JP2003024065A - ラパマイシン検定 - Google Patents
ラパマイシン検定Info
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
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-
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-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ラパマイシン対するモノクローナルを提供す
ること。 【解決手段】 ａ)活性化結合基を有するラパマイシン
を免疫原性タンパク質と反応させ、免疫原性結合体を産
生し、ｂ)上記免疫原性結合体を好適な動物種に投与
し、免疫原性チャレンジを行い、上記結合体に感受性の
抗体−産生細胞を回収し、ｃ)上記抗体−産生細胞を不
死化し、およびｄ)このように確立した不死化細胞系か
らモノクローナル抗体を回収する：ことにより得ること
ができるモノクローナル抗体により解決される。
ること。 【解決手段】 ａ)活性化結合基を有するラパマイシン
を免疫原性タンパク質と反応させ、免疫原性結合体を産
生し、ｂ)上記免疫原性結合体を好適な動物種に投与
し、免疫原性チャレンジを行い、上記結合体に感受性の
抗体−産生細胞を回収し、ｃ)上記抗体−産生細胞を不
死化し、およびｄ)このように確立した不死化細胞系か
らモノクローナル抗体を回収する：ことにより得ること
ができるモノクローナル抗体により解決される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、例えば医薬の血中
濃度追跡のためのキットに有用なラパマイシンおよびラ
パマイシン誘導体に対するモノクローナル抗体に関す
る。
濃度追跡のためのキットに有用なラパマイシンおよびラ
パマイシン誘導体に対するモノクローナル抗体に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ラパマイシンは、種々の適用において、
特に、例えば器官移植拒絶反応および自己免疫疾患の処
置および予防における使用のための免疫抑制剤として有
用な、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス(Strepto
myces hygroscopicus)により産生されるマクロライド系
抗生物質である。しかしながら、ラパマイシンは高投与
量で副作用を示し、いくぶん変わりやすい生体内利用能
を有する。ラパミシンで処置している患者の血中のラパ
マイシン濃度を追跡することは、従って、薬理学的活性
のために充分な最少の濃度を維持し、副作用の過度の危
険を避けるために、強く望まれている。臨床環境で素早
く、容易に行うことができる感受性で信頼できる検定が
ないことが、医薬としてのラパマイシンの発展の主要な
障害となっている。
特に、例えば器官移植拒絶反応および自己免疫疾患の処
置および予防における使用のための免疫抑制剤として有
用な、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス(Strepto
myces hygroscopicus)により産生されるマクロライド系
抗生物質である。しかしながら、ラパマイシンは高投与
量で副作用を示し、いくぶん変わりやすい生体内利用能
を有する。ラパミシンで処置している患者の血中のラパ
マイシン濃度を追跡することは、従って、薬理学的活性
のために充分な最少の濃度を維持し、副作用の過度の危
険を避けるために、強く望まれている。臨床環境で素早
く、容易に行うことができる感受性で信頼できる検定が
ないことが、医薬としてのラパマイシンの発展の主要な
障害となっている。
【０００３】ラパマイシンの臨床的追跡のための検定キ
ットの開発のための以前の努力は特に成功していない。
例えば、欧州特許第０４１７９５号は、ラパマイシン濃
度が抗菌活性の関数として測定される微生物検定を記載
している。ＷＯ９２／０２９４６は、マクロフィリンへ
の結合を競合測定することによりラパマイシン濃度を間
接的に測定する検定系を提供する。これらの検定の両方
とも扱いにくく特に感受性でない。更に重要なことに、
これらの両方の検定は、僅かに異なった試験条件下で相
当変化し得、異なった病院の試験結果の比較が難しい。
ットの開発のための以前の努力は特に成功していない。
例えば、欧州特許第０４１７９５号は、ラパマイシン濃
度が抗菌活性の関数として測定される微生物検定を記載
している。ＷＯ９２／０２９４６は、マクロフィリンへ
の結合を競合測定することによりラパマイシン濃度を間
接的に測定する検定系を提供する。これらの検定の両方
とも扱いにくく特に感受性でない。更に重要なことに、
これらの両方の検定は、僅かに異なった試験条件下で相
当変化し得、異なった病院の試験結果の比較が難しい。
【０００４】ラパマイシンを認識するモノクローナル抗
体の先行報告はない。ラパマイシンが免疫原性でなく、
それ自身非常に免疫抑制性であるため、ラパマイシンに
対するモノクローナル抗体の製造は本来難しい。更に、
ラパマイシンの代謝物が文献中で十分特徴付されていな
いため、ラパマイシンとその代謝物の間の識別が可能な
モノクローナル抗体の同定は難しい。
体の先行報告はない。ラパマイシンが免疫原性でなく、
それ自身非常に免疫抑制性であるため、ラパマイシンに
対するモノクローナル抗体の製造は本来難しい。更に、
ラパマイシンの代謝物が文献中で十分特徴付されていな
いため、ラパマイシンとその代謝物の間の識別が可能な
モノクローナル抗体の同定は難しい。
【０００５】
【発明の開示】本発明はラパマイシンに非常に感受性の
モノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、免疫
原性タンパク質に結合したラパマイシンの新規誘導体を
含む新規免疫原性結合体の接種に応答して産生される。
これらの抗体を使用した検定キットは臨床環境での使用
に非常に適しており、今まで可能であったものよりはる
かに正確で再現性のある結果を提供する。抗体はラパマ
イシンの精製および単離にもまた有用である。
モノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、免疫
原性タンパク質に結合したラパマイシンの新規誘導体を
含む新規免疫原性結合体の接種に応答して産生される。
これらの抗体を使用した検定キットは臨床環境での使用
に非常に適しており、今まで可能であったものよりはる
かに正確で再現性のある結果を提供する。抗体はラパマ
イシンの精製および単離にもまた有用である。
【０００６】ラパマイシンの免疫抑制誘導体のための検
定系の提供は、同様の課題が示される。特に興味のある
のは、例えば米国第５２５８３８９号およびＰＣＴ／Ｅ
Ｐ９３／０２６０４(Ｏ−アリルおよびＯ−アルキルラ
パマイシン)(両方とも本明細書に引用して包含する)に
開示されているようなラパマイシンの４０−Ｏ−誘導
体、即ちシクロヘキシル環のヒドロキシ(４０位)でＯ−
置換されたラパマイシン；特に、４０−Ｏ−置換基がア
ルキルまたは置換アルキル；例えばヒドロキシアルキ
ル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアル
キルまたはアミノアルキルである(ここで、「アルク
−」または「アルキル−」は分枝鎖または直鎖状のＣ
１−６アルキル、好ましくはＣ１−３アルキルを意味
し、炭素鎖は所望によりエーテル(−Ｏ−)架橋で中断さ
れていてもよい。)である４０−Ｏ−アルキル化ラパマ
イシン；最も好ましくは４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエ
チル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(３−ヒドロキシプロ
ピル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(２−ヒドロキ
シ)エトキシ]エチル−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−
(２−アセトアミノエチル)−ラパマイシンである。従っ
て、本発明の更なる対象は、このような４０−Ｏ−誘導
体に対するモノクローナル抗体の提供である。このよう
な抗体は診断的検定およびまた本誘導体の精製および産
生に有用である。
定系の提供は、同様の課題が示される。特に興味のある
のは、例えば米国第５２５８３８９号およびＰＣＴ／Ｅ
Ｐ９３／０２６０４(Ｏ−アリルおよびＯ−アルキルラ
パマイシン)(両方とも本明細書に引用して包含する)に
開示されているようなラパマイシンの４０−Ｏ−誘導
体、即ちシクロヘキシル環のヒドロキシ(４０位)でＯ−
置換されたラパマイシン；特に、４０−Ｏ−置換基がア
ルキルまたは置換アルキル；例えばヒドロキシアルキ
ル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアル
キルまたはアミノアルキルである(ここで、「アルク
−」または「アルキル−」は分枝鎖または直鎖状のＣ
１−６アルキル、好ましくはＣ１−３アルキルを意味
し、炭素鎖は所望によりエーテル(−Ｏ−)架橋で中断さ
れていてもよい。)である４０−Ｏ−アルキル化ラパマ
イシン；最も好ましくは４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエ
チル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(３−ヒドロキシプロ
ピル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(２−ヒドロキ
シ)エトキシ]エチル−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−
(２−アセトアミノエチル)−ラパマイシンである。従っ
て、本発明の更なる対象は、このような４０−Ｏ−誘導
体に対するモノクローナル抗体の提供である。このよう
な抗体は診断的検定およびまた本誘導体の精製および産
生に有用である。
【０００７】本発明の新規免疫原性結合体の製造に使用
するラパマイシンの新規活性化誘導体は、ラパマイシン
上のヒドロキシ基の一つ、好ましくはラパマイシンのシ
クロヘキシル部分(４０位)または２８位のヒドロキシを
通して、活性結合基、即ちタンパク質との直接の反応が
可能な基と結合し、タンパク質との反応を可能にし、作
用しまたは促進する結合剤(例えばカルボジイミド試薬)
を使用する必要なく共有結合を形成する。好ましくは、
活性化結合基は、活性化エステルまたはカルボキシ基、
即ち式−ＣＯ−Ｏ−Ｘ(ここで、Ｘはｏ−またはｐ−ニ
トロフェニル、１−ベンズトリアゾール、ペンタフルオ
ロフェニルまたは(特に)Ｎ−サクシンイミドのようなカ
ルボキシ活性基である。)を有する。他の好適な活性化
結合基は、例えばｉ）例えば式−Ｓ−Ｓ−Ｚ(ここで、
Ｚは、ラパマイシンに結合し得る２−ピリジルのような
ジチオ活性化基)で示される活性化ジチオ基；またはi
i）例えばエポキシメチルのようなエポキシ基である。
活性化結合基は、エステル、エーテル、アミド、チオま
たは他の好適な結合によりラパミシンと結合し得るが、
エステル結合が好ましい。最も好ましくは、活性化結合
基は、一端にラパマイシンへのエステル結合を有し、他
