CN107843733A - 一种妊娠相关血浆蛋白a的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

一种妊娠相关血浆蛋白a的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法。该试剂盒包括：偶联有妊娠相关血浆蛋白A捕获抗体的磁微粒、吖啶酯标记的妊娠相关血浆蛋白A检测抗体、妊娠相关血浆蛋白A校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。本发明试剂盒以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术。本发明建立的直接化学发光法灵敏度高、特异性强、准确快速，检测时间短，检测结果具有更高的准确性与重复性，该试剂盒可适用于各种发光检测仪器。

Description

一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及制 备方法
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术领域，具体是一种妊娠相关血浆蛋白A的免疫磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法。
背景技术
妊娠相关血浆蛋白A（Pregnancy-Associated Plasma Protein A，PAPP-A）是1974年从孕妇血清中分离出来的一种大分子糖蛋白化合物，由胎盘合体滋养 层和蜕膜细胞产生。其结构是由2个PAPP-A分子与2个嗜伊红主要碱性蛋白前体（proform of eosinphilmajor basic protein，proMBP）组成的异构聚合体，相对分子质量为474000。在流产、先兆流产、宫外孕及畸形胎儿的孕妇外周血中PAPP-A的含量均低于同孕周的正常孕妇，早孕阶段低水平的PAPP-A不仅可筛查染色体异常的胎儿，尤其对唐氏综合征胎儿预测有一定意义。
唐氏综合征(Down Syndrome，DS)是常见的严重危害胎儿的出生缺陷疾病。唐氏综合征给家庭和社会带来了沉重的经济负担。由于产前血清标志物筛查具有无创伤性，能最大限度减少羊膜腔穿刺或绒毛膜取样所造成的创伤，因而引起了国内外学者的高度关注。近年来，最受到关注的标志物之一就是妊娠相关血浆蛋白A，妊娠相关血浆蛋白A可作为妊娠唐氏综合征胎儿产前筛查的一个独立的标志物。PAPP-A作为一种无创性产前诊断的新趋势，可用于妇产科临床， 其优点是对胎儿无创，尤其在预测流产、宫外孕及胎儿畸形等方面有较大的价值和意义，对孕期多种合并症进行筛查监护，有效地降低异常新生儿的出生，值得临床推广和研究。
到目前为止，用于检测妊娠相关血浆蛋白A的方法主要有：免疫电泳法、放射免疫法、酶联免疫法（ELISA）以及时间分辨荧光免疫法。火箭免疫电泳、放射火箭免疫电泳是最早应用于检测PAPP-A的方法，但其特异性、灵敏度和重复性都不适宜于作定量分析及大批量标本检测，很快被其它方法取代。放射免疫法虽然特异性和灵敏度作为定量测定的可靠方法已为大家所公认，然而其是一种竞争性免疫分析法，抗原和抗体的性质均决定了检测的特异性，因此需要纯化的PAPP-A作为标准和示踪剂，但PAPP-A的提纯过程是相当复杂的，在提纯或碘处理过程中可引起分子结构改变或因同种异构化合物的存在而影响结果，此外，放免法由于碘标示踪剂存在固有半衰期，造成了试剂的有效期短，而且放免法对设备的要求特殊，使它在一般实验室开展受到限制。酶联免疫吸附测定（ELISA）检测技术是利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的靶分子，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。该方法虽然检测价格低廉、快速，但是酶标法本身受固相反应的制约，酶标显色的稳定性也易受温度和酸碱度变化的影响，所用底物大部分为有毒物质或致癌物，且其灵敏度也不够，只适用于微量物质的检测和鉴定，已经不能满足大型医院快速定量检测的要求。CN1210267A（1999年3月）公开了一种酶联定量检测妊娠相关血浆蛋白A的试剂盒，该试剂盒的主要缺点是其采用了抗PAPP-A/proMBP抗体，是以PAPP-A/proMBP复合物形式存在的血清中分离获得的抗原制备的，而在整个妊娠过程中，血清proMBP的水平大大超过了PAPP-A，使得PAPP-A的测定结果不能真实反映其在血液中的水平，检测准确性降低。而时间分辨荧光免疫法准确性及特异性较高，但速度慢，且设备昂贵，成本相对较高，不易在基层医疗机构推广使用。因此，建立一种有效、快速、简单、灵敏、抗干扰性高的检测妊娠相关血浆蛋白A的方法具有十分重要的意义。
本发明采用方法为直接化学发光法，采用吖啶酯作为化学发光标记物具有明显优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。本发明建立的磁微粒化学发光法灵敏度高、特异性强、准确快速、检测时间短、检测结果具有更高的准确性与重复性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法，本发明所提供的磁微粒化学发光方法检测妊娠相关血浆蛋白A的试剂盒，采用磁微粒偶联妊娠相关血浆蛋白A捕获抗体，吖啶酯标记妊娠相关血浆蛋白A检测抗体。试剂盒还包括妊娠相关血浆蛋白A校准品、上述吖啶酯作用的化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。
