FI110670B

FI110670B - Rapamysiinimääritys

Info

Publication number: FI110670B
Application number: FI954319A
Authority: FI
Inventors: Richard Sedrani; Valerie Quesniaux
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1993-04-08
Filing date: 1995-09-14
Publication date: 2003-03-14
Also published as: EP0693132A1; HU221606B; PL185855B1; DE69407402D1; EP0693132B1; BR9406210A; US8039600B2; FI954319A; GB9307491D0; CN1080312C; JP2003024065A; JP2006249090A; NO953975L; KR100404162B1; FI954319A0; DK0693132T3; GR3025753T3; JP4287619B2; SK280048B6; JP2001302698A

Description

RAPAMYSIINIMÄÄRITYS - RAPAMYCINBESTÄMNING

1 11067u Tämä keksintö koskee rapamysiinin ja rapamy-siinijohdannaisten monoklonaalisia vasta-aineita, joita voidaan käyttää määrityskiteissä esimerkiksi veren 5 lääketasojen tarkkailemiseksi.

Rapamysiini on Streptomyces hyqroscopicus:en tuottama makrolidiantibiootti, jonka on havaittu olevan farmaseuttisesti käyttökelpoinen moneen käyttöön, erityisesti immuunivastetta vähentävänä lääkkeenä, 10 esim. käytettäväksi elinsiirtojen hylkimisreaktion ja autoimmuunisairauksien hoitoon ja estämiseen. Suurina annoksina rapamysiini kuitenkin antaa sivuvaikutuksia ja sillä on jossain määrin muuntuva hyötyosuus. Rapamysiinin veritasojen tarkkailu potilaissa, joita hoi-15 detaan rapamysiinillä, on siksi hyvin toivottava, jotta annostusta voidaan säädellä niin, että pystytään pitämään yllä farmakologista vaikutusta varten riittävä minimitaso ja välttämään sivuvaikutusten tarpeeton vaara. Herkän ja luotettavan kliinisessä miljöössä 20 nopeasti ja helposti tehtävän määrityksen puuttuminen on ollut pääeste rapamysiinin kehittymiselle lääkeaineena .

V Aikaisemmat yritykset kehittää määrityskitte- '* "· jä rapamysiinin kliinistä tarkkailua varten eivät ole 25 olleet erityisen onnistuneita. Esimerkiksi patentti- ··· julkaisussa EP 041795 on esitetty mikrobiologinen mää-

Iti* j ·/: ritys, jossa rapamysiinipitoisuus on mitattu antifun- ♦ * * *

.·*.·. gaalisen vaikutuksen funktiona. Patenttijulkaisussa WO

92/02946 on esitetty määritysjärjestelmä, jossa rapa-30 mysiinitasoja mitataan epäsuorasti mittaamalla kilpai-lu sitoutua makrofiliiniin. Kumpikin näistä määrityk-'·’ ' sistä on hankala käyttää eikä erityisen herkkä. Vielä- : ί : kin tärkeämpää on, että kummatkin määritykset voivat vaihdella huomattavasti vain vähän erilaisten tutki-35 musolosuhteiden aikana, mikä tekee eri sairaaloista ·*'*. saatavien koetulosten vertailemisen vaikeaksi.

2 110670

Ei ole olemassa mitään aikaisempaa raporttia rapamysiiniä tunnistavista monoklonaalisista vasta-aineista. On olemassa luontaisia vaikeuksia rapamysii-nin monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi 5 koska rapamysiini ei ole immunogeeninen ja on itsessään erittäin immuunivastetta vähentävä.

Lisäksi kun kirjallisuudessa ei ole kuvattu hyvin rapamysiinin metaboliittejä, on monoklonaalisten vasta-aineiden, joka pystyvät erottamaan rapamysiinin 10 ja sen metaboliitteja, tunnistaminen vaikeaa.

Esillä oleva keksintö tuo esiin monoklonaali-sia vasta-aineita jotka ovat hyvin herkkiä rapamysii-nille. Keksinnön mukaiset vasta-aineet tuotetaan vastavaikutuksena rokotukselle uudella immunogeenisella 15 konjugaatilla, joka sisältää rapamysiinin uuden joh dannaisen, joka on sidottu immunogeeniseen proteiiniin. Näitä vasta-aineita käyttävät määrityskitit soveltuvat hyvin käytettäväksi kliinisessä ympäristössä ja antavat hyvin paljon täsmällisempiä ja toistetta-20 vissa olevia tuloksia kuin mitä aikaisemmin on ollut mahdollista saada. Vasta-aineet ovat myös käyttökelpoisia rapamysiinin puhdistuksessa ja eristämisessä.

•t : Määritysjärjestelmien esiin tuominen immuuni- ”.·! vastetta vähentäviä rapamysiini johdannaisia varten 25 aiheuttaa samantapaisia haasteita. Erityisen kiinnos- tavia ovat rapamysiinin 40-0-johdannaiset, s.o. rapa-; ,·. mysiinit, joita on O-substituoitu hydroksissa syklo- « · t ”.j.* heksyylirenkaassa (paikassa 40), esim. esitetty pa- ' tenttijulkaisuissa US 5 258 389 ja PCT/EP 93/02604 (0- 30 aryyli- ja O-alkyylirapamysiinejä) (jotka molemmat '· liitetään tähän viitteenä); erityisesti 40-0- ‘ alkyloidut rapamysiinit, joissa 40-O-substituentti on alkyyli tai substituoitu alkyyli; esim. hydroksialkyy-li, hydroksialkoksialkyyli, asyyliaminoalkyyli tai 35 aminoalkyyli, jossa "alk"- tai "alkyyli" tarkoittaa

Ci.g-alkyyliä, haarautunutta tai suoraa, edullisesti C^-alkyyliä, jossa hiiliketju voi olla valinnaisesti 3 110670 katkaistu eetteri(-0-)sidoksella; erityisesti 40-0-(2-hydroksietyyli)rapamysiini, 40-0-(3-hydroksipropyy- 1i)rapamys i ini, 40-O-[2-(2-hydroks i)etoks i]etyyli- rapamysiini, ja 40-0-(2-asetaminoetyyli)rapamysiini).

5 Siten keksinnön toinen tarkoitus on tuoda esiin mo-noklonaalisia vasta-aineita tällaisille 40-O-johdan-naisille. Tällaiset vasta-aineet ovat käyttökelpoisia diagnostisissa määrityksissä sekä myöskin johdannaisten puhdistuksessa ja tuotannossa.

10 Uudet aktivoidut rapamysiinijohdannaiset, joita käytetään uusien vastustuskykyä tuottavien keksinnön mukaisten konjugaattien valmistamiseksi, ovat rapamysiinejä, jotka on sidottu yhden rapamysiinissä olevien hydroksiryhmien kautta, edullisesti hydroksi-15 ryhmän, joka sijaitsee rapamysiinin sykloheksyyliosas-sa (paikassa 40) tai hydroksin paikassa 28, aktivoituun kytkentäryhmään s.o. ryhmään, joka pystyy reagoimaan suoraan proteiinin kanssa kovalentin sidoksen muodostamiseksi ilman että vaaditaan kytkevän aineen 20 käyttämistä (esim. karbodi-imidireagenssia) tekemään mahdolliseksi, saamaan aikaan tai edistämään reaktiota proteiinin kanssa. Edullisesti aktivoidussa kytkentä-• ryhmässä on aktivoitu esteri- tai karboksiryhmä, s.o.

