DE69407402T2

DE69407402T2 - Repamycinbestimmung

Info

Publication number: DE69407402T2
Application number: DE69407402T
Authority: DE
Inventors: Valerie Ch-4123 Allschwil Quesniaux; Richard Ch-4054 Basle Sedrani
Original assignee: Ciba Geigy AG; Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1993-04-08
Filing date: 1994-03-30
Publication date: 1998-06-04
Anticipated expiration: 2014-03-31
Also published as: HU221606B; JP2003024065A; NO320470B1; HU9501975D0; DK0693132T3; US6635745B2; KR100347166B1; FI954319A0; GR3025753T3; US20020002273A1; PL310967A1; AU677321B2; SK280048B6; SK125795A3; AU6537794A; NZ265051A; PL185855B1; FI110670B; CN1120854A; JP3397325B2

Description

Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen Rapamycin und Rapamycinderivate, die beispielsweise in Testkits zur Überwachung der Arzneimittelblutspiegel brauchbar sind.
Rapamycin ist ein Makrolidantibiotikum, das von Streptomyces hygroscopicus gebildet wird, und sich in einer Vielzahl an Anwendungen als brauchbar erwiesen hat, insbesondere als Immunsuppressivum, beispielsweise zur Verwendung bei der Behandlung und Prävention der Organtransplantatabstoßung und Autoimmunerkrankungen. Rapamycin weist jedoch in höheren Dosierungen Nebenwirkungen auf und hat eine etwas variable Bioverfügbarkeit. Die Überwachung der Blutspiegel von Rapamycin bei Patienten, die mit Rapamycin behandelt werden, ist daher sehr wünschenswert, um in der Lage zu sein, die Dosierung so zu regulieren, um den minimalen Spiegel der für die pharmakologische Aktivität ausreicht, zu halten und um jedes unangemessene Risiko für Nebenwirkungen zu vermeiden. Das Fehlen eines empfindlichen und verläßlichen Tests, der schnell und einfach in eineni klinischen Einsatz durchgeführt werden kann, war ein Haupthindernis bei der Entwicklung von Rapamycin als Pharmazeutikum.
Frühere Versuche, Testkits für die klinische Überwachung von Rapamycin zu entwickeln, waren nicht sehr erfolgreich. Die EP-A 041 795 beschreibt beispielsweise einen mikrobiologischen Test. in dem die Rapamycinkonzentration als eine Funktion der Antipilzaktivität gemessen wird. Die WO-A 92/02946 liefert ein Testsystem, das die Rapamycinspiegel indirekt durch Messung der Konkurrenz um die Bindung an Makrophilin mißt Diese beiden Tests sind aufwendig und nicht besonders empfindlich. Noch entscheidender ist, daß diese beiden Tests eine beträchtliche Variation unter leicht unterschiedlichen Testbedingungen aufweisen, was den Vergleich von Testergebnissen aus verschiedenen Krankenhäusern erschwert.
Es existieren keine früheren Berichte über monoklonale Antikörper, die Rapamycin erkennen. Es existieren inhärente Schwierigkeiten bei der Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Rapamycin, da Rapamyein nicht immunogen und für sich extrem immunsuppressiv ist. Darüberhinaus ist es schwierig einen monoklonalen Antikörper zu identifizieren, der zur Unterscheidung zwischen Rapamycin und dessen Metaboliten fähig ist, da die Metaboliten von Rapamycin in der Literatur nicht gut charakterisiert sind.
Die EP-A 0 450 936 bezieht sich auf antiparasitäre Verbindungen in Form eines Avermectinkomplexes, wobei der Komplex durch die Fermentation von Streptomyces averinitilis MA-4680 gebildet wird, und beschreibt ferner die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die für einen solchen Averniectinkomplex spezifisch sind. Die EP-A 0 524 832 bezieht sich auf Makrolidantibiotika, die unter anderem durch unterscluedliche Streptomyces Stämme herstellbar sind. Die AN 90-053405 und die JP-A 2 000 495 beziehen sich auf einen Subtilisininlubitor von Streptomyces und monoklonalen Antikörpern dagegen.
Die vorliegende Erfindung liefert monoklonale Antikörper, die gegenüber Rapamycin hochempfindlich sind. Die erfindungsgemäßen Antikörper werden in Reaktion auf eine Inokulation mit einem neuen immunogenen. Konjugat hergestellt, das ein neues Rapaniycinderivat unifaßt, das an ein immunogenes Protein gekuppelt ist Testkits, die diese Antikörper verwenden, sind für die Verwendung in einem klinischen Einsatz gut geeignet und liefern weit akuratere und reproduzierbarere Ergebnisse als dies vorher möglich war. Die Antikörper sind auch zur Reinigung und Isolierung von Rapamycin geeignet.
Die Bereitstelluiig von Testsystemen für immunsuppressive Rapamycinderivate stellt ähnliche Herausforderungen. Von besonderem Interesse sind 40-O-rapamycinderivate, das heißt Rapaniycine, die am Hydroxy des Cyclohexylrings (Position 40) O-substituiert sind, wie dies beispielsweise in US-A 5 258 389 und WO-A 93/02604 (O-Aryl- und O-Alkylrapamycine) beschrieben ist (die hiermit beide eingeführt sind), insbesondere 40-O-alkylierte Rapamycine, bei denen der 40-O-Substituent Alkyl oder ein substituiertes Alkyl ist, beispielsweise Hydroxyalkyl, Hydroxyalkoxyalkyl, Acylaminoalkyl oder Aniinoalkyl, worin "Alk-" oder "Alkyl" sich auf C&sub1;.&sub6; Alkyl bezieht, verzweigt oder linear, vorzugsweise C&sub1;&submin;&sub3; Alkyl, worin die Kohlenstollkette wahlweise durch eine Etherbindung (-O-) unterbrochen sein kann, vor allem 40-O-(2-Hydroxyethyl)rapamycin, 40-O-(3-Hydroxypropyl)-rapamycin, 40-O-[2-(2-Hydroxy)ethoxy]ethyl-rapamycin und 40-O-(2-Acetaminoethyl)-rapamycin. Daher ist ein weiteres Ziel der Erfindung die Bereitstellung von monoklonalen Antikörpern gegen solche 40-O-Denvate. Solche Antikönper sind in diagnostischen Tests und auch bei der Reinigung und Herstellung der Derivate brauchbar.
