HU221606B - Rapamicin (származékok) felismerésére képes monoklonális antitestek, ilyen antitesteket magukban foglaló immunvizsgáló készletek, ilyen antitesteket termelő hibridóma sejtvonalak és rapamicin-, valamint fehérje-molekularészből álló konjugátumok - Google Patents
Rapamicin (származékok) felismerésére képes monoklonális antitestek, ilyen antitesteket magukban foglaló immunvizsgáló készletek, ilyen antitesteket termelő hibridóma sejtvonalak és rapamicin-, valamint fehérje-molekularészből álló konjugátumok Download PDFInfo
- Publication number
- HU221606B HU221606B HU9501975A HU9501975A HU221606B HU 221606 B HU221606 B HU 221606B HU 9501975 A HU9501975 A HU 9501975A HU 9501975 A HU9501975 A HU 9501975A HU 221606 B HU221606 B HU 221606B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- rapamycin
- conjugate
- monoclonal antibodies
- monoclonal antibody
- derivative
- Prior art date
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 19
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims description 3
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 title 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 claims abstract description 168
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 claims abstract description 138
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 132
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 5
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 230000036765 blood level Effects 0.000 claims abstract description 3
- HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N Everolimus Chemical compound C1C[C@@H](OCCO)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N 0.000 claims description 17
- -1 2-Acetaminoethyl Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 8
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 7
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010027179 Tacrolimus Binding Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- 125000004945 acylaminoalkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- QOXOZONBQWIKDA-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropyl Chemical group [CH2]CCO QOXOZONBQWIKDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 18
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 31
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 26
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 26
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 8
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 8
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical class [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 6
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 5
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 5
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 4
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N palladium;triphenylphosphane Chemical compound [Pd].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CAEWJEXPFKNBQL-UHFFFAOYSA-N prop-2-enyl carbonochloridate Chemical compound ClC(=O)OCC=C CAEWJEXPFKNBQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004080 3-carboxypropanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 208000008720 Bone Marrow Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 201000006491 bone marrow cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- ZGEGCLOFRBLKSE-UHFFFAOYSA-N methylene hexane Natural products CCCCCC=C ZGEGCLOFRBLKSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 2
- DBGVGMSCBYYSLD-UHFFFAOYSA-N tributylstannane Chemical compound CCCC[SnH](CCCC)CCCC DBGVGMSCBYYSLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000006273 (C1-C3) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- LHHCLAXMAPLRRH-UHFFFAOYSA-N 3-bromo-1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound ON1C(=O)CC(Br)C1=O LHHCLAXMAPLRRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241001374849 Liparis atlanticus Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- ZDQSOHOQTUFQEM-PKUCKEGBSA-N ascomycin Chemical compound C/C([C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@]2(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)[C@@H](OC)C[C@@H](C)C\C(C)=C/[C@H](C(C[C@H](O)[C@H]1C)=O)CC)=C\[C@@H]1CC[C@@H](O)[C@H](OC)C1 ZDQSOHOQTUFQEM-PKUCKEGBSA-N 0.000 description 1
- ZDQSOHOQTUFQEM-XCXYXIJFSA-N ascomycin Natural products CC[C@H]1C=C(C)C[C@@H](C)C[C@@H](OC)[C@H]2O[C@@](O)([C@@H](C)C[C@H]2OC)C(=O)C(=O)N3CCCC[C@@H]3C(=O)O[C@H]([C@H](C)[C@@H](O)CC1=O)C(=C[C@@H]4CC[C@@H](O)[C@H](C4)OC)C ZDQSOHOQTUFQEM-XCXYXIJFSA-N 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004119 disulfanediyl group Chemical group *SS* 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000464 effect on transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001209 o-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C(C([H])=C1[H])[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1292—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
A találmány rapamicin és rapamicinszármazékok monoklonálisantitestjeire vonatkozik, amelyeket fel lehet használni például a vérhatóanyag-koncentrációjának az ellenőrzésére alkalmasvizsgálókészletek előállításához. A találmány tárgyát képezik maguk akifejezetten a rapamicin vagy a rapamicinszármazékok felismeréséreképes monoklonális an- titestek, az egy rapamicin- és egy fehérje-molekularészből összetevődő immunizáló konjugátumok, az említett mono-klonális antitestek létrehozására képes hibridóma sejtvonalak,valamint a létrehozott monoklonális antitesteket magukban foglalóimmunvizsgáló készletek. A találmány szerinti monoklonálisantitesteket úgy állítják elő, hogy a) immunizáló konjugátumotkészítenek olyan módon, hogy aktivált kapcsolócsoporttal rendelkezőrapamicint vagy rapamicinszármazékot immunizáló fehérjévelreagáltatnak; b) az a) pont szerint előállított immunizálókonjugátumot bejuttatják egy megfelelő állatfajhoz tartozó egyedszervezetébe immunizáló hatás kiváltása céljából, majd kinyerik azadott konjugátumra érzékenyített, antitesteket termelő sejteket; c) azadott, antitesteket termelő sejteket immortalizálják; és d) az egyikígy előállított, kiválasztott immortalizált sejtvonalból kinyerik azantitesteket. ŕ
Description
A találmány rapamicin és rapamicinszármazékok monoklonális antitestjeire vonatkozik, amelyeket fel lehet használni például a hatóanyag vérkoncentrációjának ellenőrzésére alkalmas vizsgálókészletek előállításához. A találmány tárgyát képezik maguk a kifejezetten a rapamicin felismerésére képes monoklonális antitestek, az egy rapamicinrészből és egy fehérjerészből álló immunizáló konjugátumok, az említett monoklonális antitestek létrehozására képes hibridóma sejtvonalak és a létrehozott monoklonális antitesteket magukban foglaló immunvizsgáló készletek.
A rapamicin egy, a Streptomyces hygroscopicus által előállított makrolid antibiotikum, amelynek már számos farmakológiai alkalmazása ismeretes. A rapamicint mindenekelőtt az immunreakciók gátlására használják, például az átültetett szervek szervezetből való kilökődésének megakadályozására, valamint az autoimmun betegségek megelőzésére és gyógykezelésére. Ezzel kapcsolatban azonban meg kell említeni, hogy a nagyobb dózisokban alkalmazott rapamicinnek mellékhatásai vannak, és bizonyos mértékig változik a rapamicin biológiai hasznosíthatósága is. így nagyon jó lenne, ha a rapamicinnel kezelt betegek vérében figyelemmel lehetne kisémi a rapamicinkoncentráció alakulását, mert ebben az esetben volna arra lehetőség, hogy a rapamicinadagolást úgy szabályozzák, hogy fennmaradjon az elegendő mértékű farmakológiai hatás kifejtéséhez szükséges minimális rapamicinkoncentráció, de ugyanakkor ne kelljen túl nagy veszéllyel számolni a mellékhatások miatt A rapamicin gyógyszerré való kifejlesztésének mindeddig az volt a nagy akadálya, hogy nem állt rendelkezésre olyan érzékeny és megbízható elemzés, amelyet klinikai körülmények között gyorsan és könnyen el lehetett volna végezni.
A rapamicinkoncentráció klinikai ellenőrzését lehetővé tevő vizsgálókészletek kifejlesztésére irányuló eddigi erőfeszítések nem voltak különösebben sikeresek. A 41 795 számú európai szabadalmi leírásban például egy olyan mikrobiológiai vizsgálatot ismertetnek, amellyel a rapamicinkoncentrációt a gombaellenes hatás függvényeként lehet mérni. A WO 92/02946. számú közzétett PCT-bejelentésben ismertetett vizsgálati módszer szerint a rapamicinkoncentrációt közvetetten mérik a makrofilinhez való versengő kötődés alapján. Mindkét vizsgálati módszer nehézkes és különösebben nem is érzékeny. Ráadásul ezeknél a vizsgálati módszereknél jelentős eredménybeli eltéréseket lehet tapasztalni már abban az esetben is, ha a vizsgálati körülmények kismértékben különböznek egymástól, ezért a különböző kórházakból származó vizsgálati eredmények összehasonlítása nehéz.
A szakirodalomban eddig nem számoltak be olyan monoklonális antitestekről, amelyek felismerik a rapamicint. A rapamicin tulajdonságai miatt nehéz előállítani ezeket az antitesteket, mert a rapamicin nem immunizál, hanem rendkívül erősen elnyomja az immunreakciókat. Fokozza a nehézségeket, hogy a szakirodalomban mindeddig nem azonosították a rapamicin anyagcseretermékeit, így nem könnyű felismerni azokat a monoklonális antitesteket, amelyek képesek különbséget tenni a rapamicin és annak anyagcseretermékei között.
A találmány olyan monoklonális antitestekre vonatkozik, amelyek nagymértékben érzékenyek rapamicinre. A találmány szerinti antitestek egy új immunizáló konjugátummal való beoltás hatására keletkeznek. Az oltóanyagként alkalmazott konjugátum új, immunizáló fehérjéhez kapcsolt rapamicinszánnazékot tartalmaz. Az ezeket az antitesteket alkalmazó vizsgálókészletek jól felhasználhatók klinikai körülmények között, és összehasonlíthatatlanul pontosabb, valamint reprodukálhatóbb eredményeket szolgáltatnak, mint az eddig ismert megoldások. Az antitesteket fel lehet használni a rapamicin tisztítására és elválasztására is.