; jonka kaava on -C0-0-X, jossa X on karboksia aktivoiva 25 ryhmä kuten esim. o- tai p-nitrofenyyli, 1-bents- « triatsoli, pentaf luorifenyyli, tai (erityisesti) N- 4 11067ϋ siiniin toisessa päässä ja aktivoitunut esteri tai aktivoitunut karboksiryhmä toisessa päässä.

Keksinnön mukaiset edulliset rapamysiinijohdannaiset ovat kaavan III mukaisia ja niitä valmiste-5 taan reaktiokaavan I mukaisesti: no.

Cxi . V’—-.XX

10 _a)_ Oy®X“

sAo 0 "o'V ° "0'V

(I) (II) 15 —»— Ov^X»

V*0 ° so’V

20 . L» , 1 l^° °

Reaktiokaava I <III} . t 25 jossa kaava I on rapamysiini, jonka a) annetaan rea goida asyloivan aineen kanssa, esim. syklisen anhydri- ;··; din tai dikarboksyylihapon (valinnaisesti hemi-O- • * * ’···' : suojatussa muodossa) kanssa, sopivissa olosuhteissa ja V ' suojaus poistetaan jos tarpeellista kaavan II mukaisen 30 rapamysiinin saamiseksi, jossa Y on välikeosa, edulli-i : ; sesti alempi alkyleeni, esim. C2.6-alkyleeni, edulli- • i : simmin etyleeni. Tämä jälkeen tämä kaavan II mukainen rapamysiini b) aktivoidaan antamalla sen reagoida kar-boksiaktivoivalla ryhmällä, esim. sellaisella jolla on ‘ 35 kaava HO-X, jossa X on niin kuin edellä on määritetty, ;· aktivoidun rapamysiinin, jolla on kaava III, saamisek- ;··· si.

5 11067'.

Edullinen aktivoitu rapamysiinijohdannainen on sukkiini-imidojohdannainen, jolla on kaava III alla, joka on valmistettu reaktiokaavan II mukaisesti: π°γ> ' a) 10 ^^3° 3° (I) (II·) 15 O _ ---► 20 » i"i dii')

*,·, 25 Reaktiokaava II

* • » * jossa kaava I on rapamysiini, joka on a) O-asyloitu » » » ! käyttämällä sukkiinianhydridiä DMAP:n ja pyridiinin I 1 > ’·' ' läsnäollessa kaavan II' mukaisen rapamysiinihemisukki- 30 naatin (40-O-(3-karboksi)propanoyylirapamysiinin) val- ; mistamiseksi; joka tämän jälkeen b) aktivoidaan N- ' hydroksisukkiini-imidilla EDC:n, Et2N:n ja CH2Cl2:n ..· läsnäollessa kaavan III' mukaisen 40-O-sukkiini-imido- t « * i » * oksisukkinyylirapamysiinin valmistamiseksi, esim. niin k * 35 kuin on esitetty tarkemmin esimerkissä 1 alla. Mo- noklonaaliset vasta-aineet, joita valmistetaan käyttä-mällä hapteenia, kuten esim. sellaiset, joita on si- 6 110670 dottu 40-aseman kautta ovat tavallisesti ristireaktii-visia rapamysiinin ja rapamysiinin 40-0-johdannaisen kanssa sellaisen, joka on esitetty edellä. Sellaiset monoklonaaliset vasta-aineet voidaan valita niin kuin 5 alla on esitetty yhdisteitä varten, jotka tunnistavat rapamysiinin erityisen alueen tai rapamysiinin 40-0-johdannaisen, esim. sitovalla domeenilla tai vaikuttavalla domeenilla niin kuin alla on esitetty.

Joissakin tapauksissa on toivottavaa saada 10 monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on suuri herkkyys modifikaatioille sykloheksyylialueella, esim. rapamysiinin ja 4O-O-rapamysiinijohdannaisten erottamiseksi, tai metaboliittien identifioimiseksi sykloheksyylialueella. Sellaisessa tapauksessa hapteeni on 15 edullisesti sidottu 28-O-paikan kautta ennemmin kuin 40-O-paikan kautta. Esimerkiksi rapamysiinin, jolla on kaava A: 0¾.

L J^O O JUoH

25 Ν γ | • Y °Y^O ° O-'V0

* Kaava A

roksialkoksialkyyli, asyyliaminoalkyyli, tai aminoal- 35 jossa R on 0-suojaava ryhmä tai substituentti niin ·;’ kuin edellä on esitetty, esim. hydroksialkyyli, hyd- » 7 1 10671: kyyli, valinnaisesti suojatussa muodossa, annetaan reagoida reaktiokaavan I mukaisesti, suojaus poistetaan jos on tarve, analogisen 28-0 aktivoidun haptee-nin saamiseksi, esim. yhdiste, jolla on kaava B: 5 __P*

Loh Y

vj 9 9^

Kaava B

20 jossa Rl on H, tai O-substituoitu niin kuin edellä on esitetty, esim. hydroksialkyyli, hydroksialkoksialkyy-li, asyyliaminoalkyyli, tai aminoalkyyli, Y on sitova osa niin kuin on esitetty edellä, ja X on karboksia aktivoiva ryhmä niin kuin edellä on esitetty. Valmis-25 tettaessa tätä hapteenia, jossa R on O-suojaava ryhmä tai O-suojattu substituentti, asyloiva aine voi valin-naisesti olla esim. dikarboksyylihappo hemi-O-suoja-tussa muodossa niin, että asyloinnin jälkeen kummatkin '··; · O-suojaavat ryhmät voidaan poistaa yhdessä vaiheessa 30 ennen kuin karboksia aktivoiva ryhmä lisätään. Esimerkiksi hapteenit monoklonaalisten vasta-aineiden valli', mistamista varten, jotka voivat tunnistaa 40-0-(2- : hydroksietyyli)rapamysiiniä, voidaan valmistaa suojaa- maila ensimmäinen hydroksi, asyloimalla hydroksi pai-35 kassa 28 dikarboksyylihapolla hemi-O-suo jatussa muo-dossa, poistamalla suojaus, ja aktivoimalla karboksi-II* ryhmä, esim. reaktiokaavan III mukaisesti: 1106?ί; 5 o"n^· ^ "Zr?L ^ AllocCI - nrr°.

0C°^XOH =H2^'Pyr · °°S Q^T'o^LoH _ CH,ci/ly ^IgC ?X Λθ/?° ?V * ]^? 0 0 o' 1 1 2

°^0‘^N'°1^1 HO‘'s'0fÄV| 0H

O’^S Γ i>o kat Pd(PPh3)4 '01A. -

15 Bu3SnH <V

LnSt° °>S0 - CHgClo.rt lNSrO olo v*|C ?x ?i0 3 4 20 o

N-hydroksisukkini-imidi HO x ]^L ?** O

EOC, tetOMAP 0 t λ / ° —cw , QCyToXo

' : „ «°Ι&°. ?V

:·: 25 0 ° .:. 5 t · i : :

Reaktiokaava III

• · * 30

Samalla tavalla rapamysiini itsessään voidaan • : aktivoida 28-O-asemassa mieluummin kuin 40-O-asemassa, ·. ’ O-suojäämällä C40 hydroksi, asyloiraalla hydroksiryhmä asemassa 28 hemi-O-suo jatulla dikarboksyylihapolla, 35 poistamalla suojaus, ja aktivoimalla karboksiryhmä. esim. reaktiokaavan IV mukaisesti: I » * * * 9 11067(.,: 0r°^5!> 1 V. Λ 0

5 °f**\ wSs~^Q

°^Ο^Α, a"ocCI occ-0map'.