Die neuen aktivierten Rapaniycinderivate, die zur Herstellung der neuen immunogenen Konjugate der Erfindung verwendet werden, sind Rapamycine, die durch eine der Hydroxygruppen am Rapamycin, vorzugsweise der Hydroxygruppe, die am Cyclohexylteil von Rapamycin liegt (Position 40) oder der Hydroxygruppe in der Position 28, an eine aktivierte Kupplungsgruppe gebunden sind, das heißt eine Gruppe, die zur direkten Reaktion mit einem Protein unter Bildung einer kovalenten Bindung fähig ist, ohne daß die Verwendung eines Kupplungsmittels (beispielsweise Carbodiimidreagentien) erforderlich ist, um die Reaktion mit dem Protein zu ermöglichen, bewirken oder fördern. Vorzugsweise weist die aktivierte Kupplungsgruppe eine aktivierte Ester- oder Carboxygruppe auf, das heißt der Formel -CO-O-X, worin X für eine carboxyaktivierende Gruppe steht, wie o- oder p- Nitrophenyl, 1-Benztriazol, Pentafluorphenyl oder (insbesondere) N-Succinimido. Andere geeignete aktivierte Kupplungsgruppen sind beispielsweise i) aktivierte Dithiognippen, beispielsweise der Formel -S-S-Z, worin Z eine Dithioaktivierungsgruppe ist, wie 2-Pyridyl, die an das Rapamycin gebonden sein kann, oder ii) Epoxygruppen. beispielsweise Epoxymethyl. Die aktivierte Kupplungsgruppe kann an das Rapamycin über eine Ester-, Ether- Amid-, Thio oder andere geeignete Bindung gebonden sind, die Esterbindung ist aber bevorzugt. Am bevorzugtesten enthält die aktivierte Kupplungsgruppe einen Bisesterrest, beispielsweise Succinyl, der an einem Ende eine Esterbindung zum Rapamycin bildet und am anderen Ende einen aktivierten Ester oder eine aktivierte Carboxygruppe aufweist.
Die bevorzugten erfindungsgemaßen Rapamycinderivate sind die der folgenden Formel III, die gemäß Reaktion I hergestellt werden: Reaktion I
worin die Formel I Rapamycin darstellt, das a) mit einem Acylierungsmittel, beispielsweise einem cyclischen Anhydrid oder einer Dicarbonsäure (wahlweise in hemi-O-geschützter Form) unter geeigneten Bedingungen umgesetzt wird und erforderlichenfalls eine Schutzgruppenabspaltung erfolgt, um das Rapamycin der Formel II zu erhalten, worin Y für einen Spacerrest stellt, vorzugsweise ein niederes Alkylen, beispielsweise C&sub2;&submin;&sub6; Alkylen, vor allem Ethylen. Dieses Rapamycin der Forniel II wird dann b) durch eine Umsetzung mit einer carboxyaktivierenden Gruppe umgesetzt, beispielsweise der Formel HO-X, worin X wie oben definiert ist, um das aktivierte Rapamycin der Formel III zu erhalten.
Ein bevorzugtes aktiviertes Rapaniycinderivat ist das Succinimidoderivat der folgenden Formel III', das beispielsweise gemäß Reaktion II hergestellt wird: Reakton II
worin die Formel I Rapamycin darstellt, das a) mittels Bernsteinsäureanhydrid in Gegenwart von DMAP und Pyridin unter Bildung des Rapamycinhemisuccinats der Formel II' (40-O-(3-Carboxy)propanoyl-rapamycin) umgesetzt wird, das dann b) mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von EDC, Et&sub3;N und CH&sub2;Cl&sub2; unter Bildung des 40- O-Succinimidooxysuccinylrapamycins der Formel III' aktiviert wird, beispielsweise wie dies ausführlicher später in Beispiel 1 beschrieben ist. Monoklonale Antikörper, die mittels eines Haptens wie diesem hergestellt werden, das über die Position 40 gebunden ist, reagieren normalerweise kreuz zwischen Rapamycin und einem 40-O- Rapamycinderivat, wie dies oben beschrieben ist. Solche inonoklonalen Antikörper können ausgewählt werden, wie dies später für Verbindungen beschrieben ist, die eine bestimmte Region des Rapamycin oder 40-O- Rapamycinderivats erkennen, beispielsweise in der Bindungsdomäne oder Effektordomäne, wie dies später beschrieben ist.
Es ist in einigen Fällen wünschenswert, nionoklonale Antikörper zu haben, die sich durch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Modifikationen in der Cyclohexylregion auszeichnen, beispielsweise zur Unterscheidung zwischen Rapamycin und 40-O-Rapamycinderivaten oder zur Identifizierung von Metaboliten in der Cyclohexylregion. In einem solchen Fall wird das Hapten vorzugsweise über die 28-O-Position statt über die 40-O- Position gebunden. Beispielsweise wird das Rapamycinderivat der Formel A Formel A
worin R für eine O-Schutzgruppe oder einen wie oben beschriebenen Substituenten steht, beispielsweise Hydroxyalkyl, Hydroxyalkoxyalkyl, Acylaminoalkyl oder Aminoalkyl wahlweise in geschützer Form, gemäß Reaktion I umgesetzt, erforderlichenfalls werden die Schutzgruppen abgespalten, um das analoge 28-O-aktivierte Hapten zu ergeben, beispielsweise eine Verbindung der Formel B Formel B
worin R1 flir R steht oder einen wie oben beschriebenen O-Substituenten, beispielsweise Hydroxyalkyl, Hydroxyalkoxyalkyl, Acylaminoalkyl oder Aminoalkyl, Y für einen wie oben definierten Linkerrest steht und X für eine wie oben definierte carboxyaktivierende Gruppe steht. Bei der Herstellung des Haptens, worin R für ein O- Schutzgruppe oder einen O-geschützten Substituenten steht, kann das Acylierungsmittel wahlweise beispielsweise eine Dicarbonsäure in hemi-O-geschützter Form sein, so daß nach der Acylierung beide O-Schutzgruppen in einem Schritt vor der Zugabe der carboxyaktivierenden Gruppe entfernt werden können. Beispielsweise können Haptene zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, die zur Erkennung von 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin fähig sind, durch Schützen der primären Hydroxygruppe, Acylierung des Hydroxy an der Position 28 mit einer Dicarbonsäure in der hemi-O-geschützten Form, Abspalten der Schutzgruppen Lind Aktivierung der Carboxygruppe beispielsweise gemaß Reaktion III hergestellt werden: Reaktion III
Ähnlich kann Rapamycin selbst am 28-O statt am 40-O durch O-Schutz des C40 Hydroxy, Acylierung der Hydroxygruppe in der Position 28 mit einer heini-O-geschützten Dicarbonsäure, Schutzgruppenabspaltung und Aktivierung der Carboxygruppe, beispielsweise gemäß Reaktion IV aktiviert werden: Reaktion IV
