CN111443203A - 11-脱氢血栓烷b2均相酶免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属体外诊断技术领域，具体提供了一种11‑脱氢血栓烷B2均相酶免疫检测试剂盒，特征是使用均相酶免疫法对11‑脱氢血栓烷B2进行测定，可以实现在全自动生化分析仪上对人体尿液11‑脱氢血栓烷B2进行高通量、快速化的定量检测。本发明还包括试剂盒所使用的酶标偶联物及其制备方法。与市场上现有的检测试剂盒相比，本发明试剂盒具有检测过程自动化程度高、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还极大的降低了11‑脱氢血栓烷B2的检测成本，有利于临床大规模推广使用。

Description

11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属体外诊断领域，具体来说是一种11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫检测试剂盒，以及上述试剂盒的制备方法。
背景技术
11-脱氢血栓烷B2(11-dhTXB2)是血栓素A2(血栓素B2)在人体尿液中的最终代谢产物，尿液中的11-脱氢血栓烷B2含量可以精准反映一定时间范围内血液中血栓素A2的水平，而人体血液内血栓素A2水平与血小板聚集能力密切相关。所以，人体尿液中11-脱氢血栓烷B2的含量可作为血小板凝集能力的判定指标之一。该检测项目对抗血小板凝集治疗效果的确认，尤其是阿司匹林耐药性检测具有重要意义。另外，对于心脑血管疾病患者，该指标可在一定程度上能反映其心梗、卒中等发病概率，进而帮助医生及时更换用药和改变治疗策略。
11-脱氢血栓烷B2为小分子化合物，在尿液中含量较低，且尿液成分复杂、干扰物极多，所以对人体尿液11-脱氢血栓烷B2含量进行定量检测较为困难，常规的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、酶联免疫分析法(ELISA)、放射免疫法(RIA)等，但是这些方法具有一定的局限性，例如需要人工操作、需要专门的仪器设备、材料过于昂贵、检测周期较长等，使该检测项目无法在临床上进行大规模推广应用。
随着近年来全球心脑血管疾病发病率的持续增加，研发一种质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的11-脱氢血栓烷B2测定试剂盒具有极高的市场价值。均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对11-脱氢血栓烷B2的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，能有效满足日益增长的临床检测需求。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供一种11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫检测试剂盒，可以实现在全自动生化分析仪上对人体尿液11-脱氢血栓烷B2进行高通量、快速化的定量检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还极大的降低了11-脱氢血栓烷B2的检测成本，有利于临床推广使用。
具体来说，本发明提供的检测试剂盒由样本稀释液、标准品、质控品和检测试剂组成。
样本稀释液为一定浓度和pH的缓冲液，可选缓冲体系包括Tris-HCl、碳酸钠-盐酸、硼酸-硼砂、甘氨酸-NaOH，优选Tris-HCl和硼酸-硼砂；其浓度为5-50mM；其pH值范围为8.0-9.5。
标准品为浓度在4000~8000pg/ml范围内的11-脱氢血栓烷B2甲酸溶液。
质控品为添加了防腐剂的人体尿液，其中11-脱氢血栓烷B2的浓度由高效液相色谱法(HPLC)确定。
检测试剂由两个独立的液体试剂组成，并按照使用顺序分为R1和R2，主要成分为11-脱氢血栓烷B2特异性抗体、酶标偶联物、酶底物、显色物质，溶解在含有Mg2+的缓冲液中。在检测试剂中，11-脱氢血栓烷B2特异性抗体抗体和酶标偶联物彼此独立，酶标偶联物和酶底物彼此独立，可选的成分组合如下所述，优选为组合三：
组合一：
R1：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM、显色物质5~25mM；R2：酶标偶联物0.05~10ug/ml
组合二：
R1：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM；R2：酶标偶联物0.05~10ug/ml、显色物质5~25mM
组合三：
R1：酶标偶联物0.05~10ug/ml；R2：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM、显色物质5~25mM
组合四：
R1：酶标偶联物0.05~10ug/ml、显色物质5~25mM；R2：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM
所述的11-脱氢血栓烷B2特异性抗体是由11-脱氢血栓烷B2免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与11-脱氢血栓烷B2特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；所述的酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与11-脱氢血栓烷B2经化学合成的半抗原酶标偶联物；所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的底物，可选的有葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸钠盐，优选葡萄糖-6-磷酸钠盐；所述的显色物质可选的有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，以及它们的钠盐，优选为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐；所述的含有Mg2+的缓冲液可选的有甘氨酸-NaOH缓冲液、Tris-HCl缓冲液、TAPS缓冲液，优选为Tris-HCl缓冲液，其pH值优选范围为8.0~9.0，其中Mg2+浓度为0.2~30mM，优选为2~10mM。
本发明还包括上述试剂盒中所使用的酶标偶联物，即葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与11-脱氢血栓烷B2的半抗原偶联物及其制备方法，其制备方法包括以下步骤：
（1）将10~50mg 11-脱氢血栓烷B2用二甲基亚砜(DMSO)配置成5~10mg/ml的溶液，加入4~20mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，再加入6~30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，在20℃震荡反应3~5小时，用DMSO稀释至1mg/ml(以11-脱氢血栓烷B2含量计)，放置于4℃终止反应，并保存于4℃；
（2）称取5～25mg的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，用含有2mM Mg2+的TAPS缓冲液配置成1mg/ml的溶液；
（3）将步骤（1）与（2）所制得的溶液按一定比例混合，并在20℃震荡反应12h，所混合的比例在1:30~1:300内，优选的比例为1:50~1:200，更优选的比例为1:100~1:150；
（4）通过凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物。
附图说明
图1试剂盒测定的标准曲线。
图2试剂盒相关性分析图。
具体实施方式
需要说明的是，以下实施例中所述内容并不限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所做等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
实施例一：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与11-脱氢血栓烷B2偶联物的制备
按以下步骤制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与11-脱氢血栓烷B2偶联物：
（1）将20mg 11-脱氢血栓烷B2溶解于4ml 二甲基亚砜（DMSO）中，加入8mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌完全溶解，再加入12mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，密闭并在20℃震荡反应4小时，再向混合物中加入16ml DMSO，精准定容至20ml，按1ml/瓶分装20瓶，在4℃保存；
（2）称取100mg的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，用95ml含有2mM Mg2+的TAPS缓冲液配置成1mg/ml的溶液，调节pH至8.3，定容至100ml；
（3）将步骤（1）与步骤（2）所制得的溶液按1：100比例混合，并在20℃震荡避光反应12h；
（4）通过凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，即酶标偶联物。
实施例二：11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫法检测试剂的制备
按以下步骤制备11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫法检测试剂：
（1）检测试剂R1的制备：取按实施例一制备的酶标偶联物5mg，溶解于1L含5mM Mg2+ 50mM Tris-HCl 缓冲液，并将pH值调至8.4；
（2）检测试剂R2的制备：取11-脱氢血栓烷B2单克隆抗体4mg，葡萄糖-6-磷酸二钠6.1g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐13.7g，溶解于1L含5mM Mg2+ 50mM Tris-HCl 缓冲液，并将pH值调至8.4；
（3）11-脱氢血栓烷B2标准品制备：将11-脱氢血栓烷B2用甲酸配制成5000pg/ml的溶液。
实施例三：11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫法检测试剂检验及检验结果
（1）设置全自动生化仪反应参数：按表1设置生化仪参数
表1.全自动生化分析仪反应参数
Figure 417065DEST_PATH_IMAGE002
（2）获得标准曲线
将标准品用样本稀释液梯度稀释至5000,2500,1250,625,312.5,0 pg/ml，按上述测定程序进行测定，获得标准曲线，如图1所示。
（3）样本检测
通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线，重复测定高、低质控样本10次，检测数据及数据分析见表2。
表2.质控品检测数据及分析