作为本发明进一步的方案，所述的磁微粒可直接与妊娠相关血浆蛋白A捕获抗体偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记妊娠相关血浆蛋白A捕获抗体。
作为本发明进一步的方案，所述磁微粒的表面修饰基团为一种或多种活性功能基团，包括但不限于羧基、氨基、对甲苯磺酰基或链霉亲和素-生物素。
作为本发明进一步的方案，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯标记的是妊娠相关血浆蛋白A检测抗体。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯标记妊娠相关血浆蛋白A检测抗体的缓冲液是pH 8.0-11.0、浓度为0.01-0.20 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
作为本发明进一步的方案，所述的捕获抗体与检测抗体均为单克隆抗体。
作为本发明进一步的方案，所述的校准品是用含有0.5-5.0% BSA的Tris或PBS或HEPES缓冲液为基质，加入妊娠相关血浆蛋白A纯品配置而成，校准品形态为液态。
作为本发明进一步的方案，所述的妊娠相关血浆蛋白A校准品溶液浓度分别为：0mIU/L、1 mIU/L、10 mIU/L、100 mIU/L、1000 mIU/L、10000 mIU/L。
作为本发明进一步的方案，所述的化学发光预激发液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2的质量分数为0.01-5.0%，HNO3的浓度为0.01-1.0 mol/L。
作为本发明进一步的方案，所述的化学发光激发液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为0.01-2.0%，NaOH的浓度为0.05-1.0 mol/L。
作为本发明进一步的方案，所述的清洗液为：pH 7.0-9.0、浓度为5.0-50.0 mmol/L的Tris或HEPES或其它溶液，其中含有质量分数为0.01-0.25%的Tween-20。
本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与吖啶酯发光的高度灵敏性结合起来，利用吖啶酯捕捉反应产生的光子以检测产物浓度。
本发明的优点在于采用双抗体夹心法联合磁微粒化学发光技术，测定妊娠相关血浆蛋白A含量。吖啶酯作为标记物的直接化学发光具有明显优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。
具体实施方式
本发明提供一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加明确、清楚，以下对本发明进一步详细说明。
本发明提供一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法，其中，本发明所提供的磁微粒化学发光方法检测妊娠相关血浆蛋白A的试剂盒，采用磁微粒偶联妊娠相关血浆蛋白A捕获抗体，吖啶酯标记妊娠相关血浆蛋白A检测抗体。试剂盒还包括妊娠相关血浆蛋白A校准品、上述吖啶酯作用的化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。
具体地，本发明所述的磁颗粒偶联悬浮液由妊娠相关血浆蛋白A捕获抗体偶联的磁颗粒和试剂缓冲液组成，其中妊娠相关血浆蛋白A捕获抗体的浓度为0.1-2.0 mg/mL。
具体地，本发明所述磁珠的内核为四氧化三铁，所述的磁微粒可直接与妊娠相关血浆蛋白A捕获抗体偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记妊娠相关血浆蛋白A捕获抗体。磁珠使用前固相的不完全沉降会影响精确度，因此选择时应选分散性好，沉降速度慢的磁珠。
具体地，本发明在制备磁微粒混悬液时，所述偶联抗体缓冲液为pH 5.0-6.0，浓度为20-200 mmol/L 的MES缓冲液。
具体地，本发明在制备磁微粒混悬液时，所述封闭缓冲液为含1%BSA的缓冲液。
具体地，本发明在制备标记液相试剂时，所述标记缓冲液是pH 8.0-11.0、浓度为0.01-0.20 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
具体地，本发明所述校准品是用含有0.5-5.0% BSA的Tris或PBS或HEPES缓冲液为基质，加入妊娠相关血浆蛋白A纯品配置而成，校准品形态为液态。
具体地，本发明所述的化学发光预激发液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2的质量分数为0.01-5.0%，HNO3的浓度为0.01-1.0 mol/L。
具体地，本发明所述化学发光激发液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为0.01-2.0%，NaOH的浓度为0.05-1.0 mol/L。