LNi^rQ o CKUCU-pyr., 0°C Ι^Λ^Ο O CH?C|-., QOf> ^ 10 1 2 °ι^ι qJ HOr^i oh 'o*1—> . Λο kat Pd(PPh3)4 . f^o

°t Bu3SnH

15 ^“Sr0 0 ^T° CH.CU. rt l*N-^-0 O ,Χ^.0

?V ?V

3 4 20 o J M°^ o** N-hydroksisukkwii-imidi _ <Λ·0 ° _?»£h.Jl-*. Ι^Χ^ΓΎ^ΐΙο

:·. “jÄP^ «V

5

··· Reaktiokaava IV

* · i : : ,·:·. Aktivoitu rapamysiini tai rapamysiini johdan- • · · 30 nainen sidotaan sen jälkeen sopivaan immunogeeniseen . . proteiiniin, esim. naudan seerumialbumiiniin (BSA), ··;_· muna-albumiiniin (OVA), tai avaimenreikä-mal jakotilon ’ hemosyaniiniin (KLH) immunogeenisen konjugaatin muo- :T: dostamiseksi. Monoklonaaliset vasta-aineet valmiste- 35 taan käyttämällä tavallisia menetelmiä esim. lisäämällä uusi immunogeeninen konjugaatti sopivaan eläinla- jiin saamaan aikaan immunogeeninen vaatimus ja otta- m · 1 · 11067,; 10 maila takaisin vasta-ainetta tuottavat solut, joita on herkistetty mainitulle konjugaatille; tekemällä kuolemattomiksi mainitut vasta-ainetta tuottavat solut fuusioimalla ne sopivaan myeloomaan; ja ottamalla takai-5 sin monoklonaalinen vasta-aine valitusta kuolematto maksi tehdystä solulinjasta, joka siten on vakiintunut.

Keksinnön mukaiset vasta-aineet voidaan tämän jälkeen käyttää sopivassa määrityksessä. Alan ammatti-10 mies huomaa heti että on olemassa useita mahdoolisuuk-sia. Yksi tapa on kilpaileva määritys, jossa käytetään vasta-ainetta ja rapamysiinimerkkiainetta, esimerkiksi jossa mikrotiitterikuoppalevyjä pintakäsitellään vasta-aineella ja altistetaan kilpailijalle, joka on mer-15 kitty (esim. fluori- tai radiomerkitty, erikoisesti biotinyloitu) rapamysiini koeliuoksen, jonka uskotaan mahdollisesti sisältävän rapamysiiniä, esim. potilaasta otetun plasman tai kokoveren, läsnäollessa tai poissaollessa. Kuoppalevyt huuhdellaan ja vasta-20 aineeseen sitoutunut määrä merkittyä kilpailijaa, mikä määrä vaihtelee käänteisesti rapamysiinimäärän kanssa testiliuoksessa, mitataan. Toinen tapa on ELISA, jossa käytetään vasta-ainetta, rapamysiiniproteiinikonju-. . : gaattia ja merkittyä (esim. merkitty entsyymillä) ·:**: 25 merkkivasta-ainetta, joka tunnistaa hiiri-IgG: tä, esim. jossa mikrotiitterikuoppalevyt pintakäsitellään rapamysiiniproteiinikonjugaatilla (esim. edellä kuva-tulla immunogeenisellä konjugaatilla, johon kuuluu 'II.· proteiini, joka on sidottu rapamysiiniin tai 40-0- t : : * 30 alkyloituun rapamysiiniin), altistetaan vasta-aineelle koeliuoksen läsnä- tai poissaollessa, huuhdotaan, ja : vasta-aine, joka on sitoutunut rapamysiinikonjugaat- v · tiin, joka havaitaan sitomalla merkkivasta-aine vasta- aineeseen, joka on sitoutunut rapamysiinikonjugaat-/··, 35 tiin. Taas sidotun vasta-aineen määrä vaihtelee kään- teisesti testiliuoksessa olevan rapamysiinimäärän ...i kanssa. Kummassakin tapauksessa määritys standardisoi- 11 1106/1 daan testiliuoksilla, jotka sisältävät tunnetun pitoisuuden rapamysiiniä. Tämän takia on tuotu esiin määri-tyskitti, joka sisältää (i) keksinnön mukaisen vasta-aineen edullisesti lyofilisoidussa muodossa tai pin-5 noitettuna mikrotiitterikuoppalevylle, ja joka (ii) valinnaisesti sisältää myös joko rapamysiiniproteiini-konjugaatin, valinnaisesti pinnoitettuna levylle, ja/tai merkityn rapamysiinijohdannaisen, ja joka (iii) valinnaisesti lisäksi sisältää rapamysiiniliuoksen 10 standardoimista ja käyttöohjeet käyttöä varten. Sellainen kitti pystyy havaitsemaan rapamysiiniä pitoisuuksina alle 10 ng/ml, esim. alle 1 ng/ml, esim. niin alhaisia kuin alle 0.25 - 0.5 ng/ml.

Keksinnön mukaiset vasta-aineet voidaan li-15 säksi karakterisoida niiden suhteellisen sitoutumisaf-finiteetin avulla immuunivastetta vähentävään askomy-siiniin, esim. FK-506. FK-506 on immuunivastetta vä hentävä makrolidi, jolla on rakenteellista samankaltaisuutta rapamysiinin sitovan domeenin osalta. Rapa-20 mysiinit (esim. rapamysiini ja sen immuunivastetta vähentävät johdannaiset) ja FK-506 sitoutuvat kummatkin makrofiliiniin (FKBPs) ja uskotaan, että kummallekin makrofiliinisidos on tarpeellinen mutta ei kuiten-, : kaan riittävä kriteeri immuunivastetta vähentävää vai- 25 kutusta varten. Rapamysiinin efektorialue on kuitenkin ·.·. aivan erilainen kuin FK-506:essa oleva, ja itse asias- '·" sa molemmilla yhdisteillä on aivan erilaiset vaikutus- mekanismit. (FK-506 esimerkiksi näyttää etupäässä ai-*;;/ heuttavan immuunivasteen vähentämistä estämällä IL-2 1 ·’ 30 transkription, kun taas rapamysiinilla ei ole merkit tävää vaikutusta IL-2 transkriptioon.) Rapamysiinejä ;,· · voidaan siten karakterisoida niin kuin niissä olisi : : : FKBP-sitova domeeni ja efektoridomeeni, ja rapamysii- nin ja rapamysiinimetaboliitit, joita modifioidaan 35 FKBPsitovalla domeenilla voidaan erottaa niistä, joita ·; modifioidaan efektoridomeenilla. Erotus voidaan tehdä keksinnön mukaisilla monoklonaalisilla vasta-aineilla • r i M » » 11067 ϋ 12 mittaamalla keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden suhteellinen ristireaktiivisuus FK-506 kanssa (ristireaktiivisuus voidaan mitata esim. kilpailevassa ELISAssa): monoklonaaliset vasta-aineet, 5 joilla on suuri ristireaktiivisuusaste (esim. suurempi kuin 50 %) tunnistavat epitooppeja rapamysiinin FBKP-sitovalla domeenilla, joka on samanlainen kuin FK-506; monoklonaaliset vasta-aineet, joilla on matala ristireaktiivisuusaste (esim. pienempi kuin 20 %, valinnai-10 sesti pienempi kuin 10 %) tunnistavat epitooppeja efektorialueella, joka rapamysiinille on ainutlaatuinen.

Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan myös seuloa ja karakterisoida niiden kyvyn mukaan erottaa 15 rapamysiini ja rapamysiinin 40-0-johdannaiset, esim. niin kuin edellä on esitetty. Kun toivotaan, että vasta-aineet eivät erota rapamysiiniä ja rapamysiinin 40-0-johdannaisia valitaan vasta-aineita, jotka osoittavat ainakin 70 %, edullisesti enemmän kuin 90 % risti-20 reaktiivisuusä rapamysiinin ja rapamysiinin 40-0-johdannaisten välillä. Sellaisessa tapauksessa haptee-ni, jota käytetään monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseen on edullisesti 40-O-aktivoitu rapamy-siini, esim. sellainen, jolla on kaava III reaktiokaa-...: 25 vassa I. Kun halutaan erottaa rapamysiini ja rapamy- ·.·. siinin 40-0-johdannainen tai metaboliitti valitaan vasta-aineita, joiden ristireaktiivisuus on pienempi kuin 30 %, edullisesti pienempi kuin 10 % tähän. Tässä ! ; : tapauksessa hapteeni, jota käytetään vasta-aineen val-,·” ' 30 mistamiseen on edullisesti 28-O-aktivoitu rapamysiini tai rapamysiinijohdannainen, jolla esim. on kaava B.

» » · · Λ : Esimerkki 1 40-Q-aktivoidun rapamysiinin valmistus a) Rapamysiinin 40-O-hemisukkinaatin valmis- *... 35 tus t * Sekoitettuun liuokseen, jossa on 1.5 g (1.64 mmol) rapamysiiniä ja 0.577 g (5.77 mmol) sukkiinian- 13 110671 hydridiä 12 ml:ssa pyridiiniä lisätään 195 mg (1.64 mmol) DMAP. Saatua seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 19 h ja konsentroidaan alennetun paineen alaisena. Jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja pestään 5 kolme kertaa vedellä. Orgaaninen liuos kuivataan ve dettömällä natriumsulfaatilla, suodatetaan ja konsentroidaan alennetun paineen alaisena. Jäännös puhdistetaan kolonnikromatografiällä silikageelillä käyttämällä 9 : 1 CH2Cl2-MeOH. Fraktiot, jotka sisältävät 10 toivottua tuotetta yhdistetään ja puhdistetaan vielä kerran kolonnikromatografiällä silikageelillä käyttämällä 19 : 1 CH2Cl2-MeOH tuottamaan, sen jälkeen kun liuos on poistettu alennetussa paineessa, 40-0-(3-karboksi)propanoyylirapamysiiniä (kaavan II* supra 15 mukainen rapamysiinihemisukkinaatti) valkoisena vaah tona, jolla on seuraavat tunnusomaiset spektroskooppiset ominaisuudet: XH NMR (CDC13) δ 2.68 (7H, m, H33, H25 ja 02CCH2CH2C02H) , 3.14 (3H, s ja m, OCH3 ja H39), 3.34 (3H, s, OCH3), 20 3.38 (3H, s, 0CH3) 4.68 (1H, m, H40), 4.72 (1H, leveä s, 10-OH); MS (FAB) m/z 1036 ([M+Na] + ), 964 ([M- (CH30+H20) ] + ) ,946 ( [M-(CH30+2H20) ] + ) .

b)40-O-sukkiini-imido-oksisukkinyylirapamy-: siinin valmistus , , : 25 Sekoitettuun liuokseen, jossa on 120 mg (0.118 mmol) rapamysiinihemisukkinaattia vaiheesta a), 16.5 μΐι (0.118 mmol) Et3N ja 22.7 mg (0.118 mmol) EDC 8 mL:ssa CH2C12 lisätään 13.6 mg (0.118 mmol) N-·* : hydroksisukkiini-imidiä. Tuloksena saatua seosta se- ’ 30 koitetaan 18 h huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen seosta laimennetaan etyyliasetaatilla ja pestään kaksi : I · kertaa vedellä. Orgaaninen liuos kuivataan vedettömäl- : : : lä natriumsulfaatilla, suodatetaan ja konsentroidaan alennetun paineen alaisena. Jäännös puhdistetaan ko-35 lonnikromatografiällä silikageelillä (etyyliasetaatti) ';·* 40-O-sukkiini-imido-oksisukkinyylirapamysiinin saami seksi (s.o. kaavan III' mukainen yhdiste reaktiokaa- • * i4 11Q67l vassa II supra) valkoisena vaahtona, jolla on seuraa-vat tunnusomaiset spektroskooppiset ominaisuudet: *Η NMR (DMSO) δ 2.67 (2H, t, 02CCH2CH2C02) , 2.81 (7H, s, CH30 ja sukkiini-imidi CH2), 2.92 (2H, t, 5 02CCH2CH2C02) , 4.55 (1H, m, H40), 5.26 (1H, d, 28-OH), 6.43 (1H, s, 10-OH); MS (FAB) m/z 1133 ([M+Na]+)# 1111 ( [M+H]+) , 1092 ([M-H20] + ), 1079 ([M-CH30] + ), 1061 ( [M(CH30+H20) ] + ) , 1043 ( [M-(CH30+2H20) ] + ) .

10 Esimerkki 2 28-O-aktivoidun 4O-O-rapamysiinijohdannaisen valmistaminen a) 40-0-(2-hydroksietyyli)rapamysiinin 28-0-hemisukkinaatti

Sekoitettuun ja jäähdytettyyn liuokseen, 15 (0°C), jossa on 958 mg (1.00 mmol) 40-0-(2- hydroksietyyli)rapamysiiniä 2.2 mL 10:1 metyleniklori-di-pyridiiniä lisätään 0.160 mL (1.50 mmol) allyy-likloroformaattia. Sekoittamista jatketaan 0°C ja kaksi annosta, joissa kummassakin on 0.080 mL (1.00 mmol) 20 pyridiiniä ja 0.053 mL (0.50 mmol) allyyliklorofor-maattia lisätään 3 tunnin ja vast. 4 tunnin jälkeen. Viimeisen reagenssilisäyksen jälkeen sekoittamista jatketaan vielä tunti ja reaktio pysäytetään IM vesipitoisella natriumbikarbonaatilla. Saatu seos uutetaan 25 kolme kertaa etyyliasetaatilla. Orgaaninen liuos pes-·,·, tään peräkkäin IN vesipitoisella suolahapolla, IN ve- sipitoisella natriumbikarbonaatilla ja saturoidulla suolavedellä, ja kuivataan tämän jälkeen vedettömällä • ; : natriumsulfaatilla, suodatetaan ja konsentroidaan ' 30 alennetussa paineessa. Jäännös puhdistetaan kolonnik- romatografiällä silikageelillä (50 : 50 heksaani- ;,· j etyyliasetaatti) allyylioksikarbonyyli suojatun yhdis- teen (kaava 2 reaktiokaavassa III edellä) saamiseksi valkoisena vaahtona.

35 Sekoitettuun ja jäähdytettyyn liuokseen, t * ‘ (0°C), jossa on 208 mg (0.200 mmol) tätä tuotetta 2 mL:ssa metyleenikloridia lisätään 2.4 mg (0.020 mmol) 15 11067,; DMPA ja 82 mg (0-400 mmol) DCC, jonka jälkeen lisätään liuos, jossa on 63 mg (0.400 mmol) monoallyylisukki-naattia 0.5 mL:ssa metyleenikloridia. Reaktioseosta sekoitetaan lämpötilassa 0°C 14 tuntia ja tuloksena 5 saatu suspensio suodatetaan suppilon, jossa on huokos-lasisuodatin, läpi. Orgaaninen liuos konsentroidaan alennetun paineen alaisena ja jäännös puhdistetaan kolonnikromatografiällä silikageelillä (30 : 70 hek- saani-etyyliasetaatti) antaen tuotteen (kaava 3 reak-10 tiokaavassa III edellä) valkoisena vaahtona.