方の端に活性化エステルまたは活性化カルボキシ基を有
するビス−エステル分子、例えばサクシニルを含む。
するラパマイシンの新規活性化誘導体は、ラパマイシン
上のヒドロキシ基の一つ、好ましくはラパマイシンのシ
クロヘキシル部分(４０位)または２８位のヒドロキシを
通して、活性結合基、即ちタンパク質との直接の反応が
可能な基と結合し、タンパク質との反応を可能にし、作
用しまたは促進する結合剤(例えばカルボジイミド試薬)
を使用する必要なく共有結合を形成する。好ましくは、
活性化結合基は、活性化エステルまたはカルボキシ基、
即ち式−ＣＯ−Ｏ−Ｘ(ここで、Ｘはｏ−またはｐ−ニ
トロフェニル、１−ベンズトリアゾール、ペンタフルオ
ロフェニルまたは(特に)Ｎ−サクシンイミドのようなカ
ルボキシ活性基である。)を有する。他の好適な活性化
結合基は、例えばｉ）例えば式−Ｓ−Ｓ−Ｚ(ここで、
Ｚは、ラパマイシンに結合し得る２−ピリジルのような
ジチオ活性化基)で示される活性化ジチオ基；またはi
i）例えばエポキシメチルのようなエポキシ基である。
活性化結合基は、エステル、エーテル、アミド、チオま
たは他の好適な結合によりラパミシンと結合し得るが、
エステル結合が好ましい。最も好ましくは、活性化結合
基は、一端にラパマイシンへのエステル結合を有し、他
方の端に活性化エステルまたは活性化カルボキシ基を有
するビス−エステル分子、例えばサクシニルを含む。
【０００８】本発明の好ましいラパマイシン誘導体は、
反応Ｉ：
反応Ｉ：
【化１】
反応Ｉ
〔式中、式Ｉはラパマイシンであり、それをａ）アシル
化剤、例えば環状無水物またはジカルボン酸誘導体(所
望によりヘミ−Ｏ−保護形である。)と、好適な反応条
件下反応させ、必要であれば脱保護し、式II(ここで、
Ｙはスペーサー分子、好ましくは低級アルキレン、例え
ばＣ２−６アルキレン、最も好ましくはエチレンであ
る。)で示されるラパマシンを産生する。式IIで示され
るラパマシンを、次いでｂ）例えば式ＨＯ−Ｘ(ここ
で、Ｘは上記で定義の意味である。)のようなカルボキ
シ活性化基との反応により活性化し、式IIIで示される
活性化ラパマイシンを産生する。〕によって製造される
式IIIで示される化合物である。
化剤、例えば環状無水物またはジカルボン酸誘導体(所
望によりヘミ−Ｏ−保護形である。)と、好適な反応条
件下反応させ、必要であれば脱保護し、式II(ここで、
Ｙはスペーサー分子、好ましくは低級アルキレン、例え
ばＣ２−６アルキレン、最も好ましくはエチレンであ
る。)で示されるラパマシンを産生する。式IIで示され
るラパマシンを、次いでｂ）例えば式ＨＯ−Ｘ(ここ
で、Ｘは上記で定義の意味である。)のようなカルボキ
シ活性化基との反応により活性化し、式IIIで示される
活性化ラパマイシンを産生する。〕によって製造される
式IIIで示される化合物である。
【０００９】ラパマイシンの好ましい活性化誘導体は、
例えば反応II：
例えば反応II：
【化２】
反応II
〔式中、式Ｉはラパマイシンであり、例えば、より完全
に下記実施例１に記載したように、それをａ）ＤＭＡＰ
およびピリジンの存在下、無水コハク酸を使用してＯ−
アシル化し、式II'のラパマイシンヘミサクシネート(４
０−Ｏ−(３−カルボキシ)プロパノイル−ラパマイシ
ン)を形成する；それを、次いでｂ）ＥＤＣ、Ｅｔ３Ｎ
およびＣＨ２Ｃｌ２の存在下、Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミドで活性化して、式III'で示される４０−Ｏ−サク
シンイミドオキシサクシニルラパマイシンを形成す
る。〕により製造される上記式IIIのサクシンイミド誘
導体である。４０位により結合しているこのようなハプ
テンを使用して製造したモノクローナル抗体は、通常ラ
パマイシンおよび上記のようなラパマイシンの４０−Ｏ
−誘導体と交差反応性である。このようなモノクローナ
ル抗体は、下記に開示のように、下記のような例えばバ
インダードメインまたはエフェクタードメイン中のラパ
マイシンまたはラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体の特定
の領域を認識する化合物に対して選択できる。
に下記実施例１に記載したように、それをａ）ＤＭＡＰ
およびピリジンの存在下、無水コハク酸を使用してＯ−
アシル化し、式II'のラパマイシンヘミサクシネート(４
０−Ｏ−(３−カルボキシ)プロパノイル−ラパマイシ
ン)を形成する；それを、次いでｂ）ＥＤＣ、Ｅｔ３Ｎ
およびＣＨ２Ｃｌ２の存在下、Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミドで活性化して、式III'で示される４０−Ｏ−サク
シンイミドオキシサクシニルラパマイシンを形成す
る。〕により製造される上記式IIIのサクシンイミド誘
導体である。４０位により結合しているこのようなハプ
テンを使用して製造したモノクローナル抗体は、通常ラ
パマイシンおよび上記のようなラパマイシンの４０−Ｏ
−誘導体と交差反応性である。このようなモノクローナ
ル抗体は、下記に開示のように、下記のような例えばバ
インダードメインまたはエフェクタードメイン中のラパ
マイシンまたはラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体の特定
の領域を認識する化合物に対して選択できる。
【００１０】例えばラパマイシンと４０−Ｏ−ラパマイ
シン誘導体を区別する、またはシクロヘキシル領域にお
ける代謝物を同定するシクロヘキシル領域の修飾に高い
感受性を有するモノクローナル抗体を有するのが好まし
い場合がある。このような場合、ハプテンは好ましくは
４０−Ｏ位置よりもむしろ２８−Ｏ位置で結合してい
る。例えば、式Ａ：
シン誘導体を区別する、またはシクロヘキシル領域にお
ける代謝物を同定するシクロヘキシル領域の修飾に高い
感受性を有するモノクローナル抗体を有するのが好まし
い場合がある。このような場合、ハプテンは好ましくは
４０−Ｏ位置よりもむしろ２８−Ｏ位置で結合してい
る。例えば、式Ａ：
【化３】
【００１１】式Ａ
〔式中、ＲはＯ−保護基または所望により保護形であり
得る上記の置換基、例えばヒドロキシアルキル、ヒドロ
キシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたは
アミノアルキルである。〕で示されるラパマイシン誘導
体を、反応Ｉにしたがって反応させ、必要であれば脱保
護し、例えば式Ｂ：
得る上記の置換基、例えばヒドロキシアルキル、ヒドロ
キシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたは
アミノアルキルである。〕で示されるラパマイシン誘導
体を、反応Ｉにしたがって反応させ、必要であれば脱保
護し、例えば式Ｂ：
【化４】
式Ｂ
〔式中、Ｒ１はＨまたは上記のＯ−置換基、例えばヒド
ロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシ
ルアミノアルキルまたはアミノアルキル、Ｙは上記のリ
ンカー分子およびＸは上記で定義のカルボキシ活性化基
である。〕で示される化合物である類似の２８−Ｏ活性
化ハプテンを得る。ＲがＯ−保護基またはＯ−保護置換
基である本ハプテンの製造において、アシル化剤は、両
方Ｏ−保護基の続くアシル化でカルボキシ活性化基を添
加する１工程前に除去し得るように、所望により、例え
ばヘミ−Ｏ−保護形のジカルボン酸であり得る。例え
ば、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン
の認識が可能なモノクローナル抗体の産生のためのハプ
テンは、例えば反応III：
ロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシ
ルアミノアルキルまたはアミノアルキル、Ｙは上記のリ
ンカー分子およびＸは上記で定義のカルボキシ活性化基
である。〕で示される化合物である類似の２８−Ｏ活性
化ハプテンを得る。ＲがＯ−保護基またはＯ−保護置換
基である本ハプテンの製造において、アシル化剤は、両
方Ｏ−保護基の続くアシル化でカルボキシ活性化基を添
加する１工程前に除去し得るように、所望により、例え
ばヘミ−Ｏ−保護形のジカルボン酸であり得る。例え
ば、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン
の認識が可能なモノクローナル抗体の産生のためのハプ
テンは、例えば反応III：
【化５】
反応IIIに従った、第１級ヒドロキシの保護、ヒドロキ
シのヘミ−Ｏ−保護形のジカルボン酸による２８位のア
シル化、脱保護およびカルボキシ基の活性化により製造
できる。
シのヘミ−Ｏ−保護形のジカルボン酸による２８位のア
シル化、脱保護およびカルボキシ基の活性化により製造
できる。
【００１２】同様に、ラパマイシンそれ自身は、例えば
反応IV：
反応IV：
【化６】
反応IVに従って、Ｃ４０ヒドロキシのＯ−保護、２８位
のヒドロキシ基のヘミ−Ｏ−保護ジカルボン酸によるア
シル化、脱保護およびカルボキシ基の活性化により、４
０−Ｏよりむしろ２８−Ｏで活性化され得る。
のヒドロキシ基のヘミ−Ｏ−保護ジカルボン酸によるア
シル化、脱保護およびカルボキシ基の活性化により、４
０−Ｏよりむしろ２８−Ｏで活性化され得る。
【００１３】活性化ラパマイシンまたはラパマシン誘導
体は、次いで好適な免疫原性タンパク質、例えばウシ血
清アルブミン(ＢＳＡ)、オブアルブミン(ＯＶＡ)または
キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)に結合し、
免疫原性結合体を形成する。モノクローナル抗体は、既
知の方法、例えば新規免疫原性結合体を好適な動物種に
投与し、免疫原性チャレンジを行い、上記結合体に感作
させた抗体産生細胞を回収する；上記抗体産生細胞を、
好適なミエローマと融合させることにより不死化する；
およびこのようにして確立した選択した不死化細胞系か
らモノクローナル抗体を回収する：を使用して製造す
る。
体は、次いで好適な免疫原性タンパク質、例えばウシ血
清アルブミン(ＢＳＡ)、オブアルブミン(ＯＶＡ)または
キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)に結合し、
免疫原性結合体を形成する。モノクローナル抗体は、既
知の方法、例えば新規免疫原性結合体を好適な動物種に
投与し、免疫原性チャレンジを行い、上記結合体に感作
させた抗体産生細胞を回収する；上記抗体産生細胞を、
好適なミエローマと融合させることにより不死化する；
およびこのようにして確立した選択した不死化細胞系か
らモノクローナル抗体を回収する：を使用して製造す
る。
【００１４】本発明の抗体は、次いで、好適な検定に使
用し得る。当業者には、幾つかの可能性が明確であろ
う。一つの試みは、例えば、ラパマイシンを含む可能性
があると信じられている試験溶液、例えば患者の血漿ま
たは全血の存在下および非存在下で、マイクロタイター
プレートを抗体で被覆し、標識(例えば、蛍光−または
放射−標識、特にビオチニル化)ラパマイシンである競
合物質に暴露する、抗体およびラパマイシントレーサー
を使用した競合検定である。プレートをすすぎ、抗体に
結合している標識競合物質の量を測定し、その量は試験
溶液中に存在するラパマイシンの量に反比例して変化す
る。他の試みは、抗体、ラパマイシンタンパク質結合
