CN110244063A - 血清淀粉样蛋白a检测用试剂盒、其制备方法以及血清淀粉样蛋白a的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒、其制备方法以及血清淀粉样蛋白A的检测方法。该试剂盒包括校准品、磁微粒试剂、标记抗体试剂、清洗液、激发物和样本稀释液。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒,具体而言涉及一种血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒、其制备方法以及血清淀粉样蛋白A的检测方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白是由104个氨基酸组成的多肽,其在天然状态时的相对分子质量约为12000~14000,血清的基因位于第11号染色体是近年发现的一种敏感的炎症标志物,是一种急性期反应蛋白,在急慢性炎性反应时,浓度明显升高,可达正常的1000倍以上,同时在细菌和病毒感染的早期均可明显升高,创伤、烧伤等应激状态下也会快速增高。
SAA联合检测CRP能提高对感染的诊断灵敏度。SAA在病毒感染性疾病中,SAA显著升高,CRP不升高,因此SAA可以作为诊断病毒感染的敏感指标;SAA联合CRP检测,可鉴别诊断细菌、病毒感染,又能提供新依据,可靠性更强,动态观察疗效并可指导临床用药;SAA联合CRP检测,有利于小儿感染性疾病(新生儿败血症、脓毒症)的早期诊断。
目前临床多采用ELISA和散射比浊法,这两种方法线性范围窄,灵敏度低,重复性差。
发明内容
已经鉴于前述问题做出本发明。本发明的目的在于提供一种可操作性强、重复性好并且灵敏度高的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒,并且提供其制备方法以及血清淀粉样蛋白A的检测方法。
本发明的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒包括校准品、磁微粒试剂、标记抗体试剂、清洗液、激发物和样本稀释液。
在本发明的试剂盒中,所述校准品包括在0~1000ng/mL范围内的6以上个不同浓度的血清淀粉样蛋白A校准品。
在本发明的试剂盒中,所述标记抗体试剂为吖啶酯类化合物标记的血清淀粉样蛋白A检测抗体,所述吖啶酯类化合物为选自吖啶酯、吖啶酯磺酰胺、吖啶酯甲苯磺酰胺、吖啶酯对甲基磺酰胺和吖啶酯三氟甲基磺酰胺中的任意一种,并且所述吖啶酯类化合物优选为吖啶酯。
在本发明的试剂盒中,所述磁微粒试剂为磁微粒包被的抗血清淀粉样蛋白A单克隆捕获抗体。
在本发明的试剂盒中,所述磁微粒的粒径为1~5μm,表面电荷密度为5~50μmol/g。
在本发明的试剂盒中,所述激发物包括第一激发物和第二激发物,并且所述第一激发物为硝酸过氧化氢水溶液,所述第二激发物为氢氧化钠水溶液。
在本发明的试剂盒中,所述样本稀释液中包含三羟甲基氨基甲烷和牛血清白蛋白。
本发明还提供一种血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒的制备方法,所述试剂盒包括校准品、磁微粒试剂、标记抗体试剂、清洗液、激发物和样本稀释液,该制备方法包括以下步骤:
样本稀释液配置步骤:配置所述样本稀释液,
校准品制备步骤:配置校准品稀释液,以所述校准品稀释液将纯化血清淀粉样蛋白A稀释为不同浓度的血清淀粉样蛋白A的校准品,
标记抗体试剂制备步骤:使标记物与检测抗体偶联反应,对反应后的混合液进行透析,随后进行稀释,以获得所述标记抗体试剂,
清洗液配置步骤,配制所述清洗液,
磁微粒试剂制备步骤:使磁微粒活化后,加入抗血清淀粉样蛋白A单克隆捕获抗体进行包被,随后进行磁性分离,以获得所述磁微粒试剂,以及
激发物制备步骤:配制所述激发物。
在本发明的制备方法中,在所述校准品制备步骤中,将所述纯化血清淀粉样蛋白A稀释为在0~1000ng/mL范围内的6个以上不同浓度的血清淀粉样蛋白A的校准品。
在本发明的制备方法中,在所述标记抗体试剂制备步骤中,所述标记物为吖啶酯类化合物,所述吖啶酯类化合物为选自吖啶酯、吖啶酯磺酰胺、吖啶酯甲苯磺酰胺、吖啶酯对甲基磺酰胺和吖啶酯三氟甲基磺酰胺中的一种,并且所述吖啶酯类化合物优选为吖啶酯。