Das aktivierte Rapamycin oder Rapamycinderivat wird dann an ein geeignetes immunogenes Protein, beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA), Ovalbumin (OVA) oder Keyhole limpet Hämocyanin (KLH) unter Bildung eines immunogenen Konjugats gebunden. Monoklonale Antikörper werden mittels herkömmlicher Techniken hergestellt, beispielsweise durch Verabreichung des neuen immunogenen Konjugats an eine geeignete Tierart, um eine immunogene Provokation auszulösen und Gewinnen der Antikörper-bildenden Zellen, die gegen dieses Konjugat sensibilisiert sind, Immortalisierung dieser Antikörper-bildenden Zellen durch Fusion mit einem geeigneten Myelom und Gewinnen der monoklonalen Antikörper aus einer ausgewählten immortalisierten Zellinie, die so etabliert wurde.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können dann in einem geeigneten Test verwendet werden. Dem Fachmann sind mehrere Möglidikeiten bekannt. Ein Ansatz ist ein konipetitiver Test unter Verwendung eines Antikörpers und eines Rapamycintracers, worin beispielsweise Mikrotiterplatten mit einem Antikörper beschichtet und einem Kompetitor ausgesetzt werden, der ein markiertes (beispielsweise fluoreszenz- oder radioaktiv markiertes, insbesondere biotinyliertes) Rapamycin ist, in Gegenwart Lind Abwesenheit der Testflüssigkeit, die möglicherweise ein Rapamycin enthalten dürfte beispielsweise Plasma oder Vollblut vorn Patienten Die Platten werden gewaschen und die Menge an markiertem Kompetitor, der an den Antikörper gebunden hat, wird gemessen, wobei die Menge sich umgekehrt mit der Rapamycinmenge in der Testflüssigkeit verändert. Ein weiterer Ansatz ist ein ELISA unter Verwendung von Antikörper, Rapamycin-Protein-Konjugat und markiertem (beispielsweise enzymmarkiertem) Tracerantikörper, der IgG der Maus erkennt, worin beispielsweise die Mikrotiterplatten mit einem Rapamycin-Protein-Konjugat (beispielsweise dem oben beschriebenen immunogenen Konjugat, das ein an ein Rapamycin oder ein 40-O-alkyliertes Rapamycin gebundenes Protein umfaßt) beschichtet werden, in Gegenwart und Abwesenheit der Testflüssigkeit einem Antikörper ausgesetzt werden, gewaschen werden, und der an das Rapamycinkonjugat gebundene Antikörper durch die Bindung des Tracerantikörpers an den an das Rapamycinkonjugat gebundenen Antikörper detektiert wird. Wieder variiert die Menge an gebundenem Antikörper umgekehrt mit der Menge an Rapaniycin in der Testprobe. In einem anderen Fall wird der Test mit Testlösungen standardisiert, die bekannte Konzentrationen an Rapamycin enthalten. Daher wird ein Testkit bereitgestellt, der umfaßt (i) den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, vorzugsweise in lyophilisierter Form oder auf einer Mikrotiterplatte beschichtet, und der (ii) wahlweise auch ein Rapamycin-Protein-Konjugat umfaßt, das wahlweise auf einer Platte beschichtet ist, und/oder ein markiertes Rapamycinderivat und der (iii) ferner wahlweise eine Rapamycinlösung zur Standardisierung und Anleitungen zum Gebrauch umfaßt. Ein solcher Kit ist zur Detektion von Rapamycin in Konzentrationen unter 10 ng/ml, beispielsweise unter 1 ng/ml und von so wenig wie beispielsweise 0,25-0,5 ng/ml fähig.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können ferner durch ihre relative Bindungsaffinität an ein immunsuppressives Ascomycin charaktierisiert werden, beispielsweise FK-506. FK-506 ist ein immunsuppressives Makrolid, das einige Strukturähnlichkeit zu Rapamycin in der Bindungsdomäne aufweist. Rapamycine (beispielsweise Rapamycin und dessen immunsuppressive Derivate) und FK-506 binden beide an Makrophiline (FKBPs) und für beide dürfte die Bindung an Makrophilin eine Notwendigkeit aber kein ausreichendes Kriterium für die immunsuppressive Aktivität sein. Die Effektorregion von Rapamycin unterscheidet sich jedoch ziemlich von FK-506 und tatsächlich haben die zwei Verbindungen ziemlich unterschiedliche Wirkluechanismen. (FK-506 scheint beispielsweise eine Inmmunsuppression primär durch die Unterdrtickung der IL-2 Transkription zu verursachen, während Rapamycin keinen signifikanten Effekt auf die IL-2 Transkription hat.) Rapamycine können daher so charakterisiert werden, daß sie eine FKBP Bindungsdomäne und eine Effektordomäne aufweisen und es kann eine Unterscheidung zwischen Rapamycinderivaten gemacht werden, die in der FKBP Bindungsdoniäne modifiziert werden gegenüber denen, die in der Effektordomäne modifiziert werden. Diese Unterscheidung kann mit monoklonalen Antikörpern der Erfindung durch die Messung der relativen Kreuzreaktivität der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper mit FK-506 (die Kreuzreaktivität kann beispielsweise in einem kompetitiven ELISA gemessen werden): Monoklonale Antikörper, die ein hohes Maß an Kreuzreaktivität aufweisen (beispielsweise mehr als 50 %) erkennen Epitope in der FKBP Bindungsdoniäne von Rapamycin, die zu der von FK-506 ähnlich ist und monoklonale Antikörper. mit eineni geringen Maß an Kreuzreaktivität ( beispielsweise welliger als 20 %, optimal weniger als 10 %) erkennen Epitope in der Effektorregion, die für Rapamycine einzigartig ist.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch gemäß ihrer Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Rapamycin und eineni 40-O-Rapamycinderivat gescreent Lind charakterisiert werden, wie dies beispielsweise oben definiert ist. Wo es erwünscht ist. daß die Antikörper nicht zwischen Rapaniycin und einem 40-O- Rapamycinderivat unterscheiden, werden Antikörper ausgewählt, die zumindest 70 %, vorzugsweise mehr als 90 % Kreuzreaktivität zwischen Rapamycin und einem 40-0-Derivat hiervon aufweisen. In einem solchen Fall ist das zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers verwendete Hapten vorzugsweise ein 40-O-aktiviertes Rapamycin, beispielsweise eines der Formel III in Reaktion 1. Wo es gewünscht wird, zwischen Rapamycin und einem 40-O- Derivat oder einem Metboliten von Rapamycin zu unterscheiden, werden Antikörper ausgewählt, die weniger als 30 %, vorzugsweise weniger als 10 % Kreuzreaktivität hierzu aufweisen. In diesem Fall ist das zur Herstellung des Antikörpers verwendete Hapten vorzugsweise ein 28-O-aktiviertes Rapamycin oder Rapamycinderivat, beispielsweise der Formel B.