具体地，本发明所述清洗液为：pH 7.0-9.0、浓度为5.0-50.0 mmol/L的Tris或HEPES或其它溶液，其中含有质量分数为0.01-0.25%的Tween-20。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：所述的一种检测妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光试剂盒的组建及制备方法，包括以下步骤：
1. 试剂盒的组建：
组建一种检测妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光试剂盒，使其含有下列组分：
磁微粒偶联的妊娠相关血浆蛋白A单克隆抗体；
吖啶酯标记的另一株妊娠相关血浆蛋白A单克隆抗体；
妊娠相关血浆蛋白A系列标准品溶液；
化学发光预激发液A和化学发光激发液B；
清洗液。
2. 偶联有妊娠相关血浆蛋白A单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备
（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入200 μL浓度为0.1 mol/L的MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入200μL的MES（pH为6.0）缓冲液，涡旋。
（2）加入15 μg的妊娠相关血浆蛋白A单克隆抗体，使羧基与抗体的摩尔比为150:1，涡旋，旋转反应管，室温孵育30 min。
（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC，于旋转反应器上涡旋，室温孵育2h。
（4）取200 μL含1%BSA的甘氨酸缓冲液（浓度为50 mmol/L）进行封闭，时间为1h。
（5）去上清，加入200 μL的清洗缓冲液（TBS+0.05%Tween-20），洗涤3次。
（6）将上述制备好的磁微粒混悬液置于500 μL保存液（300 mmol/L甘氨酸、2%甘油、5%蔗糖）中，2-8℃保存。
3. 吖啶酯标记的妊娠相关血浆蛋白A单克隆抗体液相试剂的制备
（1）纯化妊娠相关血浆蛋白A单克隆抗体：将100 μg妊娠相关血浆蛋白A单克隆抗体置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1 L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液更换5次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH 9.8、浓度为50 mmol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
（2）称取1.7 mg的吖啶酯NSP-DMAE-NHS，溶于447 μL无水二甲基甲酰胺（DMF）中，配成6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液。
（3）将经透析过后的妊娠相关血浆蛋白A单克隆抗体溶液置于500 μL离心管内，加入200 μL标记缓冲液，然后加入759 μL、6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液（避光反应）使吖啶酯与妊娠相关血浆蛋白A单克隆抗体的摩尔比为7.4:1，振荡混匀，室温下反应1 h，加入100 μL 浓度为10 g/L的赖氨酸，静置15 min，使标记反应终止。
（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ab与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液pH 6.3、浓度为0.1mol/L的PBS平衡并淋洗层析柱。
（5）分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280nm吸光度值。
（6）收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1% BSA后分装冰冻保存。
4. 妊娠相关血浆蛋白A校准品的制备
用含有2% BSA的Tris-HCl 缓冲液将妊娠相关血浆蛋白A纯品配制成标示浓度为0mIU/L、1 mIU/L、10 mIU/L、100 mIU/L、1000 mIU/L、10000 mIU/L共6个浓度的校准品梯度值。
5. 化学发光激发液A、B的制备
（1）化学发光预激发液A由H2O2和HNO3组成。其中，其中H2O2的质量分数为1.5%，HNO3的浓度为0.1 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
（2）化学发光激发液B由Triton X-100 和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100的质量分数为1.0%，NaOH的浓度为0.4 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
6. 清洗液的制备
称量3.05g Tris，8.775g NaCl至1000 mL的烧杯中，加入1mL质量分数为0.05% Tween-20，搅拌混匀，定容，将pH调至7.6后保存备用。
实施例2：利用所述的妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒进行检测的步骤为：