在本发明的制备方法中,在所述标记抗体试剂制备步骤中,所述磁微粒的粒径为1~5μm,表面电荷密度为5~50μmol/g。
在本发明的制备方法中,在所述激发物制备步骤中,所述激发物溶液包括第一激发物溶液和第二激发物溶液,并且,所述第一激发物为硝酸过氧化氢水溶液,所述第二激发物为氢氧化钠水溶液。
在本发明的制备方法中,所述样本稀释液中包含三羟甲基氨基甲烷和牛血清白蛋白。
本发明还提供一种使用本发明的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒或本发明的制备方法所制备的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒来检测血清淀粉样蛋白A的方法,该检测方法包括以下步骤:
样本稀释步骤:以所述样本稀释液对样本进行稀释;
加样反应步骤:在反应管中加入校准品、稀释后的样本、标记抗体和所述磁微粒试剂,震荡混匀后,进行孵育;
清洗步骤:对孵育后的混合物进行磁性分离,加入清洗液,待所述磁微粒试剂吸附完全后,弃去上清;
检测步骤:加入激发物,检测并读取信号值;以及
计算步骤:对所述校准品的浓度和发光值进行logistic四参数拟合,通过所述样本的RLU值计算所述样本的浓度。
在本发明的检测肺炎支原体的方法中,在所述加样反应步骤中,孵育时间为5~15min。
根据本发明的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒,能够提供一种可操作性强、重复性好并且灵敏度高的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒,并且提供其制备方法以及血清淀粉样蛋白A的检测方法。
根据本发明的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒采用闪光型化学发光,在加入激发物后立即产生发光信号。另外,本发明的试剂盒采用磁微粒化学发光法引进磁微粒作为载体,更容易实现仪器的全自动化操作。并且本发明的试剂盒的磁微粒表面积大,用来包被抗体后,试剂盒的灵敏度更高。本发明的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒生产过程简单,易于放大生产,检测过程便捷,易于实现全自动化。
具体实施方式
在下面的具体描述中,为了说明的目的,为了提供公开的实施方式的透彻理解而阐述了大量具体细节。然而,显然可以在不具有这些具体细节的情况下实现一个以上的实施方式。
下面,将详细描述本发明的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒。
<试剂盒>
本发明的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒,包括校准品、磁微粒试剂、标记抗体试剂、清洗液、激发物和样本稀释液。
<校准品>
校准品用于在定量检测时对检测项目的校准,是具有在校准函数中用作独立变量值的参考物质。在本发明的试剂盒的制备过程中,通过使用校准品稀释液对纯化血清淀粉样蛋白A进行稀释,从而获得血清淀粉样蛋白A校准品。
在本发明的一个实施方式中,校准品稀释液中包含磷酸二氢钾和/或磷酸氢二钠。校准品稀释液中磷酸二氢钾的浓度优选为0.1~10g/L,磷酸氢二钠的浓度优选为1~50g/L。
在本发明的试剂盒中,校准品稀释液中还可以包含防腐剂。可以采用领域常规使用的各种防腐剂,例如Proclin-300和叠氮钠等,但优选为Proclin-300。并且,校准品稀释液中防腐剂的含量优选为0.05~0.1vol%。校准品稀释液配置好后,在2~8℃下储存备用。
使用配制好的校准品稀释液将纯化血清淀粉样蛋白A稀释至不同的浓度,从而获得血清淀粉样蛋白A的校准品。在本发明中,可以使用配制好的校准品稀释液将纯化血清淀粉样蛋白A稀释至不同的浓度在0~1000ng/mL范围内的6个以上不同浓度。
血清淀粉样蛋白A校准品配制好后,可以在2~8℃下储存备用。
<标记抗体试剂>
在本发明的一个实施方式中,使标记物与标记抗体反应,从而获得标记抗体试剂。