Sekoitettuun ja jäähdytettyyn liuokseen, jossa on 177 mg (0.150 mmol) tätä tuotetta 5 mL:ssa metyleenikloridia lisätään 17.3 mg (0.015 mmol) tetra-kis(trifenyylifosfiini)palladiumia ja 0.080 mL (0.3 15 mmol) tributyylitinahydridia. Keltaista liuosta sekoitetaan 2 tuntia huoneen lämpötilassa ja laimennetaan etyyliasetaatilla, pestään kerran kylmällä 2N vesipitoisella sitruunahapolla ja kolme kertaa saturoidulla suolavedellä, kuivataan vedettömän natriumsulfaatin 20 päällä, suodatetaan ja konsentroidaan alennetun paineen alaisena. Kolonnikromatografia silikageelillä (85 : 15 etyyliasetaatti-metanoli) antaa hemisukkinaatin (kaava 4 reaktiokaavassa III) vaalean keltaisena öljynä.

25 b) 28-O-sukkiini-imido-oksisukkinyyli-40-O-

I

. . (hydroksi)rapamysiini ‘ Liuos, jossa on 53 mg (0.050 mmol) vaihe a):n I 1 · ;·; hemisukkinaattia 2.5 mL:ssa metyleenikloridia käsitel- *7 · lään 2 mg DMAP, 24 mg (0.125 mmol) EDC ja 14 mg (0.125 * < · : 30 mmol) N-hydroksisukkiini-imidin kanssa. Sen jälkeen kun seosta on sekoitettu 2 tuntia huoneen lämpötilas- : sa, reaktio pysäytetään IN vesipitoisella natriumbi- karbonaatilla. Seosta uutetaan kolmella annoksella etyyliasetaattia. Orgaaninen liuos pestään vesipitoi-35 sella natriumbikarbonaatilla ja suolavedellä, kuiva- *·;·' taan vedettömällä natriumbikarbonaatilla, suodatetaan ja konsentroidaan aktivoidun hapteenin saamiseksi 16

Hoe: (kaavan 5 mukainen yhdiste reaktiokaavassa III), jota käytetään proteiinihapteenikonjugaatin valmistamiseen ilman lisäpuhdistusta, ja jolla on seuraavat tunnusomaiset spektroskooppiset ominaisuudet: 5 NMR (CDC13) δ 2.43 (1H, dd, H33a), 2.50-2.98 (10H, m, H25, H33b, sukkinaattivedyt, sukkiini-imidivedyt), 3.58 (2H, m, H6b, 1 hydroxietyyli H) 3.68 (3H, m, H16, 2 hydroksietyyli H), 3.81 (2H, m, H14, 1 hydroksietyy-li H),3.39 (1H, d, H27), 5.28 (2H, m, H2, H30), 5.34 10 (1H, d, H28); MS (FAB) 1161 ([M+Li]+).

Esimerkki 3 28-O-aktivoidun rapamysiinin valmistus a) Rapamysiinin 28-O-hemisukkinaatti Sekoitettuun ja jäähdytetyyn liuokseen (0°C), 15 jossa on 914 mg (1.00 mmol) rapamysiiniä 2.2 mL:ssa 10:1 metyleenikloridi-pyridiiniä lisätään 0.212 mL (2.00 mmol) allyylikloroformaattia. 3 tunnin jälkeen lisätään 0.080 mL (1.000 mmol) pyridiiniä ja 0.053 mL (0.50 mmol) allyylikloroformaattia. Sekoittamista jat-20 ketään vielä yksi tunti ja reaktio pysäytetään 1 M vesipitoisella natriumbikarbonaatilla. Saatu seos uutetaan kolme kertaa metyyli-t-butyylieetterillä. Orgaaninen liuos pestään peräkkäin kylmällä 1 N suolahapolla, IN vesipitoisella natriumbikarbonaatilla ja .. j 25 kyllästetyllä suolaliuoksella, kuivataan vedettömällä ·.·, natriumsulfaatilla, suodatetaan ja konsentroidaan » alennetun paineen alaisena. Jäännös puhdistetaan ko- ;'*! lonnikromatografiällä silikageelillä (70:30 heksaani- < * ; * etyyliasetaatti) allyylioksikarbonyylisuojatun yhdis- ’·’ 30 teen saamiseksi (kaava 2 reaktiokaavassa IV) valkoise na vaahtona.

, j Sekoitettuun ja jäähdytettyyn liuokseen : (0°C), jossa on 400 mg (0.400 mmol) tätä tuotetta 5 mL:ssa metyleenikloridia lisätään 4.8 mg (0.040 mmol) 35 DMAP ja 164 mg (0.800 mmol) DCC, jonka jälkeen liuos ; jossa on 127 mg (0.800 mmol) monoallyylisukkinaattia 1 ;* mL:ssa metyleenikloridia lisätään. Reaktioseosta se- • « * * » 17 110670 koitetaan lämpötilassa -15°C 14 tuntia ja tuloksena saatava suspensio suodatetaan suppilon, jossa on huo-koslasisuodatin, läpi. Orgaaninen liuos konsentroidaan alennetussa paineessa ja jäännös puhdistetaan kolon-5 nikromatografiällä silikageelillä (40 : 60) heksaani-metuyyli-t-butyylieetteri) antaen tuloksena kaavan 3 reaktiokaavassa IV mukaisen yhdisteen valkoisena vaahtona.

Sekoitettuun liuokseen, jossa on 285 mg 10 (0.250 mmol) tätä tuotetta 5 mL:ssa metyleenikloridia lisätään 28.8 mg (0.025 mmol) tetrakis(trifenyyli-fosfiini)palladiumia ja 0.133 mL (0.5 mmol) tributyy-litlnahydridiä. Keltaista liuosta sekoitetaan 1 tunti huoneen lämpötilassa ja laimennetaan metyyli-t-butyy-15 lieetterillä, pestään kaksi kertaa kylmällä 2N vesipitoisella sitruunahapolla ja kolme kertaa kyllästetyllä suolaliuoksella, kuivataan vedettömällä natriumsulfaa-tilla, suodatetaan ja konsentroidaan alennetussa paineessa. Kolonnikromatografia silikagelillä (90 : 10 -20 60 : 40 metyyli-t-butyylieetteri-metanoli) antaa tu loksena 28-O-rapamysiinihemisukkinaattia (reaktiokaa-van IV kaava 4) vaalean keltaisena öljynä.

b) 28-O-sukkiini-imido-oksisukkinyylirapamy- siini 25 Liuos, jossa on 51 mg (0.50 mmol) vaiheen a) tuotetta 2 mL:ssa metyleenikloridia käsitellään 2 mg DMPA, 24 mg (0.125 mmol) EDC ja 14 mg (0.125 mmol) N-hydroksisukkiini-imidiä. Sen jälkeen kun seosta on » · sekoitettu 4 tuntia huoneen lämpötilassa, reaktio lo- * j 7 V ‘ 30 petetään IN vesipitoisella natriumbikarbonaatilla.

