイシステムの定量化限界(LOQ:Limit of Quantification)は、2.00ng/mLである。
また、本稿において、好ましい実施形態に関連して本発明が詳述されているが、その他の変形・改造様態も、下記の特許請求の範囲に記載および定義される本発明の精神と範囲内に含まれる存在する。
Claims (28)
- 特異的にエベロリムスを結合することができる抗体と、検出可能な標識に抱合するエベロリムス化合物を備える試料中のエベロリムスの存在を決定するための競合イムノアッセイにおいて、
該抱合エベロリムス化合物が、抗体と結合するために、試料中のエベロリムスと競合するように構成されること、そして
試料中のエベロリムスが治療薬物モニタリング濃度に存在する場合、標識が試料中のエベロリムスの濃度を示すシグナルを提供することを特徴とする競合イムノアッセイ。 - 治療薬濃度の範囲が約3〜約15ng/mLのエベロリムスにかかることを特徴とする請求項1に記載の競合イムノアッセイ。
- 約0〜約40ng/mLの エベロリムスが存在する場合にシグナルがエベロリムスの濃度を示すことを特徴とする請求項1に記載の競合イムノアッセイ。
- nが0または1であり、 Xが3-10個の炭素またはヘテロ原子から成るリンカー鎖であり、このリンカー鎖は置換鎖または非置換リンカー鎖でありえ、さらに直鎖または分岐鎖でありえ、 Yが-C(O)-, -NH-, -S-, -CH2-および-O-から成るグループから選択され、そして Zが抗原担体である次の化学式を有する抗原を使用して抗体が生成されることを特徴とする請求項1に記載の競合イムノアッセイ。
- 次の化学式を有する抗原を使用して抗体が生成されることを特徴とする請求項4に記載される競合イムノアッセイ。
- アッセイが、FPIA法、均一微粒子(免疫比濁法)イムノアッセイ、クローン化酵素ドナー・イムノアッセイ(CEDIA法)、化学発光不均一イムノアッセイおよび側方流動イムノアッセイから成るグループから選択されることを特徴とする請求項1に記載の競合イムノアッセイ。
- 抱合エベロリムス化合物が、X1が1つ以上の原子から成るリンカー鎖であり、各々のリンカー鎖は置換鎖または非置換鎖でありえ、さらに分岐鎖または非分岐鎖でありえ、Yが-C(O)-, -NH-, -S-, -CH2-および-O-から成るグループのから選択され、そしてZが標識である次の化学式の化合物であることを特徴とする、請求項1に記載の競合イムノアッセイ。
- X1が -O-CH2-であり, Yが-C(O)-であることを特徴とする請求項7に記載される競合イムノアッセイ。
- 抗体が、エベロリムスにかかるアッセイ範囲において50%以上の置換(displacement)の強力な結合作用と強力な抑制作用を示すことを特徴とする請求項1に記載される競合イムノアッセイ。
- キットとして提供される請求項1に記載の競合イムノアッセイ。
- 較正物質をさらに備える請求項10に記載の競合イムノアッセイ。
- 抱合エベロリムス化合物が、抗体を結合するために、試料中のエベロリムスと競合するように構成されることを特徴とし、
検出可能な標識に抱合するエベロリムス化合物および特異的にエベロリムスを結合できる抗体と試料を混合すること、
試料中のエベロリムスの濃度を示す検出可能な標識からのシグナルを測定すること、および
試料中のエベロリムスの量を決定することを含む、試料中のエベロリムスの量を決定する方法。 - 試料中のエベロリムスが治療薬物モニタリング濃度に存在する、請求項14に記載の方法。
- 治療薬濃度の範囲が約3〜約15ng/mLのエベロリムスにかかる、請求項15に記載の方法。
- nが0または1であり、 Xは、3-10個の炭素またはヘテロ原子から成るリンカー鎖であり、このリンカー鎖は置換鎖または非置換リンカー鎖でありえ且つ直鎖または分岐鎖でありえ、 Yが-C(O)-, -NH-, -S-, -CH2-および-O-から成るグループから選択され、そして Zが抗原担体である次の化学式を有する抗原を使用して抗体が生成されることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 試料が体液であることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 混合ステップが、まず検出可能な標識に抱合するエベロリムス化合物と抗体を混合し、その後で試料を加えることを含むことを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 混合ステップが、まず抗体と試料混合し、その後で検出可能な標識に抱合するエベロリムス化合物を加えることを含むことを特徴とする請求項13に記載の方法。
- nは0または1であり、 Xは、3-10個の炭素またはヘテロ原子から成るリンカー鎖であり、このリンカー鎖は置換鎖または非置換リンカー鎖でありえ且つ直鎖または分岐鎖でありえ、Yが-C(O)-, -NH-, -S-, -CH2-および-O-から成るグループから選択され、 Zが抗原担体または標識である、次の構成を有する化合物。
- n=1およびXが4-6個の置換鎖または非置換、直鎖または分枝鎖のカーボンまたはヘテロ原子から成るリンカー群であることを特徴とする請求項19に記載の化合物。
- Xが-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-であり、Yが-C(O)-であることを特徴とする請求項20に記載の化合物。
- Zが抗原担体であることを特徴とする請求項21に記載の化合物。
- エベロリムスへ特異的結合ができる請求項22に記載の化合物を使用して生成される抗体。
- 抗体が単クローン抗体であることを特徴とする請求項23に記載の抗体。
- 抗体が多クローン性抗体であることを特徴とする請求項23に記載の抗体。
- 請求項23の抗体および検出可能な標識を備える試料のエベロリムスを検出するためのイムノアッセイ・キットにおいて、試料、抗体および標識がともに混合され、エベロリムスが試料の中にある場合に標識が検出可能なシグナルを生成するように構成されることを特徴とするイムノアッセイ・キット。
- 標識が、抗体または抗体に対して特異性を有する2次抗体に連結されることを特徴とする請求項26に記載のイムノアッセイ。
- 抗体と結合するために試料中のエベロリムスと競合するように構成されるエベロリムス分子に標識が連結されることを特徴とする請求項26に記載のイムノアッセイ。
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