可以使用吖啶酯类化合物作为标记物。对吖啶酯类化合物的种类没有具体限制,例如,可以选择吖啶酯、吖啶酯磺酰胺、吖啶酯甲苯磺酰胺、吖啶酯对甲基磺酰胺和吖啶酯三氟甲基磺酰胺中的一种。但优选的,使用吖啶酯作为标记物。
例如,可以使用二甲基亚砜(DMSO)作为吖啶酯类化合物的溶剂。吖啶酯类化合物在其DMSO溶液中的浓度优选为1~5g/L。
另外,在吖啶酯类化合物与标记抗体反应时,可以添加硼酸钠溶液作为缓冲液。
吖啶酯类化合物与标记抗体的反应质量配比为20~200,优选为50~100,在本发明的一个实施方式中,吖啶酯类化合物与标记抗体的反应温度优选为36.5~37.5℃,反应时间优选为0.5~3h。
对吖啶酯类化合物与标记抗体反应后所获得的液体进行透析。关于透析的具体方法和条件,例如,可以采用0.15M pH7.4PBS进行透析。透析温度优选为3~6℃,透析次数优选为3~5次,每次透析时间优选为2~6h。在透析并获得的透析物后,使用三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲液进行稀释,并最终获得抗体标记试剂。稀释倍数优选为200~10000倍。
<磁微粒试剂>
在本发明的一个实施方式中,使磁微粒活化后,加入抗血清淀粉样蛋白A单克隆捕获抗体(以下有时简称为捕获抗体)进行包被,从而得到磁微粒试剂。
本发明所使用的磁微粒的粒径优选为1~5μm,表面电荷密度优选为5~50μmol/g。
可以使用市售的磁微粒,例如,JSR生产的MS160/Carboxyl磁微粒,其粒径为1.6μm,表面电荷密度为16μmol/g。
在对磁颗粒进行包被之前,需要先对磁微粒进行活化。例如,可以使用0.1M的磷酸盐缓冲液作为磁颗粒包被液。此外,可以在磷酸盐缓冲液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)。EDC的浓度优选为3~10g/L。
可以在离心管中对磁微粒进行活化。具体而言,依次将溶解有EDC的磷酸盐缓冲液和磁微粒加入离心管中,在优选36.5~37.5℃的温度下,活化15~60min。
对活化后的磁微粒需要进行磁性分离。磁性分离后以清洗液进行清洗。关于清洗次数,例如,可以对磁颗粒进行2~5次的清洗。
在对磁颗粒进行清洗后,向离心管中加入磷酸盐缓冲液和捕获抗体进行包被。关于包被条件,优选的,在36.5~37.5℃的温度下,包被1~5h。
可以通过用清洗液清洗3~5次来对包被后的磁微粒再次进行磁性分离和清洗步骤。向再次磁性分离的磁微粒中加入磁微粒存储液,混匀后在2~8℃下存储备用。可以使用Tris-HCL、NaCl和牛血清白蛋白的混合溶液作为磁微粒存储液。
<激发物>
在本发明的一个实施方式中,激发物包括第一激发物和第二激发物。
在本发明的一个实施方式中,第一激发物为硝酸过氧化氢水溶液。在该硝酸过氧化氢水溶液中,硝酸的浓度优选为5~15vol%,过氧化氢的浓度优选为5~15vol%。优选地,将配制后的第一激发物在2~5℃的温度下存储备用。
在本发明的一个实施方式中,第二激发物为氢氧化钠溶液,在本发明的一个实施方式中,以纯化水溶解氢氧化钠。氢氧化钠水溶液的浓度优选为1~5vol%。
<清洗液>
在本发明的试剂盒中,清洗液可以为枸橼酸盐缓冲液。枸橼酸盐缓冲液的浓度优选为0.04~0.06M,pH值优选为5.5~6.5。配制后的清洗液可以在2~8℃的温度下存储备用。
<样本稀释液>
在本发明的试剂盒中,样本稀释液包含Tris,牛血清白蛋白。Tris的浓度优选为5~10g/L,牛血清白蛋白的浓度优选为1~5g/L。防腐剂优选为Proclin-300,防腐剂的含量优选为0.05~0.1vol%。
<试剂盒的制备方法>
本发明的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒的制备方法可以包括以下步骤:
样本稀释液配置步骤:配置所述样本稀释液,
校准品制备步骤:配置校准品稀释液,以所述校准品稀释液将纯化血清淀粉样蛋白A稀释为不同浓度的血清淀粉样蛋白A的校准品,
标记抗体试剂制备步骤:使标记物与检测抗体偶联反应,对反应后的混合液进行透析,随后进行稀释,从而获得所述标记抗体试剂,
清洗液配置步骤,配制所述清洗液,