BEISPIEL 1 - Herstellung eines 40-O-aktivierten Rapamycins

a) Herstellung des 40-O-Hemisuccinats von Rapamycin

Zu einer gerührten Lösung von 1,5 g (1,64 mmol) Rapamycin und 0,577 g (5,77 mmol) Bernsteinsäureanhydrid in 12 ml Pyridin werden 195 mg (1,64 mmol) DMAP gegeben. Das entstehende Gemisch wird bei Raumtemperatur für 19 h gerührt und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird in Etliylacetat gelöst und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie auf Silicagel mittels 9:1 CH&sub2;Cl&sub2;-MeOH gereinigt. Die das erwartete Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und nochmal durch Säulencliromatographie auf Silicagel mittels 19:1 CH&sub2;Cl&sub2;-MeOH gereinigt, um nach der Entfernung des Lösemittels unter reduziertem Druck 40-O-(3-Carboxy)propanoyl-rapamycin (das Rapamycinhemisuccinat der obigen Formel II') als weißen Schaum zu erhalten, das die folgenden charakteristischen spektroskopischen Eigenschaften aufweist:
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 2,68 (7H, m, H33, H25 und O&sub2;CCH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;H), 3,14 (3H, s und m, OCH&sub3; und H39), 3,34 (3H, s, OCH&sub3;), 3,38 (3H, s, OCH&sub3;), 4,68 (1H, m, H40), 4,72 (1H, breites s, 10-OH), MS (FAB) m/z 1036 ([M+Na]&spplus;, 982 ([M-CH&sub3;O]&spplus;, 964 ([M-(CH&sub3;O+H&sub2;O)]&spplus;, 946 ([M-(CH&sub3;O+2 H&sub2;O)]&spplus;).

b) Herstellung von 40-O-Succinimidooxysuccinyl-rapamycin

Zu einer gerührten Lösung von 120 ing (0,118 mmol) des Rapamycinhemisuccinats von Schritt a), 16,5 µl (0,118 mmol) Et&sub3;N und 22,7 mg (0,118 mmol) EDC in 8 ml CH&sub2;Cl&sub2; werden 13,6 ing (0,118 mmol) N- Hydroxysuccininiid gegeben. Das entstehende Gemisch wird für 18 h bei Raumtemperatur gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt uiid zweimal mit Wasser gewaschen. Die organische Lösung wird Liber wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie auf Silicagel (Ethylacetat) unter Bildung voll 40-O-Succinimidooxysuccinyl-rapamycin (das heißt der Verbindung der Formel III' in der obigen Reaktion II) als weißer Schaum mit den folgenden charakteristischen spektroskopischen Eigenschaften gereinigt:
¹H-NMR (DMSO) δ 2,67 (2H t O,CCH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;), 2,81 (7H, s, CH&sub3;O Lind Succinimid CH&sub2;), 2,92 (2H, t, O&sub2;CCH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;), 4,55 (1H, m, H40), 5,26 (1H, d, 28-OH), 6,43 (1H, s, 10-OH), MS (FAB) m/z 1133 ([M+Na]&spplus;), 1111 ([M+H]&spplus;), 1092 (M-H&sub2;O]&spplus;, 1079 ([M-CH&sub3;O]&spplus;, 1061 ([M-(CH&sub3;O+H&sub2;O)]&spplus;), 1043 ([M-(CH&sub3;O+2 H&sub2;O)]&spplus;).

