CN110736835B - 一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法测定全血中免疫抑制剂环孢霉素a的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高灵敏度胶乳增强免疫比浊法测定全血中免疫抑制剂环孢霉素A的试剂盒，具体地，提供的环孢霉素检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1包含环孢霉素蛋白复合物、防腐剂、表面活性剂、稳定剂及缓冲液；试剂R2包含结合有抗环孢霉素A单克隆抗体的胶乳颗粒、防腐剂、表面活性剂、稳定剂及缓冲液；校准品包含防腐剂、类全血基质、环孢霉素A纯品。本发明采用单克隆抗体包被胶乳颗粒与蛋白复合物发生反应的方法保证了试剂盒的高灵敏度和宽线性范围，同时还具有准确度高、重复性好、特异性强、操作简单等优点，可用于临床常用的全自动生化分析仪。

Description

一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法测定全血中免疫抑制剂环 孢霉素A的试剂盒

技术领域

本发明属于体外诊断试剂领域，特别地，本发明涉及一种测定全血中环孢霉素A的试 剂盒。

背景技术

环孢霉素A(Cyclosporine A，CsA)是一种由11个氨基酸组成的亲脂性环状化合物， 其作为一种高效的免疫抑制剂，被广泛应用于抑制器官移植病人的免疫排斥反应，也常 用于治疗牛皮癣、遗传性皮炎、坏疽性脓皮病、荨麻疹、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。自80年代初期CsA应用于临床以来，CsA在移植排异治疗中发挥了重大作用， 在全球范围内推动了器官移植术的发展。尽管CsA的使用往往伴有多种不良反应，至今 全球仍有数十万例患者使用CsA抑制移植后的排异反应。

由于不同患者对CsA的吸收和代谢往往表现出很大的个体差异，即使使用相同的药 物剂量，不同患者的CsA血药浓度也常差异显著；由于CsA的肝、肾毒性及其狭窄的治 疗剂量范围，CsA的药效与药毒均与血药浓度密切相关，因此，准确检测CsA的血药浓 度对于控制CsA的药毒性和发挥CsA的抗排斥作用均具有重要参考价值。

目前，检测CsA血药浓度的方法主要有高效液相-质谱联用(HPLC-MS)、微粒子酶免疫测定(MEIA)、化学发光微粒子免疫测定(CMIA)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等。其中HPLC-MS法测定血药浓度准确、灵敏，但其操作繁琐，检测时间长，检测成本高，需要 昂贵设备，主要用于科研领域或作为一种参考方法。MEIA和CMIA是目前常用的检测方 法，其检测自动化程度高，检测结果准确，但试剂价格昂贵，需要使用配套的仪器。酶 联免疫吸附法则存在检测时间长，操作复杂，重复性差等缺点。胶乳增强免疫比浊法具 有操作简单、快速、灵敏度高、可应用于自动生化分析仪等优点，如能开发出可在全自 动生化分析仪上使用的免疫比浊试剂用于检测全血中环孢霉素A，将为临床环孢霉素作为 免疫抑制剂的使用提供强有力的支持。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足和缺点，提供一种具有高灵敏度和宽线性范 围的环孢霉素A检测试剂盒，同时还具有测值准确，操作简单、快速可用于门急诊检测且仪器适用面广等优点，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，其中

a)试剂R1包含环孢霉素蛋白复合物、防腐剂、稳定剂和缓冲液；

b)试剂R2包含结合有抗环孢霉素单克隆抗体的胶乳颗粒、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲液；

c)校准品包含防腐剂、环孢霉素A纯品和牛全血基质。

优选的，本发明中的环孢霉素蛋白复合物是环孢霉素C与BSA偶联产生

优选的，本发明中聚苯乙烯胶乳微球交联环孢霉素A单克隆抗体。

本发明的技术方案是将环孢霉素A抗体交联在聚苯乙烯胶乳微球表面，与环孢霉素蛋 白复合物反应，带动聚苯乙烯胶乳微球聚集产生一定浊度，而全血中的环孢霉素A将竞争 的结合聚苯乙烯微球表面的单克隆抗体，因此浊度与全血中的环孢霉素A在一定范围成反 比，可以用全自动生化仪在400-800nm波长下检测环孢霉素A的含量。

本发明所述试剂R1中的缓冲液1选自MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、 柠檬酸缓冲液中的一种或几种，其pH为5.5～8.0，浓度为25～200mmol/L；所述试剂 R2中的缓冲液2选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、硼砂缓冲液、MOPS缓冲液中的一 种或几种，其pH为7.0～9.0，浓度为25～200mmol/L。

本发明所述试剂R1中的稳定剂采用离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用：其中离子稳 定剂为NaCl、KCl或者MgCl₂等一种或几种，含量为1％～2％；悬浮稳定剂为PEG8000、PEG6000或者葡萄糖，含量为2％～5％

本发明所述试剂R2中的稳定剂2选用离子稳定剂NaCl、KCl或者K₂SO₄中一种或几种，含量为0.5％～5％

本发明所述试剂R1中的防腐剂1为叠氮钠、硫柳汞或者ProClin300；所述试剂R2中的防腐剂2为叠氮钠、硫柳汞或ProClin300；所述校准品中的防腐剂3为叠氮钠、硫柳汞或者ProClin300。

本发明所诉试剂R2中的采用表面官能团为羧基的聚苯乙烯胶乳微球，粒径为200nm～400nm。

本发明所述试剂R2中的环孢霉素抗体为鼠单克隆抗体。

本发明所述试剂R2中的表面活性剂剂为Tween-20，含量为0.5％～2％。

本发明所述试剂R2中的保护剂为牛血清白蛋白，含量为0.5％～5％

本发明所述校准品中采用冻融2～5次的牛全血作为基质。

本发明所述的一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法测定全血中免疫抑制剂环孢霉素A 的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)试剂R1的制备：将环孢霉素A 100～200mg，琥珀酸酐45～70mg，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)5～10mg，二氯甲烷(DCM)4～6mL放入瓶中室温搅拌反应10小时。加入2 倍体积0.1N盐酸洗涤2次，取有机相(注：用酸洗，需要的有机相在下层)；再加入2倍体 积饱和NaCl溶液，洗涤3次，取有机相(注：用饱和NaCl洗，需要的有机相在上层)。负 压抽干，然后再加入少量二氯甲烷，再次抽干，尽量使产物干燥。称取5～10mg产物， 加入200μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，继续加入2～3mg EDCI，10～20mg NHS搅拌反应 10min；在另一西林瓶中加入10mL含有20mg牛血清白蛋白(BSA)的MES缓冲液，混匀； 磁搅拌下，取200uL活化好的环孢素C的DMF溶液，缓慢滴加至含有BSA的溶液中，室温 反应5小时，纯化即得到环孢霉素蛋白复合物。再在缓冲液1中加入环孢霉素蛋白复合物、 稳定剂1、防腐剂1搅拌混合均匀，即得试剂R1；

(2)试剂R2的制备：用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1％，再加入质量浓度为0.01％～0.1％的EDC，在室温下搅拌反应30min，反应结束后12000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC，然后加入环孢霉素单克隆抗体，37℃下搅拌反应60min，再 加入0.5～2％BSA作为封闭剂反应60min，将得到的反应液12000rpm离心、洗涤，最后用 包括、稳定剂2、防腐剂2和表面活性剂2的缓冲液2将胶乳重悬。

(3)校准品的制备：将新鲜抗凝牛全血反复冻融2～5次后过滤，加入0.05％～0.1的防 腐剂，再按照需要添加环孢霉素A纯品。得到不同浓度的环孢霉素A校准品

本发明采用6点定标法，以样条函数作为计算模式，绘制出校准曲线。

本发明所述的试剂盒，用于测定全血中环孢霉素A，与现有技术相比，具有特异性好、 灵敏度高、准确性好、线性范围宽等优点；另外，进行检测时操作简便适用于全自动生化分析仪，大幅度提高了检测效率。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施 例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术 和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、 设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以 使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设 备和材料来实现本发明。

实施例1：

一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法检测全血中免疫抑制剂环孢霉素A试剂盒，包含如 下制备步骤：

(1)将环孢霉素A 150mg，琥珀酸酐50mg，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)6mg，二氯甲 烷(DCM)6mL放入瓶中室温搅拌反应10小时。加入2倍体积0.1N盐酸洗涤2次，取有机 相(注：用酸洗，需要的有机相在下层)；再加入2倍体积饱和NaCl溶液，洗涤3次，取有 机相(注：用饱和NaCl洗，需要的有机相在上层)。负压抽干，然后再加入少量二氯甲烷， 再次抽干，尽量使产物干燥。称取10mg产物，加入200μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)， 继续加入3mg EDCI，20mgNHS搅拌反应10min；在另一西林瓶中加入10mL含有20mg牛 血清白蛋白(BSA)的MES缓冲液，混匀；磁搅拌下，取200uL活化好的环孢霉素A的DMF 溶液，缓慢滴加至含有BSA的溶液中，室温反应5小时，纯化即得到环孢霉素蛋白复合物。 再按照如下浓度配置试剂R1：

(2)试剂R2的制备：用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1％，再加入质量浓度为0.05％的EDC，在室温下搅拌反应30min，反应结束后12000rpm离心洗 涤以除去未反应的EDC，然后加入环孢霉素单克隆抗体，37℃下搅拌反应60min，再加入 1％BSA作为封闭剂反应60min，将得到的反应液12000rpm离心、洗涤，最后用包括、稳 定剂2、防腐剂2和表面活性剂2的缓冲液2将胶乳重悬,具体浓度如下：

(3)校准品的制备：将新鲜抗凝牛全血反复冻融2～5次后过滤，加入0.05％的防腐剂， 再按照需要添加环孢霉素A纯品。得到不同浓度的环孢霉素A校准品

实施例2：

一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法检测全血中免疫抑制剂环孢霉素A试剂盒，包含如 下制备步骤：

(1)将环孢霉素A 100mg，琥珀酸酐35mg，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)5mg；三乙胺 30μL，二氯甲烷(DCM)4mL放入瓶中室温搅拌反应10小时。加入2倍体积0.1N盐酸洗 涤2次，取有机相(注：用酸洗，需要的有机相在下层)；再加入2倍体积饱和NaCl溶液， 洗涤3次，取有机相(注：用饱和NaCl洗，需要的有机相在上层)。负压抽干，然后再加 入少量二氯甲烷，再次抽干，尽量使产物干燥。称取10mg产物，加入200μLN,N-二甲基 甲酰胺(DMF)，继续加入1.5mg EDCI，10mg NHS搅拌反应10min；在另一西林瓶中加 入10mL含有20mg牛血清白蛋白(BSA)的MES缓冲液，混匀；磁搅拌下，取200uL活化好 的环孢霉素C的DMF溶液，缓慢滴加至含有BSA的溶液中，室温反应5小时，纯化即得到 环孢霉素蛋白复合物。再按照如下浓度配置试剂R1：

(2)试剂R2的制备：用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1％，再加入质量浓度为0.05％的EDC，在室温下搅拌反应30min，反应结束后12000rpm离心洗 涤以除去未反应的EDC，然后加入环孢霉素单克隆抗体，37℃下搅拌反应60min，再加入 1％BSA作为封闭剂反应60min，将得到的反应液12000rpm离心、洗涤，最后用包括、稳 定剂2、防腐剂2和表面活性剂2的缓冲液2将胶乳重悬,具体浓度如下：

(3)校准品的制备：将新鲜抗凝牛全血反复冻融2～5次后过滤，加入0.05％的防腐剂， 再按照需要添加环孢霉素A纯品。得到不同浓度的环孢霉素A校准品

实施例3：

一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法检测全血中免疫抑制剂环孢霉素A试剂盒，包含如 下制备步骤：

(1)将环孢霉素A 100mg，琥珀酸酐35mg，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)5mg，二氯甲 烷(DCM)4mL放入瓶中室温搅拌反应10小时。加入2倍体积0.1N盐酸洗涤2次，取有机 相(注：用酸洗，需要的有机相在下层)；再加入2倍体积饱和NaCl溶液，洗涤3次，取有 机相(注：用饱和NaCl洗，需要的有机相在上层)。负压抽干，然后再加入少量二氯甲烷， 再次抽干，尽量使产物干燥。称取10mg产物，加入200μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)， 继续加入1.5mg EDCI，10mgNHS搅拌反应10min；在另一西林瓶中加入10mL含有20mg 牛血清白蛋白(BSA)的MES缓冲液，混匀；磁搅拌下，取200uL活化好的环孢霉素C的DMF 溶液，缓慢滴加至含有BSA的溶液中，室温反应5小时，纯化即得到环孢霉素蛋白复合物。 再按照如下浓度配置试剂R1：

(2)试剂R2的制备：用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1％，再加入质量浓度为0.05％的EDC，在室温下搅拌反应30min，反应结束后12000rpm离心洗 涤以除去未反应的EDC，然后加入环孢霉素单克隆抗体，37℃下搅拌反应60min，再加入 1％BSA作为封闭剂反应60min，将得到的反应液12000rpm离心、洗涤，最后用包括、稳 定剂2、防腐剂2和表面活性剂2的缓冲液2将胶乳重悬,具体浓度如下：

(3)校准品的制备：将新鲜抗凝牛全血反复冻融2～5次后过滤，加入0.05％的防腐剂， 再按照需要添加环孢霉素A纯品。得到不同浓度的环孢霉素A校准品

实施例4：

一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法检测全血中免疫抑制剂环孢霉素A试剂盒，包含如 下制备步骤：

(1)将环孢霉素A 100mg，琥珀酸酐35mg，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)5mg，二氯甲 烷(DCM)4mL放入瓶中室温搅拌反应10小时。加入2倍体积0.1N盐酸洗涤2次，取有机 相(注：用酸洗，需要的有机相在下层)；再加入2倍体积饱和NaCl溶液，洗涤3次，取有 机相(注：用饱和NaCl洗，需要的有机相在上层)。负压抽干，然后再加入少量二氯甲烷， 再次抽干，尽量使产物干燥。称取10mg产物，加入200μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)， 继续加入1.5mg EDCI，10mgNHS搅拌反应10min；在另一西林瓶中加入10mL含有20mg 牛血清白蛋白(BSA)的MES缓冲液，混匀；磁搅拌下，取200uL活化好的环孢霉素C的DMF 溶液，缓慢滴加至含有BSA的溶液中，室温反应5小时，纯化即得到环孢霉素蛋白复合物。 再按照如下浓度配置试剂R1：

(2)试剂R2的制备：用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1％，再加入质量浓度为0.05％的EDC，在室温下搅拌反应30min，反应结束后12000rpm离心洗 涤以除去未反应的EDC，然后加入环孢霉素单克隆抗体，37℃下搅拌反应60min，再加入 1％BSA作为封闭剂反应60min，将得到的反应液12000rpm离心、洗涤，最后用包括、稳 定剂2、防腐剂2和表面活性剂2的缓冲液2将胶乳重悬,具体浓度如下：

(3)校准品的制备：将新鲜抗凝牛全血反复冻融2～5次后过滤，加入0.05％的防腐剂， 再按照需要添加环孢霉素A纯品。得到不同浓度的环孢霉素A校准品

测试结果：

对上述4个实施例及对比例制备的试剂用贝克曼AU480全自动生化仪进行测试，测试 波长为600nm，取样本或校准品4uL，再加入160uL的试剂R1，37℃恒温5min，然后加入40ul试剂R2，20s后读取吸光度A1,37℃孵育4分40秒后读取吸光度A2，则反应吸光度 ΔA＝A2-A1；首先使用标准品进行多点定标，并用样条函数进行计算，得到定标曲线。 样本通过其吸光度变化，与标准曲线进行对比即可得到样本中PCT浓度。对上述4个实施 例和对比例进行了分析灵敏度、准确度、精密性以及稳定性等进行了验证，验证结果。

如表1所示：

根据其测试结果可知，在本发明参数范围内制得的检测试剂，均能够具备较好的分 析灵敏度、准确度、精密性和稳定性，其中实施1为最优实施例，可以最好地提高试剂测试效果。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

Claims (2)

1.一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法测定全血中免疫抑制剂环孢霉素A的试剂盒，包括如下制备步骤：

(1)将环孢霉素A 150 mg，琥珀酸酐50 mg，4-二甲基氨基吡啶(DMAP) 6 mg，二氯甲烷6mL放入瓶中室温搅拌反应10小时；加入2倍体积0.1 N盐酸洗涤2次，取有机相；再加入2倍体积饱和NaCl溶液，洗涤3次，取有机相；负压抽干，然后再加入少量二氯甲烷，再次抽干，尽量使产物干燥；称取10 mg产物，加入200 μL N,N-二甲基甲酰胺，继续加入3 mg EDCI，20mg NHS搅拌反应10 min；在另一西林瓶中加入10 mL含有20 mg牛血清白蛋白的MES缓冲液，混匀；磁搅拌下，取200 μL活化好的环孢霉素A的DMF溶液，缓慢滴加至含有BSA的溶液中，室温反应5小时，纯化即得到环孢霉素蛋白复合物；再按照以下浓度配置试剂R1：1mL/L环孢霉素蛋白复合物，32 g/L PEG-6000，5.33 g/LMES一水合物，10 g/L NaCl，10 g/L BSA，4.5g/L MgCl₂，5 mL/L 10% NaN₃溶液；

(2)试剂R2的制备：用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%，再加入质量浓度为0.05%的EDC，在室温下搅拌反应30 min，反应结束后12000 rpm离心洗涤以除去未反应的EDC，然后加入环孢霉素单克隆抗体，37℃下搅拌反应60min，再加入1% BSA作为封闭剂反应60min，将得到的反应液12000 rpm离心、洗涤，按照以下浓度将胶乳重悬：1mL/L标记抗体的微球，11.915 g/L HEPES，10 g/L NaCl，10 g/L BSA，1 g/L Tween-20，5 mL/L 10%NaN₃溶液；

(3)校准品的制备：将新鲜抗凝牛全血反复冻融2~5次后过滤，加入0.05%的防腐剂，再按照需要添加环孢霉素A纯品；得到不同浓度的环孢霉素A校准品。

2.一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法测定全血中免疫抑制剂环孢霉素A的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将环孢霉素A 150 mg，琥珀酸酐50 mg，4-二甲基氨基吡啶(DMAP) 6 mg，二氯甲烷6mL放入瓶中室温搅拌反应10小时；加入2倍体积0.1 N盐酸洗涤2次，取有机相；再加入2倍体积饱和NaCl溶液，洗涤3次，取有机相；负压抽干，然后再加入少量二氯甲烷，再次抽干，尽量使产物干燥；称取10 mg产物，加入200 μL N,N-二甲基甲酰胺，继续加入3 mg EDCI，20mg NHS搅拌反应10 min；在另一西林瓶中加入10 mL含有20 mg牛血清白蛋白的MES缓冲液，混匀；磁搅拌下，取200 μL活化好的环孢霉素A的DMF溶液，缓慢滴加至含有BSA的溶液中，室温反应5小时，纯化即得到环孢霉素蛋白复合物；再按照以下浓度配置试剂R1：1mL/L环孢霉素蛋白复合物，32 g/L PEG-6000，5.33 g/LMES一水合物，10 g/L NaCl，10 g/L BSA，4.5g/L MgCl₂，5 mL/L 10% NaN₃溶液；

(2)试剂R2的制备：用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%，再加入质量浓度为0.05%的EDC，在室温下搅拌反应30 min，反应结束后12000 rpm离心洗涤以除去未反应的EDC，然后加入环孢霉素单克隆抗体，37℃下搅拌反应60min，再加入1% BSA作为封闭剂反应60min，将得到的反应液12000 rpm离心、洗涤，按照以下浓度将胶乳重悬：1mL/L标记抗体的微球，11.915 g/L HEPES，10 g/L NaCl，10 g/L BSA，1 g/L Tween-20，5 mL/L 10%NaN₃溶液；

(3)校准品的制备：将新鲜抗凝牛全血反复冻融2~5次后过滤，加入0.05%的防腐剂，再按照需要添加环孢霉素A纯品；得到不同浓度的环孢霉素A校准品。