（1）在反应杯中加入待测样本50 μL，再加入磁颗粒偶联悬浮液150 μL，振荡混匀，37℃孵育8 min。
（2）分离，清洗3次，将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（3）向反应杯中加入吖啶酯标记物150 μL，振荡混匀，37℃孵育7 min。
（4）分离，清洗3次，将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（5）加入100 μL化学发光预激发液A，1 s后加入100 μL化学发光激发液B，测量其相对发光强度，样本中妊娠相关血浆蛋白A的含量与其相对发光强度成一定比例关系。
实施例3：试剂盒的性能指标
（1）分析灵敏度
用试剂盒中0 mIU/L校准品作为待测样本，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值（相对发光值），计算其平均值（M）和标准差（SD），得出 M+2SD 所对应RLU值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将 M+2SD 的RLU 值带入上述方程中，求出对应的浓度值。按检测方案中最低检测限检测方法，重复3次实验，最后求出本试剂盒对妊娠相关血浆蛋白A的分析灵敏度为0.3 mIU/L。
（2）精密度
取妊娠相关血浆蛋白A检测试剂盒测试浓度为(1600.0±160.0) mIU/L和(4000.0±400.0) mIU/L的样本，每个浓度重复测试10次，计算试剂盒精密度，结果表明该试剂盒CV均小于5%。
（3）稳定性
取妊娠相关血浆蛋白A检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间1，3，5，7，9，11，12，13，14，15个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示妊娠相关血浆蛋白A检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为12个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为30天。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：包括偶联有妊娠相关血浆蛋白A捕获抗体的磁微粒混悬液、吖啶酯标记的妊娠相关血浆蛋白A检测抗体、校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。
2.根据权利要求1所述的一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的磁珠的内核为四氧化三铁或三氧化二铁，磁微粒的表面修饰基团为一种或多种活性功能基团，包括但不限于羧基、氨基、对甲苯磺酰基或链霉亲和素-生物素。
3.根据权利要求1所述的一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的磁微粒可直接与妊娠相关血浆蛋白A捕获抗体偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记妊娠相关血浆蛋白A捕获抗体。
4.根据权利要求1所述的一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
5.根据权利要求1所述的一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的吖啶酯标记的是妊娠相关血浆蛋白A检测抗体。
6.根据权利要求1所述的一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的捕获抗体与检测抗体均为单克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的校准品是以含有BSA的缓冲液为基质，加入妊娠相关血浆蛋白A纯品配置而成的系列浓度梯度的校准品溶液。
8.根据权利要求1所述的一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成，化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。
9.根据权利要求1所述的一种妊娠相关血浆蛋白A的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，包括以下步骤：在反应杯中加入一定量的待测样本，再加入磁颗粒偶联悬浮液，混匀，37℃孵育，加入清洗液去掉上清；之后按照一定的比例加入吖啶酯标记物，37℃孵育，加入清洗液去掉上清，加入化学发光预激发液A和激发液B，测定相应的发光强度RLU/s。
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CN113075406A (zh) * 2021-04-15 2021-07-06 江苏优尼泰克生物科技有限公司 用于妊娠相关性血浆蛋白a检测的组合物和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法

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