Seosta uutetaan kolmella annoksella metyyli-t-butyyli- eetteriä. Orgaaninen liuos pestään vesipitoisella nat- riumbikarbonaatilla ja suolaliuoksella, kuivataan ve-. dettömällä natriumbikarbonaatilla, suodatetaan ja kon- 35 sentroidaan aktivoidun otsikkoyhdisteen saamiseksi, jota käytetään proteiinihapteenin valmistamiseksi il- * i * > • » I £ * ie 1 ioe: man lisäpuhdistusta ja jolla on seuraavat tunnusomaiset spektroskooppiset ominaisuudet: XH NMR (CDC13) δ 2.43 (1H, dd, H33a), 2.55 - 3.02 (11H, m, H25, H33b, H39, sukkinaatti vedyt, sukkiini-imidi 5 vedyt), 3.56 (1H, m, H6b), 3.68 (1H, dd, H16), 3.83 (1H, m, H14) , 3.93 (1H, d, H27), 5.28 (2H, m, h", H30), 5,34 (1H, d, H28); MS (FAB) 1117 ([M+Li]+).

Esimerkki 4 Immuunoqeenisen konjugaatin suojaus 10 a) 40-O-sidottu rapamysiinikonjugaatti 17.4 mg 40-O-aktivoitua rapamysiiniä esimerkistä 1 liuotetaan 400 μΐ DMF tai DMSO. 120 μΐ (s.o. sisältää 5.22 mg aktivoitua rapamysiiniä) tätä liuosta lisätään tipoittain ja voimakkaasti sekoittaen liuok-15 seen, jossa on 8 mg KLH 2 ml:ssa 0.1 M NaHC03 puskuria (pH 7.7). Reaktioseosta sekoitetaan voimakkaasti 2 tuntia huoneen lämpötilassa, saatava rapamysiini-KLH-konjugaatti puhdistetaan dialyysillä lämpötilassa 4 °C vastaan 5 1 PBS, 3X 48 tunnin aikana. Valinnaisesti 20 konjugaattia konsentroidaan vielä sentrifugoimalla käyttäen mikrokonsentraattiputkia. Rapamysiini-BSA ja rapamysiini-OVA konjugaatit valmistetaan samalla tavalla, substituoimalla BSA:lla tai vast. OVA:11a KLH:n ·,· * sijasta esitetyllä menetelmällä.

"·'*! 25 b) 28-O-sidottu (valinnaisesti 40-O-alkyloi- . tu) rapamysiinikonjugaatti ··· 5 mg 28-0 aktivoitua yhdistettä esimerkistä 2 • f * · : liuotetaan 2 ml DMSO ja lisätään tipoittain sekä voi- » » · · makkaasti sekoittaen liuokseen, jossa on 5 mg KLH 1 ml 1 · · 30 sen 50 mM fosfaattipuskuria (pH 7.3). Reaktioseosta . . sekoitetaan 2 tuntia huoneen lämpötilassa ja tuloksena ·;;/ saatava konjugaatti puhdistetaan dialyysillä lämpöti- *’ ’ lassa 4°C 21 PBS vastaan 3X yli 48 tunnin ajan. Konju- gaatti, jossa on BSA- ja OVA-konjugaatteja valmiste-35 taan samalla tavalla. Rapamysiini konjugoidaan KLH, BSA ja OVA asemalla 28 käyttämen esimerkin 3 28-0- ·*·’· aktivoitua yhdistettä käyttäen samaa menetelmää.

* * is 11067(

Esimerkki 5 monoklonaalisen vasta-aineen valmistaminen a) Rapamysiinin monoklonaalinen vasta-aine Monoklonaaliset vasta-aineet valmistetaan 5 käyttämällä tavanomaisiamenetelmiä, pääasiassa kuten on esitetty julkaisussa Köhler and Milstein, Nature 256:49. Naaras Balb/C hiirille (20 - 25 g) annetaan jokaiselle 10 tai 50 pg 40-O-sidottua rapamysiini-KLH immunogeenistä konjugaattia esimerkistä 4a) 0.2 ml:ssa 10 Freundin täydellistä adjuvanttia, annettuna ihonalaisena injektiona neljään kohtaan. Kahden viikon jälkeen annetaan toinen tehostava injektio, joka sisältää saman määrän immunogeenistä konjugaattia emulsifioituna 0.2 ml:an Freundin epätäydellistä adjuvanttia taas 15 ihonalaisena injektiona. Vasta-aineiden läsnäolo, jotka ovat reaktiivisia antigeenille eläimen veriseerumissa, vahvistetaan suoralla ELISAlla niin kuin on esitetty esimerkissä 6. Hiiriä voidaan valinnaisesti vielä valita vasta-ainetta efektorialueelle (matala 20 ristireaktiivisuus FK-506 kanssa) ja FKBP sitovalle alueelle (suuri ristireaktiivisuus FK-506:delle), varten. Kuvassa 1 esimerkiksi esitetään hiiren (Ml), jolla on korkea vasta-aine taso rapamysiinin sitovaan ·.· * domeeniin, ja toisen hiiren (M7), jolla on suhteelli- 25 sen korkeat vasta-aine tasot efektoridomeenia vastaan, tiitterikäyriä. Hiiret, jotka osoittavat sopivan spe- ·· sifisyyden omaavia vasta-aineen maksimaalisia verisee- ; .·. rumitasoja, saavat tehosteinjektioita, joissa on 10 μg antigeeniä, puoleksi i.p. puoleksi i.v. päivänä -3, ja t · · 30 i.p. päivänä -2 ja -1. Päivänä 0 hiiret teurastetaan , . ja niiden pernasolut eristetään ja fuusioidaan PAI-0 solujen tai muun sopivan myeloomalinjän kanssa. Saatua • ‘ ' hybridomaa kasvatetaan ja valitaan käyttämällä ELISA:a vasta-aineen, jolla on suuri affiniteetti rapamysii- .··. 35 niin, ilmentämiseen.

* * · ·, b) 40-(hydroksietyyli)rapamysiinin monoklo- naalinen vasta-aine » »

20 110£T

Naaras Balb/C hiirille annetaan 10 tai 50 μς 40-(hydroksietyyli)rapamysiini-KLH immunogeenistä kon-jugaattia esimerkistä 4b) 0.2 ml:ssa Freundin täydellisessä adjuvanttissa ihonalaisena injektiona 4 koh-5 taan. Kahden viikon kuluttua annettaan toinen injektio (tehoste), jossa on samaa määrää immunogeenistä konju-gaattia emulsifioituna 0.2 ml Freundin epätäydellistä adjuvanttia taas ihonalaisena injektiona. Vasta-aineiden, jotka ovat reaktiivisia antigeeniä vastaan, 10 läsnäolo eläimen veriseerumissa testataan suoralla ELISA:11a niin kuin alla on esitetty. Lisäksi hiiriä vielä valitaan niiden vasta-aineiden suhteen, jotka ovat vasta-aineita rapamysiinimolekyylin alueelle, joka on modifioitu 40-0 alueella sitoutumalla BSA-15 rapamysiinikonjugaattiin verrattuna BSA-40-O(2-hyd- roksietyyli)rapamysiinikonjugaattiin. Kumpiakin vasta-aineita, jotka sitoutuvat 40-0(2-hydroksietyyli)rapamysiinikonjugaattiin, mutta eivät sitoudu konjugoituun rapamysiiniin ja vasta-aineet, jotka sitoutuvat 40-20 0(2-hydroksietyyli)rapamysiiniin ja rapamysiinikonju- gaatteihin, saadaan. Hiiret, jotka osoittavat sopivan spesifisyyden omaavan vasta-aineen maksimaalisia veriseerumi taso ja, saavat tehosteinjektioita, joissa on 10 ‘μg antigeeniä, puoleksi i.p. puoleksi i.v. päivänä -3, ’*25 ja i.p. päivänä -2 ja -1. Päivänä 0 hiiret teuraste- V taan ja niiden pernasolut eristetään ja fuusioidaan ‘I* PAI-0 solujen kanssa. Tuloksena saatua hybridomaa kas- i vatetaan ja valitaan käyttämällä ELISAra vasta-aineen, jolla on suuri affiniteetti 40-0-(2-hydroksietyy-30 li)rapamysiiniin, ilmemtämiseen.

