发明内容
为解决现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测试剂盒及制备、操作方法,采用该试剂盒进行Lp-PLA2检测具有较高的灵敏度、特异性、操作简便和更短检测时间的优点。
为了实现上述目标,本发明采用如下的技术方案:
一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒,包含磁分离试剂、酶反应物、底物溶液、稀释液、缓冲液、校准品、质控品和清洗液,所述磁分离试剂为含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球,所述酶反应物为含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体,所述底物溶液为酶促化学发光底物溶液,所述校准品及质控品为含有Lp-PLA2抗原的BSA蛋白溶液。
前述的一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒,所述稀释液为含有BSA的溶液。
前述的一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒,所述缓冲液为含有Tris的溶液。
前述的一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒,所述清洗液为含有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液。
前述的一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒,所述的Lp-PLA2试剂盒检测浓度为0.1—1600ng/mL。
一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
步骤一,磁分离试剂的制备
(1)制备MES溶液;
(2)取表面含羧基活性基团的磁微粒,加入活化剂,25℃混匀2—4小时,用MES溶液洗涤后用MES溶液重悬,加入Lp-PLA2抗体,37℃混匀2—4小时,加入缓冲液于37℃封闭1小时,然后用缓冲液洗涤磁珠,并用缓冲液制成磁分离试剂溶液;
步骤二,酶反应物的制备
(1)将抗Lp-PLA2抗体溶于PBS溶液中,加入活化剂,20℃放置30—60分钟后加入甘氨酸终止反应,20℃静置3—5分钟,通过层析柱除去活化剂,收集蛋白峰,在活化后的抗体溶液中加入DTT和PBS溶液,混匀后室温放置30—60分钟,通过层析柱除去游离的DTT,收集蛋白峰;
(2)将碱性磷酸酶ALP溶于EDTA和Tris-HCl溶液中,加入Traunt试剂,室温放置40—60分钟,通过层析柱除去活化剂,收集蛋白峰;
(3)将(1)和(2)的溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合,室温放置3—5小时,然后用层析柱分离纯化,收集第一和第二峰,除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶,将产物保存在4℃;
步骤三,底物溶液的制备
称取Tris、NaCl、Na2SO3和Proclin-300,用纯化水溶解,pH值调整到7.8—8.2之间,加入发光底物后,过滤收集滤液,用纯化水定容,混匀后即得;
步骤四,稀释液的制备
称取NaCl和BSA,量取Proclin-300加纯化水溶解,混合定容,pH值调制7.2—7.6之间,完全溶解后,过滤,贴好标签于4℃冷库贮存;
步骤五,缓冲液的制备
取Tris和NaCl,量取Proclin-300用纯化水溶解,混合待完全溶解,调整pH到7.2—7.6之间,称取阻断剂溶于上述溶液中定容,待完全溶解后,过滤即得;
步骤六,校准品和质控品的制备
将高纯度Lp-PLA2抗原称重后用稀释液溶解分装制成Lp-PLA2的校准品与质控品,校准品浓度分别为在1ng/mL——1600ng/mL之间按浓度差取6个值;
步骤七,清洗液的制备
称取Tris和NaCl,称取吐温20加纯化水,完全溶解后与Tris和NaCl混合,量取Proclin-300加纯化水完全溶解后倒入上述混合液中,用纯化水定容,PH调在7.2—7.6之间,过滤即得。
前述的一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备方法,步骤二中所述的酶反应物稀释液配制方法为:Tris、NaCl、叠氮钠,用纯化水溶解,调整pH值至7.5,加入吐温20、BSA,定容,过滤,于4℃保存。
一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒的操作方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,加样与免疫反应
在试管中加入Lp-PLA2待测样本、校准品和质控品,然后依次加入酶反应物、磁分离试剂和缓冲液,用多管混匀器轻轻振荡1分钟后,37℃水浴30分钟;
步骤二,洗涤
反应试管放置在磁分离器上,使磁微粒在磁场中沉降2分钟,缓缓倒转分离器,倒去上清液,并除去黏在管壁上的液滴;
步骤三,每支试管加入清洗液,震荡30秒使磁微粒充分混悬,再次使磁微粒在磁场中沉降,去除上清液;
步骤四,重复步骤二与步骤三2次;
步骤五,加底物溶液
每管加入底物溶液。37℃混匀后1分钟内检测;
步骤六,读值
在分光光度计或发光强度检测仪上读取吸光度或发光强度值。
本发明工作原理:磁分离酶联免疫技术采用磁粒为包被固相,37℃孵育后,磁粒在液相中与免疫复合物反应,磁性微粒上结合的Lp-PLA2抗体与酶标抗体分别与Lp-PLA2抗原的不同表位结合,反应形成双抗夹心复合物。在外加磁场中直接沉淀,倒去上清液后清洗沉淀的复合物,然后加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解发出光子,形成发光反应,使用发光仪检测反应的发光强度,根据标准曲线即可算出样品中的Lp-PLA2含量。在试剂盒检测范围内,发光强度与样本中的Lp-PLA2浓度成正比。
本发明的有益之处在于:本发明Lp-PLA2定量测定试剂盒运用磁微粒分离酶联免疫技术,提供了一种接近均相的反应体系,与现有化学发光法以及普通酶联免疫法相比,本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性,并达到了较佳的性能参数。与普通酶联免疫技术相比,运用本试剂盒可以在1小时内完成所有检测过程,缩短了临床检测时间。与化学发光法相比,本试剂盒不需要特殊的全自动化学发光仪器,可以在普通分光光度计或发光检测仪上开展,极大的降低了临床开展本检测的成本。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备实施例一:
一磁分离试剂(含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球)的制备
(1)0.1mol/L的pH4.5的MES溶液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)制备:
称取MES19.52g,Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解,调节pH至4.5;加纯化水定容到1L,采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
(2)取磁微粒(表面含“羧基COOH-”活性基团)100mg用戊二醛活化,25℃混匀2小时,用0.1mol/L MES,pH4.5溶液10mL洗涤3次,磁微粒用该溶液1mL重悬;加入2mg Lp-PLA2抗体,37℃混合均匀2小时;之后加入等体积0.01mol/L PBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37°封闭1小时;最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/LPBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次,并用该溶液制成磁分离试剂溶液。
二酶反应物(含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体)的制备
(1)将2.5mg抗Lp-PLA2抗体溶于0.01mol/L PBS PH7.4溶液中;加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL,20℃放置30分钟后加入甘氨酸终止反应;20℃静置3分钟;通过SephadexG25柱子除去活化剂,收集蛋白峰;每毫升活化的抗体溶液中加入0.5mL0.05mol/mL DTT(二硫苏糖醇)0.01mol/L PBS PH7.4溶液,混匀后,室温放置30分钟;通过SephadexG25柱子除去游离的二硫苏糖醇,收集蛋白峰。
(2)将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/L EDTA20mmol/L Tris-HCLPH8.0溶液中,溶度5mg/mL,加入0.10mg/mL Traunt试剂(巯基活化试剂)室温放置40分钟,通过SephadexG25柱子除去活化剂,收集蛋白峰;
(3)将(1)和(2)溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合,室温放置3小时,然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化,收集第一和第二峰,除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶,将产物保存在4℃。
将上述Lp-PLA2-ALP连接物用酶反应物稀释液稀释到1-5ug/mL,使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。
酶反应物稀释液配置方法:Tris12.5g,氯化钠8.5g,叠氮钠1g,加纯化水至600mL,调整pH值至7.5。加吐温201mL,BSA10g,加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤,于4℃保存。
三底物溶液(酶促化学发光底物溶液)的制备
称取Tris2.4g、NaCl6.4g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2mL于1000mL烧杯中;量筒量取700mL纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,pH值调整到7.8;加入250mL发光底物鲁米诺(Luminol-Phos)后,用0.2μm滤器过滤收集滤液,用纯化水定容至1L,混匀后即得。
四稀释液的制备
称取NaCl9.0g和BSA60g于1L的烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.5mL加10mL纯化水溶解,倒入上述烧杯中;最后定容1L,pH值调至7.2;待完全溶解后,用0.2μm滤器过滤,贴好标签于4℃冷库贮存(有效期1年)。
五缓冲液的制备
取Tris1.56g和NaCl4.24g于1L烧杯中,取0.2mL Proclin-300于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L烧杯中;取800mL纯化水于上述1L容器中,充分搅拌直至完全溶解,调整pH到7.2;称取阻断剂(优选Mak33)0.9g溶于上述溶液中;最后定容至1L,完全溶解后,用0.2μm滤器过滤即得。
六校准品与质控品的制备
将高纯度Lp-PLA2抗原称重后用稀释液溶解分装制成Lp-PLA2的校准品与质控品。校准品浓度分别为1.5ng/mL,6ng/mL,24ng/mL,96ng/mL,384ng/mL,1536ng/mL,质控品浓度分别为6ng/mL,384ng/mL。
七清洗液的制备
称取Tris12.5g和NaCl325.5g于1000mL烧杯中;称取5g吐温20于100mL容器中加20mL水使其完全溶解后,倒入烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.2mL于盛有10mL纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入烧杯中;用量筒量取800mL纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,溶液PH调至7.2;最后用纯化水定容1000mL,完全溶解后用0.2μm孔径的过滤器过滤即得。
Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备实施例二:
一磁分离试剂(含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球)的制备