BEISPIEL 2 - Herstellung des 28-O-aktivierten 40-O-Derivats von Rapamycin

a> 28-O-Hemisuccinat von 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin

Zu einer gerührten, gekühlten (0ºC) Lösung von 958 ing (1,00 mmol) 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin in 2,2 ml 10:1 Methylenchlorid-Pyridin werden 0,160 ml (1,50 mmol) Allylchlorformiat gegeben. Das Rühren wird bei 0ºC fortgesetzt und zwei Teile mit jeweils 0,080 ml (1,00 mmol) Pyridin und 0,053 ml (0,50 mmol) Allylchlorformiat werden nach jeweils 3 Stunden und 4 Stunden zugegeben. Nach der letzten Zugabe der Reagenzien wird das Rühren für mehr als eine Stunde fortgesetzt und die Reaktion wird mit 1 M wäßrigem Natriumbicarbonat gestoppt. Das entstehende Reaktionsgeinisch wird dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Lösung wird nacheinander gewaschen mit 1 N wäßriger Chlorwasserstoffsäure, 1 N wäßrigem Natriumbicarbonat und gesättigter Kochsalzlösung, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie auf Silicagel (50 : 50 Hexan-Ethylacetat) unter Bildung der Ailyloxycarbonyl-geschützten Verbindung (Formel 2 in der obigen Reaktion III) als weißer Schaum gereinigt.
Zu einer gerührten, gekühlten (0ºC) Lösung von 208 mg (0,200 mmol) dieses Produkts in 2 ml Methylenchlorid werden 2,4 mg (0.020 mmol) DMAP und 82 mg (0,400 mmol) DCC gefolgt von einer Lösmig von 63 mg (0,400 inmol) Monoallylsuccinat in 0,5 ml Metliylendilond gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 0ºC für 14 Stunden gerührt und die entstehende Suspension wird durch eine Glasfritte filtriert. Die organische Lösung wird unter reduziertem Druck konzentriert und der Rückstand wird durch Säulenchromatograpliie auf Silicagel (30:70 Hexan-Ethylacetat) unter Bildung des Produkts (Formel 3 der obigen Reaktion III) als weißer Schaum gereinigt.
Zu einer gerührten Lösung von 177 mg (0,150 mmol) dieses Produkts in 5 ml Methylenchlond werden 17,3 mg (0,015 mmol) Tetrakis(triphenylphospliin)palladium und 0,080 ml (0,3 mmol) Tributylzinnhydrid gegeben. Die gelbe Lösung wird für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und mit Ethylacetat verdünnt, einmal mit kalter 2 N wäßriger Citronensäure und dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Eine Säulenchromatographie auf Silicagel (85:15 Ethylacetat-Methanol) ergibt das Hemisuccinat (Formel 4 der Reaktion III) als hellgelbes Öl.

b) 28-O-Succinimidooxysuccinyl-40-O-(2-hydroxyethyl)-rapamycin

Eine Lösung von 53 mg (0,050 mmol) des Heinisuccinats von Schritt a) in 2,5 ml Methylenchlond werden mit 2 nig DMAP, 24 nig (0,125 mmol) EDC und 14 mg (0,125 nimol) N-Hydroxysuccinimid behandelt. Nach dem Rühren für 2 Stunden bei Raumtemperatur wird die Reaktion mit 1 N wäßrigem Natriumbicarbonat gestoppt. Das Gemisch wird mit drei Portionen Ethylacetat extrahiert. Die organische Lösuiig wird mit wäßrigem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumbicarbonat getrocknet, filtriert und konzentriert, um das aktivierte Hapten des Titels (die Verbindung der Formel 5 in Reaktion III) zu erhalten, die zur Herstellung des Protein-Hapten-Konjugats ohne weitere Reinigung verwendet wird und die die folgenden charakteristischen spektroskopischen Eigenschafien hat:
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 2,43 (1H, dd, H33a), 2,50-2.98 (10H, m, H25, H33b, Succinatwasserstoffe, Succinimidwasserstoffe), 3,58 (2H, m, H6b, 1-Hydroxyethyl H), 3,68 (3H, m, H16, 2-Hydroxyethyl H), 3,81 (2H, m, H14, 1- Hydroxyethyl H), 3,93 (1H, d. H27), 5,28 (2H, m, H2, H30), 5,34 (1H, d. H28), MS (FAB) 1161 ([M+Li]&spplus;).

BEISPIEL 3 - Herstellung von 28-O-aktiviertem Rapamycin

a) 28-O-Hemisuccinat von Rapamycin

Zu einer gerührten, gekühlten (0ºC) Lösung von 914 mg (1,00 mmol) Rapamycin in 2,2 ml 10:1 Methylenchlorid-Pyridin werden 0,212 ml (2,00 mmol) Allylchlorformiat gegeben. Nach 3 Stunden werden 0,080 ml (1,000 mmol) Pyridin und 0,053 ml (0,50 mmol) Allylchlorformiat gegeben. Das Rühren wird flir eine weitere Stunde fortgesetzt und die Reaktion wird mit 1 M wäßrigem Natriumbicarbonat gestoppt. Das entstehende Gemisch wird dreimal mit Methyl-t-Butylether extrahiert. Die organische Lösung wird nacheinander mit kalter 1 N wäßriger Chlorwasserstoffsäure, 1 N wäßrigem Natriumbicarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, flitriert Lind unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie auf Silicagel (70:30 Hexan-Ethylacetat) unter Bildung der Mlyloxycarbonyl-geschützten Verbindung (Formel 2 in Reaktion IV) als weißer Schaum gereinigt.
Zu einer gerührten, gekühlten (0ºC) Lösung von 400 mg (0,400 minol) dieses Produkts in 5 ml Methylenchlorid werden 4,8 mg (0,040 mmol) DMAP und 164 mg (0,800 mmol) DCC gefolgt von einer Lösung von 127 mg (0,800 mmol) Monoallylsuccinat in 1 ml Metliylenchlorid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei -15ºC für 14 Stunden gerührt und die entstehende Suspension wird durch eine Glasfritte filtriert. Die organische Lösung wird unter reduziertem Druck konzentriert und der Riickstand wird durch Säulenchromatographie auf Silicagel (40:60 Hexan-Methyl-t-butyletller) unter Bildung der Verbindung der Formel 3 der Reaktion IV als weißer Schaum gereinigt.
Zu einer gerührten Lösung von 285 ing (0,250 mmol) dieses Produkts in 5 ml Methylenchlorid werden 28,8 mg (0,025 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium und 0,133 ml (0,5 mmol) Tributylzinnhydrid gegeben. Die gelbe Lösung wird für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gertihrt und mit Methyl-t-butylether verdünnt, zweimal mit kalter 2 N wäßriger Citronensäure und dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter reduziertem Dnick konzentriert. Eine Säulenchromatographie auf Silicagel (90:10 - 60:40 Methyl-t-butylether - Methanol) ergibt das 28-O-Rapamycinheinisuccinat (die Verbindung der Formel 4, Reaktion IV) als hellgelbes Öl.