体、およびマウスＩｇＧを認識する標識(例えば、酵素
−標識)トレーサー抗体を使用し、例えばマイクロタイ
タープレートをラパマイシン−タンパク質結合体(例え
ば、ラパマイシンまたは４０−Ｏ−アルキル化ラパマイ
シンに結合したタンパク質を含む上記の免疫原性結合
体)で被覆し、試験溶液の存在下または非存在下、抗体
に暴露し、すすぎ、ラパマイシン結合体に結合する抗体
を、ラパマイシン結合体に結合する抗体のトレーサー抗
体の結合により検出する。再び、結合抗体の量は、試験
サンプル中のラパマイシンの量に反比例して変化する。
いずれの場合も、検定は既知の濃度のラパマイシンを含
む試験溶液で標準化する。(ｉ)好ましくは凍結乾燥形ま
たはマイクロタイタープレート上に被覆させた本発明の
モノクローナル抗体を含み、および(ii)所望によりプレ
ートに被覆した形のラパマイシンタンパク質結合体およ
び／または標識ラパマイシン誘導体のいずれかを所望に
よりまた含み、および(iii)標準化のためのラパマイシ
ン溶液および使用説明書を所望により更に含む検定キッ
トが従って提供される。このようなキットは、１０ng/m
l以下、例えば１ng/ml以下、例えば０.２５−０.５ng/m
lほど低い濃度でラパマイシンを検出できる。
用し得る。当業者には、幾つかの可能性が明確であろ
う。一つの試みは、例えば、ラパマイシンを含む可能性
があると信じられている試験溶液、例えば患者の血漿ま
たは全血の存在下および非存在下で、マイクロタイター
プレートを抗体で被覆し、標識(例えば、蛍光−または
放射−標識、特にビオチニル化)ラパマイシンである競
合物質に暴露する、抗体およびラパマイシントレーサー
を使用した競合検定である。プレートをすすぎ、抗体に
結合している標識競合物質の量を測定し、その量は試験
溶液中に存在するラパマイシンの量に反比例して変化す
る。他の試みは、抗体、ラパマイシンタンパク質結合
体、およびマウスＩｇＧを認識する標識(例えば、酵素
−標識)トレーサー抗体を使用し、例えばマイクロタイ
タープレートをラパマイシン−タンパク質結合体(例え
ば、ラパマイシンまたは４０−Ｏ−アルキル化ラパマイ
シンに結合したタンパク質を含む上記の免疫原性結合
体)で被覆し、試験溶液の存在下または非存在下、抗体
に暴露し、すすぎ、ラパマイシン結合体に結合する抗体
を、ラパマイシン結合体に結合する抗体のトレーサー抗
体の結合により検出する。再び、結合抗体の量は、試験
サンプル中のラパマイシンの量に反比例して変化する。
いずれの場合も、検定は既知の濃度のラパマイシンを含
む試験溶液で標準化する。(ｉ)好ましくは凍結乾燥形ま
たはマイクロタイタープレート上に被覆させた本発明の
モノクローナル抗体を含み、および(ii)所望によりプレ
ートに被覆した形のラパマイシンタンパク質結合体およ
び／または標識ラパマイシン誘導体のいずれかを所望に
よりまた含み、および(iii)標準化のためのラパマイシ
ン溶液および使用説明書を所望により更に含む検定キッ
トが従って提供される。このようなキットは、１０ng/m
l以下、例えば１ng/ml以下、例えば０.２５−０.５ng/m
lほど低い濃度でラパマイシンを検出できる。
【００１５】本発明の抗体は、更に免疫抑制性アスコマ
イシン、例えばＦＫ−５０６への相対的結合親和性によ
り、更に特徴付得る。ＦＫ−５０６は結合ドメインでラ
パマイシンに幾つかの構造類似性を有する免疫抑制マク
ロライドである。ラパマイシン(例えば、ラパマイシン
およびその免疫抑制誘導体)およびＦＫ−５０６の両方
ともマクロフィリン(ＦＫＢＰ)に結合し、両方のため
に、免疫抑制活性のために、マクロフィリン結合が必要
であるが、充分な基準ではないと信じられている。しか
しながら、ラパマイシンのエフェクター領域は、ＦＫ−
５０６のものと非常に異なり、実際、２個の化合物は全
く異なる活性機構を有する。(例えば、ＦＫ−５０６は
主にＩＬ−２転写抑制により免疫抑制するように思え、
一方ラパマイシンは明確はＩＬ−２転写への効果はな
い。)ラパマイシンは、従ってＦＫＢＰ結合ドメインお
よびエフェクタードメインを有することにより特徴付け
られ、ＦＫＢＰ結合ドメインが修飾されたラパマイシン
代謝物およびエフェクタードメインが修飾されたものの
間の区別ができる。この区別は、本発明のモノクローナ
ル抗体により、本発明のモノクローナル抗体とＦＫ−５
０６の間の交差反応性(交差反応性は、例えば競合ＥＬ
ＩＳＡにより測定する)を測定することによりなすこと
ができる：高い(例えば５０％以上)交差反応性を有する
モノクローナル抗体は、ＦＫ−５０６と類似のラパマイ
シンのＦＫＢＰ結合ドメインのエピトープを認識する；
低い交差反応性(例えば２０％以下、最適には１０％以
下)のモノクローナル抗体は、ラパマイシンに独特のエ
フェクター領域のエピトープを認識する。
イシン、例えばＦＫ−５０６への相対的結合親和性によ
り、更に特徴付得る。ＦＫ−５０６は結合ドメインでラ
パマイシンに幾つかの構造類似性を有する免疫抑制マク
ロライドである。ラパマイシン(例えば、ラパマイシン
およびその免疫抑制誘導体)およびＦＫ−５０６の両方
ともマクロフィリン(ＦＫＢＰ)に結合し、両方のため
に、免疫抑制活性のために、マクロフィリン結合が必要
であるが、充分な基準ではないと信じられている。しか
しながら、ラパマイシンのエフェクター領域は、ＦＫ−
５０６のものと非常に異なり、実際、２個の化合物は全
く異なる活性機構を有する。(例えば、ＦＫ−５０６は
主にＩＬ−２転写抑制により免疫抑制するように思え、
一方ラパマイシンは明確はＩＬ−２転写への効果はな
い。)ラパマイシンは、従ってＦＫＢＰ結合ドメインお
よびエフェクタードメインを有することにより特徴付け
られ、ＦＫＢＰ結合ドメインが修飾されたラパマイシン
代謝物およびエフェクタードメインが修飾されたものの
間の区別ができる。この区別は、本発明のモノクローナ
ル抗体により、本発明のモノクローナル抗体とＦＫ−５
０６の間の交差反応性(交差反応性は、例えば競合ＥＬ
ＩＳＡにより測定する)を測定することによりなすこと
ができる：高い(例えば５０％以上)交差反応性を有する
モノクローナル抗体は、ＦＫ−５０６と類似のラパマイ
シンのＦＫＢＰ結合ドメインのエピトープを認識する；
低い交差反応性(例えば２０％以下、最適には１０％以
下)のモノクローナル抗体は、ラパマイシンに独特のエ
フェクター領域のエピトープを認識する。
【００１６】本発明の抗体は、ラパマイシンおよびラパ
マイシンの４０−Ｏ−誘導体を、例えば上記のように区
別できる能力によりスクリーニングおよび特徴付でき
る。ラパマイシンおよびラパマイシンの４０−Ｏ−誘導
体の区別をしない抗体が望ましい場合、抗体は、少なく
とも７０％、好ましくは９０％以上、ラパマイシンおよ
びその４０−Ｏ−誘導体と交差反応性を示すものを選択
する。このような場合、モノクローナル抗体の製造に使
用するハプテンは、好ましくは、例えば反応Ｉの式III
の４０−Ｏ−活性化ラパマイシンである。ラパマイシン
およびラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体または代謝物の
区別が望ましい場合、抗体は、３０％以下、好ましくは
１０％以下のそれらに対する交差反応性を有するものを
選択する。この場合、抗体の製造に使用するハプテン
は、好ましくは例えば、２８−Ｏ−活性化ラパマイシン
または式Ｂのラパマイシン誘導体である。
マイシンの４０−Ｏ−誘導体を、例えば上記のように区
別できる能力によりスクリーニングおよび特徴付でき
る。ラパマイシンおよびラパマイシンの４０−Ｏ−誘導
体の区別をしない抗体が望ましい場合、抗体は、少なく
とも７０％、好ましくは９０％以上、ラパマイシンおよ
びその４０−Ｏ−誘導体と交差反応性を示すものを選択
する。このような場合、モノクローナル抗体の製造に使
用するハプテンは、好ましくは、例えば反応Ｉの式III
の４０−Ｏ−活性化ラパマイシンである。ラパマイシン
およびラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体または代謝物の
区別が望ましい場合、抗体は、３０％以下、好ましくは
１０％以下のそれらに対する交差反応性を有するものを
選択する。この場合、抗体の製造に使用するハプテン
は、好ましくは例えば、２８−Ｏ−活性化ラパマイシン
または式Ｂのラパマイシン誘導体である。
【００１７】実施例１−４０−Ｏ−活性化ラパマイシン
の製造 ａ）ラパマイシンの４０−Ｏ−ヘミサクシネートの製造 ピリジン１２ml中のラパマイシン１.５ｇ(１.６４mmol)
および無水コハク酸０.５７７ｇ(５.７７mmol)の撹拌し
た溶液に、ＤＭＡＰ１９５mg(１.６４mmol)を加る。得
られた混合物を環境温度で１９時間撹拌し、減圧下濃縮
する。残渣を酢酸エチルに溶解し、３回水で洗浄する。
有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧
下濃縮する。残渣を９：１ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨを使
用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製
する。予期される生産物を含むフラクションを合わせ、
もう１回１９：１ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨを使用したシ
リカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、減圧下で
溶媒を除去した後、４０−Ｏ−(３−カルボキシ)プロパ
ノイル−ラパマイシン(前記式II'のラパマイシンヘミサ
クシネート)が白色泡状物として提供され、下記の特異
的スペクトル特性を示す：
の製造 ａ）ラパマイシンの４０−Ｏ−ヘミサクシネートの製造 ピリジン１２ml中のラパマイシン１.５ｇ(１.６４mmol)
および無水コハク酸０.５７７ｇ(５.７７mmol)の撹拌し
た溶液に、ＤＭＡＰ１９５mg(１.６４mmol)を加る。得
られた混合物を環境温度で１９時間撹拌し、減圧下濃縮
する。残渣を酢酸エチルに溶解し、３回水で洗浄する。
有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧
下濃縮する。残渣を９：１ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨを使
用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製
する。予期される生産物を含むフラクションを合わせ、
もう１回１９：１ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨを使用したシ
リカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、減圧下で
溶媒を除去した後、４０−Ｏ−(３−カルボキシ)プロパ
ノイル−ラパマイシン(前記式II'のラパマイシンヘミサ
クシネート)が白色泡状物として提供され、下記の特異
的スペクトル特性を示す：
【００１８】１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ２.６８(７Ｈ,
ｍ,Ｈ３３,Ｈ２５およびＯ２ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ),
３.１４(３Ｈ,ｓおよびｍ,ＯＣＨ３およびＨ３９),３.