(1)0.1mol/L的pH4.5的MES溶液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)制备:
称取MES19.52g,Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解,调节pH至4.5;加纯化水定容到1L,采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
(2)取磁微粒(表面含“羧基COOH-”活性基团)100mg用戊二醛活化,25℃混匀3小时,用0.1mol/L MES,pH4.5溶液10mL洗涤3次,磁微粒用该溶液1mL重悬;加入2mg Lp-PLA2抗体,37℃混合均匀3小时;之后加入等体积0.01mol/L PBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37°封闭1小时;最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/LPBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次,并用该溶液制成磁分离试剂溶液。
二酶反应物(含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体)的制备
(1)将2.5mg抗Lp-PLA2抗体溶于0.01mol/L PBS PH7.4溶液中;加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL,20℃放置45分钟后加入甘氨酸终止反应;20℃静置4分钟;通过SephadexG25柱子除去活化剂,收集蛋白峰;每毫升活化的抗体溶液中加入0.5mL0.05mol/mL DTT(二硫苏糖醇)0.01mol/L PBS PH7.4溶液,混匀后,室温放置45分钟;通过SephadexG25柱子除去游离的二硫苏糖醇,收集蛋白峰。
(2)将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/L EDTA20mmol/L Tris-HCLPH8.0溶液中,溶度5mg/mL,加入0.10mg/mL Traunt试剂(巯基活化试剂)室温放置50分钟,通过SephadexG25柱子除去活化剂,收集蛋白峰;
(3)将(1)和(2)溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合,室温放置4小时,然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化,收集第一和第二峰,除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶,将产物保存在4℃。
将上述Lp-PLA2-ALP连接物用酶反应物稀释液稀释到1-5ug/mL,使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。
酶反应物稀释液配置方法:Tris12.5g,氯化钠8.5g,叠氮钠1g,加纯化水至600mL,调整pH值至7.5。加吐温201mL,BSA10g,加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤,于4℃保存。
三底物溶液(酶促化学发光底物溶液)的制备
称取Tris2.4g、NaCl6.4g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2mL于1000mL烧杯中;量筒量取700mL纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,pH值调整到8.0;加入250mL发光底物鲁米诺(Luminol-Phos)后,用0.2μm滤器过滤收集滤液,用纯化水定容至1L,混匀后即得。
四稀释液的制备
称取NaCl9.0g和BSA60g于1L的烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.5mL加10mL纯化水溶解,倒入上述烧杯中;最后定容1L,pH值调至7.4;待完全溶解后,用0.2μm滤器过滤,贴好标签于4℃冷库贮存(有效期1年)。
五缓冲液的制备
取Tris1.56g和NaCl4.24g于1L烧杯中,取0.2mL Proclin-300于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L烧杯中;取800mL纯化水于上述1L容器中,充分搅拌直至完全溶解,调整pH到7.4;称取阻断剂(优选Mak33)0.9g溶于上述溶液中;最后定容至1L,完全溶解后,用0.2μm滤器过滤即得。
六校准品与质控品的制备
将高纯度Lp-PLA2抗原称重后用稀释液溶解分装制成Lp-PLA2的校准品与质控品。校准品浓度分别为1ng/mL,5ng/mL,25ng/mL,125ng/mL,625ng/mL,1250ng/mL,质控品浓度分别为5ng/mL,525ng/mL。
七清洗液的制备
称取Tris12.5g和NaCl325.5g于1000mL烧杯中;称取5g吐温20于100mL容器中加20mL水使其完全溶解后,倒入烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.2mL于盛有10mL纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入烧杯中;用量筒量取800mL纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,溶液PH调至7.4;最后用纯化水定容1000mL,完全溶解后用0.2μm孔径的过滤器过滤即得。
Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备实施例三:
一磁分离试剂(含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球)的制备
(1)0.1mol/L的pH4.5的MES溶液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)制备:
称取MES19.52g,Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解,调节pH至4.5;加纯化水定容到1L,采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