b) 28-O-Succinimidooxyvuccinyl-rapomycin

Eine Lösung von 5 1 mg (0,050 mmol) des Prodilkts voll Schritt a) in 2 ml Methylenchlorid wird mit 2 mg DMAP, 24 mg (0,125 mmol) EDC und 14 mg (0,125 mmol) N-Hydroxysuccinimid behandelt. Nach dem Rühren für 4 Stunden bei Umgebungstemperatur wird die Reaktion mit 1 N wäßrigem Natriumbicarbonat gestoppt. Das Gemisch wird mit drei Teilen Methyl-t-butylether extrahiert. Die organische Lösung wird mit wäßrigem Natriumbicarbenat und Kochsalzlösung gewaschen. über wasserfreiem Natriumbicarbonat getrocknet, filtriert und unter Bildung der aktivierten Titelverbindung konzentriert. die zur Herstellung des Protein-Hapten-Konjugats ohne weitere Reinigung verwendet wird und die die folgenden charakteristischen spektroskopisclien Eigenschaften aufweist:
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 2.43 (1H, dd, H33a), 2,55-3,02 (11H, m, H25, H33b, H39, Succinatwasserstoffe, Succinimidwasserstoffe), 3,56 (1H, m, H6b), 3,68 (1H, dd, H16), 3,83 (1H, m, H14), 3,93 (1H, d, H27), 5,28 (2H, m, H2, H30), 5,34 (1H, d, H28), MS (FAB) 1117 ([M+Li]&spplus;).

BEISPIEL 4 - Herstellung von immunogenen Konjugaten

a) 40-O-gebundene Rapamycinkonjugate

17,4 nig des 40-O-aktivierten Rapamycins von Beispiel 1 werden in 400 µl DMF oder DMSO gelöst 120 µl (das heißt enthält 5,22 nig aktiviertes Rapamycin) dieser Lösung werden tropfenweise unter starkem Rühren zu einer Lösung gegeben, die 8 mg KLH in 2 ml 0,1 M NaHCO&sub3; Puffer (pH 7,7) enthält Das Reaktionsgenlisch wird für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und das entstehende Rapamycin-KLH-Konjugat wird durch Dialyse bei 4ºC gegen 5 1 PBS dreimal über 48 Stunden dialysiert. Das Konjugat wird wahlweise durch Zentrifugation mittels Mikrokonzentratorröhrchen weiter konzentriert. Rapamycin-BSA und Rapamycin-OVA Konjugate werden auf dieselbe Weise hergestellt, indem man BSA oder OVA jeweils statt KLH im obigen Verfahren verwendet.

b) 28-O-gebundene (wahlweise 40-O-alkylierte) Rapamycinkonjugate

5 mg der 28-O-aktivierten Verbindung voll Beispiel 2 werden in 2 ml DMSO gelöst und tropfenweise unter starkem Rühren zu einer Lösung gegeben, die 5 mg KLH in 1 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,3) enthält. Das Reaktionsgemisch wird für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und das entstehende Konjugat wird durch Dialyse bei 4ºC gegen 2 1 PBS drei mal über 48 Stunden dialysiert. Konjugate mit BSA und OVA werden auf dieselbe Weise hergestellt. Das Rapamycin wird an KLH, BSA und OVA über Position 28 mittels der 28-O- aktivierten Verbindung von Beispiel 3 unter Befolgnng desselben Verfahrens korjugiert.

BEISPIEL 5 - Herstellung des monoklonalen Antikörpers

a) Monoklonaler Antikörper gegen Rapamycin

Der monoklonale Antikörper wird unter Verwendung von herkömmlichen Techniken hergestellt, wie dies im wesentlichen von Köhler und Milstein in Nature 256: 49 beschrieben ist. Weibliche Balb/C Mäuse (20-25 g) erhalten jeweils 10 oder 50 µg des 40-O-gebundenen immtinogenen Rapamycin-KLH-Konjugats von Beispiel 4a in 0,2 ml komplettem Freundschen Adjuvans die durch subkutane Injektion an vier Stellen verabreicht werden. Nach 2 Wochen wird eine zweite Boosterinjektion erneut durch s.c. Injektion verabreicht, die dieselbe Menge immunogenes Konjugat in 0,2 ml inkomplettem Freundschen Adjuvans emulgiert enthält. Das Vorkommen von Antigenreaktiven Antikörpern im Blutsenim der Tiere wird durch direkten ELISA bestätigt, wie dies später in Beispiel 6 beschrieben ist. Die Mäuse können wahlweise weiter für Antikörper gegen die Effektorregion (geringe Kreuzreaktivität mit FK-506) und gegen die FKBP Bindungsregion (hohe Kreuzreaktivität mit FK-506) selektiert werden. Die Figur 1 zeigt beispielsweise Titerkurven für eine Maus (M1), die einen hohen Spiegel an Antikörper gegen die Bindungsdomäne von Rapamycin aufweist, und eine andere Maus (M7), die relativ hohe Spiegel an Antikörper gegen die Effektordomäne aufweist. Mäuse, die maximale Blutserumspiegel an Antikörper der geeigneten Spezifität enthalten, erhalten Boosterinjektionen halb i.p. und halb i.v. am Tag -3 und i.p. an den Tagen -2 und -1, die 10 µg Antigen enthalten. Ani Tag 0 werden die Mäuse getötet lind ihre Milzzellen werden isoliert und mit PAI-0 Zellen oder einer anderen geeigneten Myelomlinie fusioniert. Die entstehenden Hybridome werden kultiviert und mittels eines ELISA auf die Expression voll Antikörper mit einer hohen Affinität für Rapamycin selektiert.