３４(３Ｈ,ｓ,ＯＣＨ３),３.３８(３Ｈ,ｓ,ＯＣＨ３),
４.６８(１Ｈ,ｍ,Ｈ４０),４.７２(１Ｈ,ブロードｓ,１
０−ＯＨ)；ＭＳ(ＦＡＢ）ｍ／ｚ１０３６([Ｍ＋Ｎａ]
＋）,９８２([Ｍ−ＣＨ３Ｏ]＋),９６４([Ｍ−(ＣＨ３
Ｏ＋Ｈ２Ｏ)]＋),９４６([Ｍ−(ＣＨ３Ｏ＋２Ｈ２Ｏ)]
＋)。
ｍ,Ｈ３３,Ｈ２５およびＯ２ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ),
３.１４(３Ｈ,ｓおよびｍ,ＯＣＨ３およびＨ３９),３.
３４(３Ｈ,ｓ,ＯＣＨ３),３.３８(３Ｈ,ｓ,ＯＣＨ３),
４.６８(１Ｈ,ｍ,Ｈ４０),４.７２(１Ｈ,ブロードｓ,１
０−ＯＨ)；ＭＳ(ＦＡＢ）ｍ／ｚ１０３６([Ｍ＋Ｎａ]
＋）,９８２([Ｍ−ＣＨ３Ｏ]＋),９６４([Ｍ−(ＣＨ３
Ｏ＋Ｈ２Ｏ)]＋),９４６([Ｍ−(ＣＨ３Ｏ＋２Ｈ２Ｏ)]
＋)。
【００１９】ｂ）４０−Ｏ−サクシンイミドオキシサク
シニル−ラパマイシンの製造 ＣＨ２Ｃｌ２８ml中の工程ａ）のラパマイシンヘミサク
シネート１２０mg(０.１１８mmol)、Ｅｔ３Ｎ１６.５μ
l(０.１１８mmol)およびＥＤＣ２２.７mg(０.１１８mmo
l)の撹拌した溶液に、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド１
３.６mg(０.１１８mmol)を加える。得られる混合物を１
８時間室温で撹拌し、酢酸エチルで希釈し、２回水で洗
浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過
し、減圧下濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマト
グラフィー(酢酸エチル)で精製し、４０−Ｏ−サクシン
イミドオキシサクシニル-ラパマイシ(即ち、前記反応II
の式III'で示される化合物)を白色泡状物として得、以
下の特異的スペクトル特性を示す:
シニル−ラパマイシンの製造 ＣＨ２Ｃｌ２８ml中の工程ａ）のラパマイシンヘミサク
シネート１２０mg(０.１１８mmol)、Ｅｔ３Ｎ１６.５μ
l(０.１１８mmol)およびＥＤＣ２２.７mg(０.１１８mmo
l)の撹拌した溶液に、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド１
３.６mg(０.１１８mmol)を加える。得られる混合物を１
８時間室温で撹拌し、酢酸エチルで希釈し、２回水で洗
浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過
し、減圧下濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマト
グラフィー(酢酸エチル)で精製し、４０−Ｏ−サクシン
イミドオキシサクシニル-ラパマイシ(即ち、前記反応II
の式III'で示される化合物)を白色泡状物として得、以
下の特異的スペクトル特性を示す:
【００２０】１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ)δ２.６７(２Ｈ,
ｔ,Ｏ２ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２),２.８１(７Ｈ,ｓ,ＣＨ
３ＯおよびサクシンイミドＣＨ２),２.９２(２Ｈ,ｔ,Ｏ
２ＣＣＨ ２ＣＨ２ＣＯ２),４.５５(１Ｈ,ｍ,Ｈ４０),
５.２６(１Ｈ,ｄ,２８−ＯＨ),６.４３(１Ｈ,ｓ,１０−
ＯＨ)；ＭＳ(ＦＡＢ)ｍ／ｚ１１３３([Ｍ＋Ｎａ]＋),１
１１１([Ｍ＋Ｈ]＋),１０９２([Ｍ−Ｈ２Ｏ]＋),１０７
９([Ｍ−ＣＨ３Ｏ]＋),１０６１([Ｍ−(ＣＨ３Ｏ＋Ｈ２
Ｏ)]＋),１０４３([Ｍ−(ＣＨ３Ｏ＋２Ｈ２Ｏ)]＋)。
ｔ,Ｏ２ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２),２.８１(７Ｈ,ｓ,ＣＨ
３ＯおよびサクシンイミドＣＨ２),２.９２(２Ｈ,ｔ,Ｏ
２ＣＣＨ ２ＣＨ２ＣＯ２),４.５５(１Ｈ,ｍ,Ｈ４０),
５.２６(１Ｈ,ｄ,２８−ＯＨ),６.４３(１Ｈ,ｓ,１０−
ＯＨ)；ＭＳ(ＦＡＢ)ｍ／ｚ１１３３([Ｍ＋Ｎａ]＋),１
１１１([Ｍ＋Ｈ]＋),１０９２([Ｍ−Ｈ２Ｏ]＋),１０７
９([Ｍ−ＣＨ３Ｏ]＋),１０６１([Ｍ−(ＣＨ３Ｏ＋Ｈ２
Ｏ)]＋),１０４３([Ｍ−(ＣＨ３Ｏ＋２Ｈ２Ｏ)]＋)。
【００２１】実施例２−ラパマイシンの２８−Ｏ−活性
化４０−Ｏ−誘導体の製造 ａ）４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン
の２８−Ｏ−ヘミサクシネート １０：１塩化メチレン−ピリジン２.２ml中の４０−Ｏ
−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン９５８mg(１.
００mmol)の撹拌した冷却(０℃)溶液に、アリルクロロ
ギ酸０.１６０ml(１.５０mmol)を加える。撹拌を０℃で
続け、ピリジン０.０８０ml(１.００mmol)およびアリル
クロロギ酸各０.０５３ml(０.５０mmol)を２回それぞれ
３および４時間後に加える。試薬の最後の添加の後、撹
拌を更に１時間続け、反応を１Ｍ水性炭酸水素ナトリウ
ムで停止させる。得られる混合物を３回酢酸エチルで抽
出する。有機相を連続して１Ｎ水性塩酸、１Ｎ水性炭酸
水素ナトリウムおよび飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥し、濾過して減圧下濃縮する。残渣をシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー(５０：５０ヘキサ
ン−酢酸エチル)で精製し、アリルオキシカルボニル保
護化合物(上記反応IIIの式２)が白色泡状物として得ら
れる。
化４０−Ｏ−誘導体の製造 ａ）４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン
の２８−Ｏ−ヘミサクシネート １０：１塩化メチレン−ピリジン２.２ml中の４０−Ｏ
−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン９５８mg(１.