Hasonló nehézségeket kell legyőzni ahhoz, hogy vizsgálókészleteket dolgozzunk ki olyan rapamicinszármazékokhoz, amelyek gátolják az immunreakciókat. Ezek közül a származékok közül különleges jelentőségük van a 40-O-származékoknak, vagyis azoknak a vegyületeknek, amelyek rapamicinből a ciklohexilgyűrű hidroxilcsoportjának - vagyis a 40-es helyzetben levő hidroxilcsoportnak - O-helyettesítésével jönnek létre. Ilyen - O-aril- és O-alkil- - rapamicinszármazékokat ismertetnek az 5 258 389. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és a WO 93/02604. számú PCT/EP szabadalmi bejelentésben. Ezeket a szabadalmi dokumentumokat a találmány leírását kiegészítő referenciaanyagnak tekintjük. Jelentőségüket tekintve. ezek közül a rapamicinszármazékok közül is kiemelkednek a 40-O-alkilezett rapamicinszármazékok, amelyek 40-O-szubsztituense alkilcsoport vagy helyettesített alkilcsoport, például hidroxi-alkil-csoport, hidroxi-alkoxi-alkil-csoport, acil-amino-alkil-csoport vagy amino-alkil-csoport. Az „alk-” vagy az „alkil-” kifejezés 1-6 szénatomos, egyenes vagy elágazó szénláncú alkilcsoportokra - előnyösen 1-3 szénatomos alkilcsoportokra - vonatkozik, amelyek szénláncát adott esetben megszakíthatja egy éterkötésű oxigén (-O-). Mindenekelőtt a 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicinről, a 40O-(3-hidroxi-propil)-rapamicinről, a 40-O-[2-(2-hidroxi)-etoxi]-etil-rapamicinről és a 40-O-[2-(acetamino)-etil]-rapamicinről van szó. A találmány kidolgozásakor így azt is célul tűztük ki, hogy monoklonális antitesteket biztosítsunk ezekhez a 40-O-származékokhoz. Ilyen antitesteket nemcsak a diagnosztikai vizsgálatokhoz, hanem az említett származékok tisztításához és előállításához is fel lehet használni.
A találmány szerinti új, immunizáló konjugátumok előállításához olyan új, aktivált rapamicinszármazékokat használunk fel, amelyekben a rapamicin-molekularész az egyik hidroxilcsoportjánál - célszerűen a rapamicinmolekula ciklohexilcsoportján, a 40-es helyzetben levő hidroxilcsoportjánál vagy a 28-as helyzetben levő hidroxilcsoportnál - hozzákötődik egy aktivált kapcsolócsoporthoz, vagyis egy olyan csoporthoz, amely fehérjékkel közvetlenül képes reagálni kovalens kötés létrehozásával, tehát nincs szükség kapcsolóanyagok - például karbodiimidszármazékok - alkalmazására ahhoz, hogy lehetségessé tegyük, lejátszathassuk vagy elősegítsük a rapamicinszármazékok és a fehér2
HU 221 606 Bl jék közötti reakciót. Az aktivált kapcsolócsoportnak van egy aktivált észter vagy karboxilcsoportja, azaz -CO-O-X általános képletű csoportja, ahol X jelentése karboxilcsoportot aktiváló csoport, például o-nitrofenil-csoport, p-nitro-fenil-csoport, 1-benztriazolilcso- 5 port, pentafluor-fenil-csoport vagy - mindenekelőtt N-szukcinimido-csoport. Vannak más kapcsolócsoportok is, például
i) az aktivált ditiocsoportok - így az -S-S-Z általános képletű csoportok, amelyek képletében Z jelenté- 10 se valamilyen ditioaktiváló csoport, például 2-piridilcsoport -, amelyek képesek hozzákapcsolódni a rapamicinhez; és ii) epoxicsoportok, például az epoxi-metil-csoport.
Az aktivált kapcsolócsoport észter-, éter-, amid-, 15 tio- vagy valamilyen más kötéssel, előnyösen azonban észterkötéssel kötődhet a rapamicinmolekulához. Az aktivált kapcsolócsoport legelőnyösebb esetben tartalmaz valamilyen biszésztermolekula-részt - például szukcinilcsoportot -, amely észterkötéssel kapcsolódik 20 egyik végén a rapamicinmolekulához, másik végén pedig az aktivált észtercsoporthoz vagy az aktivált karboxicsoporthoz.
A találmány megvalósításához előnyösen használhatók fel a (III) általános képletű rapamicinszármazékok, 25 amelyek az 1. reakciósorozat szerint állíthatók elő. A (I) képletű vegyület a rapamicin, amelyet
a) valamilyen acilezőszerrel - például valamilyen ciklusos anhidriddel vagy valamilyen, adott esetben az egyik funkciós csoportján O-védett formájú dikarbon- 30 savval - reagáltatunk megfelelő körülmények között, majd a keletkezett vegyületet szükség esetén mentesítjük a védőcsoporttól; és ezután
b) az a) művelet során előállított rapamicinszármazékot, amelynek (Π) általános képletében Y jelentése 35 valamilyen köztes molekularész - célszerűen rövid szénlánca, például 2-6 szénatomos alkiléncsoport, legcélszerűbben etiléncsoport -, aktiváljuk olyan módon, hogy reagáltatjuk valamilyen, a karboxilcsoport aktiválására képes csoporttal, például olyan csoporttal, amely- 40 nek HO-X általános képletében, X jelentése a már megadott, és így megkapjuk a (III) általános képletű aktivált rapamicinszármazékot.
Az egyik előnyösen alkalmazható, aktivált rapamicinszármazékot, a (III’) képletű szukcinimido-rapami- 45 cint például a II. reakciósorozat szerint lehet előállítani.
A (I) képletű rapamicint
a) DMAP és piridin jelenlétében borostyánkősavanhidriddel O-acilezve (ΙΓ) képletig 40-O-(3-karboxi)propanoil-rapamicint állítunk elő, amelyet azután 50
b) EDC, trietil-amin és metilén-klorid jelenlétében N-hidroxi-szukcinimiddel aktiválva megkapjuk a (IIP) képletű 40-O-szukcinimido-oxi-szukcinil-rapamicint, például olyan módon, ahogy majd az 1. példában részletesebben ismertetjük. A haptének (vagyis a nem teljes 55 antigének) - így a 40-es helyzetben kapcsolódó haptének - alkalmazásával előállított monoklonális antitestek rendszerint reakcióképesek lesznek mind a rapamicinnel, mind annak 40-O-származékával szemben, amint már említettük. Ilyen monoklonális antitesteket 60 ki lehet válogatni a továbbiakban ismertetésre kerülő módon olyan vegyületekhez, amelyek felismerik a rapamicin vagy a 40-O-rapamicin-származék valamelyik jellegzetes régióját, például a kötődoménban vagy az effektordoménban, amint ezt a későbbiekben ugyancsak ismertetjük.
Bizonyos esetekben olyan monoklonális antitestekre van szükség, amelyek nagyon érzékenyek a ciklohexilrégióban bekövetkezett módosulásokra, például különbséget tudnak tenni a rapamicin és annak 40-0származékai között, illetve azonosítani tudják a ciklohexilrégióban az anyagcseretermékeket. Ilyen esetekben előnyösebb, ha a heptén a 28-O-helyzetben és nem a 40-O-helyzetben kapcsolódik. így például R helyén O-védő csoportot vagy valamelyik, már megadott szubsztituenst - például hidroxi-alkil-csoportot, hidroxi-alkoxi-alkil-csoportot, acil-amino-alkil-csoportot vagy amino-alkil-csoportot - adott esetben védett formában tartalmazó, (A) általános képletű rapamicinszármazékokat az I. reakciósorozat szerint reagáltatunk, majd a keletkezett vegyületet adott esetben mentesítjük a védőcsoporttól. így megkapjuk az analóg 28-0aktivált hapténeket, például a (B) általános képletű vegyületeket.
A (B) általános képletben
- Rl jelentése hidrogénatom vagy valamelyik, már megadott O-szubsztituens, például hidroxi-alkilcsoport, hidroxi-alkoxi-alkil-csoport, acil-ami- tno-alkil-csoport vagy amino-alkil-csoport; i- Y jelentése a már definiált kapcsoló molekula- | rész; és |
- X jelentése a korábban már meghatározott, karbo- j xilcsoportok aktiválására képes csoportok vala- ; melyike. |
Abban az esetben, ha R valamilyen O-védő csoport | vagy valamilyen, oxigénatomon védett szubsztituens, I ennek a hapténnek az előállításához acilezőszerként f* adott esetben fel lehet például használni valamilyen, egyik funkciós csoportján O-védett (vagyis hemi-Ovédett formájú) dikarbonsavat, majd az acilezést követően egy művelet keretében el lehet távolítani mindkét
O-védő csoportot, még mielőtt a karboxilcsoportot aktiváló csoportot bejuttatnánk. így például a 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicin felismerésére képes monoklonális antitestek létrehozásához elő lehet állítani hapténeket olyan módon, hogy a primer hidroxilcsoportot megvédjük, a 28-as helyzetben levő hidroxilcsoportot valamilyen hemi-O-védett formájú dikarbonsawal acilezzük, majd a karboxilcsoportot aktiváljuk, például a ΙΠ. reak- ;
ciósorozat szerint.