磁微粒试剂制备步骤:使磁微粒活化后,加入抗血清淀粉样蛋白A单克隆捕获抗体进行包被,随后进行磁性分离,以获得所述磁微粒试剂,以及
激发物制备步骤:配制所述激发物。
<血清淀粉样蛋白A的检测方法>
可以通过以下步骤,使用本发明的试剂盒,对血清淀粉样蛋白A进行检测:
样本稀释步骤:以所述样本稀释液对样本进行稀释;
加样反应步骤:在反应管中加入校准品、稀释后的样本、标记抗体和所述磁微粒试剂,震荡混匀后,进行孵育;
清洗步骤:对孵育后的混合物进行磁性分离,加入清洗液,待所述磁微粒试剂吸附完全后,弃去上清;
检测步骤:加入激发物,检测并读取信号值;以及
计算步骤:对所述校准品的浓度和发光值进行logistic四参数拟合,通过所述样本的RLU值计算所述样本的浓度。
在上述加样反应步骤中,校准品、稀释后样本、检测抗体与磁微粒试剂相互之间的添加质量比例优选为2/2/4/1。孵育温度优选为36.5~37.5℃,孵育时间优选为5~15min。
在本发明的一个实施方式中,在清洗步骤中,重复1~3次清洗操作。
在上述检测步骤中,同时加入第一激发物和第二激发物,并且第一激发物与第二激发物的加样量比为1:1。
实施例
以下将通过具体实施例对本发明的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒。
实施例1
<试剂盒的制备>
1.校准品的制备
配制校准品稀释液
称取磷酸二氢钾0.2克,磷酸氢二钠2.9克,加适量超纯水溶解,Proclin-300 1mL,混匀后,加超纯水定容至1000mL,即为校准品稀释液,2~8℃储存备用。
配制校准品
校准品的浓度为0、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL,用校准品稀释液将纯化血清淀粉样蛋白A稀释至相应浓度,2~8℃储存备用。
2.标记抗体试剂的制备
称取5mg吖啶酯溶解于1mL DMSO中,混匀后,吸取10μl上述液加入离心管中,加入0.05M硼酸钠缓冲液500μL,再加入标记抗体1mg,颠倒混匀,37℃,反应1h。
将上述液装入透析袋中,用0.15M pH7.4PBS透析,4℃,每4小时更换一次透析液,共透析16h。取出透析物,加200mL Tris-HCl缓冲液稀释。放置2~8℃冰箱保存备用。
3.磁微粒储存液的制备
称取6.05g Tris,4.5gNaCL,0.5g酪蛋白,加入适量纯化水溶解,调节pH至8.0,加纯水定容止500mL,加入0.1Vol%P300,混匀,放置2~8℃冰箱保存备用。
4.磁珠试剂的制备
配制500mL磁珠包被液,0.1M磷酸盐缓冲液。
称取5mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)溶解于1mL磷酸缓冲液中,混匀,吸取500μl上述液加入离心管中。
在离心管中加入10mg磁珠,37℃,活化30min。
磁性分离,清洗磁珠三次。
向离心管中加入500μl磷酸缓冲液,1mg捕获抗体。37℃水浴,包被3h。
磁性分离,清洗磁珠三次。
加入磁珠储存液,混匀,放置2~8℃冰箱保存备用。
5.清洗液的配制
0.05M pH6.0枸橼酸盐缓冲液:称取枸橼酸1.82克,枸橼酸钠10.45克,加纯水溶解并定容至1000mL,混匀后,放置2~8℃冰箱保存备用。
6.第一激发物的配制
量取硝酸100mL和过氧化氢100mL,用纯水定容至1000mL,混匀后分装,每瓶200mL置4℃冰箱保存备用。
7.第二激发物的配制
称取NaOH 10克,加适量纯水溶解,定容至1000mL,混匀后分装,每瓶200mL置4℃冰箱保存备用。
8.样本稀释液的配制
称取Tris 3.02克,牛血清白蛋白5g,加适量纯水溶解,pH调至7.4,定容至500mL,置4℃冰箱保存备用。
实施例2
<血清淀粉样蛋白A的检测>
使用如上所述的方法制备的试剂盒,对血清淀粉样蛋白A进行检测的步骤如下:
1样本稀释:将表1所示的各个样本按照1:200倍比例进行稀释;
2加样:在反应管中加入校准品和稀释后样本各50μL、标记抗体试剂100μL、磁珠试剂25μL,震荡混匀后,在37℃条件下,孵育10min;
3清洗:磁珠进行磁性分离,加入清洗液,待磁珠吸附完全后,弃去上清;重复以上步骤两次。