Esimerkki 6 Entsyymiin sidottu immuunosorbentti määritysmenetelmä (ELISA) : a) ELISA rapamysiiniä varten i’”: 35 Mikrotiitterilevyjä pintakäsitellään 1-2 μg/ml rapamysiini-BSA-konjugaatilla PBSsssä 2 tuntia » » 11067ϋ 21 lämpötilassa 37°C ja kyllästetään 2 % BSArlla PBSrssä 1 tunti lämpötilassa 37°C ja pestään 3x 0.05 %:sella T Tween-PBS:llä. Hybridomasupernatantit voidaan seuloa ja laimentaa 1 % liuoksella, jossa on BSA:ta PBSrssä, 5 ja inkuboida yön yli huoneen lämpötilassa (tai 18 tuntia lämpötilassa 4°C tai 2 tuntia lämpötilassa 37°C). Sidotun vasta-aineen taso mitataan antihiiri-IgG-vuohiglobuliinilla, joka on kytketty alkaliseen fosfa-taasiin para-nitrofenyylifosfaatti substraattina. Kah-10 den tunnin lämpötilassa 37°C inkubaation jälkeen ent-symaattinen substraatti hydrolysoidaan (i tuntia huoneen lämpötilassa) ja absorbanssi 405 nmrssä mitataan. Hybridomat valitaan suuren affiniteetin omaavien mo-noklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi.

15 Standardikäyriä rapamysiinin valitun vasta- aineen suhteellisen affiniteetin määrittämiseksi valmistetaan käyttämällä liuoksia, joissa on tunnettuja määriä rapamysiiniä (esim. 1 - 140 ng/ml veriseerumissa) . Kuvassa 2 on esimerkiksi esitetty monoklonaalisen 20 vasta-aineen M7-91 standardikäyrä, joka osoittaa, että valittu monoklonaalinen vasta-aine on erittäin spesifinen rapamysiinille, ja pystyy havaitsemaan rapamysiinin niinkin alhaisina määrinä kuin 0.25 ng/ml.

.· * Vasta-aineet voidaan lisäksi karakterisoida 25 rapamysiinin efektoriin sitoutuvina tai FKBP- * : sitoutuvina domeeneinä mittaamalla ristireaktiivisuus ·· FK-506: della analogisessa suorassa ELISA :ssa käyttä- «•tt ; .*. mällä mikrotiitterilevyjä, joita on päällystetty FK- 506-BSA-konjugaatilla. Esimerkiksi kuvassa 3 on esi-30 tetty 17 valitun monoklonaalisen vasta-aineen sitoutu- . , mistasojen vertailu rapamysiini-BSA ja FK-506 määri- ·;;/ tyksissä; ristireaktiivisuus prosentteina on esitetty

’·’ kuvassa 4. Tässä sitoutumisvertailussa rapamysiini-BSA

suhteessa FK-506-BSA, on havaittu monoklonaalisia vas-35 ta-aineita, joilla on hyvin alhainen affiniteetti.

·, Edellä esitetty suora ELISA voidaan muuttaa ··'· kilpailevaksi ELISArksi, jolloin kilpailija lisätään 22 1106.71- monoklonaaliseen vasta-aineliuokseen ja mitataan mo-noklonaalisen vasta-aineen sitoutuminen konjugaattiin kilpailijan läsnäollessa ja poissaollessa. Kun kilpailija on FK506 tai rapamysiini, lisätään kilpailija 5 etanoliliuoksessa, esim. 1 mg/ml suoraan monoklonaaliseen vasta-aineliuokseen (esim. 2 μ1/200 μΐ/säiliö) ja laimennetaan lisäksi mikrotiitterilevyllä. Kuvassa 5 esim. on esitetty inhibitiokäyrä M7-91 vasta-aineen (M7.91.13) sitoutumisesta BSA-rapamysiiniin vapaan 10 rapamysiinin eri pitoisuuksien läsnäollessa. Sellaisissa kilpailevissa ELISA:ssa, jossa verrataan mo-noklonaalisten vasta-aineiden sitoutuminen vapaaseen FK506 suhteessa vapaaseen rapamysiiniin havaitaan vähemmän ristireaktiivisuutta rapamysiinin ja FK506 vä-15 Iillä kuin suorassa ELISA:ssa. Tällainen kilpaileva määritys on edullinen valittaessa monoklonaalisia vasta-aineita, koska uskotaan, että joillakin monoklonaa-lisilla vasta-aineilla voi olla liian matala affiniteetti sitoutuakseen niiden antigeeniin vapaassa muo-20 dossa liuoksessa, mutta saattavat silti osoittaa biva-lenttia tai polyvalenttia sitoutumista multimeeriseen antigeeniin, jossa on monia hapteenejä sidottuna lähelle toinen toisiaan suuressa proteiinimolekyylissä. v : Kilpaileva määritys sulkee pois sellaisia matalan af- ·:*·: 25 finiteetin omaavia vasta-aineita. Tällaisen kilpaile- *·’: van määrityksen tuloksia on esitetty kuvassa 6, jossa verrataan M7-91 vasta-aine (M7.91.13), jolla on suh-; ,·. teellisen matala ristireaktiivisuus Ml-303 (Ml.303.3) • j·. vasta-aineeseen, jolla on suhteellisen suuri ristire- 30 aktiivisuus.

b) ELISA 40-0-(2-hydroksietyyli)rapamysiiniä : : : varten \* · Tämä ELISA on valmistettu analogisesti koh- dassa a) mainitun menetelmän mukaisesti. Mikrotiitte-···. 35 rilevyjä pintakäsitellään 40-O-(2-hydroksietyyli)ra- pamysiini-BSA:lla, tyydytetään BSA:lla ja pestään. Hybridoma supernatantit seulottuna inkuboidaan 18 tun- I * · * ♦ 23 Α Ί f) ;r r, .

tia lämpötilassa 4°C tai 2 tuntia lämpötilassa"^ ^70e'. Sidotun vasta-aineen taso mitataan anti-hiiri-IgG-vuohiglobuliinilla, joka on sidottu alkaliseen fosfa-taasiin para-nitrofenyylifosfaatti substraattina. Rin-5 nakkainen ELISA tehdään käyttämällä sidottua rapamy-siini-BSA:ta valitsemaan monoklonaalisia vasta-aineita, jotka pystyvät erottamaan 40-O-(2-hydroksi-etyyli)rapamysiini rapamysiinistä. Kuvassa 7 on esitetty esim. hybridoman B3-203 supernatantteja, jotka 10 sitoutuvat selektiivisesti 40-0-(2-hydroksietyyli)ra-pamysiini-BSAshan (johon kuvassa viitataan BSA-28-RAD:na) (kuva 7A) hybridoma B3-113, joka tunnistaa sekä 40-0-(2-hydroksietyyli)rapamysiini-BSA:an ja ra-pamysiini-BSA:an, joka on konjugoitu kohdan 28 kautta 15 (kuva 7B) ja hybridoma B3-164, joka tunnistaa lisäksi rapamysiinin, joka on kytketty BSA kohdan 40 kautta (kuva 7C).