A rapamicint magát a 28-as helyzetben levő oxigénatomon jobban lehet aktiválni, mint a 40-es helyzetben levő oxigénatomon. Úgy járunk el, hogy a 28-as helyzetben levő hidroxilcsoportot valamilyen hemi-Ovédett formájú dikarbonsawal acilezzük, majd a védőcsoport eltávolítása után aktiváljuk a karboxilcsoportot, például a IV. reakciósorozat szerint. « Az aktivált rapamicint vagy rapamicinszármazékot ezután hozzákapcsoljuk egy megfelelő immunizáló fe- r hérjéhez, például marhaszérum-albuminhoz (BSA), to3
HU 221 606 Bl jásfehéije-albuminhoz (ÓVA) vagy egy kúp alakú tengeri tapadócsiga (,keyhole limpet”) hemocianinjához (KHL), hogy immunizáló konjugátumot képezzünk.
A monoklonális antitesteket szokásos módszerek alkalmazásával, például a következő módon állítjuk elő: az 5 új immunizáló konjugátumot bejuttatjuk egy megfelelő fajhoz tartozó állat szervezetébe, hogy immunreakciót váltsunk ki, az említett konjugátumra érzékenyített, antitestet termelő sejteket kinyerjük, majd megfelelő csontvelődaganattal való fúzió útján immortalizáljuk, 10 és az így létrehozott, kiválasztott immortalizált sejtvonalból kinyerjük a monoklonális antitestet.
A találmány szerinti antitesteket fel lehet használni megfelelő vizsgálatokhoz. Néhány felhasználási lehetőség bizonyára nyilvánvaló az ezen a területen dolgozó 15 szakemberek számára. Az egyik ilyen lehetőség az antitest és valamilyen rapamicin nyomjelző felhasználásával végrehajtott kompetitív vizsgálat, amelyet például úgy valósíthatunk meg, hogy mikromérőhelyes lemezeket antitesttel vonunk be, majd a feltételezés szerint 20 rapamicint vagy rapamicinszármazékot tartalmazó tesztfolyadék - például a betegtől vett vérplazma vagy teljes vér - jelenlétében és távollétében kitesszük egy versengő vegyület, mégpedig például fluorral vagy radioaktív izotóppal jelzett - mindenekelőtt biotinilezett 25 - rapamicin hatásának. A lemezeket leöblítjük, majd mérjük az antitesthez kötődött, jelzett versengő vegyület mennyiségét, amely fordított arányban van a tesztfolyadékban levő rapamicin mennyiségével. A másik lehetőség az antitest, rapamicin/fehérje konjugátum és 30 megjelölt (például enzimmel megjelölt) nyomjelző antitestet felismerő patkány- vagy egér-IgG felhasználásával végzett ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), amelyet például úgy hajtunk végre, hogy mikromérőhelyes lemezeket bevonunk valamilyen rapami- 35 cin/fehérje konjugátummal (például a már ismertetett, rapamicinhez vagy 40-O-alkilezett rapamicinhez kapcsolt fehérjét tartalmazó immunizáló konjugátummal), a lemezeket ezután tesztfolyadék jelenlétében és távollétében antitest hatásának tesszük ki, majd öblítést 40 követően meghatározzuk a rapamicint tartalmazó konjugátumhoz kötődő antitestet olyan módon, hogy a nyomjelző antitestet a rapamicint tartalmazó konjugátumhoz kötődő antitesthez kapcsoljuk. A megkötődő antitest mennyisége ebben az esetben is fordítottan arányos a 45 tesztmintában levő rapamicin mennyiségével. A vizsgálatot mindegyik esetben hitelesítjük olyan tesztoldatokkal, amelyek ismert koncentrációban tartalmaznak rapamicint. Ehhez olyan vizsgálókészletről gondoskodunk, amely a következőket tartalmazza: 50 (i) a találmány szerinti monoklonális antitestet, célszerűen liofilizált formában vagy mikromérőhelyes lemezre felvitt bevonat alakjában; valamint adott esetben (ii) rapamicin/fehérje konjugátumot - adott esetben 55 lemezre felvitt bevonat formájában - és/vagy valamilyen megjelölt rapamicinszármazékot; továbbá adott esetben (iii) rapamicinoldatot a hitelesítéshez és a használati utasításhoz. 60
Ilyen készlettel meg lehet határozni a rapamicint 10 ng/ml alatti koncentrációkban, például 1 ng/ml alatti koncentrációkban, igy a 0,25-0,5 ng/ml koncentrációtartományban.
A találmány szerinti antitesteket lehet továbbá jellemezni azzal, hogy milyen a viszonylagos kötődési affinitásuk egy immungátló aszkomicinhez, például az FK-506-hoz. Az FK-506 olyan immungátló makrolid, amely bizonyos szerkezeti hasonlóságot mutat a rapamicinhez a kötődoménben. A rapamicinek (például a rapamicin és annak immungátló származékai) - csakúgy, mint az FK-506 - hozzákötődnek a makrofilinekhez (FKBP-khez). A feltételezések szerint a makrofilinhez való kötődés mindkét vegyület esetében szükséges, de nem elégséges feltétele az immungátló hatásnak. Ezzel kapcsolatban azonban meg kell említeni, hogy a rapamicin effektorrégiója teljesen más, mint az FK-506-é, és ennek a két vegyületnek a hatásmechanizmusa valójában teljesen különböző. (így például valószínűnek látszik, hogy az FK-506 immungátló hatása elsősorban az IL-2 átiródásának (transzkripciójának) akadályozásán alapul, míg a rapamicin nem gyakorol említésre méltó hatást a transzkripcióra.) A rapamicineket tehát azzal lehet jellemezni, hogy rendelkeznek egy FKBP-t megkötő doménnel és egy effektordoménnel, és meg lehet különböztetni az FKBP-t megkötő^ doménben módosított rapamicin-anyagcseretermékeket az effektordoménben módosítottaktól. A megkülönböz- f tetéshez fel lehet használni a találmány szerinti mono- * klonális antitesteket olyan módon, hogy például kompé-· i titív ELISA keretében FK-506-tal mérjük a találmány* { szerinti antitestek relatív kereszt-reakcióképességét; j
A nagy - például 50%-ot meghaladó - kereszt-reak- | cióképességgel rendelkező monoklonális antitestek fel- | ismerik a rapamicinnek az FK-506-hoz hasonló, £
FKBP-t megkötő doménjében levő epitópokat, a kis - J például 20%, optimális esetben 10% alatti - kereszt- f reakcióképességgel rendelkező monoklonális antitestek pedig felismerik a csak a rapamicinre jellemző effektorrégióban levő epitópokat.
A találmány szerinti antitesteket annak alapján is lehet osztályozni és jellemezni, hogy milyen mértékben képesek különbséget tenni a rapamicin és annak - például a már megadott - 40-O-szánnazékai között. Abban az esetben, ha olyan antitestekre van szükség, amelyek nem tesznek különbséget a rapamicin és annak 40-0származékai között, olyan antitesteket választunk, amelyek kereszt-reakcióképessége a rapamicin és a 40-0rapamicin-származékok vonatkozásában legalább 70%, = célszerűen több mint 90%. Ilyen esetben a monoklonális antitest előállításához felhasznált haptén előnyösen valamilyen 40-O-aktivált rapamicin, például a 1. reakciósorozat szerinti (III) általános képletű vegyületek valamelyike. Abban az esetben, ha arra van szükség, hogy különbséget tegyünk a rapamicin és annak 40-0származékai vagy anyagcsereterméke között, olyan antitesteket választunk, amelyek kereszt-reakcióképessége g az említett vegyületek vonatkozásában 30%-nál, előnyösen 10%-nál kisebb. Ebben az esetben az antitest előállí- ” tásához felhasznált haptén célszerűen valamilyen 28-04
HU 221 606 Bl aktivált rapamicin vagy rapamicinszármazék, például a (B) általános képletű vegyületek valamelyike.
1. példa
40-O-aktivált rapamicin előállítása
a) A rapamicin 40-O-hemiszukcinát származékának előállítása ml piridinben feloldunk 1,5 g (1,64 mmol) rapamicint és 0,577 g (5,77 mmol) borostyánkősavanhidridet, majd az így keletkezett oldathoz kevertetés közben hozzáadunk 195 mg (1,64 mmol) DMAP-t. Az így kapott elegyet a környezet hőmérsékletén 19 óra hosszat kevertetjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. A bepárlási maradékot etil-acetátban feloldjuk, majd a kapott oldatot vízzel háromszor mossuk. A szerves oldatot ezután vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, szűqük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. A bepárlási maradékot szilikagélen oszlopkromatográfiás eljárással tisztítjuk. Eluálószerként metilén-klorid és metanol 9:1 térfogatarányú elegyét használjuk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és - ismét oszlopkromatográfiás módszerrel - szilikagélen tisztítjuk. Eluálószerként metilén-klorid és metanol 19:1 térfogatarányú elegyét használjuk. Az oldószer csökkentett nyomáson végzett ledesztillálását követően fehér színű hab formájában kapjuk meg a 40-O-(3-karboxi-propanoil)-rapamicint [a (ΙΓ) képletű rapamicinhemiszukcinátot], amelynek a jellemző spektroszkópiai adatai a következők:
H-NMR (CDC13)Ő 2,68 (7H, m, H33, H25 és
O2CCH2CH2CO2H), 3,14 (3H, s és m, OCH3 és
H39), 3,34 (3H, s, OCH3), 3,38 (3H, s, OCH3), 4,68 (1H, m, H40), 4,68 (1H, m, H40), 4,72 (1H, széles s, 10-OH); MS (FAB) m/z 1036 ([M+Na]+), 982 ([M-CH3O]+), 964 ([M-(CH3O+H2O)]+), 946 ([M(CH3O+2H2O)]+).