Figure 819358DEST_PATH_IMAGE004
检测结果：本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高，精密度高，CV均低于5%。
（4）相关性分析
对100例临床尿液标本分别使用高效液相色谱法和本发明的均相酶免疫法试剂进行相关性分析，测定的数据参见图2，得到的线性方程为：y=1.0085x-2.9902，相关系数R2 =0.9672，表明本发明的检测试剂测定11-脱氢血栓烷B2临床标本的准确度高。

Claims (3)

1.一种11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于：试剂盒含有11-脱氢血栓烷B2特异性抗体和酶标偶联物，所述的酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与11-脱氢血栓烷B2的偶联物。
2.根据权利要求[1]所述的11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫检测试剂盒由以下部分组成：
(1)样本稀释液：一定浓度和pH的缓冲液，可选缓冲体系包括Tris-HCl、碳酸钠-盐酸、硼酸-硼砂、甘氨酸-NaOH，优选Tris-HCl和硼酸-硼砂；其浓度为5-50mM；其pH值范围为8.0-9.5；
(2)标准品：11-脱氢血栓烷B2甲酸溶液，浓度在4000~8000pg/ml范围内；
(3)质控品：添加了防腐剂的人体尿液，11-脱氢血栓烷B2的浓度由高效液相色谱法(HPLC)确定；
(4)检测试剂：分为R1和R2两个单独的液体试剂，特征是含有11-脱氢血栓烷B2特异性抗体、酶标偶联物、酶底物、显色物质，溶解在含有Mg2+的缓冲液中，且11-脱氢血栓烷B2特异性抗体抗体和酶标偶联物彼此独立，酶标偶联物和酶底物彼此独立，采用以下组合的一种，优选使用组合三：
组合一：
R1：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM、显色物质5~25mM；R2：酶标偶联物0.05~10ug/ml；
组合二：
R1：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM；R2：酶标偶联物0.05~10ug/ml、显色物质5~25mM；
组合三：
R1：酶标偶联物0.05~10ug/ml；R2：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM、显色物质5~25mM；
组合四：
R1：酶标偶联物0.05~10ug/ml、显色物质5~25mM；R2：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM；
所述的11-脱氢血栓烷B2特异性抗体是由11-脱氢血栓烷B2免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与11-脱氢血栓烷B2特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；所述的酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与11-脱氢血栓烷B2经化学合成的半抗原酶标偶联物；所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的底物，可选的有葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸钠盐，优选葡萄糖-6-磷酸钠盐；所述的显色物质可选的有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，以及它们的钠盐，优选为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐；所述的含有Mg2+的缓冲液可选的有甘氨酸-NaOH缓冲液、Tris-HCl缓冲液、TAPS缓冲液，优选为Tris-HCl缓冲液，其pH值优选范围为8.0~9.0，其中Mg2+浓度为0.2~30mM，优选为2~10mM。
3.根据权利要求[1]中所述的酶标偶联物及其制备方法，特征是使用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与11-脱氢血栓烷B2经化学合成制备，包括以下制备步骤：
（1）将10~50mg 11-脱氢血栓烷B2用二甲基亚砜(DMSO)配置成5~10mg/ml的溶液，加入4~20mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，再加入6~30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，在20℃震荡反应3~5小时，用DMSO稀释至1mg/ml(以11-脱氢血栓烷B2含量计)，放置于4℃终止反应，并保存于4℃；
（2）称取5～25mg的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，用含有2mM Mg2+的TAPS缓冲液配置成1mg/ml的溶液；
（3）将步骤（1）与（2）所制得的溶液按一定比例混合，并在20℃震荡反应12h，所混合的比例在1:30~1:300内，优选的比例为1:50~1:200，更优选的比例为1:100~1:150；
（4）通过凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联物。
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