b) Monoklonaler Antikörper gegen 40-(Hydroxyethyl)-rapamycin

Weibliche Balb/C Mäuse erhalten 10 oder 50 µg des immunogenen 40-(Hydroxyethyl)-rapamycin-KLH- Konjugats von Beispiel 4b) in 0,2 ml komplettem Freundsclien Adjuvans durch s.c. Injektionen an 4 Stellen. Nach 2 Wochen wird eine zweite Injektion (Booster), die dieselbe Menge an immunogenem Konjugat in 0,2 ml inkomplettem Freundschen Adjuvans emulgiert enthält, erneut durch s.c. Injektion verabreicht. Das Vorkommen von Antigen-reaktiven Antikörpern im Blutserum der Tiere wird durch direkten ELISA getestet, wie dies später beschrieben ist. Zusätzlich werden die Mäuse weiter auf Antikörper gegen das in der 40-O-Region modifizierte Rapamycinmolekül durch die Bindung an ein BSA-Rapamycillkonjugat verglichen mit einem BSA-40-O-(2- Hydroxyethyl)-rapamycinkunjugat selektiert. Sowohl Antikörper, die an das 40-O-(2-Hydroxyethyl)- rapamycinkonjugat aber nicht an konjugiertes Rapaiiiycin binden, als auch Antikörper, die an 40-O-(2- Hydroxyethyl)rapamycin- und Rapamycinkunjugate binden, werden erhalten. Mäuse, die maximale Blutserumspiegel an Antikörper der geeigneten Spezifität enthalten, erhalten Boosterinjektionen halb i.p. und halb i.v. am Tag -3 und i.p. an den Tagen -2 und -1, die 10 µg Antigen enthalten. Am Tag 0 werden die Mäuse getötet und ihre Milzzellen werden isoliert und mit PAI-0 Zellen füsioniert. Die entstehenden Hybridome werden kultiviert und mittels eines ELISA auf die Expression von Antikörper mit einer hohen Affinität für 40-O-(2-Kydroxyethyl)- rapamycin selektiert.

BEISPIEL 6 - Enzymgebundener Immunosorbenttest (ELISA)

a) ELISA für Rapamycin

Mikrotiterplatten werden mit 1-2 µg/ml Rapamycin-BSA-Konjugat in PBS für 2 Stunden bei 37ºC beschichtet, dann mit 2 % BSA in PBS für 1 Stunde bei 37ºC gesättigt und dreimal mit 0,05 % Tween-PBS gewaschen. Die zu screenenden Hybridomüberstände werden in einer 1 % Lösung von BSA in PBS verdünnt und über Nacht bei Raumtemperatur (oder 18 Stunden bei 4ºC oder 2 Stunden bei 37ºC) inkubiert. Die Menge an gebundenem Antikörper wird durch ein Anti-Maus IgG-Ziegenglobulin, das an alkalische Phosphatase gebunden ist, mit para-Nitrophenylphosphat als Substrat gemessen. Nach der Inkubation für zwei Stunden bei 37ºC wird das Enzymsubstrat hydrolysiert (1 Stunde bei Raumtemperatur) und die Absorption bei 405 nm wird gemessen. Es werden Hybridome auf die Bildung von hochaffinen monoklonalen Antikörpern ausgewählt.
Die Standardktirven zur Bestimmung der relativen Affinität eines ausgewählten Antikörpers gegenüber Rapamycin werden mittels Lösungen hergestellt, die bekannte Rapamycinkonzentrationen enthalten (beispielsweise 1 bis 140 ng/ml in Blutserum). Die Fignr 2 zeigt beispielsweise eine Standardkurve für den monoklonalen Antikörper M7-91, was zeigt, daß der monoklonale Antikörper, der als hochspezifisch für Rapamycin selektiert wurde, zur Detektion von Rapamycin in so geringen Mengen wie 0,25 ng/ml fähig ist.
Antikörper können ferner über die Bindung an die Effektor- oder FKBP Bindungsdomänen von Rapamycin durch Messen der Kreuzreaktivität mit FK-506 in einem analogen direkten ELISA mittels Mikrotiterplatten charakterisiert werden, die mit FK-506-BSA-Konjugat beschichtet sind, das analog zum Rapamycin-BSA- Konjugat hergestellt werden kann. Beispielsweise ist ein Vergleich von Bindungsmengen von 17 ausgewählten monoklonalen Antikörpern in den Rapaiiiycin-BSA und FK-506 Tests in Fignr 3 gezeigt, die Kreuzreaktivität ist als Prozentsatz in Figur 4 gezeigt. In diesem Vergleich der Bindung an Rapamycin-BSA gegenüber FK506-BSA werden monoklonale Antikörper mit einer sehr geringen Affinität detektiert.
Der obige direkte ELISA kann in einen kompetitiven ELISA umgewandelt werden, worin ein Kompetitor zur Lösung des monoklonalen Antikörpers gegeben wird und die Bindung des monoklonalen Antikörpers an das Konjugat in Gegenwart und Abwesenheit des Konipetitors wird gemessen. Wenn der Kompetitor FK506 oder ein Rapamycin ist, wird der Kompetitor in einer ethanolischen Lösung, beispielsweise 1 mg/ml direkt zur Lösung des monoklonalen Antikörpers gegeben (beispielsweise 2 µl/200 µl/Vertiefung) und weiter in der Mikrotiterplatte verdünnt. Die Figur 5 zeigt beispielsweise eine Hemmkurve der Bindung des M7-91 Antikörpers (M7.91.13) an BSA-Rapamycin in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an freiem Rapamycin. In solchen kompetitiven ELISAs, bei denen die Bindung der monoklonalen Antikörper an freies FK506 gegenüber freiem Rapatiiycin verglichen wird, beobachtet man eine geringere Kreuzreaktivität zwischen Rapaniycin und FK506 als im direkten ELISA. Ein solcher kompetitiver Test ist für die Selektion von monoklonalen Antikörpern bevorzugt, da einige monoklonale Antikörper eine zu geringe Affinität zur Bindung des Antigens in freier Form in Lösung haben dürften, aber trotzdem eine bivalente oder pelvvalente Bindung an das inultimere Antigen zeigen, das viele Haptene in dichter Nachbarschaft zueinander auf einem großen Proteinmolekul umfaßt. Ein kompetitiver Test schließt solche niedrigaffinen Antikörper aus. Die Ergebnisse eines solchen kompetitiven Tests sind in Fignr 6 gezeigt, die den M7-91 Antikörper (M7.91.13), der eine relativ geringe Kreuzreaktivität aufweist, mit dem M1-303 (M1.303.3) Antikörper vergleicht, der eine relativ hohe Kreuzreaktivität aufweist.