(2)取磁微粒(表面含“羧基COOH-”活性基团)100mg用戊二醛活化,25℃混匀4小时,用0.1mol/L MES,pH4.5溶液10mL洗涤3次,磁微粒用该溶液1mL重悬;加入2mg Lp-PLA2抗体,37℃混合均匀4小时;之后加入等体积0.01mol/L PBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37°封闭1小时;最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/LPBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次,并用该溶液制成磁分离试剂溶液。
二酶反应物(含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体)的制备
(1)将2.5mg抗Lp-PLA2抗体溶于0.01mol/L PBS PH7.4溶液中;加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL,20℃放置60分钟后加入甘氨酸终止反应;20℃静置5分钟;通过SephadexG25柱子除去活化剂,收集蛋白峰;每毫升活化的抗体溶液中加入0.5mL0.05mol/mL DTT(二硫苏糖醇)0.01mol/L PBS PH7.4溶液,混匀后,室温放置60分钟;通过SephadexG25柱子除去游离的二硫苏糖醇,收集蛋白峰。
(2)将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/L EDTA20mmol/L Tris-HCLPH8.0溶液中,溶度5mg/mL,加入0.10mg/mL Traunt试剂(巯基活化试剂)室温放置60分钟,通过SephadexG25柱子除去活化剂,收集蛋白峰;
(3)将(1)和(2)溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合,室温放置5小时,然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化,收集第一和第二峰,除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶,将产物保存在4℃。
将上述Lp-PLA2-ALP连接物用酶反应物稀释液稀释到1-5ug/mL,使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。
酶反应物稀释液配置方法:Tris12.5g,氯化钠8.5g,叠氮钠1g,加纯化水至600mL,调整pH值至7.5。加吐温201mL,BSA10g,加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤,于4℃保存。
三底物溶液(酶促化学发光底物溶液)的制备
称取Tris2.4g、NaCl6.4g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2mL于1000mL烧杯中;量筒量取700mL纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,pH值调整到8.2;加入250mL发光底物鲁米诺(Luminol-Phos)后,用0.2μm滤器过滤收集滤液,用纯化水定容至1L,混匀后即得。
四稀释液的制备
称取NaCl9.0g和BSA60g于1L的烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.5mL加10mL纯化水溶解,倒入上述烧杯中;最后定容1L,pH值调至7.6;待完全溶解后,用0.2μm滤器过滤,贴好标签于4℃冷库贮存(有效期1年)。
五缓冲液的制备
取Tris1.56g和NaCl4.24g于1L烧杯中,取0.2mL Proclin-300于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L烧杯中;取800mL纯化水于上述1L容器中,充分搅拌直至完全溶解,调整pH到7.6;称取阻断剂(优选Mak33)0.9g溶于上述溶液中;最后定容至1L,完全溶解后,用0.2μm滤器过滤即得。
六校准品与质控品的制备
将高纯度Lp-PLA2抗原称重后用稀释液溶解分装制成Lp-PLA2的校准品与质控品。校准品浓度分别为2ng/mL,7ng/mL,24.5ng/mL,85.75ng/mL,300ng/mL,1050ng/mL,质控品浓度分别为7ng/mL,1050ng/mL。
七清洗液的制备
称取Tris12.5g和NaCl325.5g于1000mL烧杯中;称取5g吐温20于100mL容器中加20mL水使其完全溶解后,倒入烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.2mL于盛有10mL纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入烧杯中;用量筒量取800mL纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,溶液PH调至7.6;最后用纯化水定容1000mL,完全溶解后用0.2μm孔径的过滤器过滤即得。
Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备实施例四:
一磁分离试剂(含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球)的制备
(1)0.1mol/L的pH5的MES溶液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)制备:
称取MES19.52g,Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解,pH调节至5.0;加纯化水定容到1L,采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
(2)取磁微粒(表面含“羧基COOH-”活性基团)100mg用戊二醛活化,25℃混匀3小时,用0.1mol/L MES,pH5溶液10mL洗涤3次,磁微粒用该溶液1mL重悬;加入2mg Lp-PLA2抗体,37℃混合均匀3小时;之后加入等体积0.01mol/L PBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37°封闭1小时;最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/L PBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次,并用该溶液制成磁分离试剂溶液。
二酶反应物(含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体)的制备
(1)将2.5mg抗Lp-PLA2抗体溶于0.01mol/L PBS PH7.4溶液中;加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane〃HCl(2IT)溶液20μL,20℃放置30分钟后加入甘氨酸终止反应;20℃静置3分钟;通过SephadexG25柱子除去活化剂,收集蛋白峰;每毫升活化的抗体溶液中加入0.5mL0.05mol/mL DTT(二硫苏糖醇)0.01mol/L PBS PH7.4溶液,混匀后,室温放置30分钟;通过SephadexG25柱子除去游离的二硫苏糖醇,收集蛋白峰。
(2)将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/L EDTA20mmol/L Tris-HCLPH8.0溶液中,溶度5mg/mL,加入0.10mg/mL Traunt试剂(巯基活化试剂)室温放置1小时,通过SephadexG25柱子除去活化剂,收集蛋白峰;
(3)将(1)和(2)溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合,室温放置3小时,然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化,收集第一和第二峰,除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶,将产物保存在4℃。
将上述Lp-PLA2-ALP连接物用酶反应物稀释液稀释到1-5ug/mL,使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。
酶反应物稀释液配置方法:Tris12.5g,氯化钠8.5g,叠氮钠1g,加纯化水至600mL,调整pH值至7.5。加吐温201mL,BSA10g,加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤,于4℃保存。
三底物溶液(酶促化学发光底物溶液)的制备
称取Tris2.4g、NaCl6.4g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2mL于1000mL烧杯中;量筒量取700mL纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,pH值调整到7.8;加入250mL发光底物鲁米诺(Luminol-Phos)后,用0.2μm滤器过滤收集滤液,用纯化水定容至1L,混匀后即得。
四稀释液的制备
称取NaCl9.0g和BSA60g于1L的烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.5mL加10mL纯化水溶解,倒入上述烧杯中;最后定容1L,pH值调至7.2;待完全溶解后,用0.2μm滤器过滤,贴好标签于4℃冷库贮存(有效期1年)。
五缓冲液的制备
取Tris1.56g和NaCl4.24g于1L烧杯中,取0.2mL Proclin-300于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L烧杯中;取800mL纯化水于上述1L容器中,充分搅拌直至完全溶解,调整pH到7.2;称取阻断剂(优选Mak33)0.9g溶于上述溶液中;最后定容至1L,完全溶解后,用0.2μm滤器过滤即得。
六校准品与质控品的制备
将高纯度Lp-PLA2抗原称重后用稀释液溶解分装制成Lp-PLA2的校准品与质控品。校准品浓度分别为1ng/mL,20ng/mL,100ng/mL,200ng/mL,500ng/mL,1500ng/mL,质控品浓度分别为20ng/mL,500ng/mL。
七清洗液的制备
称取Tris12.5g和NaCl325.5g于1000mL烧杯中;称取5g吐温20于100mL容器中加20mL水使其完全溶解后,倒入烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.2mL于盛有10mL纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入烧杯中;用量筒量取800mL纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,溶液PH调至7.2;最后用纯化水定容1000mL,完全溶解后用0.2μm孔径的过滤器过滤即得。
Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备实施例五:
一磁分离试剂(含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球)的制备
(1)0.1mol/L的pH5的MES溶液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)制备:
称取MES19.52g,Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解,pH调节至5.0;加纯化水定容到1L,采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
(2)取磁微粒(表面含“羧基COOH-”活性基团)100mg用戊二醛活化,25℃混匀5小时,用0.1mol/L MES,pH5溶液10mL洗涤3次,磁微粒用该溶液1mL重悬;加入2mg Lp-PLA2抗体,37℃混合均匀5小时;之后加入等体积0.01mol/L PBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37°封闭1小时;最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/L PBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次,并用该溶液制成磁分离试剂溶液。
二酶反应物(含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体)的制备