００mmol)の撹拌した冷却(０℃)溶液に、アリルクロロ
ギ酸０.１６０ml(１.５０mmol)を加える。撹拌を０℃で
続け、ピリジン０.０８０ml(１.００mmol)およびアリル
クロロギ酸各０.０５３ml(０.５０mmol)を２回それぞれ
３および４時間後に加える。試薬の最後の添加の後、撹
拌を更に１時間続け、反応を１Ｍ水性炭酸水素ナトリウ
ムで停止させる。得られる混合物を３回酢酸エチルで抽
出する。有機相を連続して１Ｎ水性塩酸、１Ｎ水性炭酸
水素ナトリウムおよび飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥し、濾過して減圧下濃縮する。残渣をシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー(５０：５０ヘキサ
ン−酢酸エチル)で精製し、アリルオキシカルボニル保
護化合物(上記反応IIIの式２)が白色泡状物として得ら
れる。
【００２２】塩化メチレン２ml中の本生産物２０８mg
(０.２００mmol)の撹拌した冷却(０℃)溶液に、ＤＭＡ
Ｐ２.４mg(０.０２０mmol)およびＤＣＣ８２mg(０.４０
０mmol)、続けて塩化メチレン０.５ml中のモノアリルサ
クシネート６３mg(０.４００mmol)の溶液を加える。反
応混合物を０℃で１４時間撹拌し、得られた懸濁液をフ
リットガラス漏斗で濾過した。有機溶液を減圧下濃縮
し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(３
０：７０ヘキサン−酢酸エチル)で精製し、白色泡状物
として生産物を得る(上記反応IIIの式３)。
(０.２００mmol)の撹拌した冷却(０℃)溶液に、ＤＭＡ
Ｐ２.４mg(０.０２０mmol)およびＤＣＣ８２mg(０.４０
０mmol)、続けて塩化メチレン０.５ml中のモノアリルサ
クシネート６３mg(０.４００mmol)の溶液を加える。反
応混合物を０℃で１４時間撹拌し、得られた懸濁液をフ
リットガラス漏斗で濾過した。有機溶液を減圧下濃縮
し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(３
０：７０ヘキサン−酢酸エチル)で精製し、白色泡状物
として生産物を得る(上記反応IIIの式３)。
【００２３】塩化メチレン５ml中の本生産物１７７mg
(０.１５０mmol)の撹拌した溶液に、テトラキス(トリフ
ェニルホスフィン)パラジウム１７.３mg(０.０１５mmo
l)およびトリブチリンハイドライド０.０８０ml(０.３m
mol)を加える。黄色溶液を２時間環境温度で撹拌し、酢
酸エチルで希釈し、１回冷２Ｎ水性クエン酸および３回
飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾
過し、減圧下濃縮する。シリカゲルカラムクロマトグラ
フィー(８５：１５酢酸エチル−メタノール)は、ヘミサ
クシネート(反応IIIの式４)を薄黄色油状物として提供
する。
(０.１５０mmol)の撹拌した溶液に、テトラキス(トリフ
ェニルホスフィン)パラジウム１７.３mg(０.０１５mmo
l)およびトリブチリンハイドライド０.０８０ml(０.３m
mol)を加える。黄色溶液を２時間環境温度で撹拌し、酢
酸エチルで希釈し、１回冷２Ｎ水性クエン酸および３回
飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾
過し、減圧下濃縮する。シリカゲルカラムクロマトグラ
フィー(８５：１５酢酸エチル−メタノール)は、ヘミサ
クシネート(反応IIIの式４)を薄黄色油状物として提供
する。
【００２４】ｂ）２８−Ｏ−サクシンイミドオキシサク
シニル−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイ
シン 塩化メチレン２.５ml中の工程ａ）のヘミサクシネート
５３mg(０.０５０mmol)の溶液を、ＤＭＡＰ２mg、ＥＤ
Ｃ２４mg(０.１２５mmol)およびＮ−ヒドロキシサクシ
ンイミド１４mg(０.１２５mmol)で処理する。２時間環
境温度で撹拌した後、反応を１Ｎ水性炭酸水素ナトリウ
ムで停止する。混合物を３回酢酸エチルで抽出する。有
機溶液を水性炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄
し、無水炭酸水素ナトリムで乾燥し、濾過し、濃縮して
標題活性化ハプテン(反応IIIの式５で示される化合物)
を得、それを更に精製することなく、タンパク質−ハプ
テン結合体の製造に使用し、以下の特異的スペクトル特
性を示す：
シニル−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイ
シン 塩化メチレン２.５ml中の工程ａ）のヘミサクシネート
５３mg(０.０５０mmol)の溶液を、ＤＭＡＰ２mg、ＥＤ
Ｃ２４mg(０.１２５mmol)およびＮ−ヒドロキシサクシ
ンイミド１４mg(０.１２５mmol)で処理する。２時間環
境温度で撹拌した後、反応を１Ｎ水性炭酸水素ナトリウ
ムで停止する。混合物を３回酢酸エチルで抽出する。有
機溶液を水性炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄
し、無水炭酸水素ナトリムで乾燥し、濾過し、濃縮して
標題活性化ハプテン(反応IIIの式５で示される化合物)
を得、それを更に精製することなく、タンパク質−ハプ
テン結合体の製造に使用し、以下の特異的スペクトル特
性を示す：
【００２５】１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ２.４３(１Ｈ,
ｄｄ,Ｈ３３ａ),２.５０−２.９８(１０Ｈ,ｍ,Ｈ２５,
Ｈ３３ｂ,サクシネート水素,サクシンイミド水素),３.
５８(２Ｈ,ｍ,Ｈ６ｂ,１ヒドロキシエチルＨ),３.６８
(３Ｈ,ｍ,Ｈ１６,２ヒドロキシエチルＨ),３.８１(２
Ｈ,ｍ,Ｈ１４,１ヒドロキシエチルＨ),３.９３(１Ｈ,
ｄ,Ｈ２７),５.２８(２Ｈ,ｍ,Ｈ２,Ｈ３０),５.３４(１
Ｈ,ｄ,Ｈ２８)；ＭＳ(ＦＡＢ)１１６１([Ｍ＋Ｌ
ｉ]＋)。
ｄｄ,Ｈ３３ａ),２.５０−２.９８(１０Ｈ,ｍ,Ｈ２５,
Ｈ３３ｂ,サクシネート水素,サクシンイミド水素),３.
５８(２Ｈ,ｍ,Ｈ６ｂ,１ヒドロキシエチルＨ),３.６８
(３Ｈ,ｍ,Ｈ１６,２ヒドロキシエチルＨ),３.８１(２
Ｈ,ｍ,Ｈ１４,１ヒドロキシエチルＨ),３.９３(１Ｈ,
ｄ,Ｈ２７),５.２８(２Ｈ,ｍ,Ｈ２,Ｈ３０),５.３４(１
Ｈ,ｄ,Ｈ２８)；ＭＳ(ＦＡＢ)１１６１([Ｍ＋Ｌ
ｉ]＋)。
【００２６】実施例３−２８−Ｏ−活性化ラパマイシン
の製造 ａ）ラパマイシンの２８−Ｏヘミサクシネート １０：１塩化メチレン−ピリジン２.２ml中のラパマイ
シン９１４mg(１.００mmol)の撹拌した冷却(０℃)溶液
に、クロロギ酸アリル０.２１２ml(２.００mmol)を加え
る。３時間後、ピリジン０.０８０ml(１.０００mmol)お
よびクロロギ酸アリル０.０５３ml(０.５０mmol)を加え
る。撹拌を更に１時間続け、反応を１Ｍ水性炭酸水素ナ
トリウムで停止する。得られる混合物を３回メチル−ｔ
−ブチルエーテルで抽出する。有機溶液を連続して冷１
Ｎ水性塩酸、１Ｎ水性炭酸水素ナトリウムおよび飽和食
塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、
減圧下濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィー(７０：３０ヘキサン−酢酸エチル)で精製し、ア
リルオキシカルボニル保護化合物(反応IVの式２)が白色
泡状物として得られる。
の製造 ａ）ラパマイシンの２８−Ｏヘミサクシネート １０：１塩化メチレン−ピリジン２.２ml中のラパマイ
シン９１４mg(１.００mmol)の撹拌した冷却(０℃)溶液
に、クロロギ酸アリル０.２１２ml(２.００mmol)を加え
る。３時間後、ピリジン０.０８０ml(１.０００mmol)お
よびクロロギ酸アリル０.０５３ml(０.５０mmol)を加え
る。撹拌を更に１時間続け、反応を１Ｍ水性炭酸水素ナ
トリウムで停止する。得られる混合物を３回メチル−ｔ
−ブチルエーテルで抽出する。有機溶液を連続して冷１
Ｎ水性塩酸、１Ｎ水性炭酸水素ナトリウムおよび飽和食
塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、
減圧下濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィー(７０：３０ヘキサン−酢酸エチル)で精製し、ア
リルオキシカルボニル保護化合物(反応IVの式２)が白色
泡状物として得られる。
【００２７】塩化メチレン５ml中の本生産物４００mg
(０.４００mmol)の撹拌した冷却(０℃)溶液にＤＭＡＰ
４.８mg(０.０４０mmol)およびＤＣＣ１６４mg(０.８０
０mmol)、続いて塩化メチレン１ml中のモノアリルサク
シネート１２７mg(０.８００mmol)の溶液を加える。反
応混合物を−１５℃で１４時間撹拌し、得られた懸濁液
をフリットガラス漏斗で濾過する。有機溶液を減圧下濃
縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(４
０：６０ヘキサン−メチル−ｔ−ブチルエーテル)で精
製し、反応IVの式３を白色泡状物として得る。
(０.４００mmol)の撹拌した冷却(０℃)溶液にＤＭＡＰ
４.８mg(０.０４０mmol)およびＤＣＣ１６４mg(０.８０
０mmol)、続いて塩化メチレン１ml中のモノアリルサク
シネート１２７mg(０.８００mmol)の溶液を加える。反
応混合物を−１５℃で１４時間撹拌し、得られた懸濁液
をフリットガラス漏斗で濾過する。有機溶液を減圧下濃
縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(４
０：６０ヘキサン−メチル−ｔ−ブチルエーテル)で精
製し、反応IVの式３を白色泡状物として得る。
【００２８】塩化メチレン５ml中の本生産物２８５mg
(０.２５０mmol)の撹拌した溶液に、テトラキス(トリフ
ェニルホスフィン)パラジウム２８.８mg(０.０２５mmo
l)およびトリブチルチンハイドライド０.１３３ml(０.
５mmol)を加える。黄色溶液を１時間環境温度で撹拌
し、メチル−ｔ−ブチルエーテルで希釈し、冷２Ｎ水性
クエン酸および３回飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナト
リウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮する。シリカゲル
カラムクロマトグラフィー(９０：１０−６０：４０メ
チル−ｔ−ブチルエーテル−メタノール)により、薄黄
色油状物として２８−Ｏラパマイシンヘミサクシネート
(反応IV、式４の化合物)が得られる。
(０.２５０mmol)の撹拌した溶液に、テトラキス(トリフ
ェニルホスフィン)パラジウム２８.８mg(０.０２５mmo
l)およびトリブチルチンハイドライド０.１３３ml(０.