b) 40-O-(szukcinimido-oxi-szukcinil)-rapamicin előállítása ml metilén-kloridban feloldunk az a) pont szerint előállított rapamicin-hemiszukcinátból 120 mg-ot (0,118 mmolt), továbbá 16,5 μΐ (0,118 mmol) trietilamint és 22,7 mg (0,118 mmol) EDC-t, majd az így keletkezett oldathoz kevertetés közben hozzáadunk 13,6 mg (0,118 mmol) N-hidroxi-szukcinimidet. A keletkezett elegyet a környezet hőmérsékletén 18 óra hosszat kevertetjük, etil-acetáttal felhígítjuk, majd vízzel kétszer mossuk. A szerves oldatot vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A bepárlási maradékot oszlopkromatográfiás módszerrel szilikagélen tisztítjuk. Eluálószerként etil-acetátot használunk. Ilyen módon fehér színű, habszerű anyag formájában kapjuk meg a II. reakciósorozat szerinti (ΙΙΓ) képletű 40-O-(szukcinimidooxi-szukcinil)-rapamicint, amelynek a jellemző spektroszkópiai adatai a következők:
H-NMR (DMSO) δ 2,67 (2H, ζ O2CCH2CH2CO2),
2,81 (7H, s, CH3O és a szukcinimid CH2 csoportja),
2,92 (2H, ζ O2CCH2CH2CO2), 455 (1H, m, H40),
5,26 (1H, d, 28-OH), 6,43 (1H, s, 10-OH); MS (FAB) m/z 1133 ([M+Na)+), 1111 ([M+H]+), 1092 ([M-H2O]+), 1079 ([M-CH3O]+), 1061 ([M(CH3O+H2O)]+), 1043 ((M-(CH3O+2H2O)J+).
2. példa
A rapamicin 28-O-aktivált 40-O-származékának előállítása
a) A 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicin 28-O-hemiszukcinátjának előállítása
Metilén-klorid és piridin 10:1 térfogatarányú elegyének 2,2 ml-ében feloldunk 958 mg (1,00 mmol) 40-0(2-hidroxi-etil)-rapainicint, a keletkezett oldatot 0 °Cra hűtjük, és kevertetés közben hozzáadunk 0,160 ml (1,50 mmol) klór-hangyasav-allil-észtert. A kapott elegyet 0 °C-on tovább kevertetjük, majd 3, illetve 4 óra elteltével két-két részletben beadagolunk 0,080 ml (1,00 mmol) piridint és 0,053 ml (0,50 mmol) klórhangyasav-allil-észtert. Az említett vegyületek második részletének beadagolása után a kevertetést még egy órán keresztül folytatjuk, majd a reakciót 1 M vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat adagolásával befagyasztjuk. Az igy keletkezett elegyet etil-acetáttal háromszor extraháljuk. A szerves oldatot először 1 N vizes sósavoldattal, majd 1 N vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, végül vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal megszárítjuk, szűrjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. A bepárlási maradékot szilikagélen oszlopkromatográfiás módszerrel tisztítjuk. Eluálószerként hexán és etil-acetát 1:1 térfogatarányú elegyét használjuk. Ilyen módon fehér színű, habszerű anyag formájában kapjuk meg védett formában az aUil-oxi-karbonil-vegyületet, amely a III. reakciósorozat (2) képletű vegyülete.
Az előző bekezdés szerint előállított vegyületből 208 mg-ot (0,200 mmolt) feloldunk 2 ml metilén-kloridban, a keletkezett oldatot 0 °C-ra hűtjük, majd hozzáadunk először 2,4 mg (0,020 mmol) DMAP-t és 82 mg (0,400 mmol) DCC-ζ azután - 0,5 ml metilén-kloridban feloldva - 63 mg (0,400 mmol) monoallil-szukcinátot. A reakcióelegyet 0 °C-on 14 (sa hosszat kevertetjük, majd a keletkezett szuszpenziót átszűijük zsugorított üvegtölcséren. A szerves oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk. A bepárlási maradékot szilikagélen oszlopkromatográfiás módszerrel tisztítjuk. Eluálószerként hexán és etil-acetát 30:70 térfogatarányú elegyét használjuk. Ilyen módon fehér színű, habszerű anyag formájában kapjuk meg a III. reakciósorozat (3) képletű vegyületét.
Az előző bekezdés szerint előállított vegyületből 177 mg-ot (0,150 mmolt) feloldunk 5 ml metilén-kloridban. A kapott oldathoz kevertetés közben hozzáadunk 17,3 mg (0,015 mmol) tetrakisz(trifenil-foszfin)palládiumot és 0,080 ml (0,3 mmol) tributil-ón-hidridet. Az így kapott sárga színű oldatot a környezet hőmérsékletén 2 órán át kevertetjük, etil-acetáttal hígítjuk, hideg 2 N vizes citromsavoldattal egyszer, telített vizes nátrium-klorid-oldattal pedig háromszor mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A bepárlási maradékot szilikagélen oszlopkromatográfiás módszerrel tisztítjuk. Eluálószerként etil-acetát és metanol 85:15 térfogatarányú elegyét használjuk. Ilyen módon halványsár5
HU 221 606 Bl ga színű, olajszerű anyag formájában megkapjuk a ΠΙ. reakciósorozat (4) képletű hemiszukcinátját.
b) 28-O-(szukcinimido-oxi-szukcinil)-40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicin előállítása
2,5 ml metilén-kloridban feloldunk 53 mg 5 (0,050 mmol) a) pont szerinti hemiszukcinátot, majd az igy keletkezett oldathoz hozzáadunk 2 mg DMAP-t, mg (0,125 mmol) EDC-t és 14 mg (0,125 mmol) Nhidroxi-szukcinimidet. Az így kapott elegyet 2 óra hosszat kevertetjük a környezet hőmérsékletén, majd a 10 reakciót befagyasztjuk 1N vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal. A keletkezett elegyet etil-acetáttal háromszor extraháljuk. A szerves tézist vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk, vízmentes nátrium-szultéttal szárítjuk, szűrjük, majd bepá- 15 roljuk. Ilyen módon megkapjuk a III. reakciósorozat (5) képletének megfelelő aktivált hapténti amelyet további tisztítás nélkül használunk fel a fehérje/haptén konjugátum előállításához. Ennek az aktivált hapténnek a jellemző spektroszkópiai adatai a következők: 20 •H-NMR (CDC13)Ö 2,43 (1H, dd, H33a),
2,50-2,98 (10H, m, H25, H33b, a szukcinát hidrogénatomjai, a szukcinimid hidrogénatomjai), 3,58 (2H, m, H6b, a hidroxi-etil-csoport egyik hidrogénatomja), 3,68 (3H, m, H16, a hidroxi-etil-cso- 25 port két hidrogénatomja), 3,81 (2H, m, H14, a hidroxi-etil-csoport egyik hidrogénatomja), 3,93 (1H, d, H27), 5,28 (2H, m, H2, H30), 5,34 (1H, d, H28);
MS (FAB) 1161 ([M+Li]+).
3. példa
28-O-aktivált rapamicin előállítása
a) A rapamicin 28-O-hemiszukcinátjának előállítása
Metilén-klorid és piridin 10:1 térfogatarányú elegyében feloldunk 914 mg (1,00 mmol) rapamicint, 35 majd a keletkezett oldatot 0 °C-ra hűtjük, és kevertetés közben beadagolunk 0,212 ml (2,00 mmol) klórhangyasav-allil-észtert. Három óra elteltével beadagolunk további 0,080 ml (1,000 mmol) mennyiségű piridint és 0,053 ml (0,50 mmol) mennyiségű klór- 40 hangyasav-allil-észtert. A kevertetést még egy óra hosszat folytatjuk, majd a reakciót 1 M vizes nátriumhidrogén-karbonát-oldat beadagolásával befagyasztjuk.
A keletkezett elegyet metil-tercier-butil-éterrel háromszor extraháljuk. A szerves oldatot először hideg 1N vi- 45 zes sósavoldattal, majd 1N vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, végül telített vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk és vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk.
A szűrés és csökkentett nyomáson végzett bepárlás után kapott maradékot szilikagélen oszlopkromatográ- 50 fiás módszerrel tisztítjuk. Eluálószerként hexán és etilacetát 70:30 térfogatarányú elegyét használjuk. Ilyen módon fehér színű, habszerű anyag formájában kapjuk meg védett formában a IV. reakciósorozat (2) képletének megfelelő allil-oxi-karbonil-vegyületet. 55
Az előző bekezdés szerint előállított vegyületből 400 mg-ot (0,400 mmolt) feloldunk 5 ml metilén-kloridban, majd a keletkezett oldatot 0 °C-ra hűtjük. A hűtött oldathoz hozzáadunk kevertetés közben először 4,8 mg (0,040 mmol) DMAP-ot és 164 mg (0,800 mmol) 60
DCC-t, majd - 1 ml metilén-kloridban feloldva 127 mg (0,800 mmol) monoallil-szukcinátot. A reakcióelegyet -15 °C-on kevertetjük 14 óra hosszat, majd a keletkezett szuszpenziót átszűrjük zsugorított üvegszűrővel ellátott tölcséren. A szerves oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk, és a bepárlási maradékot szilikagélen oszlopkromatográfiás módszerrel tisztítjuk. Eluálószerként hexán és metil-tercier-butil-éter elegyét használjuk. Ilyen módon fehér színű, habszerű anyag formájában kapjuk meg a IV. reakciósorozat (3) képletének megfelelő vegyületet.