b) ELISA für 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin

Dieser ELISA wird analog zum Verfahren durchgeführt, das in a) beschrieben ist. Mikrotiterplatten werden mit 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin-BSA beschichtet, mit BSA gesättigt und gewaschen. Die zu screenenden Hybridomüberstände werden 18 Stunden bei 4ºC oder 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Menge an gebundenem Antikörper wird durch ein Anti-Maus IgG-Ziegenimmunglobulin, das an alkalische Phosphatase gebunden ist, mit para-Nitrophenylphosphat als Substrat gemessen. Es wird ein paralleler ELISA mittels gebundenenl Rapamycin-BSA zur Selektion auf monoklonale Antikörper durchgeführt die zur Unterscheidung von 40-O-(2- Hydroxyethyl)-rapamycin und Rapamycin fähig sind. Die Figur 7 zeigt beispielsweise Überstände von Hybridom B3-203, die selektiv an 40-O-(2-Hydroxyethyl)rapamycin-BSA binden (in der Fignr als 85A28-RAD bezeichnet) (Figur 7A), von Hybridom B3-113, die sowohl 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin-BSA als auch Rapamycin-BSA erkennen, das über die Position 28 konjugiert ist (Figur 78) und von Hydridom B3- 164, die zusätzlich Rapamycin erkennen, das an BSA über die Position 40 gekuppelt ist (Figur 7C).
Die relative Affinität der Antikörper zu 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin gegenüber Rapamycin wird ferner durch die Kompetition der Bilidung der Antikörper an das beschichtete 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin- BSA-Konjugat hut 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin oder freiem Rapamycin in Lösung gemessen. Die Figur 8 zeigt beispielsweise, daß voll Hybridom B3-203 gebildete Antikörper stark hut 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin mit einer geringen Kreuzreaktivität für Rapamycin reagieren (Figur 8A) und daß voll Hybridom B3-113 und B3- 164 gebildete Antikörper gleich gut an 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin und Rapamycin binden (Figuren 8B und 8C). Andere Hybn dome, die mindestens 10-100 fach besser all 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin binden als an Rapamycin sind unter anderen B3-22, B3-127 und B3-156. Andere Hybridome, wie B3-29, B3-265 und B3-539 bilden Antikörper. die Rapamycin wie auch 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin binden.
Wenn einmal der gewünschte Antikörper ausgewählt wurde, wird derselbe ELISA zur Bestimmung der Blutspiegel von Rapamycin in Patienten verwendet. Ein Testkit gemäß diesem Beispiel würde einen oder mehrere ausgewählte Antikörper in lyophilisierter Form, eine Mikrotiterplatte, die mit einem Rapamycinkonjugat beschichtet ist (beispielsweise Rapainycin-BSA-Konjugat oder 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin-BSA-Konjugat), einen Rapamycinstandard und Anleitungen zum Gebrauch bereitstellen. Wahlweise kann der Kit ferner ein markiertes Rapamycinderivat zur Verwendung in einem kompetitiven Test enthalten. Anti-Maus IGG-Enzymkonjugat und Substrat, wie dies oben beschrieben ist, können ebenfalls zusätzlich bereitgestellt werden. Alternativ dazu kann der Kunde den monoklonalen Antikörper der Erfindung in seinem eigenen etablierten ELISA oder einem anderen Testsystem verwenden.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper, der zur spezifischen Erkennung eitles Rapamycins fähig ist.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der zur Erkennung eines Epitops auf dem Makrophilin-bindenden Teil eines Rapamycins fähig ist.

3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1 der zur Erkennung eines Epitops auf dem Effektorteil eines Rapamycins fähig ist.

4. Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, erhalten oder erhältlich durch

a) Umsetzung eines Rapamycins, das eine aktivierte Kupplungsgruppe aufweist, mit einem immunogenen Protein zur Herstellung eines immunogenen Konjugats,

b) Verabreichung des immunogenen Konjugats an eine geeignete Tierart, um eine immunogene Provokation auszulösen und Gewinnen Voll Antikörper-bildenden Zellen, die gegen das Kotijugat sensibilisiert sind,

c) Immortalisierung der Antikörper-bildenden Zellen, und

d) Gewinnen eines monoklonalen Antikörpers aus einer ausgewählten immortalisierten Zellinie die so etabliert wurde.

5. Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Rapamycin ist (i) Rapamycin oder (ii) 40-O-alkyliertes Rapamycin, vorzugsweise woriti der 40-O-Alkylsubstituent ausgewählt ist aus Hydroxyalkyl, Hydroxyalkoxyalkyl, Acylaminoalkyl oder Aminoalkyl.

6. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 5, worin das Rapamycin ausgewählt ist aus

i) 40-O-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin

ii) 40-O-(3-Hydroxypropyl)-rapamycin

iii) 40-O-(2-(2-Hydroxy)ethoxy]ethyl)-rapamycin, und

iv) 40-O-(2-Acetaminoethyl)-rapamycin.

7. Monoklonaler Antikörper nach einem der vorangehenden Ansprüche, der zur Unterscheidung zwischen Rapamycin und 40-O-alkylierten Rapamycin fähig ist, wie in Anspruch 5 oder 6 beschrieben.

8. Immunogenes Konjugat, das einen Rapamycinteil und einen Proteinteil umfaßt, wobei der Rapamycinteil über eine der Hydroxygruppen des Rapamycins gebunden ist.

9. Immunogenes Konjugat nach Anspruch 8, hergestellt durch die Umsetzung eines Proteins mit einem Rapamycinderivat, das eine aktivierte Kupplungsgruppe trägt.

10. Immunogenes Konjugat nach Anspruch 9, worin das Rapamycinderivat ausgewählt ist aus

i) 40-O-Succinimidooxysuccinyl-rapamycin,

ii) 28-O-Succimmidooxysuccinyi-rapamycin, oder

iii) 28-O-Succinimidooxysuccinyl)-40-O-(2-hydroxyethyl)-rapamycin,

11. Rapamycin mit einer aktivierten Kupplungsgruppe, ausgewählt aus

i) 40-O-Succinimidooxysuccinyl-rapamycin,

ii) 28-O-Succinimidooxysuccinyl-rapamycin, oder

iii) 28-O-(Succinimidooxysuccinyl)-40-O-(2-hydroxyl)-rapamycin.

12. Hybridomzellinie, die zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers nach einen der Ansprüche 1 bis 7 fähig ist.

13. Immuntestkit zur Messung des Blutspiegels eines Rapamycins, der einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt.