DE69121844T2

DE69121844T2 - Immunotest für Cyclosporin

Info

Publication number: DE69121844T2
Application number: DE69121844T
Authority: DE
Inventors: Svetlana Alexander; Maureen H Beresini; Dariush Davalian; Mae W Hu; Edwin F Ullman
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 1990-11-20
Filing date: 1991-11-19
Publication date: 1997-01-23
Anticipated expiration: 2011-11-20
Also published as: JP3433952B2; CA2055813A1; EP0487289A2; ES2091301T3; ATE142344T1; ES2181734T3; JPH04316599A; EP0674178A3; EP0487289A3; EP0674178B1; DE69133095T2; DE69133095D1; US6410696B1; US6054303A; EP0674178A2; DE69121844D1; JP2003201298A; US6190873B1; JP3936285B2; EP0487289B1

Description

Der Körper stützt sich auf ein komplexes System der Immunantwort, um Eigenes von Nicht-Eigenem zu unterscheiden. Das geeignete Funktionieren des Immunsystems ist für die langfristige Gesundheit des Körpers lebenswichtig.
Eine mangelhafte Immunantwort kann zur Unfähigkeit des Körpers führen, sich selbst vor nicht-eigenen Substanzen zu schützen. Eine übermäßige Immunantwort kann zu einer Überreaktion des Körpers auf etwas führen, das sonst eine unschädliche Substanz ist.
Von Zeit zu Zeit muß das Immunsystem des Körpers kontrolliert werden, um entweder eine mangelhafte Antwort zu verstärken oder eine übermäßige Antwort zu unterdrücken. Wenn zum Beispiel Organe, wie Niere, Herz, Herz-Lunge, Knochenmark und Leber, in Menschen transplantiert werden, stößt der Körper manchmal das transplantierte Gewebe durch einen als Allotransplantat-Abstoßung bezeichneten Prozeß ab.
Bei der Behandlung der Allotransplantat-Abstoßung wird das Immunsystem häufig auf kontrollierte Art und Weise durch eine Arzneistofftherapie unterdrückt. Immunsuppressive Arzneistoffe werden Transplantat-Empfängern vorsichtig verabreicht, um eine Verhinderung der Allotransplantat-Abstoßung von nichteigenem Gewebe zu unterstützen.
Ein Cyclosporin-Arzneistoff, der in den Vereinigten Staaten und anderen Ländern als Immunsuppressivum Verwendung findet, ist Cyclosporin A (CsA). CsA ist ein cyclisches Undecapeptid der allgemeinen Struktur:
worin alle α-Aminosäurereste, die das cyclische Grundgerüst von cyclosporin A bilden, die L-Konfiguration aufweisen, außer der α-Aminosäure 8, die die D-Konfiguration aufweist. Der Aminosäurerest 1 ist von einer unüblichen Aminosäure mit 9 Kohlenstoffen, [2S,3R,4R,6E]-3-Hydroxy-4-methyl-2-methylamino-6-octensäure, abgeleitet. Die Aminosäurereste 1, 3, 4, 6, 9, 10 und 11 sind an den Amid-Stickstoffatomen des cyclischen Grundgerüsts von Cyclosporin A N-methyliert. Cyclosporin A ist in den U.S.-Patenten Nrn. 4117118 (1978) und 4396542 (1983) beschrieben.
CsA hat möglicherweise andere nützliche Eigenschaften, wie antibiotische, antiarthritische und entzündungshemmende Wirksamkeiten, und kann bei der Behandlung anderer Erkrankungen, wie Diabetes, Malaria und Autoimmunkrankheiten, Verwendung finden.
Eine große Anzahl von CsA-Metaboliten, die den Undecapeptid-Ring beibehalten, wurde identifiziert und berichtet (siehe Maurer, G.; Loosli, H. R.; Schreier, E.; Keller, B., Drug Metabolism and Disposition 1984, 12(1), 120-126). Es ist nicht bekannt, welche Rolle, wenn überhaupt, diese Metaboliten entweder bei der gewünschten immunsuppressiven Wirksamkeit oder irgendwelchen unerwünschten, nachteiligen Reaktionen spielen, wenn CsA zur Verhinderung der Allotransplantat-Abstoßung verwendet wird.
Obwohl CsA ein hoch wirksamer immunsuppressiver Arznei-stoff ist, muß seine Verwendung vorsichtig durchgeführt werden, da der wirksame Dosierungsbereich eng ist, und eine übermäßige Dosierung ernste Nebenwirkungen zur Folge haben kann. Nierendysfunktion, Hypertonie, kardiovaskuläre Krämpfe, Hirsutismus, Akne, Tremor, Krämpfe, Kopfschmerzen, gummiartige Hyperplasien, Durchfall, Übelkeit, Erbrechen, Lebertoxizität, abdominale Beschwerden, Parästhesie, Hitzegefühl, Leukopenie, Lymphom, Sinusitis und Gynäkomastie wurden an Patienten mit Nieren-, Herzoder Lebertranspiantaten beobachtet, die einer Behandlung mit CsA unterzogen wurden, wobei zu wenig CsA zu einer Transplantat-Abstoßung führen kann.
Die Handhabung der Dosierung von CsA umfaßt die sorgfältige Kontrolle des im Patienten vorliegenden Arzneistoffspiegels. Da die Verteilung und der Metabolismus von CsA zwischen den Patienten stark variieren, und infolge des breiten Bereiches und der Schwere der nachteiligen Reaktionen, wird eine genaue Überwachung des Arzneistoffspiegels als wesentlich angesehen.
Für den Nachweis von Cyclosporin wurden Labor-Verfahren entwickelt. Diese Verfahren beinhalten typischerweise Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Radio-Immunoassay (RIA) oder Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay (FPIA). Siehe zum Beispiel Wolf, B. A. et al., Clinical Chem. 1989, 35(1), 120-124; Vernillet, L. et al., Clinical. Chem. 1989, 35(4), 608-611; Ball, P. E. et al Clinical Chem. 1988, 34(2) , 257- 260; Schran, H. F. et al., Clinical Chem. 1987, 33(12), 2225- 2229; Sanghvi, A. et al Clinical Chem. 1988, 34(9) , 1904- 1906; McBride, J. H. et al., Clinical Chem. 1989, 35(8), 1726- 1730; Quesniaux, V. et al Clinical Chem. 1987, 33(1), 32-37.
Jede dieser Techniken weist hinsichtlich der Sicherheit und Komplexität des Verfahrens und des Spezifitätsgrades hinsichtlich der interessierenden Cyclosporine bestimmte Einschränkungen auf. HPLC erfordert zum Beispiel eine lange Probenvorbereitung und/oder Laufzeiten unter Verwendung Labor-intensiver Verfahren mit hohen Kosten; RIA zeigt die allgemein bekannten Gefahren der Handhabung radioaktiven Materials; und FPIA, wenn auf nicht-spezifischen, mono- oder polyklonalen Antikörpern basierend, versagt oft bei der Unterscheidung zwischen CsA und seinen Metaboliten.
Ein einfaches analytisches Verfahren, das für ausgewählte Cyclosporine spezifisch ist, wird zur Verwendung bei der Durchführung der Cyclosporin-Behandlung benötigt.
Ein Immunoassay ist eine Technik, die den Anforderungen eines einfachen Verfahrens zur Messung der Menge an Cyclosporin in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält, entspricht. Die meisten verfügbaren Antikörper, die interessierende Cyclosporine erkennen können, erkennen und kreuzreagieren jedoch auch mit nahe verwandten Verbindungen, wie Cydosporin-Metaboliten. Wegen dieser Kreuzreaktivität sind von diesen Antikörpern abhängige Immunoassays weniger spezifisch für interessierende Cyclosporine, als man wünschen könnte. Cyclosporin-Immunoassays, die von Antikörpern abhängen, welche mit von den interessierenden Cyclosporinen verschiedenen Verbindungen kreuzreagieren, können verbessert werden, wenn die kreuzreaktiven Verbindungen gegenüber der Erkennung durch die Antikörper, welche die interessierenden Cyclosporine erkennen, im wesentlichen inaktiviert werden.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung betreffen ein einfaches, für Cyclosporine spezifisches Immunoassay-Verfahren. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung betreffen auch ein Verfahren zur Inaktivierung kreuzreaktiver Verbindungen in Immunoassay-Verfahren für Cyclosporin.
Die internationale Patentanmeldung Nr. 8602080 (1986) beschreibt monoklonale Antikörper, die für bestimmte Cyclosporine selektiv sind. Diese Antikörper werden als Antwort auf Cydosporine gebildet, die durch einen modifizierten Aminosäurerest, wie ein (D)-Lysin an Stellung 8 oder ein (L)-Threonin an Stellung 2, an antigene Träger gebunden sind.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 283801 (1988) beschreibt ein Fluoreszenz-Immunoassay-Verfahren und Derivate von Cyclosporin A, die zur Bildung von Antikörpern verwendet werden. Cyclosporin A ist über die Aminosäure-Seitenkette an dem Aminosäurerest Nr. 1 an einen immunogenen Träger gebunden.
Cacalano, N. A.; Cleveland, W. L.; Erlanger, B. F., J. Immunol. Meth. 1989, ikB, 257-263, beschreiben das vermutliche jedoch nicht sichere statistische, photochemische Pfropfen von Alkylseitenketten des .Cyclosporins A auf 4-Benzoylbenzoesäure. Diese Pfropf substanzen werden zur Kopplung an immunogene Träger für die Herstellung von Antikörpern verwendet.
Das U.S.-Patent Nr. 4727035 (1988) beschreibt ein Immunoassay-Verfahren für Cyclosporine. Das Verfahren beinhaltet entweder einen Radioiod- oder einen Fluoreszenz-Immunoassay.
Quesniaux, V. F. J.; Tees, R.; Schreier, M. H.; Wenger, R. M.; Van Regenmortel, M. H. V., Molecular Immunology 1987, 24(11), 1159-1168, beschreiben Antikörper, die sich als Antwort auf Cyclosporin-Immunogen-Konjugate bilden. Die Konjugate sind durch eine modifizierte Seitenkette an den Aminosäuren 2 oder 8 an Cyclosporin gebunden.
Die U.S.-Patente Nrn. 4764503 (1988), 4639434 (1987) und 4384996 (1983) beschreiben Cyclosporine, die an dem Aminosäurerest Nr. 8 modifiziert sind. Diese Cyclosporine sind an der Seitenkette der Aminosäure hydroxyliert und sind als immunsuppressive Arzneistoffe brauchbar.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren, die zur Messung der Menge an Cyclosporin in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält, brauchbar sind. Das Verfahren beinhaltet die folgenden Stufen a) Vereinigung in einem wäßrigen Medium 1) einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält, 2) von Cyclosporin, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einem der Alanin- Stickstoffatome, welche Teil des cyclischen Grundgerüsts von Cyclosporin sind, an einen Marker konjugiert ist, und 3) von Antikörpern, die sich an das Cyclosporin-Marker-Konjugat binden können; und gegebenenfalls b) Messen der Menge an Cyclosporin- Marker-Konjugat, das an die Antikörper gebunden ist.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Cyclosporin, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einem der Alanin-Stickstoffatome, welche Teil des cyclischen Grundgerüsts von Cyclosporin sind, an einen Marker konjugiert ist. Diese Konjugate sind in dem Assay-Verfahren der Erfindung brauchbar.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Cyclosporin, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einem der Alanin-Stickstoffatome, welche Teil des cyclischen Grundgerüsts von Cyclosporin sind, an einen immunogenen Träger konjugiert ist. Diese Konjugate sind zur Bildung von Antikörpern für die Verwendung in einem Assay-Verfahren der Erfindung brauchbar.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper, die als Antwort auf Cyclosporin gebildet werden, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einem der Alanin-Stickstoffatome, welche Teil des cyclischen Grundgerüsts von Cyclosporin sind, an einen immunogenen Träger konjugiert ist. Diese Antikörper sind in dem Assay-Verfahren der Erfindung brauchbar.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Cyclosporin, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einem der Alanin-Stickstoffatome, welche Teil des cyclischen Grundgerüsts von Cyclosporin sind, an einen immunogenen Träger oder einen Marker konjugiert ist.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Reagenzien, die zur Durchführung eines Assay-Verfahrens der Erfindung brauchbar sind.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Testsätze, die zur bequemen Durchführung eines Assay-Verfahrens der Erfindung brauchbar sind.
Verfahren, Zusammensetzungen, Reagenzien und Testsätze, welche in Cyclosporin-Immunoassays brauchbar sind, werden bereitgestellt. Bevor mit der Beschreibung der speziellen Ausführungsformen fortgefahren wird, wird eine Reihe von Begriffen definiert.

DEFINITIONEN

Verbindungsgruppe - Eine Verbindungsgruppe ist ein Teil einer Struktur, welcher 2 oder mehrere Unterstrukturen verbindet. Eine Verbindungsgruppe weist mindestens 1 nicht-unterbrochene Kette aus von Wasserstoff (oder anderen einwertigen Atomen) verschiedenen Atomen auf, die sich zwischen den Unterstrukturen erstreckt. Die Atome einer Verbindungsgruppe und die Atome einer Kette innerhalb einer Verbindungsgruppe sind selbst durch chemische Bindungen verbunden.
Die Anzahl von Atomen in einer Verbindungsgruppe wird durch das Zählen der von Wasserstoff verschiedenen Atome bestimmt. Die Anzahl von Atomen in einer Kette innerhalb einer Verbindungsgruppe wird durch das Zählen der Anzahl der von Wasserstoff verschiedenen Atome entlang dem kürzesten Weg zwischen den zu verbindenen Unterstrukturen bestimmt. Zum Beispiel weist Diphenylmethan 2 Benzol-Ringe auf, die durch eine Verbindungsgruppe mit 1 Atom, welche eine Kette aus 1 Atom enthält, verbunden sind, weist Stuben 2 Benzol-Ringe auf, die durch eine Verbindungsgruppe mit 2 Atomen, welche eine Kette aus 2 Atomen enthält, verbunden sind, und weist 1,2-Diphenyl-3-ethylcyclohexan 2 Benzol-Ringe auf, die durch eine Verbindungsgruppe mit 8 Atomen, welche eine Kette aus 2 Atomen enthält, verbunden sind.
Carbonsäureamidrest - Ein Carbonsäureamidrest ist ein Teil einer Struktur, der eine Unterstruktur der Formel umfaßt:
worin X Wasserstoff, Alkyl (mit weniger als etwa 9 Kohlenstoffatomen) oder Hydroxyalkyl (mit weniger als etwa 9 Kohlenstoffatomen) ist. Bevorzugt ist X Wasserstoff oder ein gegebenenfalls mit Hydroxylgruppen substituierter, unverzweigter oder verzweigter Alkylrest, der in erster Linie, neben Wasserstoff, weniger als etwa 9 Kohlenstoffatome, bevorzugt weniger als etwa 7 Kohlenstoffatome, besonders bevorzugt weniger als etwa 5 Kohlenstoffatome, enthält. Carbonsäureamidreste sind typischerweise durch Alkylen-Ketten miteinander verbunden, wobei Poly(carbonsäureamide) gebildet werden, die auch als Poly(peptide) bezeichnet werden. Bevorzugt sind die Alkylen-Ketten unverzweigte oder verzweigte Alkyl-Ketten, die gegebenenfalls mit Hydroxylgruppen substituiert sind, die in erster Linie als von Wasserstoff verschiedene Atome weniger als etwa 11 Kohlenstoffatome, bevorzugt weniger als etwa 9 Kohlenstoffatome, besonders bevorzugt weniger als etwa 7 Kohlenstoffatome, enthalten.
Nicht-Oxocarbonyl - Ein von einem Keton oder Aldehyd verschiedener Rest mit der allgemeinen Struktur der Formel:
worin T&sub1; ein Chalkogen (Sauerstoff oder Schwefel) oder substituierter Stickstoff ist, wobei der Stickstoff-Substituent zum Beispiel H oder Alkyl sein kann. Beispiele von Nicht-Oxocarbonylresten sind Carbonsäuren, Ester, Amide, Carbamate, Carbonate, Hamstoffe und so weiter und umfassen die Schwefel- und Stickstoff-Analoga davon.
Cyclosporin - In dem Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein Cyclosporinrest ein natürliches oder synthetisches Cydosporin oder Cyclosporin-Derivat. Cyclosporinreste sind cydische Undecapeptide der allgemeinen Formel:
worin R ein gegebenenfalls mit Hydroxylgruppen substituierter, linearer oder verzweigter Alkylrest ist, der in erster Linie, neben Wasserstoff, weniger als etwa 9 Kohlenstoffatome, bevorzugt weniger als etwa 7 Kohlenstoffatome, enthält. Zum Beispiel ist R in Cyclosporin A CH&sub2;CH&sub3;, ist R in Cyclosporin B -CH&sub3;, ist R in Cyclosporin C -CH(OH)CH&sub3; und ist R in Cyclosporin D CH(CH&sub3;)&sub2;. Geeignete Cyclosporine umfassen Cyclosporin A, Cyalosporin B, Cyclosporin C, Cyclosporin D, Cyclosporin E, Cydosporin F, Cyclosporin G, Cyclosporin H und Cyclosporin 1.
Die genaue Struktur von Cyclosporin kann auf geringe Art und Weise von Beispiel zu Beispiel variieren. Änderungen in der Struktur der Seitenketten der Aminosäurereste 2-6 und 9-11 werden zum Beispiel innerhalb des Umfanges der Erfindung ins Auge gefaßt. Ferner werden Änderungen in der Struktur des an den Amid-Stickstoffatomen der Aminosäurereste 2-6 und 9-11 hängenden Substituenten innerhalb des Umfanges der Erfindung ins Auge gefaßt. Ferner werden noch Änderungen in der absoluten stereochemischen Konfiguration des α-Kohlenstoffatoms der Aminosäurereste 2-11 innerhalb des Umfanges der Erfindung ins Auge ge-
Innerhalb des Umfanges der Erfindung bleibt der Aminosäurerest Nr. 1 im wesentlichen unverändert. Ferner sind einer oder beide der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 d-Alanin, l-Alanin oder eine Mischung davon.
Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin - Jede der cyclischen Peptid-Einheiten eines Cyclosporin-Moleküls enthält ein Amid-Stickstoffatom als Teil des Grundgerüsts des Cyclosporin- Rings. Innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung sind die Amid-Stickstoffatome der Alaninreste Alanin-Stickstoffatome von Cyclosporin. Diese sind zum Beispiel Stickstoffatome der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 in Cyclosporin A, C und D sowie die Reste Nr. 2, 7 und 8 in Cyclosporin B.
Kohlenstoffatom Nr. 6 des Aminosäurerestes Nr. 1 von Cydosporin - Der Aminosäurerest an der Stellung Nr. 1 von Cyclosporin A (CsA) ist eine kondensierte Form der freien Aminosäure [2S,3R,4R,6EJ -3-Hydroxy-4-methyl-2-methylamino-6-octensäure Siehe Wenger, R., U.S.-Patent Nr. 4396542 (1983); Wenger, R. M., Helvetica Chim. Acta 1983, 66(7), 2308-2321. Diese ungewöhnliche Aminosäure wird auch als N-Methyl-(4R)-4-but-2E-en-1-yl-4- methyl-(L)-threonin (Mebmt) bezeichnet. Siehe Wenger, R. et al., U.S.-Patent Nr. 4639434 (1987). Die Struktur und das sowohl für die kondensierten als auch die freien Formen von MeBmt verwendete Numerierungssystem sind in der Formel gezeigt:
Störendes, kreuzreaktives Material - Von den interessierenden Cyclosporinen verschiedene Materialien, die durch Antikörper erkannt werden können, die in der Lage sind, die interessierenden Cyclosporine zu erkennen, sind störendes, kreuzreaktives Material. Solches Material kann Verbindungen umfassen, die zu den interessierenden Cyclosporinen in Beziehung stehen. Speziell sind Metaboliten von Cyclosporin, welche den Undecapeptid-Ring beibehalten, herkömmliches, störendes, kreuzreaktives Material. Die oben eingeschlossene Arbeit von Maurer et al. beschreibt eine Reihe von Cyclosporin-Metaboliten. Die Strukturen von 8 herkömmlichen Metaboliten sind unten gezeigt. Diese 8 Metaboliten sind veranschaulichende jedoch nicht ausschließende Beispiele von störendem, kreuzreaktivem Material. Die vorhegende Erfindung beinhaltet in einem ihrer am meisten bevorzugten Aspekte den Metaboliten M-1 von Cyclosporin A als störendes, kreuzreaktives Material.
* R&sub5; und R&sub6; werden mit einem Sauerstoffatom zusammengenommen, wobei ein Tetrahydrofuranyl-Ring gebildet wird, und die Di- efinil-Bindung ist gesättigt.
Organischer Rest - Ein organischer Rest ist ein Rest eines großen organischen Moleküls oder ein Rest eines kleinen organischen Moleküls Organische Reste umfassen vorzugsweise immunogene Träger und Marker zusammen mit irgendeiner Verbindungsgruppe. Ein organischer Rest kann irgendeine Anzahl von Atomen aufweisen, wobei der organische Rest bevorzugt mindestens 5 Atome einschließlich Wasserstoff enthält.
Rest eines kleinen organischen Moleküls - Ein Rest eines kleinen organischen Moleküls ist ein Rest, der durch die Anlagerung eines kleinen organischen Moleküls erhalten wird. Ein kleines organisches Molekül ist eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 2000 und bevorzugt etwa 100 bis 1000, besonders bevorzugt etwa 300 bis 600, wie Biotin, Fluoreszein, Rhodamin und andere Farbstoffe, Tetracyclin und andere Protein-bindende Moleküle und Haptene und dergleichen. Das kleine organische Molekül ist zur Anlagerung (Konjugation), gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an ein Cyclosporin an einem der Alanin-Stickstoffatome des Cyclosporins in der Lage. Wenn das kleine organische Molekül so gebunden ist, wird es zu einem Rest eines kleinen organischen Moleküls Rest eines großen organischen Moleküls. Ein Rest eines großen organischen Moleküls ist ein Rest mit einem größeren Molekulargewicht als 2000 und umfaßt Poly(aminosäuren), Lipopolysaccharide, Partikel und dergleichen. Eine solche Gruppe kann unter anderem ein Marker oder ein immunogener Träger sein.
Poly(aminosäure) - Eine Poly(aminosäure) ist ein aus Aminosäuren gebildetes Polyamid. Poly(aminosäuren) werden auch als Polypeptide bezeichnet und weisen im allgemeinen ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 2000 mit keiner Obergrenze des Molekulargewichts auf, das gewöhnlich weniger als 10000000, in der Regel nicht mehr als etwa 600000 Dalton, beträgt. In der Regel gibt es, abhängig davon ob ein antigener Träger oder ein Enzym beteiligt ist, verschiedene Bereiche.
Immunogener Träger - Ein immunogener Träger ist ein Rest, welcher bei der Konjugation, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an ein Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin und bei der Injektion in einen Säuger eine Immun-Antwort induziert und die Bildung von Antikörpern hervorruft, die sich an Cyclosporin binden. Immunogene Träger werden auch als antigene Träger und mit anderen in dem Fachgebiet üblichen Synonymen bezeichnet.
Das Molekulargewicht antigener Träger liegt typischerweise im Bereich von etwa 2000 bis 10&sup7;, in der Regel von etwa 20000 bis 600000, und häufiger von etwa 25000 bis 250000. Es liegt in der Regel mindestens etwa ein Cyclosporinrest pro einem Molekulargewicht von 150000, häufiger mindestens eine Gruppe pro einem Molekulargewicht von 50000, bevorzugt mindestens eine Gruppe pro einem Molekulargewicht von 25000, vor.
Vielfältige Proteintypen können als antigenes Poly(aminosäure)-Material verwendet werden. Diese Typen umfassen Albumine, Serumproteine, z.B. Globuline, Proteine der Augenlinse, Lipoproteine etc. Veranschaulichende Proteine umfassen Rinderserumalbumin (BSA), Hämocyanin der Schlüssellochschnecke (KLH), Eiovalbumin, Rinder-y-globulin (BGG) etc. Alternativ können synthetische Poly(aminosäuren) verwendet werden.
Der immunogene Träger kann auch ein Polysaccharid sein, welches ein Polymer mit hohem Molekulargewicht ist, das durch wiederholte Kondensationen von Monosacchariden aufgebaut wurde. Beispiele von Polysacchariden sind Stärken, Glykogen, Cellulose, Kohlenhydratgumen, wie Gummi arabicum, Agar und so weiter. Die Polysaccharide können auch Polyaminosäurereste und/oder Lipid-Reste enthalten.
Der immunogene Träger kann auch entweder eine Poly(nucleinsäure) allein sein oder er kann an eine der oben erwähnten Poly(aminosäuren) oder Polysaccharide konjugiert sein.
Der immunogene Träger kann auch ein Partikel sein. Die Partikel weisen im allgemeinen einen Durchmesser von mindestens etwa 0,02 µm und nicht mehr als etwa 100 µm, in der Regel mindestens etwa 0,05 µm und weniger als etwa 20 µm, bevorzugt von etwa 0,3 bis 10 µm auf. Das Partikel kann organisch oder anorganisch, quellbar oder nicht-quellbar, porös oder nicht-porös, bevorzugt mit einer annähernd gleichen Dichte wie Wasser, im allgemeinen von etwa 0,7 bis 1,5 g/ml, sein und aus einem Material zusammengesetzt sein, das durchsichtig, teilweise durchsichtig oder undurchsichtig sein kann. Die Partikel können biologische Materialien, wie Zellen und Mikroorganismen, z.B. Erythrozyten, Leukozyten, Lymphozyten, Hybridoma, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli, Viren und dergleichen, sein. Die Partikel können auch Partikel sein, die organische und anorganische Polymere, Liposomen, Latex-Partikel, Phospholipid- Vesikel, Chylomikronen, Lipoproteine und dergleichen umfassen.
Die Polymere können entweder Additions- oder Kondensationspolymere sein. Davon abgeleitete Partikel sind in einem wäßrigen Medium leicht dispergierbar und können adsorptionsfähig oder funktionalisierbar sein, so daß sie sich entweder direkt oder indirekt durch eine Verbindungsgruppe an einen Cyclosporinrest binden (konjugieren).
Die Partikel können von natürlich vorkommenden Materialien, natürlich vorkommenden Materialien, welche synthetisch modifiziert sind, und synthetischen Materialien abgeleitet sein. Unter den besonders interessierenden, organischen Polymeren sind Polysaccharide, speziell vernetzte Polysaccharide, wie Agarose, welche als Sepharose erhältlich ist, Dextran, das als Sephadex und Sephacryl erhältlich ist, Cellulose, Stärke und dergleichen; Additionspolymere, wie Polystyrol, Polyvinylalkohol, Homopolymere und Copolymere von Acrylsäureester- und Methacrylsäureester-Derivaten, speziell Ester und Amide mit freien Hydroxyl-Funktionalitäten und dergleichen.
Die Partikel sind in der Regel polyfunktionell und sind, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einen Cyclosporinrest gebunden oder können sich daran binden (konjugiert werden). Eine große Vielfalt funktioneller Gruppen ist verfügbar oder kann eingebaut werden. Funktionelle Gruppen umfassen Carbonsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyanogruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und dergleichen. Die Art der Bindung einer großen Vielfalt von Verbindungen an Partikel ist allgemein bekannt und umfassend in der Literatur veranschaulicht. Siehe zum Beispiel Cautrecasas J. Biol. Chem. 1970, 245 3059, wobei deren Bindungsverfahren hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Marker - Ein Marker ist irgendein Molekül, welches ein Signal erzeugt oder das zur Erzeugung eines Signals angeregt werden kann. Der Marker kann an einen Analyten oder an einen Antikörper oder an ein anderes Molekül, wie einen Rezeptor oder ein Molekül, das sich an einen Rezeptor binden kann, wie einen Liganden, speziell ein Hapten, konjugiert sein. In der vorliegenden Erfindung kann der Marker ein Mitglied des nachstehend definierten signalerzeugenden Systems sein, das ein signalerzeugendes Mittel umfaßt.
Der Marker kann isotop oder nicht-isotop, bevorzugt nicht-isotop, sein. Beispielsweise und ohne Einschränkung kann der Marker Teil eines katalytischen Reaktionssystems, wie Enzyme, Enzym-Fragmente, Enzym-Substrate, Enzym-Inhibitoren, Coenzyme oder Katalysatoren; Teil eines chromogenen Systems, wie Fluorophore, Farbstoffe, Chemolumineszenz -Farbstoffe, Lumineszenz-Farbstoffe oder Sensibilisatoren; ein dispergierbares Partikel, der nicht-magnetisch oder magnetisch sein kann, ein fester Träger, ein Liposom, ein Ligand, ein Rezeptor, ein Hapten, radioaktive Isotope und so weiter, sein.
Enzyme, Enzym-Fragmente, Enzym-Inhibitoren, Enzym-Substrate und andere Komponenten von Enzym-Reaktionssystemen können als Marker verwendet werden. Wo irgendeine dieser Komponenten als Marker verwendet wird, ist eine chemische Reaktion, umfassend eine der Komponenten, Teil des signalerzeugenden Systems.
Wenn Enzyme verwendet werden, liegen die Molekulargewichte des Markers typischerweise im Bereich von etwa 10000 bis 600000, häufiger von etwa 10000 bis 300000, und die beteiligten Reaktionen sind meistens Hydrolyse oder Redox-Reaktionen.
Gekoppelte Katalysatoren können auch ein Enzym mit einem nicht-enzymatischen Katalysator beinhalten. Das Enzym kann einen Reaktanten erzeugen, welcher einer durch den nicht-enzymatischen Katalysator katalysierten Reaktion unterliegt, oder der nicht-enzymatische Katalysator kann ein Substrat (umfaßt Coenzyme) für das Enzym erzeugen. Eine große Vielfalt nicht-enzymatischer Katalysatoren, die verwendet werden können, wird in dem U.S.-Patent Nr. 4160645 (1979) gefunden, wobei dessen geeignete Teile hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Das verwendete Enzym oder Coenzym stellt durch die Erzeugung eines Produkts, welches Licht absorbiert, z.B. eines Farbstoffes, oder nach der Bestrahlung Licht emittiert, z.B. eines Fluoreszenz-Farbstoffes, die gewünschte Verstärkung bereit. Alternativ kann die katalytische Reaktion zur direkten Emission von Licht, z.B. Chemolumineszenz, führen. Auf eine große Anzahl von Enzymen und Coenzymen zur Bereitstellung solcher Produkte wird in dem U.S.-Patent Nr. 4275149, Spalten 19 bis 23, und in dem U.S.-Patent Nr. 4318980, Spalten 10 bis 14, hingewiesen.
Eine Reihe von Enzym-Kombinationen, die in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können, ist in dem U.S.-Patent Nr. 4275149, Spalten 23 bis 28, angegeben.
Von besonderem Interesse sind Enzyme, die an der Bildung von Wasserstoffperoxid beteiligt sind, und die Verwendung des Wasserstoffperoxids zur Oxidation einer Farbstoff-Vorstufe zu einem Farbstoff. Spezielle Kombinationen umfassen Saccharidoxidasen, z.B. Glucose- und Galactoseoxidase, oder heterocyclische Oxidasen, wie Uricase und Xanthinoxidase, die mit einem Enzym, das das Wasserstoffperoxid zur Oxidation einer Farbstoff-Vorstufe verwendet, das heißt einer Peroxidase, wie Meerrettichperoxidase, Lactoperoxidase oder Mikroperoxidase, gekoppelt sind. Weitere Enzym-Kombinationen können in dem durch Bezugnahme eingeschlossenen Gegenstand gefunden werden.
Wenn ein einzelnes Enzym als Marker verwendet wird, sind solche Enzyme, die Verwendung finden können, Hydrolasen, Transferasen, Lyasen, Isomerasen, Ligasen oder Synthetasen und Oxidoreduktasen, bevorzugt Hydrolasen. Alternativ können Luciferasen, wie Leuchtkäfer-Luciferase und bakterielle Luciferase, verwendet werden. Die auf der I.U.B.-Klassifizierung basierenden Enzyme der Wahl sind in erster Linie: Oxidoreduktasen der Klasse 1. und Hydrolasen der Klasse 3.; speziell in der Klasse 1 sind die interessierenden Enzyme Dehydrogenasen der Klasse 1.1, insbesondere 1.1.1, 1.1.3 und 1.1.99, und Peroxidasen in der Klasse 1.11. Von den Hydrolasen besonders Klasse 3.1, insbesondere 3.1.3 und Klasse 3.2, insbesondere 3.2.1.
Beispiele der Dehydrogenasen umfassen Malat-Dehydrogenase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und Lactat-Dehydrogenase. Von den Oxidasen ist Glucose-Oxidase ein Beispiel. Ein Beispiel der Peroxidasen ist Meerrettich-Peroxidase. Beispiele der Hydrolasen sind alkalische Phosphatase, β-Glucosidase und Lysozym.
Die Enzyme, die Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) oder sein Phosphat (NADP) als Cofaktor verwenden, speziell das erstere, können verwendet werden. Ein bevorzugtes Enzym ist Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, bevorzugt NAD-abhängige Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase.
Der Marker kann auch entweder direkt oder auf Grund von fluoreszierenden Verbindungen oder Fluoreszenz-Farbstoffen, die auf herkömmliche Art an ein Partikel oder ein anderes Molekül gebunden sind, fluoreszierend sein. Die fluoreszierenden Marker werden, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an Cyclosporin oder Antikörper oder Rezeptoren für Cyclosporin gebunden oder so funktionalisiert, daß sie sich daran binden (konjugieren) können.
Die interessierenden Fluoreszenz-Farbstoffe emittieren im allgemeinen Licht bei einer wellenlänge von über etwa 350 nm, in der Regel über etwa 400 nm und bevorzugt über etwa 450 nm. Wünschenswerterweise weisen die Fluoreszenz-Farbstoffe einen hohen Quantenwirkungsgrad, eine große Stokes'sche Verschiebung auf und sind unter den Bedingungen ihrer Konjugation und Verwendung chemisch stabil. Der Begriff lumineszierender Marker soll Substanzen umfassen, die nach der Aktivierung durch elektromagnetische Strahlung, elektrochemische Anregung oder chemische Aktivierung Licht emittieren, und umfaßt fluoreszierende und phosphoreszierende Substanzen, Szintillatoren und chemolumineszierende Substanzen.
Interessierende Fluoreszenz-Farbstoffe fallen in eine Vielfalt von Kategorien mit bestimmten primären Funktionalitäten. Diese primären Funktionalitäten umfassen 1- und 2-Aminonaphthalin, p,p-Diaminostilbene, Pyrene, quartäre Phenanthridinsalze, 9-Aminoacridine, p,p'-Diaminostilbenimine, Anthracene, Oxacarboxyanin, Merocyanin, 3-Aminoequilenin, Perylen, Bisbenzoxazol, Bis-p-oxazolylbenzol, 1,2-Benzophenazin, Retinol, Bis-3-aminopyridiniumsalze, Hellebrigenin, Tetracyclin, Sterophenol, Benzimidazolylphenylamin, 2-Oxo-3-chromen, Indol, Xanthen, 7-Hydroxycumarin, 4,5-Benzimidazole, Phenoxazin, Salicylat, Strophanthidin, Porphyrine, Triarylmethane, Flavin und Chelatoxide und Salze der seltenen Erden. Beispiele von Fluoreszenz-Farbstoffen sind in dem U.S.-Patent Nr. 4318707, Spalten 7 und 8, aufgezählt, wobei dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Energie-Absorber oder -Quencher können entweder getrennt oder zusammen verwendet werden. Der Absorber oder Quencher kann zusätzlich an ein festes, unlösliches Partikel mit einem Durchmesser von mindestens etwa 50 nm gebunden sein. Wenn sich der Abstand zwischen dem Absorber und dem Quencher aus speziellen Bindungsvorgängen (wie Antikörper-Antigen-Bindung) ergibt, wird die Fluoreszenz des Absorbers durch den Quencher gelöscht. Der Quencher kann derselbe wie der Fluoreszenz-Farbstoff oder verschieden, in der Regel verschieden, sein.
Eine alternative Lichtquelle als ein nachweisbares Signal ist eine chemolumineszierende Quelle, und daher kann ein Marker eine chemolumineszierende Verbindung sein. Die chemolumineszierende Quelle beinhaltet eine Verbindung, die durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt wird und dann Licht emittieren kann, welches als das nachweisbare Signal dient oder an einen fluoreszierenden Akzeptor Energie abgibt.
Eine mannigfaltige Anzahl von Verbindungsfamilien wurde gefunden, um Chemolumineszenz unter einer Vielfalt von Bedingungen bereitzustellen. Eine Verbindungsfamilie ist 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion. Die am weitesten verbreitete Verbindung ist Luminol, welche das 5-Amino-Analogon der obigen Verbindung ist. Andere Mitglieder der Familie umfassen das 5-Amino-6,7,8- trimethoxy- und das Dimethylamin[ca]benzo-Analogon. Diese Ver bindungen können mit alkalischem Wasserstoffperoxid oder Calciumhypochlorit und einer Base lumineszierend gemacht werden. Die 2,4,5-Triphenylimidazole mit Lophin als gängigem Namen für die Stamm-Verbindung sind eine andere Verbindungsfamihe. Chemolumineszierende Analoga umfassen para-Dimethylamino- und para- Methoxy-Substituenten. Chemolumineszenz kann auch mit Geridiniumestern, Dioxetanen und Oxalsäureestern, in der Regel aktiven Oxalylestern, z.B. p-Nitrophenyl, und einem Peroxid, z.B. Wasserstoffperoxid, unter basischen Bedingungen erhalten werden. Alternativ können Luciferine zusammen mit Luciferase oder Lucigeninen verwendet werden.
Konjugat - Ein Konjugat ist ein Molekül, das zwei oder mehrere Untereinheiten umfaßt, die, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, miteinander verbunden sind, wobei eine Einzelstruktur gebildet wird. Die Bindung kann entweder durch eine direkte Verknüpfung (z.B. eine chemische Bindung) zwischen den Untereinheiten oder durch die Verwendung einer Verbindungsgruppe gebildet werden. In einem Kontext der vorliegenden Erfindung ist zum Beispiel Cyclosporin, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einem Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin an ein Enzym konjugiert ist, ein Cyclosporin-Enzym-Konju gat. Eine Zusammensetzung, von der beschrieben ist, daß sie die Untereinheit A umfaßt, die, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an die Untereinheit B konjugiert ist, ist eine Zusammensetzung, worin die Untereinheit A, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an die Untereinheit B gebunden ist.
Konjugation - Konjugation ist irgendein Verfahren, in welchem zur Bildung eines Konjugats zwei Untereinheiten miteinander verbunden werden. Das Konjugationsverfahren kann irgendeine Anzahl von Stufen umfassen.
Rezeptor - Ein Rezeptor ist irgendeine Verbindung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist, einen besonderen räumlichen und polaren Aufbau eines Moleküls zu erkennen. Diese organisierten Bereiche eines Moleküls werden als epitope oder determinante Stellen bezeichnet. Beispiele natürlich vorkommender Rezeptoren umfassen Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Poly(nucleinsäuren), die Komplement-Komponente, d.h. Thyroxin-bindendes Globulin, Lektine, Protein A und dergleichen. Rezeptoren werden auch als Antiliganden bezeichnet. Es existiert ein natürlicher Rezeptor, der sich spezifisch an Cyclosporin bindet.
Ligand - Ein Ligand ist irgendein organisches Molekül, für welches von Natur aus ein Rezeptor existiert oder hergestellt werden kann. In einem Kontext der vorliegenden Erfindung ist zum Beispiel Cyclosporin ein Ligand, und die vorliegende Erfindung stellt Rezeptor-Antikörper für Cyclosporin bereit. In einem anderen Kontext der vorliegenden Erfindung kann Cyclosporin, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einem Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin an einen zweiten Liganden konjugiert sein. Wenn Cyclosporin in dieser Art an einen zweiten Liganden gebunden ist (Cyclosporin-Ligand-Konjugat), erkennen Rezeptoren, die in der Lage sind, den zweiten Liganden zu erkennen, das Cyclosporin-Ligand-Konjugat.
Hapten - Haptene sind in der Lage, sich spezifisch an entsprechende Antikörper zu binden, aber wirken selbst nicht als Immunogene (oder Antigene) zur Herstellung der Antikörper. Antikörper, welche ein Hapten erkennen, können gegen Verbindungen hergestellt werden, die das an einen immunogenen (oder antigenen) Träger gebundene Hapten umfassen. Haptene sind eine Untergruppe von Liganden.
In einem Kontext der vorliegenden Erfindung ist zum Beispiel Cyclosporin ein Hapten. Wenn Cyclosporin, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einem der Alanin-Stickstoffatome von Cyclosporin an einen antigenen Träger konjugiert ist, können Antikörper hergestellt werden, die in der Lage sind, Cydosporin zu erkennen. In einem anderen Kontext der vorliegenden Erfindung ist Cyclosporin, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einem der Alanin-Stickstoffatome von Cyclosporin an ein zweites Hapten konjugiert. Wenn Cyclosporin in dieser Art und Weise an ein zweites Hapten konjugiert ist (Cyclosporin-Hapten-Konjugat), binden sich Antikörper, die in der Lage sind, das zweite Hapten zu erkennen, und Antikörper, die in der Lage sind, Cyclosporin zu erkennen, an das Cyclosporin-Hapten-Konjugat.
Mitglied eines spezifischen Bindungspaares - Ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares (sbp-Mitglied) ist eines von zwei verschiedenen Molekülen, das einen Bereich auf der Oberfläche oder in einer Höhle aufweist, der spezifisch an einen besonderen räumlichen und polaren Aufbau des anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär zu diesem definiert ist. Die Mitglieder des spezifischen Bindungspaares werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Diese sind in der Regel Mitglieder eines immunologischen Paares, wie Antigen-Antikörper, obwohl andere spezifische Bindungspaare, wie Biotin- Avidin, Hormone-Hormonrezeptoren, Nucleinsäure-Doppelstränge, IgG-Protein A, DNS-DNS, DNS-RNS und dergleichen keine immunobgischen Paare aber spezifische Bindungspaare sind.
Träger oder Oberfläche - Ein Träger oder eine Oberfläche ist ein poröses oder nicht-poröses, wasserunlösliches Material. Der Träger kann hydrophil sein oder kann hydrophil gemacht werden und umfaßt anorganische Pulver, wie Siliciumdioxid, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche Polymer-Materialien, speziell Cellulose-Materialien und Materialien, die von Cellulose abgeleitet sind, wie faserhaltige Papiere, z.B. Filterpapier, chromatographisches Papier etc.; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, wie Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylsäureester, Polyethylen, Polypropylen, Poly-(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylsäureester, Polyethylenterephthalat, Nylon, Polyvinylbutyrat etc.; die entweder selbst oder zusammen mit anderen Materialien verwendet werden; als Bioglas erhältliches Glas, Keramik-Materialien, Metalle und dergleichen. Natürliche oder synthetische Aggregate, wie Liposomen, Phospholipid-Vesikel und Zellen, können auch verwendet werden. Andere Materialien, die verwendet werden können, sind oben in der Definition immunogener Träger-Partikel und unten in der Definition eines signalerzeugenden Systems beschrieben.
Die Bindung von sbp-Mitgliedern an den Träger oder an die Oberfläche kann durch allgemein bekannte Verfahren erfolgen, die gewöhnlich in der Literatur verfügbar und oben in der Definition immunogener Träger-Partikel beschrieben sind. Die Oberfläche kann irgendeine von mehreren Formen, wie einen Streifen, ein Stäbchen, ein Partikel, umfassend ein Kügelchen, und dergleichen, aufweisen.
Die Oberfläche ist in der Regel polyfunktionell oder kann polyfunktionalisiert werden oder kann durch spezifische oder nicht-spezifische, kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen ein sbp-Mitglied binden. Eine große Vielfalt funktioneller Gruppen für die Bindung ist in der Definition immunogener Träger-Partikel beschrieben.
Die Länge einer Verbindungsgruppe zu dem sbp-Mitglied kann, abhängig von der Art der zu bindenden Verbindung, der Auswirkung des Abstandes zwischen der zu bindenden Verbindung, der Auswirkung des Abstandes zwischen der zu bindenden Verbindung und dem Träger auf den Assay, und dergleichen, stark variieren. Das sbp-Mitglied wird im wesentlichen an die äußere Oberfläche des Trägers gebunden.
Signalerzeugendes System - Die Funktion des signalerzeugenden Systems ist die Erzeugung eines Produkts, welches ein nachweisbares Signal bereitstellt, das zur Menge an gebundenem und/oder nicht-gebundenem Marker in Beziehung steht.
Das signalerzeugende System kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei mindestens eine Komponente ein Marker ist. Das signalerzeugende System umfaßt alle Reagenzien, die zur Erzeugung eines meßbaren Signals erforderlich sind, umfassend signalerzeugende Mittel, die unter Erzeugung eines Signals mit dem Marker wechselwirken können.
Das signalerzeugende System stellt ein Signal bereit, das durch äußere Mittel, gewöhnlich durch die Messung elektromagnetischer Strahlung, wünschenswerterweise durch visuelle Untersuchung, nachweisbar ist. Meistens umfaßt das signalerzeugende System ein chromophores Substrat und ein Enzym, wobei die chromophoren Substrate enzymatisch in Farbstoffe, welche Licht im ultravioletten oder sichtbaren Bereich absorbieren, phosphoreszierende Stoffe oder Fluoreszenz-Farbstoffe umgewandelt werden.
Das signalerzeugende Mittel kann mit dem Marker wechselwirken, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Solche Mittel umfassen zum Beispiel elektromagnetische Strahlung, Wärme, chemische Reagenzien und dergleichen. Wenn chemische Reagenzien verwendet werden, können einige der chemischen Reagenzien als Teil einer Entwicklerisung eingeschlossen sein. Die chemischen Reagenzien können Substrate, Coenzyme, Verstärker, zweite Enzyme, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Abfänger, Metallionen, spezifische Bindungssubstanzen, die zur Bindung signalerzeugender Substanzen erforderlich sind, und dergleichen umfassen. Einige der chemischen Reagenzien, wie Coenzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten reagieren, andere Enzymen und Katalysatoren und dergleichen, können an andere Moleküle oder an einen Träger gebunden sein.
Das den Marker umfassende signalerzeugende System kann ein oder mehrere Partikel umfassen, welche unlösliche Partikel mit einem Durchmesser von mindestens etwa 50 nm und nicht mehr als etwa 50 µm, in der Regel mindestens etwa 100 nm und weniger als etwa 25 µm, bevorzugt von etwa 0,2 bis 5 µm, sind. Das Partikel kann organisch oder anorganisch, porös oder nicht-porös sein, bevorzugt eine ähnliche Dichte wie Wasser, im allgemeinen von etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml, aufweisen und aus einem Material zusammengesetzt sein, das durchsichtig, teilweise durchsichtig oder undurchsichtig sein kann. Als Marker verwendete Partikel weisen im allgemeinen ähnliche Eigenschaften wie die oben in den Definitionen eines immunogenen Trägers und eines Trägers oder einer Oberfläche beschriebenen auf.
Viele verschiedene Arten von Partikeln können zur Modulierung der Lichtemission verwendet werden. Von speziellem Interesse sind Kohlenstoff-Partikel, wie Holzkohle, Lampenschwarz, Graphit, kolbidaler Kohlenstoff und dergleichen. Außer Kohlenstoff-Partikeln können auch Metall-Sole, speziell der Edelmetalle, Gold, Silber und Platin, Verwendung finden. Andere von Metallen abgeleitete Partikel können Metalisulfide, wie Blei-, Silber- oder Kupfersulfide, oder Metalloxide, wie Eisenoder Kupferoxid, umfassen.
Mit Fluoreszein versehene Latex-Partikel sind in dem U.S.-Patent Nr. 3853987 angegeben und sind als Covaspheres von Covalent Technology Corp. im Handel erhältlich.
Messung der Menge an Cyclosporin - Quantitative, halbquantitative und qualitative Verfahren sowie alle anderen Verfahren zur Bestimmung von Cyclosporin werden als Verfahren zur Messung der Menge an Cyclosporin angesehen. Ein Verfahren, das nur die Anwesenheit oder Abwesenheit von Cyclosporin in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält, nachweist, wird zum Beispiel als innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung liegend angesehen.
Synonyme für den Ausdruck "Messen der Menge an Cyclosporin", welche innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung ins Auge gefaßt werden, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Nachweisen, Messen oder Bestimmen von Cyclosporin; Nachweisen, Messen oder Bestimmen der Anwesenheit von Cyclosporin; und Nachweisen oder Bestimmen der Menge an Cyclosporin.
Im wesentlichen in der Lage oder im wesentlichen nicht in der Lage, sich zu binden an oder zu erkennen - Betrifft einen Grad der Bindung oder des Erkennens oder dessen Mangel zwischen Molekülen in einer Assay-Mischung unter speziellen Assay- Bedingungen. In ihrem breitesten Aspekt reicht die Differenzierung zwischen der Unfähigkeit eines Moleküls, ein anderes Molekül zu binden oder zu erkennen, und der Fähigkeit, ein drittes Molekül zu binden oder zu erkennen, aus, um die Durchführung eines aussagekräftigen Assays unter einem speziellen Satz von Assay-Bedingungen zu erlauben, welcher die relativen Konzentrationen der Moleküle umfaßt. Unter einem anderen Aspekt ist ein Molekül im wesentlichen nicht in der Lage, ein anderes Molekül im Sinne einer Kreuzreaktivität zu binden oder zu erkennen, wenn das erste Molekül eine Reaktivität gegenüber einem zweiten Molekül zeigt, die weniger als 25 %, bevorzugt weniger als 10 % besonders bevorzugt weniger als 5 % der Reaktivität beträgt, die gegenüber einem dritten Molekül unter einem speziellen Satz von Assay-Bedingungen gezeigt wird, welcher die relative Konzentration der Moleküle umfaßt.
Probe von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält - Irgendeine Probe, von der vernünftigerweise vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält, kann durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung analysiert werden. Solche Proben können menschliche, tierische oder künstliche Proben umfassen. Die Probe kann in irgendeinem geeigneten Medium hergestellt werden, welches den Assay nicht stört. Typischerweise liegt die Probe in einer wäßrigen Lösung oder einer natürlichen Flüssigkeit, bevorzugt Harn, Vollblut, Serum, Plasma oder Speichel, besonders bevorzugt Vollblut, vor.
Vorbehandlung der Probe - Gegebenenfalls kann die Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält, vorbehandelt werden. Die Vorbehandlung ist irgendeine Stufe, die dazu bestimmt ist, den Ziel-Analyten für eines oder mehrere der Assay-Reagenzien leichter verfügbar zu machen. Proben, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung analysiert werden sollen, werden vorzugsweise vorbehandelt, um Zellen, welche anwesend sein können, zu lysieren, um Proteine, welche anwesend sein können, zu fällen, und um Cyclosporin, welches anwesend sein kann, zu solubilisieren. Eine solche Vorbehandlung kann die Behandlung der Probe mit einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt einem Alkohol, besonders bevorzugt Methanol, umfassen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Zusammensetzungen, umfassend ein Cyclosporin, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einem Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin an einen organischen Rest konjugiert ist. Bevorzugt ist Cyclosporin A, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe mit weniger als etwa 50, bevorzugt weniger als etwa 35, besonders bevorzugt weniger als etwa 20 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, die eine Kette mit einer Länge von nicht mehr als etwa 35, bevorzugt nicht mehr als 25, besonders bevorzugt nicht mehr als 15 Atomen, aufweist, an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und/oder 8 von Cyclosporin A konjugiert. Der organische Rest kann ein Rest mit einem größeren Molekulargewicht als etwa 2000, bevorzugt größer als etwa 5000, oder ein Rest eines kleinen organischen Moleküls, wie ein Ligand, Hapten oder Biotin, sein. Bevorzugt ist der Rest mit einem größeren Molekulargewicht als 2000 eine Poly(aminosäure). Die Polyaminosäure ist besonders bevorzugt ein immunogener Träger, wie Hämocyanin der Schlüssellochschnecke (KLH), Rinderserumalbumin (BSA) oder Rinder-γ-globulin (BGG), oder sie ist ein Enzym, wie Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PDH).
Bevorzugt umfaßt die Verbindungsgruppe, wenn anwesend, eine Hydroxyalkan-Kette der Formel -(CH&sub2;)nO-, wobei das Alanin- Stickstoffatom von Cyclosporin an ein Kohlenstoffatom des Hydroxyalkans konjugiert ist, und der organische Rest an das Sauerstoffatom konjugiert ist, und n eine ganze Zahl im Bereich von etwa 1 bis 6, bevorzugt 2 bis 4, ist, besonders bevorzugt n 2 ist. Bevorzugter wird die Hydroxyalkan-Verbindungsgruppe an dem Sauerstoffatom durch etwa 1 bis etwa 3 Carbonsäureamidreste, die durch Alkylen-Ketten miteinander verbunden sind, verlängert. Im Fall der Verlängerung wird der organische Rest an ein Ende der Carbonsäureamid-Verlängerungsgruppe und das Sauerstoffatom des Hydroxyalkanrestes an das andere Ende der Carbonsäureamid-Verlängerungsgruppe gebunden.
Alternativ umfaßt die Verbindungsgruppe, wenn anwesend, eine Carboxybenzylgruppe der Formel:
wobei das Alanin-Stickstoffatom von Cyclosporin an das Benzyl- Kohlenstoffatom konjugiert ist, und der organische Rest an ein Sauerstoffatom der Carboxylgruppe gebunden ist. Bevorzugt befindet sich die Carboxylgruppe in ortho- oder para-Stellung, besonders bevorzugt in para-Stellung, zu dem Benzyl-Kohlenstoffatom. Besonders bevorzugt wird die Carboxybenzylgruppe an dem Sauerstoffatom der Carboxylgruppe durch etwa 1 bis etwa 3 Carbonsäureamidreste, die durch Alkylen-Ketten miteinander verbunden sind, verlängert. Im Fall der Verlängerung wird der organische Rest an ein Ende der Carbonsäureamid-Verlängerungsgruppe und das Sauerstoffatom der Carboxylgruppe an das andere Ende der Carbonsäureamid-Verlängerungsgruppe gebunden.
Besonders bevorzugt ist die Verbindungsgruppe aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus:
Da Cyclosporine cyclische Undecapeptide sind, ist der Alanin-Stickstoff Teil eines Aminosäurerestes. Bevorzugt ist der Alanin-Stickstoff Teil der Aminosäurereste Nr. 7 oder 8 von Cyclosporin. Wenn die Verbindungsgruppe eine gegebenenfalls Carbonsäureamid-verlängerte Hydroxyalkan-Kette umfaßt, dann ist der Alanin-Stickstoff besonders bevorzugt Teil des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin, und wenn die Verbindungsgruppe eine gegebenenfalls Carbonsäureamid-verlängerte Carboxybenzylgruppe umfaßt, dann ist der Alanin-Stickstoff Teil eines Aminosäurerestes von Cyclosporin, der aus den Resten Nr. 7 oder 8 ausgewählt ist.
Wenn der organische Rest ein immunogener Träger ist, kann er geeigneterweise antigene Poly(aminosäuren), Lipopolysaccharide und Partikel sein. Es ist bevorzugt, daß er eine Poly(aminosäure) ist. Besonders bevorzugt ist er Hämocyanin der Schlüssellochschnecke (KLH) oder Rinderserumalbumin (BSA). Wenn der organische Rest ein immunogener Träger ist, ist es ferner bevorzugt, daß die Verbindungsgruppe eine Carboxybenzylgruppe ist. Besonders bevorzugt wird die Carboxybenzylgruppe durch etwa 1 bis etwa 3 Carbonsäureamidreste, die durch Alkylen-Ketten miteinander verbunden sind, verlängert.
Eine der bevorzugten Zusammensetzungen, die durch die vorliegende Erfindung ins Auge gefaßt wird, ist eine Mischung aus Cyclosporin A, das an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 durch die Verbindungsgruppe der Formel (XIX) an Hämocyanin der Schlüssellochschnecke konjugiert ist, und Cydosporin A, das an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 8 durch die Verbindungsgruppe der Formel (XIX) an Hämocyanin der Schlüssellochschnecke konjugiert ist.
Wenn der organische Rest ein Marker ist, hängt die Art des Markers von der Art des durchzuführenden Assays ab. Für Enzym-Immunoassays ist der Marker ein Enzym. Bevorzugt ist er für homogene Enzym- Immunoassays Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase. Wenn der organische Rest ein Marker ist, ist es ferner bevorzugt, daß die Verbindungsgruppe ein Hydroxyalkanrest ist. Besonders bevorzugt wird der Hydroxyalkanrest durch etwa 1 bis etwa 3 Carbonsäureamidreste verlängert.
Eine andere der bevorzugten Zusammensetzungen, die durch die vorliegende Erfindung ins Auge gefaßt wird, ist Cyclosporin A, das an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 durch die Verbindungsgruppe der Formel (II) an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase konjugiert ist.
Unter einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Cyclosporin, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einem der Alanin- Stickstoffatome, welche Teil des cyclischen Grundgerüsts von Cyclosporin sind, an einen organischen Rest konjugiert ist. Das Verfahren umfaßt die folgenden Stufen:
a) Umsetzung eines gegebenenfalls geschützten Cyclosporins mit einer Base, die ausreichend basisch ist, um ein sekundäres Amid zu deprotonieren,
b) Umsetzung der Verbindung von a) mit einem Alkylierungsmittel, um ein Cyclosporin zu bilden, das an einem seiner Amid-Stickstoffatome seines cyclischen Grundgerüsts an eine Verbindungsgruppe konjugiert ist,
c) gegebenenfalls Vergrößerung der Länge der Verbindungsgruppe der Verbindung von b) durch die Zugabe von Carbonsäureamidresten, um ein Cyclosporin zu bilden, das an einem seiner Amid-Stickstoffatome seines cyclischen Grundgerüsts an eine Carbonsäureamid-verlängerte Verbindungsgruppe konjugiert ist,
d) Entfernung von irgendwelchen Schutzgruppen aus der Verbindung von b) oder c), um Cyclosporin zu bilden, das an einem seiner Alanin-Stickstoffatome seines cyclischen Grundgerüsts an eine Verbindungsgruppe oder an eine Carbonsäureamidverlängerte Verbindungsgruppe konjugiert ist (Cyclosporin-Verbindungsgruppe-Konjugat),
e) gegebenenfalls Aktivierung einer funktionellen Gruppe an dem Cyclosporin-Verbindungsgruppe-Konjugat von d), um ein Cyclosporin zu bilden, das an einem seiner Alanin-Stickstoffatome seines cyclischen Grundgerüsts an eine aktivierte Verbindungsgruppe konjugiert ist (Cyclosporin-aktivierte Verbindungsgruppe-Konjugat), und
f) gegebenenfalls Umsetzung des Cyclosporin-aktivierte Verbindungsgruppe-Konjugats von e) mit einem kleinen organischen Molekül oder einer Verbindung mit einem größeren Molekulargewicht als 2000, um Cyclosporin zu bilden, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe, an einem seiner Alanin- Stickstoffatome an einen organischen Rest konjugiert ist, wobei der organische Rest ein Rest eines kleinen organischen Moleküls oder ein Rest mit einem größeren Molekulargewicht als 2000 ist.
Bevorzugt ist die Schutzgruppe von a) eine Hydroxyl- Schutzgruppe, welche unter stark basischen Bedingungen stabil ist, jedoch unter anderen milden Bedingungen leicht entfembar ist. Solche Gruppen sind in dem Fachgebiet allgemein bekannt und werden nicht ausführlich beschrieben. Eine ausführliche Schilderung solcher Gruppen und die für ihre Herstellung und spätere Entfernung erforderlichen Bedingungen können jedoch in Greene, T. W., "Protective Groups in Organic Synthesis" (Wiley- Interscience, NY, 1981) Seite 1, Absatz 1, und Seiten 10-72, und McOmie, J. F. W., Hrsg., "Protective Groups In Organic Chemistry" (Plenum Press, NY, 1973) Seiten 96-120, gefunden werden. Solche Gruppen umfassen Methyl-, t-Butyl-, Allyl-, Benzyl-, Triarylmethyl-, Silyl- und Tetrahydropyranylether; Acetale, Ketale, Essigsäureester, Benzoesäureester, p-Nitrobenzoesäureester, Ameisensäureester, Trifluor-, Chlor-, Methoxy- und Phenoxyessigsäureester; Kohlensäureester und dergleichen. Besonders bevorzugt basiert die Schutzgruppe auf einem Alkylsilan. Insbesondere bevorzugt ist sie eine Trimethylsilylgruppe. Trimethylsilyl-(TMS)-geschütztes CsA (TMS-CsA) ist in Formel (XXV) gezeigt.
Die Silylierungsreaktion (ausführlich in dem eingeschlossenen Material von Greene auf den Seiten 39-50 beschrieben) wird typischerweise in gemischten Lösungsmitteln, wie einer Amin/Halogenalkan-Mischung, durchgeführt. Bevorzugt ein Trialkylamin oder mit Dichlormethan gemischtes Pyridin, besonders bevorzugt Pyridin/Dichlormethan. Die Reaktion wird unter einer inerten Atmosphäre, wie Stickstoff, Argon, Helium und dergleichen, durchgeführt. Die Reaktion erfordert typischerweise zwischen 1 Minute und 24 Stunden, bevorzugt 30 Minuten und 18 Stunden. Die Reaktionstemperaturen liegen zwischen -10ºC und 100ºC, bevorzugt 0ºC und 50ºC, besonders bevorzugt 20ºC und 25ºC.
Bevorzugt weist die in der Stufe a) verwendete Base eine ausreichende Basenstärke auf, um eine sekundäre Amidgruppe, welche Teil einer Poly(aminosäure) ist, zu deprotonieren. Solche Basen sind in dem Fachgebiet allgemein bekannt und werden nicht ausführlich beschrieben. Bevorzugt ist die Base ein Alkalimetallanion (Salz der Gruppe 1A eines Hydrids oder organischen Anions), wie ein Metallhydrid, -alkyl oder -amid, umfassend Methyllithium, Butyllithium, Lithiumhydrid, Kaliumhydrid, Lithiumdiisopropylamid, Lithiumcyclohexylisopropylamid und dergleichen. Besonders bevorzugt ist die Base eine Metallhydridbase, wie Natrium-, Lithium- oder Kaliumhydrid.
Die Deprotonierungsreaktion wird bei -78ºC bis 100ºC, bevorzugt -10ºC bis 40ºC, besonders bevorzugt 0ºC bis 20ºC, durchgeführt. Das Lösungsmittel für solche Reaktionen ist ein inertes, organisches Lösungsmittel, wie aliphatische Kohlenwasserstoffe und aromatische Kohlenwasserstoffe, zum Beispiel Benzol, Toluol oder Hexan. Gegebenenfalls wird ein Metallionen- Chelator, der zur Komplexierung von Kationen der Gruppe 1A geeignet ist, wie ein Kronenether, eine β-Dicarbonyl-Verbindung oder ein Poly(alkylenoxid), zu dem Lösungsmittel gegeben. Bevorzugt wird ein Kronenether, wie 18-Krone-6 oder 15-Krone-5, in einem Lösungsmittel aus aromatischen Kohlenwasserstoffen verwendet, besonders bevorzugt wird 15-Krone-5-Ether in Toluol verwendet. Die Reaktion wird typischerweise unter einer inerten Atmosphäre zwischen 1 Minute und 24 Stunden, bevorzugt 10 Minuten und 12 Stunden, besonders bevorzugt 10 Minuten und 2 Stunden, durchgeführt.
Bevorzugt ist die Alkylierungsgruppe von b) ein α-Halogenalkylbenzoesäureester oder ein Epoxid.
Wenn die herzustellende Verbindung eine Carboxybenzyl- Verbindungsgruppe aufweist, dann weist die Alkylierungsgruppe besonders bevorzugt die Formel (XXVI) auf.
R&sub1; und R&sub2; in Formel (XXVI) sind jeweils unabhängig voneinander H oder Alkyl mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen, bevorzugt H oder Methyl, besonders bevorzugt H.
G&sub1; in Formel (XXVI) ist ein Halogenatom, bevorzugt ein Brom-, Chlor- oder lodatom, besonders bevorzugt ein Bromatom.
T&sub2; in Formel (XXVI) ist O, S oder NR&sub3;, worin R&sub3; H oder Alkyl mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen, bevorzugt O oder S, besonders bevorzugt O, ist.
Der Wert von k&sub1; in Formel (XXVI) beträgt 1 bis etwa 4, bevorzugt bis etwa 2, besonders bevorzugt beträgt k&sub1; 1.
G&sub2; in Formel (XXVI) ist OR&sub4; oder SR&sub5;, worin R&sub4; und R&sub5; Schutzgruppen für die entsprechenden Sauerstoff-, Stickstoffoder Schwefelcarbonyl-Funktionen sind, die abhängig von der Art von T&sub2; und G&sub2; ausgewählt sind. Schutzgruppen für diese funktionellen Gruppen sind in Greene, T. W., "Protective Groups in Organic Synthesis" (Wiley-Interscience, NY, 1981), Seite 1, Absatz 1, Seiten 154-192, 209-210 und 249-278; und McOmie, J. F. W., Hrsg., "Protective Groups In Organic Chemistry" (Plenum Press, NY, 1973), Seiten 183-210, 286-295 und 404-412, beschrieben und werden nicht ausführlich angegeben. G&sub2; ist bevorzugt OR&sub4;, worin R&sub4; Alkyl mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen ist, besonders bevorzugt R&sub4; Methyl ist.
Wenn die herzustellende Verbindung eine Carboxybenzyl- Verbindungsgruppe aufweist, dann ist das Alkylierungsmittel insbesondere bevorzugt ein ortho- oder para-α-Halogenmethylbenzoesäurealkyl-(mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen)ester. Bevorzugt ist das Produkt der Alkylierung mit dem α-Halogenmethylbenzoesäurealkylester ein Cyclosporin, das an einem der Alanin-Stickstoffatome der Aminosäureeste Nr. 7 und 8 von
Cyclosporin an einen ortho- oder para-Carboxybenzylalkylesterrest konjugiert ist.
Wenn die herzustellende Verbindung eine Hydroxyalkan- Verbindungsgruppe aufweist, dann weist die Alkylierungsgruppe besonders bevorzugt die Formel (XXVII) auf.
R&sub6;, R&sub7;, R&sub8; und R&sub9; in Formel (XXVII) sind jeweils unabhängig voneinander H, Alkyl mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen, bevorzugt H oder Methyl, besonders bevorzugt H.
Wenn die herzustellende Verbindung eine Hydroxyalkan- Verbindungsgruppe aufweist, dann ist das Alkylierungsmittel insbesondere bevorzugt ein Alkylepoxid mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen, wie Ethylenoxid, Propylenoxid und dergleichen. Bevorzugt ist das Produkt der Alkylierung mit Ethylenoxid ein Cyclosporin, das an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin an eine Kette aus 2 Kohlenstoffen mit einer Hydroxy-Endgruppe konjugiert ist.
Das Alkylierungsreagens wird typischerweise nach der oben für die Deprotonierung beschriebenen Zeit zu der Reaktionsmischung gegeben. Nach der Zugabe des Alkylierungsreagens wird die Reaktion zwischen 1 Minute und 48 Stunden, bevorzugt 1 Stunde und 36 Stunden, besonders bevorzugt 12 Stunden und 24 Stunden, fortgesetzt.
Bevorzugt ist die fakultative Stufe c) der Verlängerung mit einer Carbonsäureamid-Kette ein Standardverfahren der Poly(aminosäure)synthese. Solche Stufen sind in dem Fachgebiet herkömmlich und werden nicht ausführlich beschrieben. Eine Zusammenfassung solcher Stufen kann jedoch in White , A. et ifil., PPrinciples of Biochemistry" (Mcgraw-Hill, NY, 1978) , Seiten 92-95, gefunden werden.
Im allgemeinen werden irgendwelche Amino-, Hydroxyl-, Carboxylgruppen oder andere Gruppen, die nicht umgesetzt werden sollen, geschützt (wie in den oben angegebenen Arbeiten von Greene und Mcomie beschrieben). Schutzgruppen umfassen Benzyloxycarbonyl, Triphenylmethyl, tertiäres Butyloxycarbonyl, Phthaloyl, Trifluoracetyl, Benzyl, p-Toluolsulfonyl, gesättigtes Niederalkyl, Benzylester, tertiären Butylester, Acetyl und dergleichen. Die umzusetzende nicht-geschützte Carboxylgruppe wird durch die Reaktion mit einem Kupplungsreagens aktiviert, wobei eine aktivierte Estergruppe gebildet wird. Solche Kupplungsmittel umfassen Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Chlorameisensäureisobutylester, N,N'-Carbonyldiimidazol, p-Nitrophenol/ DCC und dergleichen. Der aktivierte Ester wird dann zur Bildung der mit einer Carbonsäureamid-Kette verlängerten Verbindung von c) mit einer Aminoverbindung umgesetzt.
Besonders bevorzugt umfaßt die Stufe der Verlängerung mit einer Carbonsäureamid-Kette die Reaktion der Verbindung von b) mit einem Isocyanat oder Thioisocyanat. Typischerweise läßt man die Verbindung, die mit einer Kette verlängert werden soll, mit einem metallorganischen Katalysator, wie einem Alkylmetallalkoxid, in einem aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel reagieren, und ein gesättigter Isocyanatoder Thioisocyanat-Alkyl-(mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen)-ester wird zugegeben. Bevorzugt ist der Katalysator ein Trialkylzinn-Komplex, besonders bevorzugt Tributylzinnethoxid. Die bevorzugten Lösungsmittel sind aromatische Kohlenwasserstoffe, besonders bevorzugt Toluol. Bevorzugt ist das Reagens zur Verlängerung mit einer Carbonsäureamid-Kette ein Isocyanatmethylester, wie β-Alaninisocyanatmethylester, Glykonsäureisocyanatmethylester und dergleichen.
Eine alternative, besonders bevorzugte Stufe der Verlängerung mit einer Carbonsäureamid-Kette umfaßt die Reaktion der Verbindung von b) unter den für die Konjugationsstufe unten beschriebenen Bedingungen. Man läßt die Verbindung, die kettenverlängert werden soll, vorzugsweise mit einem unten beschriebenen Aktivierungsreagens reagieren, und man läßt den aktivierten Ester mit oder ohne Reinigung mit der mit einer Carbonsäureamid-Kette verlängernden Einheit, bevorzugt einer Aminosäure oder Poly(aminosäure), besonders bevorzugt einer nicht-substituierten Aminosäure, wie Glycin, Alanin, Valin, Leucin oder Isoleucin, oder aus etwa 2 bis 12 Resten davon hergestellten Poly(aminosäuren) reagieren, wobei die Einheit zur Kettenverlängerung insbesondere bevorzugt aus der Einheit aus 2 Aminosäuren Glycyl-Glycin besteht.
Irgendeine Zahl geeigneter Stufen zur Kettenverlängerung kann der Reihe nach durchgeführt werden, um vielfältige Längen von Carbonsäureamid-verlängerten Ketten zu erhalten.
Die Stufe d) der Abspaltung der Schutzgruppe wird basierend auf der oben ausführlich beschriebenen Schutzgruppe ausgewählt. Das oben zitierte und eingeschlossene Referenzmaterial beschreibt die Bedingungen und Reagenzien zur Entfernung der bevorzugten Schutzgruppen.
Typischerweise umfaßt die Abspaltung der Schutzgruppe die wäßrige Hydrolyse bei einem pH-Wert von etwa 2-12, bevorzugt 3-11, besonders bevorzugt 4-10, in Wasser bei etwa 5-95ºC, bevorzugt 10-40ºC, besonders bevorzugt 20-25ºC. Fakultative Katalysatoren der Hydrolyse umfassen Säuren oder Basen, bevorzugt HCL, H&sub2;SO&sub4;, HF, HBR, p-Toluolsulfonsäure, NaOH, Na&sub2;CO&sub3;, NaHCO&sub3;, K&sub2;CO&sub3; oder KHCO&sub3;, besonders bevorzugt HCl oder K&sub2;CO&sub3;. Gegebenenfalls kann ein organisches Colösungsmittel, typischerweise ein protisches Lösungsmittel, bevorzugt ein Alkohol, besonders bevorzugt Methanol, verwendet werden.
Eine alternative, bevorzugte Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppe umfaßt die Behandlung mit einer Fluoridionen-Quelle, wie HF, oder einem organischen Fluoridsalz, bevorzugt einem quartären Ammoniumfluorid, besonders bevorzugt einem Tetraalkylammoniumfluorid. Die Reaktion wird bei den oben beschriebenen Temperaturen in einem inerten, organischen Lösungsmittel, bevorzugt einem Ether, besonders bevorzugt Diethylether oder Tetrahydrofuran, durchgeführt.
Die oben beschriebenen Verfahren zur Carbonsäureamid- Kettenverlängerung sind auch für die Stufen der Aktivierung und Konjugation von e) und f) nützlich.
Bevorzugt werden die Stufen der Aktivierung und Konjugation von e) und f) durchgeführt, wie es in dem Fachgebiet üblich ist. Maggio, E. T., "Enzyme-Immunoassay" (CRC Press, Boca Raton, FL, 1980), Kapitel 4, Seiten 81-86, enthält zum Beispiel eine Zusammenstellung solcher Verfahren.
Besonders bevorzugt wird das Cyclosporin-Verbindungsgruppe-Konjugat durch die Reaktion mit einem Aktivierungsreagens, wie einem Chlorameisensäurealkyl-(mit weniger als etwa 9 Kohlenstoffatomen)-ester, z.B. Chlorameisensäureisobutylester; Dialkylcarbodiimid, z.B. Dicyclohexylcarbodiimid; 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC), 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholino-4-ethyl)carbodiimid-p-toluolsulfonsäuremethylester (CMC), N-Hydroxysuccinimid (NHS) /EDAC, N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS)/EDAC und dergleichen, aktiviert. Die Aktivierungsreaktion wird typischerweise bei -10-100ºC, bevorzugt bei 0-30ºC, besonders bevorzugt bei 0-10ºC, bevorzugt unter einer Atmosphäre von Stickstoff, Helium, Argon und dergleichen, durchgeführt. Die Aktivierungsreaktion wird 1 Minute bis 10 Tage, bevorzugt 1 Stunde bis 2 Tage, besonders bevorzugt 6-18 Stunden, durchgeführt. Nach der Aktivierungsreaktion wird die aktivierte Verbindung zu einer Lösung des kleinen organischen Moleküls oder der Verbindung mit einem größeren Molekulargewicht als 2000 in einem organischen oder wäßrigen/organischen Lösungsmittel, wie DMF oder DMF/Boratpuffer und dergleichen, gegeben. Die Zugabe kann während einer Zeitdauer stattfinden oder sie kann auf einmal durchgeführt werden. Wenn die Zugabe während einer Zeitdauer stattfindet, erfordert sie typischerweise 1 Minute bis 12 Stunden, bevorzugt 10 Minuten bis 8 Stunden, und besonders bevorzugt 30 Minuten bis 3 Stunden. Nach der Zugabe läßt man die Mischung 1 Minute bis 3 Tage, bevorzugt 10 Minuten bis 1 Tag, besonders bevorzugt 1 bis 18 Stunden, rühren.
Das Produkt wird dann gegebenenfalls, wie erforderlich, gereinigt. Die Reinigung und Charakterisierung von Poly(aminosäure)-Hapten-Konjugaten wurden ausführlich in Maggio et al. "Enzyme-Immunoassay" (CRC Press, Boca Raton, FL, 1980), Kapitel 4, Seiten 86-88, beschrieben. Wenn das Konjugat ein Cyclosporin-immunogener Träger-Konjugat oder ein Cyclosporin-Enzym-Konjugat ist, kann die Reinigung zum Beispiel durch Dialyse gegen wäßrige/organische und wäßrige Lösungen, wie Wasser/DMF oder Wasser, oder durch Gelfiltrationschromatographie auf Trägern, wie Sephadex und dergleichen, erfolgen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt Antikörper, die als Antwort auf ein Immunogen gebildet wurden, das Cyclosporin ist, das an einem Alanin-Stickstoffatom des cydischen Grundgerüsts des Cyclosporins an einen immunogenen Träger konjugiert ist. Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung Konjugate aus solchen Antikörpern und einem Marker.
Bevorzugt werden die Antikörper gegenüber Cyclosporin A gebildet, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe mit weniger als etwa 50 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, bevorzugt weniger als etwa 35 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, besonders bevorzugt weniger als etwa 20 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, die eine Kette mit einer Länge von nicht mehr als etwa 35, bevorzugt nicht mehr als etwa 25, besonders bevorzugt nicht mehr als etwa 15, Atomen aufweist, an den Alanin-Stickstoffatomen der Äminosäurereste Nr. 7 und/oder 8 von Cyclosporin A an einen immunogenen Träger konjugiert ist.
Ein Antikörper ist ein Immunglobulin, welches sich an einen besonderen räumlichen und polaren Aufbau eines anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und kann durch Verfahren, die in dem Fachgebiet allgemein bekannt sind, wie die Immunisierung eines Wirts und die Gewinnung von Seren, aus welchen das Immunglobulin durch bekannte Verfahren abgetrennt werden kann (polyklonal), durch die Herstellung kontinuierlicher Hybridzellinien und die Gewinnung des sezernierten Proteins (monoklonal) oder durch das Klonieren und Exprimieren von Nukleotid-Sequenzen oder deren mutagenisierter Versionen hergestellt werden, die mindestens die zur spezifischen Bindung von natürlichen Antikörpern erforderlichen Aminosäure- Sequenzen kodieren. Antikörper können ein vollständiges Immunglobulin oder Fragmente davon umfassen, wobei die Immunglobuline die vielfältigen Klassen und Isotypen, wie IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b und IGG3, IgM etc. beinhalten. Fragmente davon können Fab, Fv und F(ab')2, Fab' und dergleichen umfassen.
Monoklonale Antikörper können durch das von Milstein und Kohler diskutierte und in Nature, 1975 256, 495-7 berichtete Verfahren erhalten werden. Die Einzelheiten dieses Verfahrens sind allgemein bekannt und werden hier nicht wiederholt. Im wesentlichen umfaßt es jedoch das Injizieren eines Immunogens in einen Wirt, in der Regel eine Maus oder ein anderes geeignetes Tier. Anschließend werden Zellen aus der Milz des Tieres entnommen. Alternativ kann der Wirt nicht-sensibilisierte Milzzellen sein, welche gegenüber dem Immunogen in vitro sensibilisiert sind. Die entstandenen Zellen werden mit Myelom-Zellen fusioniert. Das Ergebnis ist eine als "Hybridoma" bezeichnete Hybridzelle, die in vitro kultiviert werden kann. Die Hybridoma-Population wird gescreent und zur Isolierung einzelner Klone manipuliert, von denen jeder einen einzelnen Antikörper gegenüber dem Antigen sezerniert.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, Cyclosporin und in naher Beziehung stehende Verbindungen spezifisch zu erkennen, die an Stellung 1 (CsA-Nummerierung) die nicht-modifizierte Aminosäure mit 9 Kohlenstoffatomen ent hai ten.
Konjugate aus den Antikörpern der vorliegenden Erfindung und einem Marker können durch Verfahren hergestellt werden, die bereits oben für die Konjugation von Poly(aminosäuren) an Cydosporinreste beschrieben wurden. Die Aktivierung des Cyclosporin-Verbindungsgruppe-Konjugats wird wie beschrieben durchgeführt. Die Konjugation der aktivierten Verbindung an den Antikörper wird wie oben beschrieben durchgeführt.
Bevorzugt wird der pH-Wert eines Marker-Konjugat-Reagens bis zum Gleichgewicht optimiert, wobei unter irgendwelchen anderen Überlegungen auch die Aktivität und Stabilität des Marker-Konjugats berücksichtigt werden.
In einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft diese vorliegende Erfindung Cyclosporin-G6PDH-Konjugat-Reagenzien, in denen der pH-Wert 6-10, bevorzugt 7-9, besonders bevorzugt 7,5-8,5, beträgt.
Bevorzugt wird der pH-Wert eines Antikörper-Reagens optimiert, um die Stabilität und Genauigkeit von Assay-Reagens- Komponenten zu maximieren.
In einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Cyclosporin-Antikörper-Reagenzien, in denen der pH-Wert 4-7, bevorzugt 5-6, besonders bevorzugt 5,25- 5,85, beträgt.
Oberflächenaktive Zusätze, umfassend Füllstoffe, wie BLG oder PEG; Antischaummittel und Tenside, wie Tween -20, Plurafax A38, Triton X-100, Pluronic 2SR2, RSA, BSA, Mod-u-cyte, Sol-u-pro oder dergleichen; und andere Materialien, die in dem Fachgebiet herkömmlicherweise verwendet werden, können sowohl zu den Antikörper- als auch zu den Marker-Konjugat-Reagenzien gegeben werden. Oberflächenaktive Zusätze können zugegeben werden, um hydrophobe Verbindungen oder Verbindungen mit niedriger Löslichkeit in Lösung zu halten, Assay-Reagens-Komponenten zu stabilisieren oder die Aktivität des Assay-Reagens zu optimieren.
Bevorzugt werden oberflächenaktive Zusätze zu Antikörper-Reagenzien gegeben, um Cyclosporin in Lösung zu halten, wenn das Antikörper-Reagens zu der Probe gegeben wird, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält.
In einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Cyclosporin-Antikörper-Reagenzien, die einen oder mehrere beigemengte Füllstoffe, Tenside und/oder Antischaummittel enthalten.
Bevorzugt werden oberflächenaktive Zusätze zu Marker- Konjugaten gegeben, um Marker-Konjugate während der Aufbewahrung und Yerwendung in Lösung zu halten.
In einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Cyclosporin-G6PDH-Konjugat-Reagenzien, die einen oder mehrere Füllstoffe, Tenside und/oder Antischaummittel enthalten.
Antimikrobielle Mittel können zu Assay-Reagenzien gegeben werden, um die Haltbarkeitsdauer der Reagenzien zu verlängern. In dem Fachgebiet herkömmliche antimikrobielle Mittel sind brauchbar. In einer ihrer am meisten bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Cyclosporin-Assay-Reagenzien, die antimikrobielle Mittel enthalten.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Messung der Menge an Cyclosporin in Proben, von denen vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthalten. Die Antikörper und die Marker-Konjugate der vorliegenden Erfindung können zur Messung der Menge an Cyclosporin in einer Probe verwendet werden, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält. Der Assay kann die Stufen einer fakultativen Vorbehandlung der Probe, das nachfolgende Kontaktieren der Probe mit Antikörpern für Cyclosporin und das entweder direkte oder indirekte Messen der Menge an Immun-Komplexen aus den Antikörpern und Cyclosporin umfassen. Die unter diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Verbesserung ist die Verwendung der anwesenden Antikörper als die Antikörper für Cyclosporin. Die Immun-Komplexe werden zum Beispiel direkt nachgewiesen, wenn die verwendeten Antikörper an einen Marker konjugiert sind. Der Immun-Komplex wird durch die Untersuchung der Auswirkung der Immun-Komplex-Bildung in einem Assay-Medium auf das signalerzeugende System oder durch die Verwendung eines markierten Rezeptors, der sich spezifisch an einen Antikörper der Erfindung bindet, indirekt nachgewiesen.
In einer anderen Ausführung eines Assays zur Bestimmung von Cyclosporin in einer gegebenenfalls vorbehandelten Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält, wird die Probe mit Antikörpern für Cyclosporin und einem durch die Antikörper erkannten Marker-Konjugat dieser Erfindung kontaktiert. Das Verfahren umfaßt ferner entweder das direkte oder indirekte Messen der Menge an Immun-Komplexen aus dem Marker-Konjugat und den Antikörpern. Cyclosporin, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe mit weniger als etwa 50, bevorzugt weniger als 35, besonders bevorzugt weniger als 20, von Wasserstoff verschiedenen Atomen, die eine Kette mit einer Länge von nicht mehr als etwa 35, bevorzugt nicht mehr als 25, besonders bevorzugt nicht mehr als 15, Atomen aufweist, an einen Marker konjugiert ist, kann als das Marker-Konjugat verwendet werden.
Der Assay der Erfindung wird auf alle Immunoassays für Cyclosporin angewendet. Der Assay kann entweder ohne Trennung (homogen) oder mit Trennung (heterogen) irgendwelcher der Assay-Komponenten oder -Produkte durchgeführt werden. Beispiele heterogener Assays sind Enzym-Immunoassays, wie der Festphasen- Enzym-Immunoassay (ELISA), siehe "Enzyme-Immunoassay" von Edward T. Maggio, CRC Press Incorporated, Boca Raton, Florida, 1980. Homogene Immunoassays werden durch Enzym-verstärkte Immunoassay-Verfahren (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 3817837), Immunofluoreszenz-Verfahren, wie die in dem U.S.-Patent Nr. 3993345 offenbarten, Enzym-Channeling-Verfahren, wie die in dem U.S.- Patent Nr. 4233402 offenbarten, und andere Enzym-Immunoassays, wie oben in Maggio diskutiert, veranschaulicht.
Die zu analysierende Probe kann vorbehandelt werden, um Zellen, die anwesend sein können, zu lysieren, um Proteine, die anwesend sein können, zu fällen, und/oder um Cyclosporin, das anwesend sein kann, zu solubilisieren. Es ist bevorzugt, daß die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu analysierenden Proben durch das Kontaktieren der Probe mit einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt einem Alkohol, besonders bevorzugt einem Alkohol mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, vorbehandelt werden.
Der Assay für den Analyten wird gewöhnlich in einem wäßrigen, gepufferten Medium bei einem mäßigen pH-Wert, im allgemeinen dem durchgeführt, welcher eine optimale Empfindlichkeit des Assays bereitstellt.
Das wäßrige Medium kann ausschließlich Wasser sein oder kann 0 bis 40 Volumenprozent eines Colösungsmittels umfassen.
Der pH-Wert für das Medium liegt in der Regel im Bereich von etwa 4 bis 11, häufiger im Bereich von etwa 5 bis 10 und bevorzugt im Bereich von etwa 6,5 bis 9,5. Der pH-Wert stellt in der Regel einen Kompromiß zwischen der optimalen Bindung der Bindungsmitglieder irgendwelcher spezifischer Bindungspaare und dem optimalen pH-Wert für andere Reagenzien des Assays, wie Mitglieder des signalerzeugenden Systems, dar.
Vielfältige Puffer können verwendet werden, um den gewünschten pH-Wert zu erreichen und während der Bestimmung aufrechtzuerhalten. Beispiele von Puffern umfassen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen. Der spezielle verwendete Puffer ist für diese Erfindung nicht kritisch, aber in einem einzelnen Assay kann der eine oder andere Puffer bevorzugt sein.
Mäßige Temperaturen und in der Regel konstante Temperaturen während der Dauer der Messung werden gewöhnlich zur Durchführung des Assays, speziell für Bestimmungen der Rate, verwendet. Die Inkubationstemperaturen liegen gewöhnlich im Bereich von etwa 5ºC bis 45ºC, häufiger von etwa 15ºC bis 40ºC. Die Temperaturen während der Messungen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 10ºC bis 50ºC, häufiger von etwa 15ºC bis 40ºC.
Die Konzentration von Cyclosporin, die untersucht werden kann, variiert im allgemeinen von etwa 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;¹³ M, häufiger von etwa 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;&sup8; M. Überlegungen derart, ob der Assay qualitativ, halbquantitativ oder quantitativ (hinsichtlich der in der Probe anwesenden Menge an Cyclosporin) ist, das spezielle Nachweisverfahren und die Konzentration des Cyclosporins bestimmen gewöhnlich die Konzentrationen der vielfältigen Reagenzien.
Während die Konzentrationen der vielfältigen Reagenzien in dem Assay-Medium im allgemeinen durch den interessierenden Konzentrationsbereich von Cyclosporin bestimmt werden, wird die Endkonzentration jedes der Reagenzien gewöhnlich empirisch bestimmt, um die Empfindlichkeit des Assays über den Bereich zu optimieren. Das heißt, eine signifikante Änderung der Cyclosporin-Konzentration sollte einen genau meßbaren Signalunterschied bereitstellen.
Während die Reihenfolge der Zugabe stark variiert werden kann, gibt es, abhängig von der Art des Assays, bestimmte Bevorzugungen. Die einfachste Reihenfolge der Zugabe ist die gleichzeitige Zugabe aller Materialien und die Bestimmung der Auswirkung, die das Assay-Medium auf das Signal hat, wie in einem homogenen Assay. Alternativ können die Reagenzien nacheinander vereinigt werden. Gegebenenfalls kann nach jeder Zugabe eine Inkubationsstufe, im allgemeinen im Bereich von etwa 30 Sekunden bis 6 Stunden, häufiger von etwa 1 Minute bis 1 Stunde, eingeschlossen sein.
In einem homogenen Assay wird nach der entweder gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Vereinigung aller Reagenzien das Signal bestimmt. Das Signal wird zur Menge an Cyclosporin in der untersuchten Probe in Beziehung gesetzt. In dem Enzymverstärkten Immunoassay-Verfahren, wie in dem U.S.-Patent Nr. 3817837 (1974) beschrieben, wird zum Beispiel für den Nachweis von Cyclosporin eine Probe, von der vermutet wird, daß sie Cydosporin enthält, in einem wäßrigen Medium entweder gleichzeitig oder nacheinander mit einem Antikörper der vorliegenden Erfindung und einem Cyclosporin-Enzym-Konjugat der vorliegenden Erfindung vereinigt.
Im allgemeinen wird ein Substrat für das Enzym zugegeben, was nach der Enzym-katalysierten Reaktion die Bildung eines chromogenen oder fluorogenen Produkts zur Folge hat. Bevorzugt ist das Cyclosporin-Enzym-Konjugat Cyclosporin A, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe mit weniger als 50 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, bevorzugt weniger als 35 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, besonders bevorzugt weniger als 20 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, die eine Kette mit einer Länge von nicht mehr als etwa 35, bevorzugt 25, besonders bevorzugt 15, Atomen aufweist, an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin an ein Enzym gebunden ist. Ein besonders bevorzugtes Enzym ist Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase. Das Cyclosporin in der Probe und das Cyclosporin-Enzym-Konjugat konkurrieren um Stellen an dem Antikörper. Die Enzym-Aktivität in dem Medium wird anschließend, in der Regel durch spektrophotometrische Mittel, bestimmt und mit der Enzym-Aktivität verglichen, die bestimmt wurde, wenn ein Kalibrator oder eine Referenzprobe, in welchem (welcher) eine bekannte Menge an Cyclosporin anwesend ist, untersucht wird. Typischerweise wird der Kalibrator oder die Referenzprobe auf eine Art und Weise untersucht, die im wesentlichen dieselbe ist, wie bei der Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält. Im allgemeinen kann das Ergebnis aus einer unbekannten Probe mit den Ergebnissen von Assay-Läufen an mehreren Standard-Proben verglichen werden. Die Standard-Proben enthalten typischerweise unterschiedliche, jedoch bekannte, Konzentrationen des zu bestimmenden Cyclosporin-Analyten. Die in den Standard-Proben vorliegenden Konzentrationsbereiche umspannen den Bereich von vermuteten Analyt-Konzentrationen in den unbekannten Proben.
Heterogene Assays beinhalten in der Regel eine oder mehrere Trennstufen. Der heterogene Assay kann kompetitiv oder nicht-kompetitiv sein. In dem kompetitiven Assay kann ein Antikörper der Erfindung an einen Träger gebunden sein, welcher dann mit einem Medium kontaktiert wird, das die Probe und Cyclosporin enthält, das an einem Alanin-Stickstoffatom des cyclischen Grundgerüsts des Cyclosporins an einen nachweisbaren Marker, wie ein Enzym, konjugiert ist. Cyclosporin in der Probe konkurriert mit dem Konjugat um die Stellen an dem Antikörper, der an den Träger gebunden ist. Nach der Trennung des Trägers und des Mediums kann die Marker-Aktivität des Trägers oder des Mediums durch herkömmliche Verfahren bestimmt werden und wird zu der Menge an Cyclosporin in der Probe in Beziehung gesetzt.
In einem anderen kompetitiven heterogenen Ansatz wird ein Antikörper der Erfindung an einen Träger gebunden. Ein Medium wird hergestellt, das eine Probe enthält, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin und Cyclosporin, das an einem Alanin- Stickstoffatom des cyclischen Grundgerüstes des Cyclosporins an einen Rest eines kleinen organischen Moleküls (Molekulargewicht weniger als 2000), wie Biotin, konjugiert ist, enthält. Bevorzugt ist Cyclosporin A, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe mit weniger als etwa 50 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, bevorzugt weniger als etwa 35 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, besonders bevorzugt weniger als etwa 20 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, die eine Kette mit einer Länge von nicht mehr als etwa 35, bevorzugt nicht mehr als 25, besonders bevorzugt nicht mehr als 15 Atomen, aufweist, über das Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und/oder 8 von Cyclosporin A konjugiert. Cyclosporin und das Konjugat konkurrieren um die Antikörper-Stellen. Nach einer Zeitdauer wird der Träger von dem Medium abgetrennt, gewaschen und mit einem zweiten Medium kontaktiert, das einen Rezeptor oder Bindungspartner für das kleine organische Molekül enthält, der an einen Marker, wie ein Enzym, gebunden ist. Wenn das kleine organische Molekül Biotin ist, kann der Träger mit Avidin, das an ein Enzym gebunden ist, kontaktiert werden. Der Träger wird von dem zweiten Medium abgetrennt, und die Enzymaktivität entweder des Trägers oder des zweiten Mediums wird durch herkömmliche Verfahren bestimmt. Die Enzymaktivität steht zu der Menge an Cyclosporin in der Probe in Beziehung.
Ein Beispiel eines nicht-kompetitiven Ansatzes ist ein Sandwich-Assay, der zwei Antikörper umfaßt, von denen einer markiert werden kann und ferner einer an einen Träger gebunden werden kann oder zur Bindung an einen Träger veranlaßt werden kann.
Unter einem anderen Aspekt kann die Agglutination zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge an Cyclosporin in einer Probe verwendet werden. Antikörper, die als Antwort auf Cyclosporin gebildet wurden, das an einem Alanin-Stickstoffatom des cyclischen Grundgerüsts des Cyclosporins an einen immunogenen Träger konjugiert ist, können an Partikel konjugiert sein. Bevorzugt wird der Antikörper als Antwort auf Cyclosporin A gebildet, das, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe mit weniger als etwa 50 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, bevorzugt weniger als etwa 35 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, besonders bevorzugt weniger als etwa 20 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, die eine Kette mit einer Länge von nicht mehr als etwa 35, bevorzugt nicht mehr als 25, besonders bevorzugt nicht mehr als 15 Atomen, aufweist, an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und/oder 8 von Cyclosporin A an einen immunogenen Träger konjugiert ist. Bevorzugte immunogene Träger umfassen KLH und BSA, besonders bevorzugt KLH.
Ein anderes Konjugat, das unter dem Aspekt der Agglutination verwendet werden kann, ist Cyclosporin, das an einem Alanin-Stickstoffatom des cyclischen Grundgerüsts des Cyclosporins an ein Partikel konjugiert ist. Bevorzugt ist Cyclosporin A, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe mit weniger als etwa 50 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, bevorzugt weniger als etwa 35 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, besonders bevorzugt weniger als etwa 20 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, die eine Kette mit einer Länge von nicht mehr als etwa 35, bevorzugt nicht mehr als 25, besonders bevorzugt nicht mehr als 15 Atomen, aufweist, an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und/oder 8 von Cyclosporin A konjugiert.
In einem Ansatz unter diesem Aspekt der Agglutination kann eine Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält, mit einem oben erwähnten Antikörper-Partikel-Konjugat vereinigt werden. Nach einer geeigneten Inkubation kann der Agglutinationsgrad der Partikel aufgrund der Anwesenheit von Cydosporin direkt bestimmt werden. Andererseits können die Partikel von dem Medium abgetrennt, gewaschen und mit einem Cyclosporin vereinigt werden, das in der oben beschriebenen Art und Weise an ein Partikel konjugiert ist. Die Agglutination kann anschließend als Maß der Cyclosporinmenge in der Probe bestimmt werden. Die obige Beschreibung veranschaulicht nur zwei von vielen Agglutinationsvorschriften, die unter Verwendung der Verbindungen der Erfindung durchgeführt werden können.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Testsätze, die zur bequemen Durchführung des Assay-Verfahrens der Erfindung zur Messung der Menge an Cyclosporin in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält, nützlich sind. Zur Erhöhung der Vielseitigkeit der vorliegenden Erfindung können die Reagenzien in abgepackter Kombination in denselben oder getrennten Behältern bereitgestellt werden, so daß das Verhältnis der Reagenzien das Verfahren und den Assay wesentlich optimiert. Die Reagenzien können jeweils in getrennten Behältern vorliegen oder vielfältige Reagenzien können, abhängig von der Kreuzreaktivität und der Stabilität der Reagenzien, in einem oder mehreren Behältern vereinigt sein. Der Testsatz umfaßt als ein Reagens einen Antikörper, der als Antwort auf Cyclosporin gebildet wurde, das an einem Alanin- Stickstoffatom des cyclischen Grundgerüsts des Cyclosporins an einen immunogenen Träger könjugiert ist. Bevorzugt ist der als Antwort auf Cyclosporin A gebildete Antikörper, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe mit weniger als etwa 50 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, bevorzugt weniger als etwa 35 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, besonders bevorzugt weniger als etwa 20 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, die eine Kette mit einer Länge von nicht mehr als etwa 35, bevorzugt nicht mehr als 25, besonders bevorzugt nicht mehr als 15 Atomen, aufweist, an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und/oder 8 von Cyclosporin A konjugiert. Bevorzugte immunogene Träger umfassen KLH und BSA, besonders bevorzugt KLH. Dieser Antikörper kann markiert oder nicht-markiert sein.
Der Testsatz kann auch Cyclosporin umfassen, das an einem Alanin-Stickstoffatom des cyclischen Grundgerüsts von Cyclosporin an einen Marker konjugiert ist. Bevorzugt ist Cyclosporin A, gegebenenfalls durch eine Verbindungsgruppe mit weniger als etwa 50 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, bevorzugt weniger als etwa 35 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, besonders bevorzugt weniger als etwa 20 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, die eine Kette mit einer Länge von nicht mehr als etwa 35, bevorzugt nicht mehr als 25, besonders bevorzugt nicht mehr als 15 Atomen, aufweist, an einem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und/ oder 8 von Cyclosporin A konjugiert Der Testsatz kann ferner andere abgepackte Reagenzien zur Durchführung eines Assays umfassen, die Mitglieder des si gnalerzeugenden Systems, Träger, Hilfsreagenzien und so weiter einschließen.
Ein Träger, wie oben in den Definitionen beschrieben, ist ein poröses oder nicht-poröses, wasserunlösliches Material. Der Träger kann hydrophil sein oder kann hydrophil gemacht werden und umfaßt anorganische Pulver, wie Siliciumdioxid, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche polymere Materialien, speziell Cellulose-Materialien und von Cellulose abgeleitete Materialien, wie faserhaltige Papiere, z.B. Filterpapier, chromatographisches Papier etc.; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, wie Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylsäureester, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylsäureester, Polyethylenterephthalat, Nylon, Polyvinylbutyrat etc.; die entweder selbst oder zusammen mit anderen Materialien verwendet werden können; Glas, Keramik-Materialien, Metalle und dergleichen.
Vielfältige Hilfsmaterialien werden häufig in einem Assay nach der vorliegenden Erfindung verwendet. Puffer sowie Stabilisatoren für das Assay-Medium und die Assay-Komponenten sind zum Beispiel gewöhnlich in dem Assay anwesend. Häufig können zusätzlich zu diesen Zusätzen weitere Proteine, wie Albumine, oder Tenside, speziell nicht-ionische Tenside, Bindungsverstärker, z.B. Polyalkylenglykole oder dergleichen, eingeschlossen sein.
Die folgenden Beispiele beschreiben die speziellen Ausführungsformen der Erfindung weiter. Diese sind typische Beispiele zur Veranschaulichung und sollen den Umfang der Erfindung beschreiben und nicht einschränken.

BEISPIEL 1

GESCHÜTZTES CYCLOSPORIN

Chlortrimethylsilan wurde tropfenweise bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre und Rühren zu einer Lösung von 1800 mg (1,5 mmol) Cyclosporin A in 6 ml getrocknetem Pyridin und 6 ml getrocknetem Dichlormethan gegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wurde die Mischung über Nacht gerührt. Die Mischung wurde anschließend unter Vakuum bis zur Trockene eingedampft, der feste Rückstand wurde erneut in Dichlormethan gelöst und auf einer Silicagel-Säule unter Eluieren mit Essigsäureethylester/Hexan (80:20) gereinigt, wobei sich 1700 mg (89 %) TMS- geschütztes Cyclosporin A (Formel (XXV), TMS-CsA), ein weißer Feststoff, ergaben. Smp. : 152-156ºC. IR (CHCl&sub3;) : 3650w, 3300s, 2950s, 2945s, 2850s, 1650s, 1415s und 1400 cm-¹. MS: m/e 1275 (M+). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

BEISPIEL 2

KONJUGAT AUS HÄMOCYANIN DER SCHLÜSSELLOCHSCHNECKE UND PARA- CARBOXYBENZYLCYCLOSPORIN

A. GESCHÜTZTES PARA-CARBOXYBENZYLCYCLOSPORIN

0,3 ml 15-Krone-5-ether wurden unter Rühren zu einer Lösung von 900 mg (0,71 mmol) des Produkts von Beispiel 1 in 20 ml getrocknetem Toluol gegeben. 350 mg Natriumhydrid (50 %ige Suspension in Mineralöl, mit getrocknetem Toluol gewaschen) wurden anschließend bei Eisbad-Temperatur unter Argonatmosphäre zugegeben. Die Mischung wurde gerührt und man ließ sie während einer Dauer von 30 Minuten auf Raumtemperatur erwärmen. 400 mg (2,5 x 0,71 mmol) para-Brommethylbenzoesäuremethylester wurden zugegeben, und die Mischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. 150 ml Essigsäureethylester wurden zugegeben, gefolgt von einer langsamen und vorsichtigen Zugabe von 50 ml Wasser, und 1 N Chlorwasserstoffsäure wurde anschließend zugegeben, bis die Mischung sauer war (pH 3,0). Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 2 x 50 ml Wasser, 100 ml Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertern Druck entfernt, wobei sich 1,3 g eines blassen Schaums ergaben, welcher auf einer Silicagel-Dünnschichtplatte unter Eluieren mit Essigsäureethylester/Hexan (65:35; RF 0,6) gereinigt wurde, wobei sich eine Mischung (etwa 50:50) aus 670 mg (67 %) TMS-geschütztem Cyclosporin A, ein weißer Feststoff, ergab, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (XIII) an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 von Cydosporin A an eine Methoxygruppe gebunden war. MS: m/e 1423 (M&spplus;). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

B. PARA-CARBOXYBENZYLCYCLOSPORIN

Ungefähr 1,5 ml Wasser (oder bis sich die Lösung leicht trübte) wurden tropfenweise unter Rühren zu einer Lösung von 280 mg (0,197 mmol) des Produkts von Beispiel 2A in 5 ml Methanol gegeben. 230 mg Kaliumcarbonat (wasserfrei) wurden zugegeben, die Mischung wurde 12 Stunden gerührt, und weiteres Wasser wurde tropfenweise zugegeben, bis sich die Lösung leicht trübte. Die Mischung wurde für weitere 12 Stunden bei RT gerührt. 1 N Chlorwasserstoffsäure wurde vorsichtig zu der Mischung gegeben, bis die Lösung sauer (pH 2,0) wurde. 50 ml Wasser wurden zugegeben, und die Mischung wurde mit 3 x 50 ml Dichlormethan extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit 2 x 50 ml Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, wobei sich 270 mg eines Rohprodukts ergaben, das erneut in 10 ml Dichlormethan gelöst und auf einer Silicagel-Säule unter Eluieren mit Essigsäureethylester, bis das Ausgangsmaterial entfernt war, und anschließend mit Essigsäureethylester/Essigsäure (99,99:0,1) gereinigt wurde, wobei sich eine Mischung (etwa 50: 50) aus 160 mg (0,12 mmol, 63 %) Cyclosporin A, ein weißer Feststoff, ergab, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (XIII) an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 von Cyclosporin A an eine Hydroxylgruppe gebunden war. Smp. : 171-177ºC. IR (CHCl&sub3;) : 3700w, 3300w, 3000m, 2950s, 2920m, 2875m und 1640 cm&supmin;¹. UV: (Ethanol) 230 nm (&epsi; = 2,4 x 10&sup4;). MS: m/e 1334 (M1&sub1; 24). Anal. ber. für C&sub7;&sub0;H&sub1;&sub1;&sub7;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub4;: C, 62,90; H 8,82; N, 11,06. Gefunden: C, 62,10; H, 8,83; N, 10,80. Die ¹Hund ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

C. IMMUNOGEN DES HÄMOCYANINS DER SCHLÜSSELLOCHSCHNECKE

21 mg (1,5 x 0,074 mmol) 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) und 25 mg (1,5 x 0,074 mmol) N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) wurden bei Eisbad-Temperatur unter Argonatmosphäre und Rühren zu einer Lösung von 100 mg (0,074 mmol) des Produkts von Beispiel 28 in 1,3 ml getrocknetem DMF gegeben. Die Mischung wurde über Nacht oder bis kein durch DC- Analyse (Essigsäureethylester/Essigsäure, 99:1) nachgewiesenes Ausgangsmaterial zurückblieb, gerührt. Diese Lösung wurde während einer Dauer von 1,5 Stunden bei Eisbad-Temperatur zu einer Lösung von 150 mg Hämocyanin der Schlüssellochschnecke (KLH) (66 % Protein, 92 % Reinheit) in 6 ml 100 mM Boratpuffer (pH 9,1) und 0,5 ml DMF gegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wurde die Mischung in einem Kühlraum bei 4ºC (nachstehend als "Kühlraum" bezeichnet) über Nacht gerührt. Die milchige Mischung wurde gegen Wasser/DMF (80:20), Wasser/DMF (90:10) und schließlich Wasser dialysiert. Der Inhalt des Dialysierschlauches wurde anschließend lyophilisiert, wobei sich 150 mg einer Mischung (etwa 50:50) aus Cyclosporin A ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (XIII) an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 von Cyclosporin A an Hämocyanin der Schlüssellochschnecke gebunden war.

D. BESTIMMUNG DER HAPTENZAHL

1 ml einer 0,1 %igen Lösung von 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNB) wurde zu 1 ml einer Lösung des Produkts von Beispiel 2C (0,59 mg/ml) in 100 mM Boratpuffer (pH 9,1) gegeben, und die Mischung wurde 2 Stunden auf 40ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen der Mischung auf Raumtemperatur wurde eine Lösung aus 1 ml 10 %igem Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1 ml 1 N Chlorwasserstoffsäure zugegeben. Eine Standardlösung von KLH (gereinigt, 1,09 mg/ml) in 100 mM Boratpuffer (pH 9,1) wurde hergestellt und bei 40ºC 2 Stunden mit 1 ml 0,1 %iger TNBS-Lösung behandelt. Diese Standardlösung wurde mit 1 ml 10 %iger SDS-Lösung und 1 ml 1 N Chlorwasserstoffsäure umgesetzt. Die Extinktion der Probe und von Standardlösungen bei 340 nm wurde gemessen, und die Haptenzahl wurde nach dem Verfahren von Habeeb, A. F., Analytical Biochem. 1966, 14, 328 (hier durch Bezugnahme eingeschlossen), berechnet und zu 1100 bestimmt.

BEISPIEL 3

KONJUGAT AUS HÄMOCYANIN DER SCHLÜSSELLOCHSCHNECKE UND ORTHO-CARBOXYBENZYLCYCLOSPORIN

A. GESCHÜTZTES ORTHO-CARBOXYBENZYLCYCLOSPORIN

900 mg (0,71 mmol) des Produkts von Beispiel 1 wurden bei RT unter Rühren zu einer Suspension von 350 mg Natriumhydrid (50 %ige Suspension in Mineralöl, mit 3 x 10 ml getrocknetern Toluol gewaschen) in getrocknetem Toluol gegeben, und anschließend wurden 0,35 ml 15-Krone-5-ether zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten bei RT unter Argonatmosphäre gerührt. Vier Portionen ortho-Brommethylbenzoesäuremethylester wurden zugegeben (zum Zeitpunkt 0, 12 h, 24 h, 36 h; 508 mg wurden zu jedem Zeitpunkt bis zu einer Gesamtmenge von 4 x 508 mg, 4 x 2 mmol, zugegeben). Nach 36-stündigem Rühren der Mischung bei RT wurden 150 ml Essigsäureethylester und anschließend vorsichtig 20 ml Wasser zugegeben. Die Mischung wurde mit 1 N Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 3 x 30 ml Wasser, 50 ml Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das organische Lösungsmittel wurde entfernt, der ölige Rückstand wurde erneut in Essigsäureethylester gelöst und auf einer Silicagel-Dünnschichtplatte unter Eluieren mit Essigsäureethylester/Hexan (65:35, RF 0,6) gereinigt, wobei sich eine Mischung (etwa 50:50) aus 600 mg (60 %) TMS-geschütztem Cyclosporin A, ein weißer Feststoff, ergab, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (XIV) an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 von Cyclosporin A an eine Methoxygruppe gebunden war. MS: m/e 1,423 (M&spplus;). Die ¹H- und ¹³C-NMR- Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

B. ORTHO-CARBOXYBENZYLCYCLOSPORIN

Ungefähr 3,0 ml Wasser (oder bis sich die Lösung leicht trübte) wurden unter Rühren zu einer Lösung von 500 mg (0,357 mmol) des Produkts von Beispiel 3A gegeben. 1000 mg Kaliumcarbonat (wasserfrei) wurden zugegeben (wenn die Mischung trüb blieb, wurden ein paar Tropfen Methanol zugegeben, um eine klare Lösung zu erhalten). Die Mischung wurde 27 Stunden bei RT unter Argonatmosphäre gerührt. 150 ml Dichlormethan und 50 ml Wasser wurden zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt, und die wäßrige Phase wurde mit 2 x 50 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 2 x 50 ml Wasser/Salzlösung (1:1) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde bis zur Trockene abgedampft, wobei sich 40 mg Rohprodukt ergaben, das auf einer Silicagel-Säule unter Eluieren mit Essigsäureethylester gereinigt wurde, bis das Ausgangsmaterial und irgendwelche nicht-sauren Materialien entfemt waren, und anschließend wurde es mit einer Mischung aus Essigsäureethylester/Essigsäure (99,5:0,5) eluiert, wobei sich eine Mischung (etwa 50:50) aus 350 mg (0,26 mmol, 75 %) Cyclosporin A, ein weißer Feststoff, ergab, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (XIV) an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 von Cyclosporin A an eine Hydroxylgruppe gebunden war. Smp.: 162-171ºC. IR (CHCl&sub3;) : 3500w, 3450w, 3400m, 3300s, 2950m, 2850m, 1620s, 1420m, 1400 und 1200b cm&supmin;¹. MS: m/e 1334 (M-1, 60). Anal. ber. für C&sub7;&sub0;H&sub1;&sub1;&sub7;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub4;: C, 62,90; H 8,82; N, 11,06. Gefunden: C, 62,23; H, 8,48; N, 11,79. Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

C. IMMUNOGEN DES HÄMOCYANINS DER SCHLÜSSELLOCHSCHNECKE

Unter Verwendung des Produkts von Beispiel 38 und des Verfahrens von Beispiel 2C wurde eine Mischung (etwa 50:50) aus Cyclosporin A, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (XIV) an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 von Cyclosporin A an Hämocyanin der Schlüssellochschnecke gebunden war, in ähnlicher Ausbeute hergestellt.

D. BESTIMMUNG DER HAPTENZAHL

Unter Verwendung des Produkts von Beispiel 3C und des Verfahrens von Beispiel 2D wurde eine Haptenzahl von 500 bestimmt.

BEISPIEL 4

KONJUGAT AUS RINDERSERUMALBUMIN UND ORTHO-CARBOXYBENZYLCYCLOSPORIN

A. RINDERSERUMALBUMIN-CYCLOSPORIN

Unter Verwendung des Produkts von Beispiel 38 und des Verfahrens von Beispiel 2C, außer daß Rinderserumalbumin (BSA) anstelle von KLH verwendet wurde, wurde eine Mischung (etwa 50:50) aus Cyclosporin A, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (XIV) an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 von Cyclosporin A an Rinderserumalbumin (Cs-BSA) gebunden war, in ähnlicher Ausbeute erhalten.

B. BESTIMMUNG DER HAPTENZAHL

Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 2D, außer daß BSA anstelle von KLH verwendet wurde, wurde die Haptenzahl des in Beispiel 4A gebildeten Cs-BSA-Konjugats zu 55 bestimmt.

BEISPIEL 5

GESCHÜTZTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN

450 mg Natriumhydrid (50 %ige Suspension in Mineralöl, mit getrocknetem Toluol gewaschen) wurden bei RT unter Argonatmosphäre und Rühren zu einer Lösung von 1000 mg (0,78 mmol) der Verbindung von Beispiel 1 und 0,2 ml 15-Krone-5-ether in 30 ml getrocknetem Toluol gegeben. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung auf 4ºC gekühlt, und 6 ml Ethylenoxid wurden durch eine Spritze zugegeben. Der Reaktionskolben wurde verschlossen (durch einen Stopfen und Parafilm abgedichtet) und bei RT 24 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde vorsichtig mit 100 ml Wasser behandelt, mit 1 N Chlorwasserstoffsäure angesäuert und 200 ml Dichlormethan wurden zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 100 ml Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, wobei sich das Rohprodukt als weißer Feststoff ergab, welcher auf einer Silicagel-Säule unter Eluieren mit Essigsäureethylester gereinigt wurde, wobei sich 350 mg (34 %) TMS-geschütztes Cyclosporin A, ein weißer Feststoff, ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (I) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Hydroxylgruppe gebunden war. Smp.: 124-132ºC. IR (CHCl&sub3;): 3650w, 3400w, 3300m, 2950m, 1620s, 1460w, 1400w und 1200b cm-¹. MS: m/e 1317 (M+, 100), 1271 (M-CH&sub2;CH&sub2;OH, 10). Die ¹H- und ¹³C- NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

BEISPIEL 6

KONJUGAT AUS HÄMOCYANIN DER SCHLÜSSELLOCHSCHNECKE UND MONOCARBONSÄUREAMID-VERLÄNGERTEM HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN

A. GESCHÜTZTES MONOCARBONSÄUREAMID-VERLÄNGERTES HYDROXY- ETHYLCYCLOSPORIN

Glycinsäuremethylesterisocyanat wurde bei RT unter Argonatmosphäre und Rühren zu einer Lösung von 300 mg (0,23 mmol) des Produkts von Beispiel 5 und 154 mg (0,4 mmol) Tri-n-butylzinnethoxid in 2 ml getrocknetem Toluol gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 h gerührt. 50 ml Essigsäureethylester und 50 ml Wasser wurden zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 2 x 50 ml Salzlösung/Wasser (1:1) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und das Rohprodukt wurde auf einer Silicagel- Säule unter Eluieren mit Essigsäureethylester gereinigt, wobei sich 280 mg (0,20 mmol, 85 %) TMS-geschütztes Cyclosporin A ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (II) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Methoxygruppe gebunden war. MS: m/e 1433 (M+1, 100). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

B. MONOCARBONSÄUREAMID-VERLÄNGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN

Wasser wurde unter Rühren zu einer Lösung von 250 mg (0,17 mmol) des Produkts von Beispiel 6A in 10 ml Methanol gegeben, bis sich die Mischung schwach trübte. 200 mg Kaliumcarbonat (wasserfrei) wurden zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei RT unter Argonatmosphäre gerührt. Die Mischung wurde mit 1 N Chlorwasserstoffsäure angesäuert, und 20 ml Wasser wurden zugegeben. Die Mischung wurde mit 3 x 75 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit 10 ml Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, wobei sich 220 mg (0,16 mmol, 96 %) Cyclosporin A, ein weißer Feststoff, ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (II) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Hydroxylgruppe gebunden war. Smp.: 156-166ºC. Dieses Material wies eine Reinheit von etwa 95 % auf, konnte jedoch auf einer Silicagel-Säule unter Eluieren mit Essigsäureethylester/Methanol/Essigsäure (98:1,9:0,1, RF = 0,15) weiter gereinigt werden. IR (CHCl&sub3;) : 3650w, 3400w, 3300w, 2950m, 1700w, 1620s, 1460m, 1400m und 1090w cm-¹. MS: m/e 1369 (M&spplus;+Na, 60), 1347 (M+H, 50). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

C. KONJUGAT VON HÄMOCYANIN DER SCHLÜSSELLOCHSCHNECKE

5,2 mg (1,2 x 2,2 x 10&supmin;² mmol) EDAC und 5,8 mg (1,2 x 2,2 x 10&supmin;² mmol) Sulfo-NHS wurden bei 4ºC unter Argonatmosphäre und Rühren zu einer Lösung von 30 mg (2,2 x 10&supmin;² mmol) des Produkts von Beispiel 68 in 1 ml getrocknetem DMF gegeben. Die Mischung wurde dann in einem Kühlraum über Nacht gerührt. Diese Lösung wurde während einer Dauer von 2 h zu einer Lösung von 100 mg KLH (66 % Protein, 92 % Reinheit) in 3,5 ml 100 mM Boratpuffer (pH 9,1) und 0,5 ml DMF gegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wurde die Mischung über Nacht in einem Kühlraum gerührt. Die Mischung wurde gegen H&sub2;O/DMF (75 %:25 %) und gegen Wasser dialysiert, wobei sich 74 mg Cyclosporin A ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (II) an dem Alanin Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an Hämocyanin der Schlüssellochschnecke gebunden war.

D. BESTIMMUNG DER HAPTENZAHL

Unter Verwendung des Produkts von Beispiel 6C und des Verfahrens von Beispiel 2D wurde eine Haptenzahl von 500 bestimmt.

BEISPIEL 7

KONJUGAT AUS HÄMOCYANIN DER SCHLÜSSELLOCHSCHNECKE UND TRICARBONSÄUREAMID-VERLÄNGERTEM HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN

A. DICARBONSÄUREAMIDAMINO-VERLÄNGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN

9,0 mg (1,3 x 6 x 10&supmin;² mmol) N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 16,1 mg (1,3 x 6 x 10&supmin;² mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wurden bei 4ºC unter Argonatmosphäre und Rühren zu einer Lösung von 80 mg (6 x 10&supmin;² mmol) des Produkts von Beispiel 68 in 1 ml getrocknetem THF gegeben. Die Mischung wurde über Nacht in einem Kühlraum gerührt und langsam zu einer Lösung von 600 mg (10 mmol) Ethylendiamin in 5 ml THF gegeben. Die Mischung wurde 4 h bei RT gerührt und 20 ml Wasser wurden zugegeben. Die Mischung wurde mit 3 x 50 ml Dichlormethan extrahiert und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, wobei sich 80 mg (5,6 x 10&supmin;² mmol, 94 %) Cyclosporin A ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (XI) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Aminogruppe gebunden war und ohne weitere Reinigung verwendet wurde.

B. TRICARBONSÄUREAMID-VERLÄNGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN

24 mg (3 x 5,6 x 10&supmin;² mmol) 97 %iges Diglykolsäureanhydrid und 26 mg (0,25 mmol) Triethylamin wurden bei RT unter Argonatmosphäre und Rühren zu einer Lösung von 80 mg (5,6 x 10&supmin;² mmol) des Produkts von Beispiel 7A in 1 ml getrocknetem THF gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt. 10 ml
Wasser und 50 ml Dichlormethan wurden zugegeben, und die Mischung wurde mit 1 N Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Die organische Phase wurde abgetrennt, und die wäßrige Phase wurde mit 2 x 25 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 50 ml Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;) . Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, wobei sich 70 mg (83 %) Cyclosporin A, ein glasiger Feststoff, ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (XII) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Hydroxylgruppe gebunden war. MS: m/e 1505 (M+H, 30 %) . Das ¹H-NMR-Spektrum stimmte mit der zugeordneten Struktur überein.

C. KONJUGAT VON HÄMOCYANIN DER SCHLÜSSELLOCHSCHNECKE

5,5 mg (1,2 x 4 x 10&supmin;² mmol) NHS und 9,8 mg (1,2 x 4 x 10&supmin;² mmol) DCC wurden bei 4ºC unter Argonatmosphäre und Rühren zu einer Lösung von 60 mg (4 X 10&supmin;² mmol) des Produkts von Beispiel 78 in 1 ml DMF gegeben. Die Mischung wurde über Nacht gerührt. Die Lösung wurde während einer Dauer von 3 h bei 4ºC zu einer Lösung von 120 mg KLH (66 % Protein, 92 %ige Reinheit) in 6 ml 100 mM Phosphatpuffer (pH 8,3) und 0,8 ml DMF gegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wurde die Mischung über Nacht in einem Kühlraum gerührt. Die Mischung wurde gegen H&sub2;O/DMF (90: 10) und Wasser dialysiert. Das Konjugat wurde anschließend lyophilisiert, wobei sich 120 mg Cyclosporin A ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (XII) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an Hämocyanin der Schlüssellochschnecke gebunden war.

D. BESTIMMUNG DER HAPTENZAHL

Unter Verwendung des Produkts von Beispiel 7C und des Verfahrens von Beispiel 2D wurde eine Haptenzahl von 700 bestimmt.

BEISPIEL 8

MONOCARBONSÄUREAMID-VERLANGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN-HOMOLOG

A. GESCHÜTZTES MONOCARBONSÄUREAMID-VERLÄNGERTES HYDROXY- ETHYLCYCLOSPORIN-HOMOLOG

β-Alaninisocyanatmethylester wurde unter Rühren zu einer Lösung von 60 mg (4,5 x 10&supmin;² mol) des Produkts von Beispiel 5 und 30 mg (8,9 x 10&supmin;² mmol) Tri-n-butylzinnethoxid in 1 ml getrocknetem Toluol gegeben. Die Mischung wurde 2 h gerührt. 50 ml Essigsäureethylester und 50 ml Wasser wurden zugegeben, die organische Phase wurde abgetrennt und mit 2 x 50 ml Salzlösung/Wasser (1:1) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Die organische Phase wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der schaumige Feststoff wurde auf einer Silicagel-Säule unter Eluieren mit Essigsäureethylester gereinigt, wobei sich 59 mg (4,1 x 10&supmin;² mmol, 91 %) TMS-geschütztes Cyclosporin A ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (IX) an dem Alanin- Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Methoxygruppe gebunden war.

B. MONOCARBONSÄUREAMID-VERLÄNGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN-HOMOLOG

Wasser und 30 mg Kaliumcarbonat (wasserfrei) wurden unter Rühren zu einer Lösung des Produkts von Beispiel 8A in 1 ml Methanol gegeben, und die Mischung wurde 20 h gerührt. Die Mischung wurde mit 1 N Chlorwasserstoffsäure angesäuert, 20 ml Wasser wurden zugegeben, die Mischung wurde mit 2 x 20 ml Dichlormethan extrahiert und getrocknet (MgSO&sub4;). Dieses Material wurde auf einer Silicagel-Säule unter Eluieren mit Essigsäureethylester/Methanol/Essigsäure (98:2:0,1) gereinigt, wobei sich 25 mg (90 %) Cyclosporin A ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (IX) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Hydroxylgruppe gebunden war. MS: m/e 1318 (M+H, 100).

BEISPIEL 9

MONOCARBONSÄUREAMID-VERLANGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN-THIOANALOGON

A. GESCHÜTZTES MONOCARBONSÄUREAMID-VERLÄNGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN- THIOANALOGON

90 mg Essigsäureisothiocyanatmethylester wurden unter Rühren zu einer Lösung von 60 mg (4,5 x 10&supmin;² mol) des Produkts von Beispiel 5 und 70 mg (0,2 mmol) Tri-n-butylzinnethoxid in 1 ml getrocknetem Toluol gegeben. Die Mischung wurde 2 h gerührt. 50 ml Essigsäureethylester und 50 ml Wasser wurden zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit 2 x 50 ml Salzlösung/Wasser (1:1) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Die organische Phase wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der schaumige Feststoff wurde auf einer Silicagel-Säule unter Eluieren mit Essigsäureethylester gereinigt, wobei sich 55 mg (3,8 x 10&supmin;² mmol) TMS-geschütztes Cyclosporin A ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (X) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Methoxygruppe gebunden war.

B. MONOCARBONSÄUREAMID-VERLANGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN-THIOANALOGON

Wasser und 30 mg Kaliumcarbonat (wasserfrei) wurden unter Rühren zu einer Lösung von 55 mg (3,4 x 10&supmin;² mmol) des Produkts von Beispiel 9A in 10 ml Methanol gegeben, und die Mischung wurde 20 h gerührt. Die Mischung wurde mit 1 N Chlorwasserstoffsäure angesäuert, 20 ml Wasser wurden zugegeben, die Mischung wurde mit 2 x 20 ml Dichlormethan extrahiert und getrocknet (MgSO&sub4;) . Dieses Material wurde auf einer Silicagel- Säule unter Eluieren mit Essigsäureethylester/Methanol/Essigsäure (98:2:0,1) gereinigt, wobei sich 50 mg (3,4 x 10&supmin;² mmol, 89 %) Cyclosporin A ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (X) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Hydroxylgruppe gebunden war. MS: m/e 1496 (70 %) , 1363 (80 %).

BEISPIEL 10

MONOCARBONSÄUREAMID-VERLANGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN-ALKYLANALOGON

A. GESCHÜTZTES MONOCARBONSÄUREAMID-VERLANGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN-ALKYLANALOGON

Unter Verwendung des Produkts von Beispiel 5 und des Verfahrens von Beispiel 8A (außer daß α-Alaninisocyanatmethylester anstelle von β-Alaninisocyanatmethylester verwendet wurde) wurde TMS-geschütztes Cyclosporin A, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (VI) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Methoxygruppe gebunden war, in ähnlicher Ausbeute hergestellt.

B. MONOCARBONSÄUREAMID-VERLANGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN-ALKYLANALOGON

Unter Verwendung des Produkts von Beispiel 10A und des Verfahrens von Beispiel 8B wurde Cyclosporin A, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (VI) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Hydroxylgruppe gebunden war, in 90 %iger Ausbeute hergestellt. MS: m/e 1399 (M+K, 100 %) , 1383 (M+Na, 70 %) , 1362 (M+H, 30 %).

BEISPIEL 11

AROMATISCHES ANALOGON VON MONO CARBONSÄUREAMID-VERLANGERTEM HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN

A. GESCHÜTZTES, AROMATISCHES ANALOGON VON MONOCARBONSÄUREAMID-VERLÄNGERTEM HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN

Unter Verwendung des Produkts von Beispiel 5 und des Verfahrens von Beispiel 8A (außer daß α-Phenyl-α-alaninisocyanatmethylester anstelle von α-Alaninisocyanatmethylester verwendet wurde) wurde TMS-geschütztes Cyclosporin A, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (V) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Methoxygruppe gebunden war, in ähnlicher Ausbeute hergestellt.

B. AROMATISCHES ANALOGON VON MONOCARBONSÄUREAMID-VERLÄNGERTEM HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN

Unter Verwendung des Produkts von Beispiel 1DA und des Verfahrens von Beispiel 88 wurde TMS-geschütztes Cyclosporin A, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (V) an dem Alanin- Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Hydroxylgruppe gebunden war, in ähnlicher Ausbeute hergestellt. MS: m/e 1422 (M-H, 30 %)

BEISPIEL 12

CARBOXYMETHYL-VERLÄNGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN

A. GESCHÜTZTES CARBOXYMETHYL-VERLÄNGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN

20 mg Natriumhydrid (50 %ige Suspension in Mineralöl, in getrocknetem THF gewaschen) und 20 mg 15-Krone-5-ether wurden bei RT unter Argonatmosphäre und Rühren zu einer Lösung von 130 mg (9,8 x 10&supmin;² mmol) des Produkts von Beispiel 5 in 1,5 ml getrocknetem THF gegeben. Die Mischung wurde 1 h gerührt und 80 mg α-Bromessigsäuremethylester in 0,5 ml getrocknetem THF wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde weitere 2 h gerührt, eine weitere Portion von 80 mg α-Bromessigsäuremethylester wurde zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde 2 h gerührt. 50 ml Essigsäureethylester und 20 ml Wasser wurden zugegeben, und die Mischung wurde mit 1 N Chlorwasserstoffsäure angesäuert (pH 3,0). Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 2 x 50 ml Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde auf einer Silicagel-Dünnschichtplatte unter Eluieren mit Essigsäureethylester gereinigt, wobei sich 80 mg (60 %) TMS-geschütztes Cyclosporin A, ein weißer Feststoff, ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (VII) an dem Alanin- Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Methoxygruppe gebunden war. MS: m/e 1358 (M-H, 100). Das ¹H-NMR-Spektrum stimmte mit der zugeordneten Struktur überein.

B. CARBOXYMETHYL-VERLÄNGERTES HYDROXYETHYLCYCLOSPORIN

Ungefähr 1,5 ml Wasser wurden unter Rühren zu einer Lösung von 79 mg (5,8 x 10&supmin;² mmol) des Produkts von Beispiel 12A in 4 ml Methanol gegeben, bis sich die Mischung trübte. 40 mg Kaliumcarbonat (wasserfrei) wurden zugegeben, und die Mischung wurde 20 h gerührt. Die Mischung wurde mit 1 N Chlorwasserstoffsäure angesäuert, 20 ml Wasser wurden zugegeben, die Mischung wurde mit 2 x 20 ml Dichlormethan extrahiert und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Rohprodukt wurde auf einer Silicagel-Säule unter Eluieren mit Essigsäureethylester/Methanol/Essigsäure (98:2:0,1) gereinigt, wobei sich 65 mg (80 %) Cyclosporin A, ein weißer Feststoff, ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (VII) an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an eine Hydroxylgruppe gebunden war. MS: m/e 1326 (M+Na), 1304 (M+H) . Das ¹H-NMR-Spektrum stimmte mit der zugeordneten Struktur überein.

BEISPIEL 13

KONJUGAT AUS HÄMOCYANIN DER SCHLÜSSELLOCHSCHNECKE UND DICARBONSÄUREAMID-VERLANGERTEM PARA-CARBOXYBENZYLCYCLOSPORIN

A. DICARBONSÄUREAMID-VERLÄNGERTES PARA-CARBOXYBENZYLCYCLOSPORIN

12,8 mg N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) und 13,9 mg (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) wurden bei 4ºC unter Argonatmosphäre und Rühren zu einer Lösung von 60 mg des Produkts von Beispiel 28 in 0,69 ml DMF gegeben. Man ließ die Reaktionsmischung über Nacht bei 4ºC rühren. Die vollständige Bildung des Sulfo-NHS-Esters wurde durch DC (Silicagel, Elutionsmittel Essigsäure/Methanol/Dichlormethan, 0,15:2:8) nach 18 Stunden beobachtet. Der entstandene Sulfo-NHS-Ester wurde während einer Dauer von 30 Minuten bei 4ºC langsam zu einer Lösung von 12,1 mg Glycyl-Glycin in einer Mischung aus 1 ml 0,05 M Boratpuffer (pH 9) und 2 ml DMF gegeben, wobei der pH- Wert im Bereich von 8,5 bis 9 eingestellt wurde. Man ließ die hellgelbe Lösung bei 4ºC weitere 30 Minuten und bei Raumtemperatur 2 Stunden rühren. 1 N HCl wurde zu dem entstandenen Produkt gegeben (bis der pH-Wert der Mischung 4 betrug), und der Niederschlag wurde aufgenommen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 49 mg eines weißen Produkts ergaben. Das Filtrat wurde mit Essigsäureethylester extrahiert, die organischen Extrakte wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wobei sich eine zweite Produktmenge ergab. Die vereinigten Produkte wurden durch präparative Dünnschichtchromatographie (Silicagel, Elutionsmittel Essigsäure/Methanol/Dichlormethan, 3:40:160) gereinigt, wobei sich 29 mg einer Mischung (etwa 50:50) aus Cyclosporin A ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (XIX) an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 von Cyclosporin A an eine Hydroxylgruppe gebunden war. MS: m/e 1450 (M+H), 1488 (M+K).

B. KONJUGAT VON HÄMOCYANIN DER SCHLÜSSELLOCHSCHNECKE

3,1 mg EDAC und 3,58 mg N-Hydroxysulfosuccinimid in 300 µl DMF wurden zu 20 mg des Produkts von Beispiel 13A in 300 µl DMF gegeben. Man ließ die Reaktionsmischung über Nacht bei 4ºC rühren. Die unvollständige Bildung des Sulfo-NHS-esters wurde durch DC (Silicagel, Elutionsmittel Essigsäure/Methanol/Dichiormethan, 3:40:160) beobachtet. 3,1 mg weiteres EDAC und 3,58 mg N-Hydroxysulfosuccinimid wurden zugegeben. Man ließ die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 4 Stunden rühren. Die vollständige Umsetzung wurde durch DC (Silicagel, Elutionsmittel Essigsäure/Methanol/Dichlormethan, 3:40:160) beobachtet. Die oben hergestellte Reaktionsmischung des Sulfo-NHS-esters wurde während einer Dauer von 4 Stunden bei Raumtemperatur zu einer Lösung von 40 mg KLH in einer Mischung aus 3,0 ml 0,05 M Boratpuffer (pH 9) und 0,7 ml DMF gegeben, wobei der pH-Wert konstant auf 8,5 eingestellt wurde. Eine weitere Menge von 0,25 ml DMF wurde während einer Dauer von 4 Stunden zugegeben. Die entstandene Mischung wurde bei 4ºC über Nacht gerührt. Die trübe Mischung wurde gegen 3 x 4 1 10 % DMF/Wasser (pH 8 mit NH&sub4;OH) und 5 x 4 1 Wasser (pH 8 mit NH&sub4;OH) dialysiert. Das entstandene Produkt wurde lyophilisiert, wobei sich 32 mg Cyclosporin A ergaben, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (XIX) an dem Alanin-Stickstoffatom der Aminosäurereste Nr. 7 und 8 von Cyclosporin A an Hämocyanin der Schlüssellochschnecke gebunden war.

C. BESTIMMUNG DER HAPTENZAHL

Unter Verwendung des Produkts von Beispiel 13B und des Verfahrens von Beispiel 2D wurde eine Haptenzahl von 948 bestimmt.

BEISPIEL 14

CYCLOSPORIN-GLUCOSE-6-PHOSPHAT-DEHYDROGENASE-KONJUGATE

A. AKTIVIERUNG VON CYCLOSPORIN-HAPTEN

In einen flammgetrockneten Kolben wurden 35 mg Cyclosporin-Hapten, speziell das Produkt von Beispiel 68, 6,2 mg Sulfo- NHS, 5,5 mg EDAC und 0,35 ml DMF gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei 4ºC gerührt. B. KONJUGATION AN GLUCOSE-6-PHOSPHAT-DEHYDROGENASE Das Produkt von Beispiel 14 A wurde bei Eisbad-Temperatur portionsweise zu einer Lösung von Glucose-6-phosphat-Dehy drogenase (G6PDH, in 0,055 M Natriumcarbonatpuffer), Glucose-6phosphat (G6P, 4,5 mg/mg G6PDH) und NADH (9 mg/mg G6PDH) in Natriumcarbonatpuffer, pH 8,8/DMF (0,2 ml/ml Puffer) gegeben. Die Reaktion wurde überwacht und bei einer 29-35 %igen Inhibierung der Enzymaktivität in Anwesenheit von Anti-CsA-Antikörper, bezogen auf die Enzymaktivität in Abwesenheit von Anti-CsA-Antikörper, beendet.

C. ISOLIERUNG DES KONJUGATS

Das Konjugat dieses Cyclosporin A von Beispiel 148, das durch die Verbindungsgruppe der Formel (II) an dem Alanin- Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase gebunden war, wurde durch chromatographische Trennung auf Sephadex G100 unter Verwendung von 0,055 M Tris-HCl (pH 8,0) tsoliert, das 0,05 % Natriumazid und 0,005 % Thimerosal enthielt. Haptenzahlen von weni ger als etwa 5-10 wurden bei Inaktivierungen von weniger als etwa 35 % erhalten.
Die Produkte der Beispiele 2B, 3B, 78, 8B, 9B, 10B, 11B oder 12B wurden durch dieses Verfahren von Beispiel 14 ebenfalls in die entsprechenden G6PDH-Konjugate umgewandelt.

BEISPIEL 15

HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN GEGENÜBER CYCLOSPORIN

A. ALLGEMEINE VERFAHREN

Die verwendeten Hybridoma-Standardverfahren wurden ausführlich beschrieben (Kohler, G., Milstein, C., Nature 1975, 256, 495-7; Hurrell, J. G. R., "Monodonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applicationsyl, CRC Press, 1982, Boca Raton, FL 33431).

B. IMMUNISIERUNG

BALB/C Mäuse wurden mit 50 bis 200 µg Immunogen (speziell dem KLH-Konjugat von Beispiel 138) in komplettem Freund-Adjuvans (CFA) durch intraperitoneale (IP) oder subkutane (SC) Injektion immunisiert. Die Verstärkung mit Immunogen (inkomplettes Freund-Adjuvans (IFA), IP oder SC) wurde monatlich durchgeführt. Eine abschließende IP, SC oder intravenöse (IV) Injektion von 100-500 µg in Salzlösung wurde vor der Fusion durchgeführt.

C. ÜBERWACHUNG DER IMMUNISIERUNG

Ein ELISA-Test für Serum-Antikörper wurde zur Überwachung der Mäuse nach etwa 2 bis 3 Immunisierungen verwendet. Serum-Antikörper-Titer wurden vor dem Assay seriell zweifach verdünnt.
Mikrotiter-EIA-Platten (Costar Nr. 3590) wurden mit 50 µl/Vertiefung des G6PDH-Enzym-Konjugats beschichtet, das mit demselben Hapten wie das Immunogen markiert worden war, in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 0,01 M Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid und 0,02 % Natriumazid, pH 7,2) 1:100 verdünnt, 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, und anschließend wurden zur Verhinderung einer nicht-spezifischen Bindung 300 µl/Vertiefung 1 %iges normales Schaf serum (NSS) in PBS zugegeben. Nach einer Wartezeit von 30 Minuten wurde der Inhalt der Platten entnommen. 50 µl/Vertiefung seriell verdünntes Serum wurden zugegeben und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit ELISA-Waschpuffer < 0,05 % Tween -20, [Fisher Scientific Co. Nr. CS-279-3], in PBS, pH 7,2) gewaschen. 50 µl/ Vertiefung mit alkalischer Phosphatase markierte Anti-Maus-Ziegen-Seren (spezifisch für IGG + IGM + leichte Ketten, Tago Nr. 6543; 887, Mitten Road, Burlingame, CA94011, USA), die 1:1000 in PBS verdünnt worden waren, wurden auf die Platten gegeben, und man ließ sie weitere 30 Minuten bei 37ºC inkubieren. Die Platten wurden wie zuvor gewaschen, und anschließend wurden 100 µl/Vertiefung Substrat (15 mg Dinatrium-para-nitrophenylphosphat [PNPP, Sigma Nr. S104-105] pro 25 ml 10 %igem Diethanolamin [Eastman-Kodak Nr. 1598], pH 9,8, das 0,5 mM MgCl&sub2; [Mallinckrodt Nr. 5958] enthielt) zugegeben. Man ließ die Platten etwa 30 Minuten oder bis eine sichtbare Farbentwicklung auftrat bei Raumtemperatur auf einem Schüttler liegen. Die Platten wurden anschließend auf einem Titertek Multiscan bei 405 nm abgelesen. Die OD-Ablesungen wurden gegen die Verdünnung der Serumprobe aufgetragen. Der Serum-Antikörper-Titer wurde als die Verdünnung definiert, bei welcher sich eine 70 %ige OD-Abnahme von der höchsten OD der Titrationskurve ergibt.

D. ZELLFUSION

Milzzellen wurden aus den immunisierten Mäusen geerntet und unter Verwendung von PEG mit den Myelom-Zellen P3 X63- AG8.653 fusioniert. Die Zellen wurden erneut in ergänzten HAT- Medien suspendiert und auf Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen verteilt. Vier Tage später wurden Zellen durch das Ersetzen der Hälfte der ergänzten HAT-Medien zugeführt.

E. SCREENEN DER HYBRIDOMA

Etwa 1 Woche nach der Zelifusion wurden die Hybridoma auf spezifische Antikörper gescreent. Ein umgekehrter ELISA-Assay wurde zum Screenen auf die Bildung von Antikörpern verwendet.
Mikrotiter-EIA-Platten wurden mit 50 µl/Vertiefung gegenüber IGG + IGA + IGM und H- + L-Ketten spezifischem Anti- Maus-Kaninchen-Antikörper (Zymed Nr. 61-6400 SY) beschichtet, der in PBS, pH 7.2, 1:100 verdünnt worden war, und bis zur Verwendung bis zu einer Woche bei 4ºC aufbewahrt. Zur Verhinderung einer nicht-spezifischen Bindung wurden die Platten mit 300 µl/ Vertiefung 1 %iger NSS/PBS gefüllt, und man ließ sie 30 Minuten stehen und entleerte sie dann. 50 µl/Vertiefung verbrauchtes Medium wurden anschließend zugegeben und 30 bis 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal gewaschen. Mit demselben Hapten wie das Immunogen markiertes G6PDH-Enzym wurde 1:100 bis 1:700 in PBS verdünnt, 50 µl/Vertiefung wurden zugegeben und anschließend 30 bis 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden wieder wie zuvor gewaschen, und 100 µl/Vertiefung Substrat (0,053 M Trizma-Base [Sigma Nr. T1503], 0,02 M NAD, 0,033 M G-6-P, 0,025 % NaN&sub3; [Natriumazid, J. T. Baker Nr. 7-V015], pH-Wert mit HCl auf 6,2 eingestellt, 0,63 mM para- Iodnitrotetrazoliumviolett [INT, Sigma Nr. 18377], 1 % NSS und 60 Einheiten/ml Diaphorase [Sigma Nr. 2381]) wurden schließlich zugegeben. Die Platten wurden etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert und auf einem Titertek Multiscan bei 492 nm abgelesen. Vertiefungen mit Ablesungen, die mindestens zweimal höher als der Hintergrund waren, wurden als ELISA+ angesehen.

F. ANTIKÖRPERBILDUNG IN ASZITES

Zur Maßstabsvergrößerung der Bildung monoklonaler Antikörper in Aszites wurden die Mäuse durch eine IP Injektion von IFA, 0,3 bis 0,5 ml/Maus, zur Auslösung eines Tumor-Wachstums 2 bis 7 Tage vor dem Durchtritt von Zellen sensibilisiert. Man ließ die Zellen, etwa 18 x 10&sup6; Zellen, in einem T-75-Kolben in die logarithmische Phase wachsen, zentrifugierte und suspendierte sie dann erneut in 2 ml S-DMEM. Jede Maus erhielt 0,5 ml einer IP Injektion von etwa 4-5 x 10&sup6; Zellen. Ein Aszites-Tumor entwickelte sich in der Regel innerhalb von einer oder zwei Wochen. Die eine hohe Konzentration an Antikörper enthaltende Aszites-Flüssigkeit wurde anschließend unter Verwendung einer 18- Eichnadel abgezogen. Man ließ die Flüssigkeit bei Raumtemperatur gerinnen und zentrifugierte sie dann 30 Minuten bei 1500 UpM. Die den Antikörper enthaltende Flüssigkeit wurde abgegossen und bei -20ºC gefroren aufbewahrt.
Durch das Verfahren dieses Beispiels 15 wurden auch Antikörper gegen die Produkte der Beispiele 2C, 3C, 6C, 7C und 4A gebildet.

BEISPIEL 16

AUSWAHL VON ANTIKÖRPERN UND ENZYM-KONJUGATEN

A. ALLGEMEINE FAKTOREN

Die Auswahl von optimalen monoklonalen Antikörpern und Enzym-Konjugaten für die Verwendung in einem EMIT -Assay für Cyclosporin ist von einer Reihe zusammenhängender Faktoren abhängig. In erster Linie muß der Antikörper das Enzym-Konjugat erkennen und dessen Aktivität beeinflussen. Da Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) ein bevorzugtes Enzym ist, wird der Antikörper aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, die Aktivität eines Glucose-6-phosphat-Konjugats zu hemmen. Ferner wird der Antikörper aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, interessierende Cyclosporine zu erkennen. Wenn zum Beispiel ein Assay gewünscht ist, der Cyclosporin A und nicht seine Metaboliten nachweisen kann, dann wird ein Antikörper mit dieser Spezifität ausgewählt. Wenn alternativ ein Assay gewünscht ist, der Cyclosporin A und seine Hauptmetaboliten nachweisen kann, dann wird ein Antikörper mit dieser Spezifität ausgewählt.
Andere Auswahifaktoren umfassen die Stabilität, die Bequemlichkeit der Herstellung und die Löslichkeiten der Antikörper und Enzym-Konjugate.
Einzelheiten des durchzuführenden Assays beeinflussen auch die Auswahl von Antikörpern und Enzym-Konjugaten. Die Probe könnte zum Beispiel Vollblut, Serum, Urin und dergleichen sein. Das Verdünnungsmittel des Assays, stabilisierende Zusätze, Puffer-Komponenten, Antischaummittel und eine Vorbehandlung könnten die Auswahl von Antikörpern und Enzym- Konjugaten beeinflussen.
Die oben beschriebenen Faktoren sind allgemeingültig und zusammenhängend. Die Auswahl optimaler Antikörper und Enzym- Konjugate umfaßt das sorgfältige Abstimmen einiger der oben beschriebenen Faktoren sowie anderer wichtiger Faktoren in dem interessierenden speziellen Assay.

B. SCREENEN DER ENZYM-KONJUGATE

In Beispiel 14 hergestellte Cyclosporin-A-Glucose-6- phosphat-Dehydrogenase-Konjugate wurden hinsichtlich der Inhibierung in Prozent gescreent, nachdem sie mit zwei der Antikörper (Klone 5E10 und 2G4) von Beispiel 15 behandelt worden waren. Schlüsselfaktoren der Auswahl umfaßten die Maximierung der Inhibierbarkeit und Stabilität der Konjugate. TABELLE 1 Screenen der Cyclosporin-G6PDH-Konjugate
a. Molares Endverhältnis von Hapten zu Enzym in der Reaktionsmischung der Konjugation
b. Desaktivierung in Prozent
c. Enzym-Inhibierung in Prozent

C. SCREENEN DER ANTIKÖRPER

Die Antikörper von Beispiel 15 wurden hinsichtlich der Inhibierung in Prozent gegenüber den Glucose-6-phosphat-Konjugaten von Beispiel 14 gescreent. Die Schlüsselfaktoren der Auswahl umfaßten die Maximierung der Inhibierung von Enzym-Konjugaten und die Verringerung der Inhibierung durch die Zugabe von CsA. TABELLE 2 Screenen der Cyclosporin-Antikörper auf die Inhibierung in Prozent TABELLE 3 Screenen der Cyclosporin-Antikörper auf die Inhibierung in Prozent gegenüber der G6PDH-Konjugat-Verbindungsgruppe II KLH-Immunogen-Verbindungsgruppe XIV KLH-Immunogen-Verbindungsgruppe XIX

D. SCREENEN DER ANTIKÖRPER-KREUZREAKTIVITÄT

-Die Antikörper von Beispiel 15 wurden auf die Kreuzreaktivität gegenüber Cyclosporin-Metaboliten unter Verwendung der G6PDH-Konjugat-Verbindungsgruppe II gescreent. Die Schlüsselfaktoren der Auswahl umfaßten die Minimierung der Kreuzreaktivität. TABELLE 4 Kreuzreaktivität von Antikörpern mit den Metaboliten M1, M8, M17 und M21 TABELLE 5 Kreuzreaktivität von Antikörpern mit Metabolit M17

E. SCHLUSSFOLGERUNG

Aufgrund des obigen Screenens wurde Cyclosporin A, das durch die Verbindungsgruppe der Formel II an dem Alanin-Stickstoffatom des Aminosäurerestes Nr. 7 von Cyclosporin A an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase konjugiert war, als Beispiel eines Enzym-Konjugats ausgewählt.
Der Antikörper-Klon Nr. 2G4 wurde als Beispiel eines Antikörpers ausgewählt.

BEISPIEL 17

DURCHFÜHRUNG DES EMIT -ASSAYS

Einzelheiten der Emit -Assay-Vorschrift sind in dem U.S.-Patent Nr. 3517837 (1974) beschrieben. Antikörper, die unter Verwendung des KLH-Konjugats von Beispiel 138 durch das Verfahren von Beispiel 15 hergestellt worden waren, wurden verwendet und werden für dieses Beispiel als monokionale Anti-CsA- Antikörper bezeichnet. Das G6PDH-Konjugat wurde unter Verwendung der Verbindung von Beispiel 6B durch das Verfahren von Beispiel 14 hergestellt und wird für dieses Beispiel als CsA- G6PDH-Konjugat bezeichnet. Der Assay wurde auf dem Analysengerät COBAS MIRA durchgeführt.
100 µl einer Voliblut-Probe und 6 Kalibratoren wurden getrennt mit 200 µl Methanol verwirbelt. Das Methanol lysierte die Zellen, solubilisierte Cyclosporin und fällte Blut-Proteine. Nach 1-minütiger Inkubation wurde die Mischung zentrifugiert Der Überstand wurde mit dem Verdünnungsmittel der Vorbehandlung 1 zu 3 verdünnt. 36 µl der entstandenen, vorbehandelten Probe wurden auf dem Analysengerät mit 155 µl des Reagens mit monokionalem Anti-CSA-Antikörper, weiches ein Substrat und einen Cofaktor enthielt, 75 Sekunden inkubiert. Anschließend wurden 75 µl des CSA-G6PDH-Konjugat-Reagens zugegeben. Nach einer zweiten Inkubation von 175 Sekunden wurde die Enzym-Aktivität (eine Funktion der Arzneistoff-Konzentration) überwacht, indem die NADH-Biidung spektrophotometrisch bei 340 nm 100 Sekunden verfolgt wurde.
Das Reagens mit monoklonalem Anti-CsA-Antikörper enthielt monokionalen Anti-CsA-Antikörper, Nicotinamidadenindinucleotid, Glucose-6-phosphat, Natriumchlorid, Füllstoff, Tensid und Konservierungsstoffe.
Das CsA-G6PDH-Konjugat-Reagens enthielt Enzym-Konjugat, Tris-Puffer, Füllstoffe, Stabilisatoren und Konservierungsstoffe.
Das Verdünnungsmittel enthielt Tris-Puffer, Tensid und Konservierungsstoffe.
Jedes der Reagenzien wurde übereinstimmend mit der Emit -Standardtechnologie formuliert. Die Reagenzien wurden nicht iyophilisiert und waren daher Flüssigkeiten. Füllstoffe, Tenside und Konservierungsstoffe, die eine bequeme Verwendung und Aufbewahrung der Reagenzien erlaubten, wurden ausgewählt.
Ein bevorzugter Stabilisator für das CsA-G6PDH-Konjugat- Reagens war ein Antikörper, welcher sich an eine von enzymatisch aktiven Steilen verschiedene Stelle oder Steilen an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase band. Ein solcher Antikörper wurde unter Verwendung von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase als ein Immunogen durch die in Beispiel 15 beschriebenen Hybridoma- Standardverfahren hergestellt. Der Anti-G6PDH-Antikörper wurde als Stabilisator für das CsA-G6PDH-Konjugat-Reagens verwendet.
20 Proben und 6 Kalibratoren wurden nach dieser Vorschrift in weniger als 2 Stunden vorbehandelt und untersucht.
Der Bereich der Assay-Standard-Kurve erstreckte sich bis 500 ng/ml. Die analytische Wiederfindung innerhalb des Kurvenbereiches variierte von 95 bis 104 %. Die Präzision innerhalb eines Laufs mit Kontrollen mit 3 Konzentrationen lag im Bereich von 5,0 bis 7,1 % CV. Die Präzision von Lauf zu Lauf mit denselben Kontrollen lag im Bereich von 4,9 bis 7,4 % CV.
Eine Kreuzreaktivität wurde mit dem Cyclosporin-A-Metaboliten M1, aber nicht mit den anderen Hauptmetaboliten M8, M17 und M21 beobachtet. 57 potentiell zusammen verabreichte Arzneistoffe, Schwankungen im Hämatokrit-Wert und hohe Konzentrationen an Bilirubin oder Triglyceriden störten den Assay nicht.

ASSAY-PARAMETER AUF DEM ANALYSENGERÄT COBAS MIRA

Assay-Temperatur 37ºC
Wellenlänge 340 nm
Volumen der vorbehandelten Probe 36 µl
Volumen des Verdünnungsmittels (Wasser) 59 µl
Volumen des Antikörper-Reagens 155 µl
Inkubationszeit (Probe + Antikörper-Reagens) 75 s
Volumen des Enzym-Reagens 75 µ1
Verzögerungszeit 175 s (Probe + Antikörper- und Enzym-Reagenzien)
Ablesezeit 100 s
10 frische Cyclosporin-A-negative Voliblut-Proben wurden mit 3 Konzentrationen an Cyclosporin A versetzt. Die Proben wurden in Doppelbestimmungen untersucht.
2 getrennte Proben frisches Cyclosporin-A-negatives Vollblut wurden mit 5 Konzentrationen an Cyciosporin A versetzt. Die Proben wurden in Doppelbestimmungen untersucht. Zugegebene Konz. 35 75 150 275 425 (ng/ml)
Bestimmungen der Präzision innerhalb eines Laufs wurden an 20 verschiedenen Probenextrakten mit jeweils drei Konzentrationen durchgeführt. Bestimmungen der Präzision von Lauf zu Lauf wurden mit jeweils drei Konzentrationen in insgesamt 20 Läufen auf 2 Analysengeräten durchgeführt. In jedem Lauf wurden verschiedene Probenextrakte untersucht, und die quantitativen Bestimmungen stammten von übereinstimmenden Standardkurven.
Proben von der American Association of Clinicai Chemist/College of American Pathologists (AACC/CAP) Whoie Biood Cyciosporin A Survey und von dem United Kingdom Quality Assessment Scheme (UKQAS) wurden mit dem EMIT -Assay für Cyclosporin-A untersucht. Die Ergebnisse waren mit denen der HPLC und des CYCLO-Trac SP RIA (INCSTAR) gut vergleichbar.
Die Kreuzreaktivität mit den vier Hauptmetaboliten von Cyclosporin A wurde in Anwesenheit von 200 ng/ml Cyclosporin A untersucht. Von diesem Metaboliten zeigte nur M1 (AM9) eine signifikante Kreuzreaktivität
Die unten aufgeführten 75 Verbindungen zeigten in dem Assay keine Kreuzreaktivität Sie wurden in Anwesenheit von 200 ng/ml Cyclosporin A in den folgenden Konzentrationen untersucht. Eine wesentliche Kreuzreaktivität wurde als 25 -%ige oder größere Erhöhung der Cyclosporin-A-Konzentration definiert. In Anwesenheit von 30 mg/dl Bilirubin oder 1000 mg/dl Triglyceriden wurde keine klinisch signifikante Störung in dem EMIT -Assay für Cyclosporin-A gefunden.
Proben mit Hämatokrit-Werten im Bereich von 18 % bis 66 % zeigten keine klinisch signifikanten Schwankungen bei der Wiederfindung von Cyclosporin A bei Konzentrationen von 75, 250 und 400 ng/ml.

Claims

1. Verfahren zur Messung der Menge an Cyclosporin in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält, umfassend die folgende Stufe: Vereinigung in einem wäßrigen Medium:

1) der Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält,

2) von Cyclosporin, das an einem der Alanin Stickstoffatome des cyclischen Grundgerüsts des Cyclosporins an einen Marker konjugiert ist (Cyciosporin-Marker-Konjugat), und

3) von Antikörpern, die sich an das Cyclosporin- Marker-Konjugat binden können.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Messung der Menge an Cyclosporin in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyclosporin enthält, umfassend die folgenden Stufen:

a) Vereinigung in einem wäßrigen Medium:

1) der Probe, von der vermutet wird, daß sie Cyciosporin enthält,

2) von Cyclosporin, das an einem der Alanin- Stickstoffatome des cyclischen Grundgerüsts des Cyciosporins an G'ucose-6-phosphat- Dehydrogenase konjugiert ist (Cyclosporin- G6PDH-Konjugat),

3) von Antikörpern, die sich an das Cyclosporin- G6PDH-Konjugat binden können, und

4) von Substraten von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase; und

b) Messen der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase- Aktivität.

3. Verbindung, umfassend ein Cyclosporin, das an einem Alanin-Stickstoffatom des cyclischen Grundgerüsts des Cyclosporins an einen organischen Rest mit mindestens 5 Atomen konjugiert ist.

4. Verbindung nach Anpruch 3, in welcher das Cyclosporin mit Hilfe einer Bindung oder einer Verbindungsgruppe mit weniger als etwa 20 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, die eine Kette mit einer Länge von nicht mehr als etwa 15 Atomen aufweist, an den organischen Rest gebunden ist.

5. Verbindung nach Anspruch 3 oder 4, in welcher der organische Rest einen Marker, einen immunogenen Träger oder einen Rest eines kleinen organischen Moleküls umfaßt.

6. Antikörper, hergestellt als Antwort auf die Verbindung nach Anspruch 3, 4 oder 5, in welcher der organische Rest ein immunogener Träger ist.

7. Antikörper nach Anspruch 6, die Antikörper umfassen, die Cyclosporin erkennen können.

8. Antikörper nach Anspruch 6, wobei das Cyclosporin Cyclosporin A ist.

9. Verbindung, bei der es sich um ein Konjugat der Antikörper von Anspruch 6 und eines Markers handelt.

10. Verbindung nach Anspruch 3 der Formel:

worin ein Mitglied der Gruppe β&sub1; und β&sub2; Wasserstoff ist und das andere Mitglied ein organischer Rest mit mindestens 5 Atomen ist.

11. Verbindung nach Anspruch 10, in welcher der organische Rest eine Kette von etwa 3 bis 15 von Wasserstoff verschiedenen Atomen umfaßt, die an Glucose-6-phosphat- Dehydrogenase gebunden ist.

12. Antikörper, hergestellt als Antwort auf die Verbindung nach Anspruch 10, in welcher der organische Rest ein immunogener Träger ist.

13. Verbindung nach Anspruch 10( in welcher entweder (i) β&sub2; Wasserstoff ist und β&sub1; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

worin β&sub3; eine Poly(aminosäure) darstellt, oder in welcher (ii) ein Mitglied von β&sub1; und β&sub2; Wasserstoff ist und das andere Mitglied aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

worin β&sub3; eine Poly(aminosäure) ist.

14. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 10, umfassend (i), wenn der organische Rest eine Kette aus zwei Kohlenstoffen mit einer Hydroxy-Endgruppe umfaßt, die folgenden Stufen:

a) Umsetzung eines Cyclosporins mit einer Base, die ausreichend basisch ist, um ein sekundäres Amid zu deprotonieren,

b) Umsetzung der deprotonierten Verbindung von a) mit einem Epoxid und

c) Entfernung von Schutzgruppen aus dem Cyclosporin; (ii), wenn der organische Rest eine Carboxybenzylgruppe umfaßt, die folgenden Stufen:

b) Umsetzung der deprotonierten Verbindung von a) mit einerα-Halogenmethylbenzoesäure, Niederalkylester, und

c) Entfernung von Schutzgruppen aus dem Cyclosporin; oder (iii), wenn der organische Rest ein Enzym-Marker ist, die folgenden Stufen:

a) Herstellung eines aktivierten Esters der Verbindung nach Anspruch 10, in welcher der organische Rest eine Kette von etwa 2 bis 14 von Wasserstoff verschiedenen Atomen, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, umfaßt, und

b) die Zugabe des aktivierten Esters zu einem Enzym.

15. Zusammensetzung, umfassend einen Immun-Komplex eines Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Hapten-Konjugats (G6PDH-Konjugats) und eines Antikörpers gegen Cyclosporin, der sich an das Cyclosporin-Marker-Konjugat von Anspruch 1 binden kann.