Vasta-aineiden suhteellinen affiniteetti 40-0-(2-hydroksietyyli)rapamysiiniin suhteessa rapamysii-20 niin mitataan lisäksi kilpailuttamalla vasta-aineiden sitou-tuminen päällystettyyn 40-0-(2-hydroksietyyli )rapamysiini-BSA-konjugaatti 40-0-(2-hydroksietyyli) rapamysiinin tai rapamysiiniin, joka on vapaassa > liuoksessa, kanssa. Kuvassa 8 on esitetty esimerkiksi, ·:··: 25 että vasta-aineet, joita hybridoma B3-203 tuottaa, *·*: reagoivat voimakkaasti 40-0-(2-hydroksietyyli)rapa- mysiinin kanssa, jolla on matala ristireaktiivisuus ; rapamysiinille (kuva 8A) ja että vasta-aineet, joita tuottaa hybridoma B3-113 ja B3-164 sitoutuvat yhtä • · · ‘ 30 hyvin 40-0-(2-hydroksietyyli)rapamysiiniin ja rapamy siiniin (kuvat 8B ja 8C). Muut hybridoomat, jotka : tuottavat vasta-aineita, jotka sitoutuvat ainakin 10 - V : 100 kertaa paremmin 40-0-(2-hydroksietyyli)rapamysii- niin kuin rapamysiiniin, ovat B3-22, B3-127 ja B3-156.

··. 35 Muut hybridomat kuten B3-29, B3-265 ja B3-539 tuotta- vat vasta-aineita, jotka sitovat rapamysiiniä yhtä hyvin kuin 40-0-(2-hydroksietyyli)rapamysiiniä.

24 1 106/υ

Kun haluttu vasta-aine on valittu, käytetään samaa ELISA:a potilaissa olevien rapamysiinin verotasojen määrittämiseksi. Tämän esimerkin mukaisessa mää-rityskitissä on yksi tai useampi valittu vasta-aine 5 lyofilisoidussa muodossa, mikrotiitterilevy, joka on pintakäsitelty rapamysiinikonjugaatilla (esim. rapamy-siini-BSA-konjugaatilla tai 40-0-(2-hydroksietyyli)ra-pamysiini-BSA-konjugaatilla), rapamysiinistandardi ja ohjeet käyttöä varten. Valinnaisesti kitti voi lisäksi 10 sisältää leimatun rapamysiinijohdannaisen käytettäväksi kilpailevassa määrityksessä. Lisäksi voi olla edellä esitettyä anti-hiiri-IgG-entsyymikonjugaattia ja substraattia. Vaihtoehtoisesti käyttäjä voi käyttää keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta omas-15 sa ELISA:ssa tai muussa määritysjärjestelmässä. 1 »II** ‘ ·

Claims

1106/L-

1. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se pystyy spesifisesti tunnistamaan rapamysiiniä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaa linen vasta-aine tunnettu siitä, että se pystyy tunnistamaan epitoopin rapamysiinin FKBP-sitovassa osassa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaa-10 linen vasta-aine, tunnettu siitä, että se pystyy tunnistamaan epitoopin rapamysiinin efekto-riosassa.

4. Patenttivaatimuksen 1-3 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että 15 vasta-aine saadaan tai on saatavissa: a) antamalla rapamysiinin, jossa on aktivoitu kyt-kentäryhmä, reagoida immunogeenisen proteiinin kanssa immunogeenisen konjugaatin aikaansaamiseksi, 20 b) antamalla immunogeenistä konjugaattia sopivalle ’ * eläinlajille immunogeenisen vasteen tuottmiseksi • t · ' 1 ja ottamalla talteen vasta-ainetta tuottavat so- '.· lut, jotka ovat herkistyneet konjugaatille, '1' c) immortalisoimalla vasta-ainetta tuottavat solut, : 25 ja d) ottamalla talteen monoklonaalinen vasta-aine valitusta immortalisoidusta siten saadusta solulin-jasta, joka siten on aikaansaatu.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukai- 30 nen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu sii- *· ’· tä, että rapamysiini on (i) rapamysiini tai (ii) 40-0- alkyloitu rapamysiini, edullisesti sellainen, jossa

40-O-alkyylisubstituentti on valittu ryhmästä hydrok- .···. sialkyyli, hydroksialkoksialkyyli, asyyliaminoalkyyli, •y 35 tai aminoalkyyli. » · » 26 1106/-

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen monoklonaa-linen vasta-aine, tunnettu siitä, että rapa-mysiini on valittu alla olevista: i) 40-0-(2-hydroksietyyli)rapamysiini, 5 ii) 40-0-(3-hydroksipropyyli)rapamysiini, iii) 40-0-[2-(2-hydroksi)etoksi]etyylirapamysiini, ja iv) 40-0-(2-asetaminoetyyli)rapamysiini.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6, mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siilo tä, että vasta-aine pystyy erottamaan rapamysiinin ja

40-O-alkyloidusta rapamysiinistä niin kuin patenttivaatimuksessa 5 tai 6 on esitetty.

8. Immunogeeninen konjugaatti, tunnet -t u siitä, että konjugaatti on valittu ryhmästä, jo- 15 hon kuuluu rapamysiini, jossa on immunogeeninen proteiini 40 tai 28 asemassa, ja 40-0-(2-hydroksietyyli)-rapamysiini, jossa on immunogeeninen proteiini 28 asemassa .

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen immunogee-20 ninen konjugaatti, tunnettu siitä, että konju- gaatti valmistetaan antamalla immunogeenisen proteii-;· nin reagoida rapamysiinin, jossa on aktivoitu kytken- täryhmä 40 tai 28 asemassa, tai 40-0-(2-hydroksietyyli)-rapamysiinin, jossa on aktivoitu kyt-25 kentäryhmä 28 asemassa, kanssa, aktivoidun kytkentä-'ryhmän ollessa valittu ryhmästä, johon kuuluu -C0-0-X, *·' ' jossa X on karboksi-aktivoiva ryhmä, -S-S-Z, jossa Z on ditio-aktivoiva ryhmä, ja epoksi-ryhmä.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen immunogee-30 ninen konjugaatti, tunnettu siitä, että rapa- mysiini tai 40-0-(2-hydroksietyyli)-rapamysiini, jossa on aktivoitu kytkentäryhmä, on valittu alla olevista: i) 40-O-sukkiini-imido-oksisukkinyylirapamysiini ’·*_ ii) 28-O-sukkiini-imido-oksisukkinyylirapamysiini ’·.· 35 iii) 28-0-(sukkiini-imido-oksisukkinyyli)-40-0-(2-hyd- roksietyyli) rapamysiini . 110671-

11. Rapamysiini, jossa on aktivoitu kytkentä-ryhmä, tunnettu siitä, että se on valittu alla olevista: i) 4 0-O-sukkiini -imido-oksisukkinyylirapamysiini 5 ii) 28-O-sukkiini-imido-oksisukkinyylirapamysiini, iii) 28-0-(sukkiini-imido-oksisukkinyyli)-40-0-(2-hyd-roksi)etyylirapamysiini.

12. Jonkin partenttivaatimuksista 1-7 mukaisesti määritetyn monoklonaalisen vasta-aineen si- 10 sältävä immunomäärityskitti rapamysiinin veritasojen määrittämiseksi. • » PATENTKRAV 1 10 6 / L