(1)将2.5mg抗Lp-PLA2抗体溶于0.01mol/L PBS PH7.4溶液中;加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL,20℃放置60分钟后加入甘氨酸终止反应;20℃静置5分钟;通过SephadexG25柱子除去活化剂,收集蛋白峰;每毫升活化的抗体溶液中加入0.5mL0.05mol/mL DTT(二硫苏糖醇)0.01mol/L PBS PH7.4溶液,混匀后,室温放置60分钟;通过SephadexG25柱子除去游离的二硫苏糖醇,收集蛋白峰。
(2)将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/L EDTA20mmol/L Tris-HCLPH8.0溶液中,溶度5mg/mL,加入0.10mg/mL Traunt试剂(巯基活化试剂)室温放置1小时,通过SephadexG25柱子除去活化剂,收集蛋白峰;
(3)将(1)和(2)溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合,室温放置4小时,然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化,收集第一和第二峰,除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶,将产物保存在4℃。
将上述Lp-PLA2-ALP连接物用酶反应物稀释液稀释到1-5ug/mL,使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。
酶反应物稀释液配置方法:Tris12.5g,氯化钠8.5g,叠氮钠1g,加纯化水至600mL,调整pH值至7.5。加吐温201mL,BSA10g,加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤,于4℃保存。
三底物溶液(酶促化学发光底物溶液)的制备
称取Tris2.4g、NaCl6.4g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2mL于1000mL烧杯中;量筒量取700mL纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,pH值调整到8.2;加入250mL发光底物鲁米诺(Luminol-Phos)后,用0.2μm滤器过滤收集滤液,用纯化水定容至1L,混匀后即得。
四稀释液的制备
称取NaCl9.0g和BSA60g于1L的烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.5mL加10mL纯化水溶解,倒入上述烧杯中;最后定容1L,pH值调至7.6;待完全溶解后,用0.2μm滤器过滤,贴好标签于4℃冷库贮存(有效期1年)。
五缓冲液的制备
取Tris1.56g和NaCl4.24g于1L烧杯中,取0.2mL Proclin-300于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L烧杯中;取800mL纯化水于上述1L容器中,充分搅拌直至完全溶解,调整pH到7.6;称取阻断剂(优选Mak33)0.9g溶于上述溶液中;最后定容至1L,完全溶解后,用0.2μm滤器过滤即得。
六校准品与质控品的制备
将高纯度Lp-PLA2抗原称重后用稀释液溶解分装制成Lp-PLA2的校准品与质控品。校准品浓度分别为10ng/mL,30ng/mL,90ng/mL,270ng/mL,810ng/mL,1620ng/mL,质控品浓度分别为30ng/mL,810ng/mL。
七清洗液的制备
称取Tris12.5g和NaCl325.5g于1000mL烧杯中;称取5g吐温20于100mL容器中加20mL水使其完全溶解后,倒入烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.2mL于盛有10mL纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入烧杯中;用量筒量取800mL纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,溶液PH调至7.6;最后用纯化水定容1000mL,完全溶解后用0.2μm孔径的过滤器过滤即得。
将本发明所得的Lp-PLA2定量检测试剂盒进行如下操作:
步骤一,加样与免疫反应
在试管中加入45μl LPPLA2待测样本、校准品和质控品,然后依次加入60μL酶反应物、30μL磁分离试剂和60μL缓冲液。用多管混匀器轻轻振荡1分钟后,37℃水浴30分钟;
步骤二,洗涤
反应试管放置在磁分离器上(所有试管都要求与磁分离器接触),使磁微粒在磁场中沉降2分钟,缓缓倒转分离器,倒去上清液,并除去黏在管壁上的液滴。
步骤三,每支试管加入200μL清洗液,震荡30秒使磁微粒充分混悬,再次使磁微粒在磁场中沉降,去除上清液。
步骤四,重复步骤二和步骤三2次;
步骤五,加底物溶液
每管加入200μL底物溶液。37℃混匀后1分钟内检测;
步骤六,读值
在分光光度计或发光强度检测仪上读取吸光度或发光强度值。
检测结果:
以本试剂实施例1为例制备出脂蛋白相关磷脂酶A2定量试剂盒,并以此检测200例盲样标本,得到以下试剂盒检测结果:
分析灵敏度:对20次零校准品的测定,取其2倍的平均偏差,其在标准曲线上对应的浓度即为分析灵敏度;本发明试剂盒分析灵敏度为0.1ng/mL。
精密性:同时评价批内和批间不精密度:每天做2个批次的测试,每批测试时,对同一样品作双份测量,共做20天。评估结束时共有40对,即80个测试结果。从40批次测量中双份结果的差值求出批内精密度。从所有80个数据计算出批间精密度。
本发明试剂盒:批内精密度CV%≤10.0%;批间精密度CV%≤15.0%;
线性范围:取本试剂实施例1,每点重复检测3次,得出本试剂盒标准曲线为:y=2.9931x-31.509,线性相关R2=0.9997。本发明试剂盒线性范围为0.1-3500ng/mL。图1为Lp-PLA2校准曲线。
又以本试剂盒与市售酶联免疫法试剂盒分别检测同一批40例标本,得出以下值,显示出了两者良好的相关性,见表1:
表140个样本ELISA法检测结果与本发明的检测结果对比
以上所述的仅是本发明的优选实施方案,对于本技术领城的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以作为若干的改进和调整,这些改进的调整也应视为本发明的保护范围。