Az előző bekezdés szerint előállított vegyületből 285 mg-ot (0,250 mmolt) feloldunk 5 ml metilén-kloridban, majd az így keletkezett oldathoz kevertetés közben hozzáadunk 28,8 mg (0,025 mmol) tetrakisz(trifenil-foszfin)-palládiumot és 0,133 ml (0,5 mmol) tributil-ón-hidridet. Az így kapott sárga színű oldatot 1 óra hosszat kevertetjük a környezet hőmérsékletén, majd metil-tercier-butil-éterrel hígítjuk, hideg 2 N vizes citromsavoldattal kétszer, telített vizes nátrium-kloridoldattal pedig háromszor mossuk, vízmentes nátriumszultéttal szárítjuk, szűrjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A bepárlási maradékot szilikagélen oszlopkromatográfiás módszerrel tisztítjuk. Eluálószerként metil-tercier-butil-éter és metanol (90:10)-(60:40) térfogatarányú elegyeit használjuk. Ilyen módon halványsárga színű, olajszerű anyag formájában kapjuk meg a IV. reakciósorozat (4) képletű vegyületének megfelelő 28O-rapamicm-hemiszukcinátot.
b) 28-O-(szukcinimido-oxo-szukciml)-rapamicin előállítása
Az a) pont szerint előállított termékből 51 mg-ot (0,050 mmolt) feloldunk 2 ml metilén-kloridban, majd az így keletkezett oldathoz hozzáadunk 2 mg DMAP-t; 24 mg (0,125 mmol) EDC-t és 14 mg (0,125 mmol) Nhidroxi-szukcinimidet. A kapott elegyet 4 óra hosszat kevertetjük a környezet hőmérsékletén, majd a reakciót 1N vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat beadagolásával befagyasztjuk. Az igy keletkezett elegyet metil-tercier-butil-éterrel háromszor extraháljuk. A szerves oldatot vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk, vízmentes nátrium-hidrogén-karbonáttal szárítjuk, szüljük és bepároljuk. Ilyen módon kapjuk meg aktivált formában a cim szerinti vegyületet, amelyet további tisztítás nélkül használunk fel a fehérje/haptén konjugátum előállítására. A cím szerinti vegyület jellemző spektroszkópiai adatai a következők:
•H-NMR (CDC13)ö 2,43 (1H, dd, H33a),
2,55-3,02 (11H, m, H25, H33b, H39, szukcinát-hidrogének, szukcinimid-hidrogének), 3,56 (IH, m, H6b), 3,68 (IH, dd, H16), 383 (IH, m, H14), 3,93 (IH, d, H27), 5,28 (2H, m, H2, H30), 5,34 (IH, d, H28); MS (FAB) 1117 ([M+Li]+).
4. példa
Immunizáló konjugátumok előállítása
a) 40-O-kapcsolódású rapamicinkonjugátumok előállítása
Az 1. példa szerinti, 40-O-helyzetben aktivált rapamicinből 17,4 mg-ot feloldunk 400 μΐ dimetil-forma6
HU 221 606 Bl midban vagy dimetil-szulfoxidban. Az így keletkezett oldatból 120 μΐ - vagyis 5,22 mg aktivált rapamicint tartalmazó - mennyiséget erőteljes kevertetés közben cseppenként hozzáadunk egy olyan oldathoz, amely 2 ml 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát-pufferoldatban 5 (pH=7,7) 8 mg KLH-t tartalmaz. A reakcióelegyet 2 órán át a környezet hőmérsékletén kevertetjük, majd a keletkezett rapamicin/KLH konjugátumot 4 °C-on 48 órán át végzett dialízissel (5 1 PBS, 3X) tisztítjuk.
A kapott konjugátumot adott esetben tovább tisztítjuk 10 mikromennyiségek tőményítésére alkalmas csövek felhasználásával végzett centrifugálással. Ugyanilyen módon állítjuk elő a KLH BSA-val vagy OVA-val való helyettesítésével a rapamicin/BSA, illetve a rapamicin/OVA konjugátumokat. 15
b) 28-O-kapcsolódású (40-O-helyzetben adott esetben alkilezett) rapamicinkonjugátumok előállítása
A 2. példa szerinti, 28-O-helyzetben aktivált vegyületből 5 mg-ot feloldunk 2 ml dimetil-szulfoxidban, 20 majd az így kapott oldatot erőteljes keverés közben cseppenként hozzáadjuk egy olyan oldathoz, amely 1 ml 50 mM foszfátos pufferoldatban (pH=7,3) feloldva 5 mg KLH-t tartalmaz. A reakcióelegyet a környezet hőmérsékletén 2 órán át kevertetjük, majd a keletkezett 25 konjugátumot 4 °C-on 48 órán át végzett dialízissel (21 PBS, 3X) tisztítjuk. Ugyanilyen módon állítjuk elő BSA-val és OVA-val is a konjugátumokat. A 3. példa szerinti, 28-O-helyzetben aktivált vegyület felhasználásával ugyanezzel az eljárással lehet rapamicint a 28-as hely- 30 zetben KLH-hoz, BSA-hoz és OVÁ-hoz kapcsolni.
5. példa
Monoklonális antitest előállítása
a) Monoklonális antitest előállítása rapamicinhez 35
Monoklonális antitestet állítunk elő hagyományos módon, lényegében a Köhler és Milstein által ismertetett eljárással [Natúré, 256. 49.]. 20-25 g-os nőstény Balb/C egerekbe négy helyen bőr alá fecskendezünk 10 vagy 50 pg mennyiségű, 4a) példa szerinti, 40-0- 40 kapcsolódású, immunizáló rapamicin/KLH konjugátumot 0,2 ml teljes Freund-adjuvánsban. Két hét múlva ugyancsak bőr alá - emlékeztető injekciót fecskendezünk be, amely 0,2 ml nem teljes Freund-adjuvánsban ugyanolyan mennyiségű immunizáló konjugátumot tar- 45 talmaz, mint az első injekció. Az állatok vérszérumában levő antigénnel szemben reakcióképes antitestek jelenlétéről a 6. példában ismertetésre kerülő közvetlen ELISA-val győződünk meg. Az egereket adott esetben szétválogatjuk aszerint, hogy antitestjük az effektorré- 50 gióval vagy az FKBP-t megkötő régióval szemben rendelkezik-e affinitással. (Az előbbi esetben kismértékű, az utóbbi esetben pedig nagymértékű a kereszt-reakcióképesség az FK-506-ra vonatkoztatva.) Az 1. ábrán például koncentrációgörbék láthatók egy olyan egér ese- 55 tében (Ml), amelyben nagy a rapamicin kötődoménjéhez affinitással rendelkező antitest koncentrációja, valamint egy olyan egér esetében (M7), amelyben viszonylag nagy a rapamicin effektordoménjéhez affinitással rendelkező antitest koncentrációja. Azok az egerek, 60 amelyeknek vérszérumában maximális a megfelelő jellemzőkkel rendelkező antitest koncentrációja, 10 pg antigént tartalmazó emlékeztető injekciókat kapnak a -3.
napon (a megadott mennyiség felét intraperitoneálisan, másik felét pedig intravénásán fecskendezzük be), valamint intraperitoneálisan a -2. és a -1. napon. A 0. napon az egereket megöljük, és elkülönített lépsejtjeiket
PAI-0 sejtekkel vagy más megfelelő csontvelődaganat-sejtvonallal egyesítjük. Az így kapott hibridőmákat tenyésztés után az ELISA alkalmazásával osztályozzuk, hogy olyan antitest jusson érvényre, amelynek nagy az affinitása a rapamicinhez.
b) Monoklonális antitest előállítása 40-(hidroxietil)-rapamicinhez
Nőstény Balb/C egerekbe négy helyen bőr alá fecskendezünk 0,2 ml teljes Freund-adjuvánsban 10 vagy 50 pg mennyiségű, 4b) példa szerinti immunizáló 40(hidroxi-etil)-rapamicin/KLH konjugátumot. Két hét múlva - ugyancsak bőr alá - emlékeztető injekciót fecskendezünk be, amely 0,2 ml nem teljes Freundadjuvánsban emulgeálva ugyanolyan mennyiségű immunizáló konjugátumot tartalmaz, mint az első injekció. Az állatok vérszérumában levő antigénnel szemben reakcióképes antitestek jelenlétét a már ismertetett módon (közvetlen ELISA) vizsgáljuk. Ezenkívül az egereket a továbbiakban szétválogatjuk aszerint, hogy antitestjük a 40-O-régióban BSA/rapamicin konjugátum vagy BSA/40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicin konju- f gátum hozzákapcsolásával módosított rapamicinmole- I kulával szemben rendelkezik-e nagyobb affinitással.» f így kapunk mind olyan antitesteket, amelyek hozzákap- | csolódnak a 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicin-konjugá- J tumhoz, de nem kapcsolódnak hozzá a konjugált rapamicinhez, mind olyan antitesteket, amelyek hozzákapcsolódnak úgy a 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicin-konjugátumhoz, mint a rapamicinkonjugátumhoz. Azok az egerek, amelyek vérszérumában maximális a megfelelő jellemzőkkel rendelkező antitest koncentrációja, 10 pg antigént tartalmazó emlékeztető injekciókat kapnak a -3. napon (a megadott mennyiség felét intraperitoneálisan, a másik felét pedig intravénásán fecskendezzük be), valamint intraperitoneálisan a -2. és a -1. napon.
A 0. napon az egereket megöljük, és elkülönített lépsejtjeiket PAI-0 sejtekkel egyesítjük. Az így kapott hibridómákat tenyésztés után ELISA alkalmazásával osztályozzuk, hogy olyan antitest jusson érvényre, amelynek nagy az affinitása a 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicinhez.
6. példa
Enzimhez kötődő immunszorbens vizsgálat (ELISA) a) ELISA rapamicinhez
Mikromérőhelyes lemezeket bevonunk olyan oldattal, amely PBS-milliliterenként 1-2 pg rapamicin/BSA konjugátumot tartalmaz. A bevont lemezeket 2 óra hosszat 37 °C-on tartjuk, majd a bevonatot PBS felhasználásával készült 2 m%-os BSA-oldattal 37 °C-on 1 órán keresztül telítjük. A lemezeket ezt követően 0,05 m%-os Tween-PBS-eleggyel háromszor mossuk. r
Az osztályozni kívánt hibridóma-felülúszókat felhígit7
HU 221 606 Bl juk PBS felhasználásával készült 1 m%-ps BSA-oldattal, majd az így keletkezett elegyet a környezet hőmérsékletén egy éjszakán át (vagy 4 °C-on 18 óra hosszat vagy 37 °C-on 2 óra hosszat) inkubáljuk A megkötött antitest koncentrációját úgy mérjük hogy szubsztrátum- 5 ként p-nitro-fenil-foszfáttal alkalikus foszfatázhoz kapcsolt antiegér IgG kecskeglobulint használunk. Két órán át 37 °C-on inkubálunk majd az enzimes szubsztrátumot a környezet hőmérsékletén 1 órán keresztül hidrolizáljuk. Ezután 405 nm-en mérjük az abszorpció- 10 képességet. A nagy affinitású monoklonális antitestek előállításához ezután kiválogatjuk a hibridómákat.
Rapamicint ismert koncentrációkban tartalmazó oldatok (például vérszérum-milliliterenként 1-140 ng rapamicint tartalmazó oldatok) felhasználásával standard 15 görbéket veszünk fel, hogy meghatározzuk egy kiválasztott antitest affinitását a rapamicinhez. A 2. ábra például - amelyen egy standard görbe látható a mi M791-es monoklonális antitestünkhöz - szemlélteti, hogy a rapamicinnel szemben mutatott nagymértékű specifi- 20 kussága alapján kiválasztott monoklonális antitest a rapamicint még igen alacsony koncentráció - 0,25 ng/ml - esetén is képes kimutatni.
Az antitesteket jellemezni lehet továbbá a rapamicin effektordoménjéhez vagy FKBP-t megkötő do- 25 ménjéhez való kötődésükkel is, amelyet úgy mérünk, hogy a rapamicin/BSA konjugátumhoz hasonló módon előállítható FK-506/BSA konjugátummal bevont mikromérőhelyes lemezek felhasználásával analóg közvetlen ELISA-t végzünk A 3. ábrán például összeha- 30 sonlítjuk 17 kiválasztott antitestnek a rapamicin/BSA konjugátum és az FK-506 felhasználásával végzett vizsgálatai során mért kötődési szintjeit, a 4. ábrán pedig a kereszt-reakcióképességet szemléltetjük százalékban kifejezve. A rapamicin/BSA konjugátumhoz, valamint az 35 FK-506/BSA konjugátumhoz való kötődések összehasonlításával igen kis affinitású monoklonális antitesteket mutatunk ki.
Az előbb ismertetett közvetlen ELISA-t át lehet alakítani kompetitív ELISA-vá olyan módon, hogy valami- 40 lyen versengő vegyületet adagolunk a monoklonális antitestet tartalmazó oldathoz, és a versengő vegyület jelenlétében, valamint távollétében méijük a konjugátumhoz kötődő monoklonális antitest mennyiségét. Abban az esetben, ha a versengő vegyület FK-506 vagy 45 rapamicin, illetve rapamicinszármazék, a versengő vegyületet - például 1 mg/ml koncentrációjú - etanolos oldat formájában közvetlenül adjuk hozzá a monoklonális antitestoldathoz (például 2 μ1/200 μΐ mennyiségben mérőhelyenként), majd a mikromérőhelyes lemezen vé- 50 gezzük el a hígítást Az 5. ábrán például inhibíciós görbe látható, amelyet úgy vettünk fel, hogy különböző koncentrációkban jelen levő szabad rapamicin mellett mértük az M7-91-es antitest (M7.91.13) kötődését a BSA/rapamicin konjugátumhoz. Ha ilyen kompetitív 55 ELISA-k keretében hasonlítjuk össze a monoklonális antitestek kötődését a szabad FK-506-hoz, illetve a szabad rapamicinhez, a rapamicin és az FK-506 közötti kereszt-reakcióképesség láthatóan kisebb, mint a közvetlen ELISA-nál. A monoklonális antitestek kiválasztá- 60 sához előnyös ilyen kompetitív vizsgálatot végezni, mert a feltételezések szerint van néhány olyan monoklonális antitest, amelynek túl kicsi lehet az affinitása ahhoz, hogy az oldatban szabad formában jelen levő antigénje kötődjék. Ezek a monoklonális antitestek azonban bivalensen vagy polivalensen kötődhetnek olyan multimer antigénhez, amely egy terjedelmes fehéijemolekulához kötődve sok haptént tartalmaz szorosan egymás mellett. A kompetitív vizsgálatok kizátják az ilyen, kis affinitással rendelkező antitesteket. Ilyen kompetitív vizsgálat eredményeit mutatjuk be a 6. ábrán, amelyen összehasonlítható a viszonylag kis kereszt-reakcióképességű M7-91-es antitest (M7.91.13) a viszonylag nagy kereszt-reakcióképességű Ml-303-as antitesttel (Ml.303.3).
b) ELISA 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicinhez
Ezt az ELISA-t az a) pontban ismertetett eljárással analóg módon hajtjuk végre. Mikromérőhelyes lemezeket bevonunk 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicin/BSA konjugátummal, a bevonatot BSA-val telitjük, majd mossuk. Az osztályozni kívánt hibridóma-felülúszókat 4 °C-on 18 óra hosszat vagy 37 °C-on 2 óra hosszat inkubáljuk. A megkötődött antitest mennyiségét olyan módon méijük, hogy szubsztrátumként p-nitro-fenilfoszfáttal alkalikus foszfatázhoz kapcsolt antiegér IgG kecskeglobulint alkalmazunk. Párhuzamos ELISA-t végzünk megkötött rapamicin/BSA konjugátum felhasználásával, hogy kiválogathassunk olyan monoklo- ínális antitesteket, amelyek képesek megkülönböztetni a k
40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicint a rapamicintől. f
A 7. ábrán például a következő hibridómák felülúszói- í nak abszorpcióképességét szemléltetjük: i
- az ábrán mint BSA-28-RAD szereplő B3-203-as i hibridóma, amely szelektíven kötődik a 40-0-(2- | hidroxi-etil)-rapamicin/BSA konjugátumhoz f [7 A. ábra]; [
-B3-113-as hibridóma, amely felismeri mind a *
40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicin/BSA konjugátumot, mind a BSA-hoz a 28-as helyzetben kapcsolódó rapamicint [7B. ábra]; és
- B3-164-es hibridóma, amely az előbbieken kívül felismeri azt a rapamicint is, amely a 40-es helyzetben kapcsolódik a BSA-hoz [7C. ábra],
A továbbiakban méijük az antitesteknek a 40-0-(2hidroxi-etil)-rapamicinnel szemben mutatott relatív affinitását a rapamicinhez való affinitásra vonatkoztatva.
A mérést úgy végezzük el, hogy „versenyeztetjük” a 40-0-(2-hidroxi-etil)-rapamicin/BSA konjugátumot oldatban szabadon jelen levő 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicinnel vagy rapamicinnel abban, hogy mennyi antitestet tudnak megkötni. A 8. ábrából például kitűnik, hogy a B3-203-as hibridóma által termelt antitestek kis rapamicinnel szembeni kereszt-reakcióképességet mutatva élénken reagálnak a 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicinnel [8A) ábra], ugyanakkor a B3-113-as és a B3164-es hibridóma által termelt antitestek ugyanolyan jól kötődnek a 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicinhez, |g mint a rapamicinhez [8B. és 8C. ábra]. A B3-22-es, a B3-127-es és a B3-156-OS hibridóma is azok közé a r hibridómák közé tartozik, amelyek olyan antitesteket
HU 221 606 BI termelnek, amelyek 10-100-szor nagyobb mennyiségben kötődnek a 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicinhez, mint a rapamicinhez. Vannak olyan hibridómák is például a B3-29-es, a B3-265-ös és a B3-539-es -, amelyek olyan antitesteket termelnek, amelyek ugyanolyan jól kötődnek a rapamicinhez, mint a 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicinhez.