５mmol)を加える。黄色溶液を１時間環境温度で撹拌
し、メチル−ｔ−ブチルエーテルで希釈し、冷２Ｎ水性
クエン酸および３回飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナト
リウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮する。シリカゲル
カラムクロマトグラフィー(９０：１０−６０：４０メ
チル−ｔ−ブチルエーテル−メタノール)により、薄黄
色油状物として２８−Ｏラパマイシンヘミサクシネート
(反応IV、式４の化合物)が得られる。
【００２９】ｂ）２８−Ｏ−サクインイミドオキシサク
シニル−ラパマイシン 塩化メチレン２ml中の工程ａ）の生産物５１mg(０.０５
０mmol)の溶液をＤＭＡＰ２mg、ＥＤＣ２４mg(０.１２
５mmol)およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド１４mg
(０.１２５mmol)で処理する。４時間環境温度で撹拌し
た後、反応を１Ｎ水性炭酸水素ナトリウムで停止する。
混合物をメチル−ｔ−ブチルエーテルで３回抽出する。
有機溶液を水性炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄
し、無水炭酸水素ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し
て、活性化標題混合物を得、それを更に精製することな
くタンパク質−ハプテン結合体の製造に使用し、それは
以下の特異的スペクトル特性を示す：
シニル−ラパマイシン 塩化メチレン２ml中の工程ａ）の生産物５１mg(０.０５
０mmol)の溶液をＤＭＡＰ２mg、ＥＤＣ２４mg(０.１２
５mmol)およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド１４mg
(０.１２５mmol)で処理する。４時間環境温度で撹拌し
た後、反応を１Ｎ水性炭酸水素ナトリウムで停止する。
混合物をメチル−ｔ−ブチルエーテルで３回抽出する。
有機溶液を水性炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄
し、無水炭酸水素ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し
て、活性化標題混合物を得、それを更に精製することな
くタンパク質−ハプテン結合体の製造に使用し、それは
以下の特異的スペクトル特性を示す：
【００３０】１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ２.４３(１Ｈ,
ｄｄ,Ｈ３３ａ),２.５５−３.０２(１１Ｈ,ｍ,Ｈ２５,
Ｈ３３ｂ,Ｈ３９,サクシネート水素、サクシンイミド水
素),３.５６(１Ｈ,ｍ,Ｈ６ｂ),３.６８(１Ｈ,ｄｄ,Ｈ１
６),３.８３(１Ｈ,ｍ,Ｈ１４),３.９３(１Ｈ,ｄ,Ｈ２
７),５.２８(２Ｈ,ｍ,Ｈ２,Ｈ３０),５.３４(１Ｈ,ｄ,
Ｈ２８)；ＭＳ(ＦＡＢ)１１１７([Ｍ＋Ｌｉ]＋)。
ｄｄ,Ｈ３３ａ),２.５５−３.０２(１１Ｈ,ｍ,Ｈ２５,
Ｈ３３ｂ,Ｈ３９,サクシネート水素、サクシンイミド水
素),３.５６(１Ｈ,ｍ,Ｈ６ｂ),３.６８(１Ｈ,ｄｄ,Ｈ１
６),３.８３(１Ｈ,ｍ,Ｈ１４),３.９３(１Ｈ,ｄ,Ｈ２
７),５.２８(２Ｈ,ｍ,Ｈ２,Ｈ３０),５.３４(１Ｈ,ｄ,
Ｈ２８)；ＭＳ(ＦＡＢ)１１１７([Ｍ＋Ｌｉ]＋)。
【００３１】実施例４−免疫原性結合体の製造
ａ）４０−Ｏ−架橋ラパマイシン結合体
実施例１の４０−Ｏ−活性化ラパマイシン１７.４mgを
ＤＭＦまたはＤＭＳＯ４００μlに溶解する。本溶液１
２０μl(即ち活性化ラパマイシン５.２２mgを含む)を
０.１Ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液(ｐＨ７.７)２ml中のＫＬ
Ｈ８mgを含む激しく撹拌した溶液に滴下する。反応混合
物を室温で２時間撹拌し、得られるラパマイシン−ＫＬ
Ｈ結合体を４℃でＰＢＳ５ｌ、３×に対して４８時間に
わたって透析して精製する。本結合体を、所望により、
マイクロコンセントレーター管を使用した遠心により更
に濃縮する。ラパマイシン−ＢＳＡおよびラパマイシン
−ＯＶＡ結合体は、上記方法のＫＬＨをそれぞれＢＳＡ
およびＯＶＡに変えて同様の方法で製造する。
ＤＭＦまたはＤＭＳＯ４００μlに溶解する。本溶液１
２０μl(即ち活性化ラパマイシン５.２２mgを含む)を
０.１Ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液(ｐＨ７.７)２ml中のＫＬ
Ｈ８mgを含む激しく撹拌した溶液に滴下する。反応混合
物を室温で２時間撹拌し、得られるラパマイシン−ＫＬ
Ｈ結合体を４℃でＰＢＳ５ｌ、３×に対して４８時間に
わたって透析して精製する。本結合体を、所望により、
マイクロコンセントレーター管を使用した遠心により更
に濃縮する。ラパマイシン−ＢＳＡおよびラパマイシン
−ＯＶＡ結合体は、上記方法のＫＬＨをそれぞれＢＳＡ
およびＯＶＡに変えて同様の方法で製造する。
【００３２】ｂ）２８−Ｏ−架橋(所望により４０−Ｏ
−アルキル化)ラパマイシン結合体 実施例２の２８−Ｏ−活性化化合物５mgをＤＭＳＯ２ml
に溶解し、５０mMリン酸緩衝液(ｐＨ７.３)１ml中のＫ
ＬＨ５mgを含む激しく撹拌した溶液に滴下する。反応混
合物を室温で２時間撹拌し、得られる結合体を４℃でＰ
ＢＳ２ｌ、３×に対して４８時間にわたって透析して精
製する。ＢＳＡおよびＯＶＡとの結合体は、同様の方法
で製造する。実施例３の２８−Ｏ活性化化合物を使用し
て、同様の方法に従って、ラパマイシンはＫＬＨ、ＢＳ
ＡおよびＯＶＡと２８位で結合する。
−アルキル化)ラパマイシン結合体 実施例２の２８−Ｏ−活性化化合物５mgをＤＭＳＯ２ml
に溶解し、５０mMリン酸緩衝液(ｐＨ７.３)１ml中のＫ
ＬＨ５mgを含む激しく撹拌した溶液に滴下する。反応混
合物を室温で２時間撹拌し、得られる結合体を４℃でＰ
ＢＳ２ｌ、３×に対して４８時間にわたって透析して精
製する。ＢＳＡおよびＯＶＡとの結合体は、同様の方法
で製造する。実施例３の２８−Ｏ活性化化合物を使用し
て、同様の方法に従って、ラパマイシンはＫＬＨ、ＢＳ
ＡおよびＯＶＡと２８位で結合する。
【００３３】実施例５−モノクローナル抗体の製造
ａ）ラパマイシンに対するモノクローナル抗体
モノクローナル抗体を、本質的にケーラーおよびミルス
タインら、Nature256:49に記載の方法に従って既知の技
術を使用して、製造する。雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス(２０
−２５ｇ)は、各々、フロインド完全アジュバント０.２
ml中の実施例４ａ）の４０−Ｏ−架橋ラパマイシン−Ｋ
ＬＨ免疫原性結合体１０または５０μgを、４カ所に皮
下注射により投与される。２週間後、フロインド不完全
アジュバント０.２mlに乳化した同量の免疫原性結合体
を含む２回目のブースター注射を、再び皮下注射により
投与する。動物血清中の抗原に対して反応性の抗体の存
在は、下記実施例６に記載の直接ＥＬＩＳＡにより確認
する。マウスは、所望により、エフェクター領域(ＦＫ
−５０６との低い交差反応性)およびＦＫＢＰ結合領域
(ＦＫ−５０６との高い交差反応性)に対する抗体につい
て更に選択し得る。例えば、図１は、ラパマイシン結合
ドメインに対する高濃度の抗体を有するマウス(Ｍ１)お
よびエフェクタードメインに対する相対的に高い濃度の
抗体を有する他のマウス(Ｍ７)の力価曲線を示す。好適
な特異性の抗体の最大血清濃度を示すマウスは、抗原１
０μgを半分腹腔内および半分静脈内で−３日、静脈内
で−２日および−１日にブースター注射を受ける。０日
において、マウスを屠殺し、その脾臓細胞を単離し、Ｐ
ＡＩ−０細胞または他の好適なミエローマ系と融合す
る。得られるハイブリドーマを培養し、ＥＬＩＳＡを使
用して、ラパマイシンに高親和性を有する抗体の発現に
ついて選択する。
タインら、Nature256:49に記載の方法に従って既知の技
術を使用して、製造する。雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス(２０
−２５ｇ)は、各々、フロインド完全アジュバント０.２
ml中の実施例４ａ）の４０−Ｏ−架橋ラパマイシン−Ｋ
ＬＨ免疫原性結合体１０または５０μgを、４カ所に皮
下注射により投与される。２週間後、フロインド不完全
アジュバント０.２mlに乳化した同量の免疫原性結合体
を含む２回目のブースター注射を、再び皮下注射により
投与する。動物血清中の抗原に対して反応性の抗体の存
在は、下記実施例６に記載の直接ＥＬＩＳＡにより確認
する。マウスは、所望により、エフェクター領域(ＦＫ
−５０６との低い交差反応性)およびＦＫＢＰ結合領域
(ＦＫ−５０６との高い交差反応性)に対する抗体につい
て更に選択し得る。例えば、図１は、ラパマイシン結合
ドメインに対する高濃度の抗体を有するマウス(Ｍ１)お
よびエフェクタードメインに対する相対的に高い濃度の
抗体を有する他のマウス(Ｍ７)の力価曲線を示す。好適
な特異性の抗体の最大血清濃度を示すマウスは、抗原１
０μgを半分腹腔内および半分静脈内で−３日、静脈内
で−２日および−１日にブースター注射を受ける。０日
において、マウスを屠殺し、その脾臓細胞を単離し、Ｐ
ＡＩ−０細胞または他の好適なミエローマ系と融合す
る。得られるハイブリドーマを培養し、ＥＬＩＳＡを使
用して、ラパマイシンに高親和性を有する抗体の発現に
ついて選択する。
【００３４】ｂ）４０−(ヒドロキシエチル)−ラパマイ
シンに対するモノクローナル抗体 雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、フロインド完全アジュバンド
０.２ml中の４０−(ヒドロキシエチル)−ラパマイシン
ＫＬＨ免疫原性結合体１０または５０μgを、皮下注射
により４カ所に投与される。２週間後、フロインド不完
全アジュバント０.２mlに乳化した同量の免疫原性結合
体を含む２回目の注射(ブースター)を、再び皮下注射に
より投与する。動物血清中の抗原に対して反応性の抗体
の存在を、下記の直接ＥＬＩＳＡにより試験する。加え
て、マウスは、ＢＳＡ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエ
チル)−ラパマイシンの結合体よりもＢＳＡ−ラパマイ
シンの結合体に結合することにより４０−Ｏ領域が修飾
されたラパマイシン分子の領域に対する抗体を選択し得
る。４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン
結合体に結合するが、ラパマイシン結合体に結合しない
抗体および４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマ
イシンおよびラパマイシン結合体の両方に結合する抗体
の両方が得られる。好適な特異性の抗体の最大血清濃度
を示すマウスは、抗原１０μgを半分腹腔内および半分
静脈内で、−３日、静脈内で−２日および−１日にブー
スター注射を受ける。０日において、マウスを屠殺し、
その脾臓細胞を単離し、ＰＡＩ−０細胞と融合する。得
られるハイブリドーマを培養し、ＥＬＩＳＡを使用し
て、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン
に高親和性を有する抗体の発現について選択する。
シンに対するモノクローナル抗体 雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、フロインド完全アジュバンド
０.２ml中の４０−(ヒドロキシエチル)−ラパマイシン
ＫＬＨ免疫原性結合体１０または５０μgを、皮下注射
により４カ所に投与される。２週間後、フロインド不完
全アジュバント０.２mlに乳化した同量の免疫原性結合
体を含む２回目の注射(ブースター)を、再び皮下注射に
より投与する。動物血清中の抗原に対して反応性の抗体
の存在を、下記の直接ＥＬＩＳＡにより試験する。加え
て、マウスは、ＢＳＡ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエ
チル)−ラパマイシンの結合体よりもＢＳＡ−ラパマイ
シンの結合体に結合することにより４０−Ｏ領域が修飾
されたラパマイシン分子の領域に対する抗体を選択し得
る。４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン
結合体に結合するが、ラパマイシン結合体に結合しない
抗体および４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマ
イシンおよびラパマイシン結合体の両方に結合する抗体
の両方が得られる。好適な特異性の抗体の最大血清濃度
を示すマウスは、抗原１０μgを半分腹腔内および半分
静脈内で、−３日、静脈内で−２日および−１日にブー
スター注射を受ける。０日において、マウスを屠殺し、
その脾臓細胞を単離し、ＰＡＩ−０細胞と融合する。得
られるハイブリドーマを培養し、ＥＬＩＳＡを使用し
て、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン
に高親和性を有する抗体の発現について選択する。
【００３５】実施例６−固相酵素免疫測定法(ＥＬＩＳ
Ａ) ａ）ラパマイシンのＥＬＩＳＡ マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の１−２μg／m
lラパマイシン−ＢＳＡ結合体で２時間３７℃で被覆
し、次いでＰＢＳ中の２％ＢＳＡで飽和し、０.０５％
ツイン−ＰＢＳで３×洗浄する。スクリーニングすべき
ハイブリドーマ上清をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液で希釈
し、一晩室温(または１８時間４℃または３７℃２時間)
でインキュベーションする。結合抗体の濃度を、基質と
してのパラ−ニトロフェニルホスフェートと一緒にアル
カリホスファターゼが結合した抗−マウスＩｇＧヤギグ
ロブリンにより測定する。３７℃で２時間インキュベー
ションした後、酵素基質を加水分解(１時間室温)し、４
０５nmの吸光度を測定する。ハイブリドーマを、高親和
性モノクローナル抗体の産生に対して選択する。
Ａ) ａ）ラパマイシンのＥＬＩＳＡ マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の１−２μg／m
lラパマイシン−ＢＳＡ結合体で２時間３７℃で被覆
し、次いでＰＢＳ中の２％ＢＳＡで飽和し、０.０５％
ツイン−ＰＢＳで３×洗浄する。スクリーニングすべき
ハイブリドーマ上清をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液で希釈
し、一晩室温(または１８時間４℃または３７℃２時間)
でインキュベーションする。結合抗体の濃度を、基質と
してのパラ−ニトロフェニルホスフェートと一緒にアル
カリホスファターゼが結合した抗−マウスＩｇＧヤギグ
ロブリンにより測定する。３７℃で２時間インキュベー
ションした後、酵素基質を加水分解(１時間室温)し、４
０５nmの吸光度を測定する。ハイブリドーマを、高親和
性モノクローナル抗体の産生に対して選択する。
【００３６】選択した抗体のラパマイシンに対する相対
的親和性を決定するための標準曲線は、既知の濃度のラ
パマイシン(例えば、血清中１から１４０ng／ml)を含む
溶液を使用して調製する。例えば、図２は、我々のモノ
クローナル抗体Ｍ７−９１の標準曲線を示し、ラパマイ
シンに非常に特異的であるとして選択したモノクローナ
ル抗体が、濃度が０.２５ng／mlほど低くてもラパマイ
シンを検出可能であることを証明する。
的親和性を決定するための標準曲線は、既知の濃度のラ
パマイシン(例えば、血清中１から１４０ng／ml)を含む
溶液を使用して調製する。例えば、図２は、我々のモノ
クローナル抗体Ｍ７−９１の標準曲線を示し、ラパマイ
シンに非常に特異的であるとして選択したモノクローナ
ル抗体が、濃度が０.２５ng／mlほど低くてもラパマイ
シンを検出可能であることを証明する。
【００３７】抗体は、更に、ラパマイシン−ＢＳＡ結合
体と同様に製造できるＦＫ−５０６−ＢＳＡ結合体で被
覆したマイクロタイタープレートを使用した類似の直接
ＥＬＩＳＡでＦＫ−５０６との交差反応性を測定するこ
とにより、ラパマイシンのエフェクターまたはＦＫＢＰ
結合ドメインに結合するものとして特徴付け得る。例え
ば、１７個の選択したモノクローナル抗体のラパマイシ
ン−ＢＳＡおよびＦＫ−５０６検定における比較を図３
に示す；パーセントとしての交差反応性は図４に示す。
このラパマイシン−ＢＳＡ対ＦＫ−５０６−ＢＳＡの結
合の比較において、非常に低い親和性のモノクローナル
抗体が検出される。
体と同様に製造できるＦＫ−５０６−ＢＳＡ結合体で被
覆したマイクロタイタープレートを使用した類似の直接
ＥＬＩＳＡでＦＫ−５０６との交差反応性を測定するこ
とにより、ラパマイシンのエフェクターまたはＦＫＢＰ
結合ドメインに結合するものとして特徴付け得る。例え
ば、１７個の選択したモノクローナル抗体のラパマイシ
ン−ＢＳＡおよびＦＫ−５０６検定における比較を図３
に示す；パーセントとしての交差反応性は図４に示す。
このラパマイシン−ＢＳＡ対ＦＫ−５０６−ＢＳＡの結
合の比較において、非常に低い親和性のモノクローナル
抗体が検出される。
【００３８】上記の直接ＥＬＩＳＡは、コンペティター
を、モノクローナル抗体溶液に加え、競合物質存在下お
よび非存在下でのモノクローナル抗体の結合体への結合
を測定する競合的ＥＬＩＳＡに変え得る。競合物質ーが
ＦＫ−５０６またはラパマイシンである場合、例えば１
mg／mlのエタノール性溶液中の競合物質をモノクローナ
ル抗体溶液に直接加え(例えば２μl／２００μl／ウェ
ル)、マイクロタイタープレート中で更に希釈する。例
えば図５は、異なった濃度の遊離ラパマイシンの存在下
でのＭ７−９１抗体(Ｍ７.９１.１３)のＢＳＡ−ラパマ
イシンへの結合の阻害曲線を示す。このようなモノクロ
ーナル抗体の遊離ＦＫ−５０６対遊離ラパマイシンへの
結合を比較する競合的ＥＬＩＳＡにおいて、ラパマイシ
ンおよびＦＫ−５０６の間の直接ＥＬＩＳＡよりも低い
交差反応性が見られる。あるモノクローナル抗体が、遊
離形のその抗原に結合するには低すぎる親和性を有する
が、それにもかかわらず巨大タンパク質分子上で違いに
緊密に近接して結合した多くのハプテンから成る多量体
抗原への二価または多価結合を示すと信じられているた
め、このような競合的検定はモノクローナル抗体の選択
に好ましい。競合的検定は、このような低親和性抗体を
除外する。このような競合的検定の結果を図６に示し、
それは、相対的に低い交差親和性を有するＭ７−９１抗
体(Ｍ７.９１.１３)と、相対的に高い交差反応性を有す
るＭ１−３０３(Ｍ１.３０３.３)を比較する。
を、モノクローナル抗体溶液に加え、競合物質存在下お
よび非存在下でのモノクローナル抗体の結合体への結合
を測定する競合的ＥＬＩＳＡに変え得る。競合物質ーが
ＦＫ−５０６またはラパマイシンである場合、例えば１
mg／mlのエタノール性溶液中の競合物質をモノクローナ
ル抗体溶液に直接加え(例えば２μl／２００μl／ウェ
ル)、マイクロタイタープレート中で更に希釈する。例
えば図５は、異なった濃度の遊離ラパマイシンの存在下
でのＭ７−９１抗体(Ｍ７.９１.１３)のＢＳＡ−ラパマ
イシンへの結合の阻害曲線を示す。このようなモノクロ
ーナル抗体の遊離ＦＫ−５０６対遊離ラパマイシンへの
結合を比較する競合的ＥＬＩＳＡにおいて、ラパマイシ
ンおよびＦＫ−５０６の間の直接ＥＬＩＳＡよりも低い
交差反応性が見られる。あるモノクローナル抗体が、遊
離形のその抗原に結合するには低すぎる親和性を有する
が、それにもかかわらず巨大タンパク質分子上で違いに
緊密に近接して結合した多くのハプテンから成る多量体
抗原への二価または多価結合を示すと信じられているた
め、このような競合的検定はモノクローナル抗体の選択
に好ましい。競合的検定は、このような低親和性抗体を
除外する。このような競合的検定の結果を図６に示し、
それは、相対的に低い交差親和性を有するＭ７−９１抗
体(Ｍ７.９１.１３)と、相対的に高い交差反応性を有す
るＭ１−３０３(Ｍ１.３０３.３)を比較する。
【００３９】ｂ）４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−
ラパマイシンのＥＬＩＳＡ 本ＥＬＩＳＡは、ａ）に記載の方法と同様に行う。マイ
クロタイタープレートをマイクロタイタープレートを、
４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−Ｂ
ＳＡで被覆し、次いでＢＳＡで飽和し、洗浄する。スク
リーニングすべきハイブリドーマ上清を１８時間４℃、
または２時間３７℃でインキュベーションする。結合抗
体の濃度を、基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフ
ェートを伴ったアルカリホスファターゼが結合した抗−
マウスＩｇＧヤギグロブリンで測定する。平衡ＥＬＩＳ
Ａを、結合ラパマイシン−ＢＳＡを使用して行い、４０
−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンをラパマ
イシンと分けることができるモノクローナル抗体を選択
する。例えば図７は、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチ
ル)−ラパマイシン−ＢＳＡ(図中ではＢＳＡ−２８−Ｒ
ＡＤと呼ぶ)へ特異的に結合するハイブリドーマＢ３−
２０３(図７Ａ)、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−
ラパマイシン−ＢＳＡおよびラパマイシン−ＢＳＡ結合
体を２８位により認識するハイブリドーマＢ３−１１３
(図７Ｂ)および加えて４０位によりＢＳＡに結合したラ
パマイシンを認識するハイブリドーマＢ３−１６４(図
７Ｃ)の上清を示す。
ラパマイシンのＥＬＩＳＡ 本ＥＬＩＳＡは、ａ）に記載の方法と同様に行う。マイ
クロタイタープレートをマイクロタイタープレートを、
４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−Ｂ
ＳＡで被覆し、次いでＢＳＡで飽和し、洗浄する。スク
リーニングすべきハイブリドーマ上清を１８時間４℃、
または２時間３７℃でインキュベーションする。結合抗
体の濃度を、基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフ
ェートを伴ったアルカリホスファターゼが結合した抗−
マウスＩｇＧヤギグロブリンで測定する。平衡ＥＬＩＳ
Ａを、結合ラパマイシン−ＢＳＡを使用して行い、４０
−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンをラパマ
イシンと分けることができるモノクローナル抗体を選択
する。例えば図７は、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチ
ル)−ラパマイシン−ＢＳＡ(図中ではＢＳＡ−２８−Ｒ
ＡＤと呼ぶ)へ特異的に結合するハイブリドーマＢ３−
２０３(図７Ａ)、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−
ラパマイシン−ＢＳＡおよびラパマイシン−ＢＳＡ結合
体を２８位により認識するハイブリドーマＢ３−１１３
(図７Ｂ)および加えて４０位によりＢＳＡに結合したラ
パマイシンを認識するハイブリドーマＢ３−１６４(図
７Ｃ)の上清を示す。
【００４０】抗体の４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)
−ラパマイシン対ラパマイシンへの相対的親和性を、被
覆４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−
ＢＳＡ結合体の、溶液中の４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ
エチル)−ラパマイシンまたは遊離ラパマイシンへの結