Ha már a kívánt antitestet kiválasztottuk, ugyanezt az ELISA-t alkalmazzuk arra, hogy a betegek vérében meghatározzuk a rapamicinkoncentrációkat. Egy ennek a példának megfelelő vizsgálókészletben lenne például liofilizált formában egy vagy több kiválasztott antitest, egy rapamicinkonjugátummal - például rapamicin/BSA konjugátummal vagy 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicin/BSA konjugátummal - bevont mikromérőhelyes lemez, egy rapamicin-standard, valamint egy használati utasítás. A kit adott esetben tartalmazhatna továbbá egy izotóppal jelölt rapamicinszármazékot is a kompetitív vizsgálatokhoz. Kiegészítésképpen lehet még a készletben olyan antiegér IgG/enzim konjugátum és szubsztrátum, amelyet a korábbiakban már ismertettünk. A készletet megvásárló személy a találmány szerinti monoklonális antitestet felhasználhatja a saját maga által kidolgozott ELISA keretében vagy más vizsgálati módszerek keretében is.
Claims (13)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Monoklonális antitestek, azzal jellemezve, hogy rapamicint vagy 40-O-alkilezett származékát specifikusan felismerni képesek.
- 2. Az 1. igénypont szerinti monoklonális antitestek, azzal jellemezve, hogy rapamicin vagy 40-O-alkilezett származékának FKBP-kötő részén levő epitópot felismerni képesek.
- 3. Az 1. igénypont szerinti monoklonális antitestek, azzal jellemezve, hogy rapamicin vagy 40-O-alkilezett származékának effektor részén levő epitópot felismerni képesek.
- 4. Eljárás az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy:a) aktivált kapcsolócsoportot tartalmazó rapamicint vagy 40-O-alkilezett származékát reagáltatjuk egy immunogén proteinnelb) az így nyert immunogén konjugátumot egy megfelelő állatfajhoz tartozó egyed szervezetébe juttatjuk az immunogén hatás kiváltása céljából, majd a konjugátumra érzékenyített, antitestet termelő sejteket kinyerjük,c) a monoklonális antitestet termelő sejteket immortalizáljuk, ésd) az így kapott, kiválasztott immortalizált sejtvonalból a monoklonális antitestet kinyeijük.
- 5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy a 40-O-alkilezett rapamicinben jelen levő 40-O-alkil-szubsztituens hidroxi-aklil-, hidroxi-alkoxi-alkil-, acil-amino-alkilvagy amino-alkil-csoport lehet.
- 6. Az 5. igénypont szerinti monoklonális antitestek, azzal jellemezve, hogy a 40-O-alkilezett rapamicini) 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicin;ii) 40-O-(3-hidroxi-propil)-rapamicin;iii) 40-O-[2-(hidroxi)-etoxi]-etil-rapamicin; és iv) 40-O-(2-acetamino-etil)-rapamicin.
- 7. Az előző igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy képes megkülönböztetni a rapamicint és az 5. és 6. igénypontban leírtak szerinti 40-O-alkilezett rapamicint.
- 8. Immunogén konjugátum, azzal jellemezve, hogy egy rapamicinrészből és egy proteinrészből áll.
- 9. Eljárás a 8. igénypont szerinti immunogén konjugátum előállítására, azzal jellemezve, hogy egy proteint egy aktivált kapcsolócsoportot tartalmazó rapamicinszármazékkal reagáltatunk.
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás immunogén konjugátum előállítására, azzal jellemezve, hogy a rapamicinszármazékkénti) 40-O-szukcinimid-oxi-szukcinil-rapamicint, ii) 28-O-szukcinimido-oxi-szukcinil-rapamicint, vagy iii) 28-O-(szukcmimido-oxi-szukcinil)-40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicint alkalmazunk.
- 11. Aktivált kapcsolócsoportot tartalmazó rapamicinszármazék, azzal jellemezve, hogyi) 40-O-szukcinimid-oxi-szukcinil-rapamicin, ii) 28-O-szukcinimido-oxi-szukcinil-rapamicin, vagy iii) 28-O-(szukcinimido-oxi-szukcinil)-40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicin.
- 12. Hibridóma sejtvonal, azzal jellemezve, hogy az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitest előállítására képes.
- 13. Immunoassay kit rapamicin vagy 40-O-alkilezett rapamicinszármazék vérszintjének mérésére, azzal jellemezve, hogy az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet tartalmaz.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB939307491A GB9307491D0 (en) | 1993-04-08 | 1993-04-08 | Organic compounds |
| PCT/EP1994/001006 WO1994024304A1 (en) | 1993-04-08 | 1994-03-30 | Rapamycin assay |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9501975D0 HU9501975D0 (en) | 1995-08-28 |
| HUT72835A HUT72835A (en) | 1996-05-28 |
| HU221606B true HU221606B (hu) | 2002-11-28 |
Family
ID=10733650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9501975A HU221606B (hu) | 1993-04-08 | 1994-03-30 | Rapamicin (származékok) felismerésére képes monoklonális antitestek, ilyen antitesteket magukban foglaló immunvizsgáló készletek, ilyen antitesteket termelő hibridóma sejtvonalak és rapamicin-, valamint fehérje-molekularészből álló konjugátumok |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8039599B1 (hu) |
| EP (1) | EP0693132B1 (hu) |
| JP (4) | JP3397325B2 (hu) |
| KR (2) | KR100404162B1 (hu) |
| CN (1) | CN1080312C (hu) |
| AT (1) | ATE161289T1 (hu) |
| AU (1) | AU677321B2 (hu) |
| BR (1) | BR9406210A (hu) |
| CZ (1) | CZ284431B6 (hu) |
| DE (1) | DE69407402T2 (hu) |
| DK (1) | DK0693132T3 (hu) |
| ES (1) | ES2110230T3 (hu) |
| FI (1) | FI110670B (hu) |
| GB (1) | GB9307491D0 (hu) |
| GR (1) | GR3025753T3 (hu) |
| HU (1) | HU221606B (hu) |
| NO (1) | NO320470B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ265051A (hu) |
| PL (1) | PL185855B1 (hu) |
| RU (1) | RU2175672C2 (hu) |
| SK (1) | SK280048B6 (hu) |
| WO (1) | WO1994024304A1 (hu) |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE40596E1 (en) * | 1993-04-08 | 2008-12-02 | Novartis Ag | Rapamycin assay |
| GB9307491D0 (en) | 1993-04-08 | 1993-06-02 | Sandoz Ltd | Organic compounds |
| ES2176245T3 (es) | 1993-04-23 | 2002-12-01 | Wyeth Corp | Anticuerpos de ramapicinas de ciclo abierto. |
| US7279561B1 (en) | 1993-04-23 | 2007-10-09 | Wyeth | Anti-rapamycin monoclonal antibodies |
| GB9318612D0 (en) * | 1993-09-08 | 1993-10-27 | Sandoz Ltd | An assay |
| US5635406A (en) * | 1995-06-07 | 1997-06-03 | Abbott Laboratories | Stabilized standards and calibrators containing rapamycin and tacrolimus bound to anti-rapamycin and anti-tacrolimus antibodies |
| CN1235608A (zh) * | 1996-09-09 | 1999-11-17 | 美国家用产品公司 | 烷基化的雷帕霉素衍生物 |
| AU740304B2 (en) * | 1997-04-09 | 2001-11-01 | Isotechnika Inc. | Method for production of antibodies to specific sites of rapamycin |
| US6709873B1 (en) | 1997-04-09 | 2004-03-23 | Isodiagnostika Inc. | Method for production of antibodies to specific sites of rapamycin |
| DE19951684A1 (de) * | 1999-10-27 | 2001-05-03 | Aventis Pharma Gmbh | Neuer immunologischer Assay zur Bestimmung von C-peptidhaltigen Kontaminanten in Proben von Humanisulin und dessen Derivaten |
| US7193065B2 (en) * | 2001-07-13 | 2007-03-20 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Protease inhibitor conjugates and antibodies useful in immunoassay |
| US7157561B2 (en) * | 2001-07-13 | 2007-01-02 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Methods of inhibiting transmission of a costimulatory signal of lymphocytes |
| US20040243224A1 (en) * | 2003-04-03 | 2004-12-02 | Medtronic Vascular, Inc. | Methods and compositions for inhibiting narrowing in mammalian vascular pathways |
| US20050176080A1 (en) * | 2004-02-10 | 2005-08-11 | Vani Bodepudi | Hapten, immunogens and derivatives of ascomycin useful for preparation of antibodies and immunoassays |
| CA2558596A1 (en) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Astellas Pharma Inc. | Anti fk778 antibodies and high sensitive immunoassay methods |
| EP1730525B1 (en) * | 2004-03-10 | 2013-06-19 | Seradyn, Inc. | Immunoassays for everolimus |
| US7445916B2 (en) | 2004-04-14 | 2008-11-04 | Wyeth | Process for preparing rapamycin 42-esters and FK-506 32-esters with dicarboxylic acid, precursors for rapamycin conjugates and antibodies |
| US20110104186A1 (en) | 2004-06-24 | 2011-05-05 | Nicholas Valiante | Small molecule immunopotentiators and assays for their detection |
| MX2007001676A (es) * | 2004-08-10 | 2007-04-12 | Wyeth Corp | Derivados de 42-ester de rapamicina con acido 2,2-bis(hidroximetil)propionico y metodos para hacer los mismos. |
| US8021849B2 (en) | 2004-11-05 | 2011-09-20 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Methods and kits for the determination of sirolimus in a sample |
| AU2006225382B2 (en) * | 2005-03-21 | 2013-05-09 | Cytacoat Ab | An antimicrobial agent comprising a cysteine compound covalently bound to a substrate, in particular by binding through an S-S bridge via a spacer molecule |
| US7189582B2 (en) | 2005-04-27 | 2007-03-13 | Dade Behring Inc. | Compositions and methods for detection of sirolimus |
| US20080081379A1 (en) * | 2006-07-13 | 2008-04-03 | Sigler Gerald F | Homogeneous double receptor agglutination assay for immunosuppressant drugs |
| US7883855B2 (en) | 2006-07-21 | 2011-02-08 | Abbott Laboratories | Immunosuppressant drug extraction reagent for immunoassays |
| FR2908658B1 (fr) * | 2006-11-20 | 2011-11-11 | Centre Nat Rech Scient | Composition pour la prevention et/ou le traitement des maladies associees a la surexpression du tnf et/ou de l'il-12 |
| US7914999B2 (en) | 2006-12-29 | 2011-03-29 | Abbott Laboratories | Non-denaturing lysis reagent |
| EP2118657B1 (en) | 2006-12-29 | 2014-05-21 | Abbott Laboratories | Non-denaturing lysis reagent for use with capture-in-solution immunoassay |
| WO2008082979A2 (en) | 2006-12-29 | 2008-07-10 | Abbott Laboratories | Diagnostic test for the detection of a molecule or drug in whole blood |
| CA2673296C (en) | 2006-12-29 | 2012-10-16 | Abbott Laboratories | Improved assay for immunosuppressant drugs |
| US20080287675A1 (en) * | 2007-05-18 | 2008-11-20 | Abbott Laboratories | Cascade system |
| US9901567B2 (en) | 2007-08-01 | 2018-02-27 | Syntarga B.V. | Substituted CC-1065 analogs and their conjugates |
| US20110097733A1 (en) | 2009-10-27 | 2011-04-28 | Michel Anciaux | Process for the production of a hybridoma and antibody obtained therefrom, able to recognize more than one vitamin d metabolite |
| DK3056203T3 (da) | 2010-04-21 | 2018-01-29 | Syntarga Bv | Konjugater af cc-1065-analoger og bifunktionelle linkere. |
| BR112014032916A2 (pt) * | 2012-06-28 | 2017-08-01 | Pfizer | anticorpos anti-fármacos e usos destes para o monitoramento de fármaco |
| CN105899237B (zh) | 2014-01-10 | 2019-09-03 | 斯索恩生物制药有限公司 | 用于治疗子宫内膜癌的倍癌霉素adc |
| KR102344354B1 (ko) | 2014-01-10 | 2021-12-28 | 비온디스 비.브이. | 향상된 생체내 항종양 활성을 나타내는 듀오카르마이신 adc |
| EP3197919A1 (en) * | 2014-09-22 | 2017-08-02 | Synthon Biopharmaceuticals B.V. | Pan-reactive antibodies to duocarmycins |
| JP7319362B2 (ja) | 2018-11-02 | 2023-08-01 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | マクロフィリン結合医薬アッセイに使用するための結合競合剤およびその使用方法 |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5169773A (en) * | 1984-10-04 | 1992-12-08 | Sandoz Ltd. | Monoclonal antibodies to cyclosporins |
| DE3587505T2 (de) | 1984-10-04 | 1994-01-05 | Sandoz Ag | Monoklonale antikörper gegen zyklosporine. |
| US4650803A (en) | 1985-12-06 | 1987-03-17 | University Of Kansas | Prodrugs of rapamycin |
| ATE98700T1 (de) | 1987-06-05 | 1994-01-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Anti-fr-900506-stoffe-antikoerper und hoechstempfindliches enzym-immunoassay-verfahren. |
| JPH02495A (ja) * | 1987-12-25 | 1990-01-05 | Tosoh Corp | モノクローナル抗体、その製法及びそれを用いた測定法 |
| CA2039541A1 (en) * | 1990-04-05 | 1991-10-06 | Ethel B. Jacobson | Monoclonal antibodies to avermectins |
| EP0473961B1 (en) * | 1990-08-15 | 1996-01-03 | Abbott Laboratories | Immunoassay reagents and method for determining cyclosporine |
| US5130307A (en) | 1990-09-28 | 1992-07-14 | American Home Products Corporation | Aminoesters of rapamycin |
| PT98990A (pt) * | 1990-09-19 | 1992-08-31 | American Home Prod | Processo para a preparacao de esteres de acidos carboxilicos de rapamicina |
| US5120842A (en) * | 1991-04-01 | 1992-06-09 | American Home Products Corporation | Silyl ethers of rapamycin |
| US5100883A (en) | 1991-04-08 | 1992-03-31 | American Home Products Corporation | Fluorinated esters of rapamycin |
| US5322772A (en) | 1991-04-09 | 1994-06-21 | Children's Research Institute | Rapamycin assay |
| US5118678A (en) | 1991-04-17 | 1992-06-02 | American Home Products Corporation | Carbamates of rapamycin |
| FI921595A (fi) * | 1991-04-17 | 1992-10-18 | American Home Prod | Rapamycinkarbamater |
| US5194447A (en) | 1992-02-18 | 1993-03-16 | American Home Products Corporation | Sulfonylcarbamates of rapamycin |
| US5118677A (en) | 1991-05-20 | 1992-06-02 | American Home Products Corporation | Amide esters of rapamycin |
| US5514544A (en) * | 1991-07-26 | 1996-05-07 | Eli Lilly And Company | Activator gene for macrolide biosynthesis |
| US5151413A (en) | 1991-11-06 | 1992-09-29 | American Home Products Corporation | Rapamycin acetals as immunosuppressant and antifungal agents |
| US5177203A (en) | 1992-03-05 | 1993-01-05 | American Home Products Corporation | Rapamycin 42-sulfonates and 42-(N-carboalkoxy) sulfamates useful as immunosuppressive agents |
| GB9221220D0 (en) * | 1992-10-09 | 1992-11-25 | Sandoz Ag | Organic componds |
| US5258389A (en) | 1992-11-09 | 1993-11-02 | Merck & Co., Inc. | O-aryl, O-alkyl, O-alkenyl and O-alkynylrapamycin derivatives |
| GB9307491D0 (en) | 1993-04-08 | 1993-06-02 | Sandoz Ltd | Organic compounds |
| US5504091A (en) | 1993-04-23 | 1996-04-02 | American Home Products Corporation | Biotin esters of rapamycin |
| AU6711994A (en) | 1993-04-23 | 1994-11-21 | American Home Products Corporation | Rapamycin conjugates and antibodies |
| ES2176245T3 (es) | 1993-04-23 | 2002-12-01 | Wyeth Corp | Anticuerpos de ramapicinas de ciclo abierto. |
| US6187547B1 (en) * | 1993-09-08 | 2001-02-13 | Novartis Ag | Assay kit |
-
1993
- 1993-04-08 GB GB939307491A patent/GB9307491D0/en active Pending
-
1994
- 1994-03-30 WO PCT/EP1994/001006 patent/WO1994024304A1/en active IP Right Grant
- 1994-03-30 ES ES94913093T patent/ES2110230T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-30 DK DK94913093.4T patent/DK0693132T3/da active
- 1994-03-30 AT AT94913093T patent/ATE161289T1/de active
- 1994-03-30 RU RU95119595/13A patent/RU2175672C2/ru active
- 1994-03-30 KR KR10-2002-7004572A patent/KR100404162B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-03-30 EP EP94913093A patent/EP0693132B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-30 KR KR1019950704410A patent/KR100347166B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-03-30 HU HU9501975A patent/HU221606B/hu unknown
- 1994-03-30 NZ NZ265051A patent/NZ265051A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-30 AU AU65377/94A patent/AU677321B2/en not_active Expired
- 1994-03-30 BR BR9406210A patent/BR9406210A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-03-30 JP JP52268294A patent/JP3397325B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-30 SK SK1257-95A patent/SK280048B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-03-30 DE DE69407402T patent/DE69407402T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-30 CN CN94191718A patent/CN1080312C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-30 PL PL94310967A patent/PL185855B1/pl unknown
- 1994-03-30 CZ CZ952583A patent/CZ284431B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-09-14 FI FI954319A patent/FI110670B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-10-06 NO NO19953975A patent/NO320470B1/no not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-12-23 GR GR970403403T patent/GR3025753T3/el unknown
-
2000
- 2000-06-02 US US09/585,743 patent/US8039599B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-01-09 US US09/757,212 patent/US6635745B2/en not_active Ceased
- 2001-03-19 JP JP2001078335A patent/JP2001302698A/ja active Pending
- 2001-08-20 US US09/933,104 patent/US8039600B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-05-02 JP JP2002130451A patent/JP4287619B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-03-22 JP JP2006079344A patent/JP2006249090A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU221606B (hu) | Rapamicin (származékok) felismerésére képes monoklonális antitestek, ilyen antitesteket magukban foglaló immunvizsgáló készletek, ilyen antitesteket termelő hibridóma sejtvonalak és rapamicin-, valamint fehérje-molekularészből álló konjugátumok | |
| EP1206493B1 (en) | Monoclonal antibodies to tacrolimus and immunoassay methods for tacrolimus | |
| AU2013305884A1 (en) | Antibodies to risperidone haptens and use thereof | |
| JP2004149542A (ja) | ラパマイシン結合体及び抗体 | |
| US20080206788A1 (en) | Reagents and methods for the detection and quantification of vancomycin in biological fluids | |
| USRE40596E1 (en) | Rapamycin assay | |
| CA2156397C (en) | Rapamycin assay | |
| US6797479B2 (en) | Reagents and methods for the detection and quantification of vancomycin in biological fluids | |
| CA2559998C (en) | Rapamycin conjugates and antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: NOVARTIS AG., CH |