合を比較して更に測定する。例えば、図８は、ラパマイ
シンと低い交差反応性で４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエ
チル)−ラパマイシンと強く反応するハイブリドーマＢ
３−２０３により産生された抗体(図８Ａ)および４０−
Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンおよびラパ
マイシンと同等に結合するハイブリドーマＢ３−１１３
およびＢ３−１６４により産生された抗体(図８Ｂおよ
び８Ｃ)を示す。ラパマイシンと比較して、少なくとも
１０−１００倍４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラ
パマイシンに結合する抗体を産生する他のハイブリドー
マは、Ｂ３−２２、Ｂ３−１２７およびＢ３−１５６を
含む。Ｂ３−２９、Ｂ３−２６５およびＢ３−５３９の
ような他のハイブリドーマは、ラパマイシンおよび４０
−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンに結合す
る抗体を産生する。
−ラパマイシン対ラパマイシンへの相対的親和性を、被
覆４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−
ＢＳＡ結合体の、溶液中の４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ
エチル)−ラパマイシンまたは遊離ラパマイシンへの結
合を比較して更に測定する。例えば、図８は、ラパマイ
シンと低い交差反応性で４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエ
チル)−ラパマイシンと強く反応するハイブリドーマＢ
３−２０３により産生された抗体(図８Ａ)および４０−
Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンおよびラパ
マイシンと同等に結合するハイブリドーマＢ３−１１３
およびＢ３−１６４により産生された抗体(図８Ｂおよ
び８Ｃ)を示す。ラパマイシンと比較して、少なくとも
１０−１００倍４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラ
パマイシンに結合する抗体を産生する他のハイブリドー
マは、Ｂ３−２２、Ｂ３−１２７およびＢ３−１５６を
含む。Ｂ３−２９、Ｂ３−２６５およびＢ３−５３９の
ような他のハイブリドーマは、ラパマイシンおよび４０
−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンに結合す
る抗体を産生する。
【００４１】一度所望の抗体を選択したら、同じＥＬＩ
ＳＡを使用して、患者のラパマイシンの血中濃度を測定
する。本実施例の検定キットは、凍結乾燥形の１個また
はそれ以上の選択した抗体、ラパマイシン結合体(例え
ばラパマイシン−ＢＳＡ結合体または４０−Ｏ−(２−
ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−ＢＳＡ結合体)で被
覆したマイクロタイタープレート、ラパマイシン標準お
よび使用説明書を提供する。所望により、キットは、競
合検定に使用するための標識ラパマイシン誘導体を更に
含む。上記のような抗−マウスＩｇＧ−酵素結合体およ
び基質は、付加的に提供され得る。別法として、消費者
は、本発明のモノクローナル抗体を、彼ら自身が確立し
たＥＬＩＳＡまたは他の検定系中で使用し得る。
ＳＡを使用して、患者のラパマイシンの血中濃度を測定
する。本実施例の検定キットは、凍結乾燥形の１個また
はそれ以上の選択した抗体、ラパマイシン結合体(例え
ばラパマイシン−ＢＳＡ結合体または４０−Ｏ−(２−
ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−ＢＳＡ結合体)で被
覆したマイクロタイタープレート、ラパマイシン標準お
よび使用説明書を提供する。所望により、キットは、競
合検定に使用するための標識ラパマイシン誘導体を更に
含む。上記のような抗−マウスＩｇＧ−酵素結合体およ
び基質は、付加的に提供され得る。別法として、消費者
は、本発明のモノクローナル抗体を、彼ら自身が確立し
たＥＬＩＳＡまたは他の検定系中で使用し得る。
【図１】 ラパマイシン結合ドメインに対する高濃度の
抗体を有するマウス(Ｍ１)およびエフェクタードメイン
に対する相対的に高い濃度の抗体を有する他のマウス
(Ｍ７)の力価曲線を示すグラフである。
抗体を有するマウス(Ｍ１)およびエフェクタードメイン
に対する相対的に高い濃度の抗体を有する他のマウス
(Ｍ７)の力価曲線を示すグラフである。
【図２】 我々のモノクローナル抗体Ｍ７−９１の標準
曲線を示すグラフである。
曲線を示すグラフである。
【図３】 １７個の選択したモノクローナル抗体のラパ
マイシン−ＢＳＡおよびＦＫ−５０６検定における比較
を示すグラフである。
マイシン−ＢＳＡおよびＦＫ−５０６検定における比較
を示すグラフである。
【図４】 １７個の選択したモノクローナル抗体のラパ
マイシン−ＢＳＡおよびＦＫ−５０６検定における比較
を図３に示す；パーセントとしての交差反応性を示すグ
ラフである。
マイシン−ＢＳＡおよびＦＫ−５０６検定における比較
を図３に示す；パーセントとしての交差反応性を示すグ
ラフである。
【図５】 異なった濃度の遊離ラパマイシンの存在下で
のＭ７−９１抗体(Ｍ７.９１.１３)のＢＳＡ−ラパマイ
シンへの結合の阻害曲線を示すグラフである。
のＭ７−９１抗体(Ｍ７.９１.１３)のＢＳＡ−ラパマイ
シンへの結合の阻害曲線を示すグラフである。
【図６】 競合的検定の結果を示すグラフである。
【図７】 ４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマ
イシン−ＢＳＡ(図中ではＢＳＡ−２８−ＲＡＤと呼ぶ)
へ特異的に結合するハイブリドーマＢ３−２０３(図７
Ａ)、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシ
ン−ＢＳＡおよびラパマイシン−ＢＳＡ結合体を２８位
により認識するハイブリドーマＢ３−１１３(図７Ｂ)お
よび加えて４０位によりＢＳＡに結合したラパマイシン
を認識するハイブリドーマＢ３−１６４(図７Ｃ)の上清
の吸光度を示すグラフである。
イシン−ＢＳＡ(図中ではＢＳＡ−２８−ＲＡＤと呼ぶ)
へ特異的に結合するハイブリドーマＢ３−２０３(図７
Ａ)、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシ
ン−ＢＳＡおよびラパマイシン−ＢＳＡ結合体を２８位
により認識するハイブリドーマＢ３−１１３(図７Ｂ)お
よび加えて４０位によりＢＳＡに結合したラパマイシン
を認識するハイブリドーマＢ３−１６４(図７Ｃ)の上清
の吸光度を示すグラフである。
【図８】 ラパマイシンと低い交差反応性で４０−Ｏ−
(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンと強く反応する
ハイブリドーマＢ３−２０３により産生された抗体(図
８Ａ)および４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパ
マイシンおよびラパマイシンと同等に結合するハイブリ
ドーマＢ３−１１３およびＢ３−１６４により産生され
た抗体(図８Ｂおよび８Ｃ)の相対的親和性を示すグラフ
である。
(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンと強く反応する
ハイブリドーマＢ３−２０３により産生された抗体(図
８Ａ)および４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパ
マイシンおよびラパマイシンと同等に結合するハイブリ
ドーマＢ３−１１３およびＢ３−１６４により産生され
た抗体(図８Ｂおよび８Ｃ)の相対的親和性を示すグラフ
である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
// Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 GA03 HA15
4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13
4B065 AA92X AB05 AC14 BA08
CA25 CA46
4H045 AA11 BA50 DA76 EA50 FA72
Claims (6)
- 【請求項１】 ４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラ
パマイシンを認識できるモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラ
パマイシンのＦＫＢＰ−結合部分のエピトープを認識で
きる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 ａ)活性化結合基を有する４０−Ｏ−(２
−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンを免疫原性タンパ
ク質と反応させて免疫原性結合体を産生し、 ｂ)上記結合体を好適な動物種に投与して免疫化し、上
記結合体に感受性の抗体−産生細胞を回収し、 ｃ)上記抗体−産生細胞を不死化し、および ｄ)このように確立した不死化細胞系からモノクローナ
ル抗体を回収する：ことにより得たまたは得ることがで
きる、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 タンパク質を、活性化結合基を有する４
０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンと反応
させて産生される、免疫原性結合体。 - 【請求項５】 請求項１から３のいずれかに記載のモノ
クローナル抗体の産生が可能な、ハイブリドーマ細胞
系。 - 【請求項６】 請求項１から３のいずれかに記載のモノ
クローナル抗体を含む、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエ
チル)ラパマイシンの血中濃度測定のための免疫検定キ
ット。
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|---|---|---|---|
| GB939307491A GB9307491D0 (en) | 1993-04-08 | 1993-04-08 | Organic compounds |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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| JP2002130451A Expired - Lifetime JP4287619B2 (ja) | 1993-04-08 | 2002-05-02 | ラパマイシン検定 |
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|---|---|---|---|
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| BR (1) | BR9406210A (ja) |
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| HU (1) | HU221606B (ja) |
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| PL (1) | PL185855B1 (ja) |
| RU (1) | RU2175672C2 (ja) |
| SK (1) | SK280048B6 (ja) |
| WO (1) | WO1994024304A1 (ja) |
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