4检测:同时加入激发物1和激发物2,加样量各100μL,立即检测,读取信号值。
5计算:对校准品的浓度和发光值进行logistic四参数拟合,通过样本RLU计算样本浓度。具体数据如表1所示。
表1
经计算,表1所示的使用本发明的血清淀粉样蛋白A的检测用试剂盒所检测的样本回算浓度与样本稀释浓度之间的相关性r约为0.998,证明本发明的血清淀粉样蛋白A的检测用试剂盒具备优异的准确性。
尽管已经参考实施例描述了本发明,但是本发明不限于这些实施例,并且可以在不脱离本发明的主旨的范围的情况下进行各种修改。
以上已经描述了本发明的实施例。然而,在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下,本发明可以以其他特定形式实施。因此,本发明的实施例在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是前面的描述所表示,因此在权利要求的含义和等同范围内的所有变化都包含在其中。
而且,在本发明的实施例中描述的效果仅是列出了本发明实现的最佳效果。因此,本发明的效果不限于在本发明的实施例中描述的那些。
Claims (15)
1.一种血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒,包括校准品、磁微粒试剂、标记抗体试剂、清洗液、激发物和样本稀释液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,
所述校准品包括在0~1000ng/mL范围内的6以上个不同浓度的血清淀粉样蛋白A校准品。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其中,
所述标记抗体试剂为吖啶酯类化合物标记的血清淀粉样蛋白A检测抗体,
所述吖啶酯类化合物为选自吖啶酯、吖啶酯磺酰胺、吖啶酯甲苯磺酰胺、吖啶酯对甲基磺酰胺和吖啶酯三氟甲基磺酰胺中的任意一种,并且
所述吖啶酯类化合物优选为吖啶酯。
4.根据权利要求1~3任意一项所述的试剂盒,其中,
所述磁微粒试剂为磁微粒包被的抗血清淀粉样蛋白A单克隆捕获抗体。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的试剂盒,其中,
所述磁微粒的粒径为1~5μm,表面电荷密度为5~50μmol/g。
6.根据权利要求1~5任意一项所述的试剂盒,其中,
所述激发物包括第一激发物和第二激发物,并且
所述第一激发物为硝酸过氧化氢水溶液,所述第二激发物为氢氧化钠水溶液。
7.根据权利要求1~6任意一项所述的试剂盒,其中,
所述样本稀释液中包含三羟甲基氨基甲烷和牛血清白蛋白。
8.一种血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒的制备方法,所述试剂盒包括校准品、磁微粒试剂、标记抗体试剂、清洗液、激发物和样本稀释液,该制备方法包括以下步骤:
样本稀释液配置步骤:配置所述样本稀释液,
校准品制备步骤:配置校准品稀释液,以所述校准品稀释液将纯化血清淀粉样蛋白A稀释为不同浓度的血清淀粉样蛋白A的校准品,
标记抗体试剂制备步骤:使标记物与检测抗体偶联反应,对反应后的混合液进行透析,随后进行稀释,以获得所述标记抗体试剂,
清洗液配置步骤,配制所述清洗液,
磁微粒试剂制备步骤:使磁微粒活化后,加入抗血清淀粉样蛋白A单克隆捕获抗体进行包被,随后进行磁性分离,以获得所述磁微粒试剂,以及
激发物制备步骤:配制所述激发物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒制备方法,其中,
在所述校准品制备步骤中,将所述纯化血清淀粉样蛋白A稀释为在0~1000ng/mL范围内的6个以上不同浓度的血清淀粉样蛋白A的校准品。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒制备方法,其中,
在所述标记抗体试剂制备步骤中,所述标记物为吖啶酯类化合物,
所述吖啶酯类化合物为选自吖啶酯、吖啶酯磺酰胺、吖啶酯甲苯磺酰胺、吖啶酯对甲基磺酰胺和吖啶酯三氟甲基磺酰胺中的一种,并且
所述吖啶酯类化合物优选为吖啶酯。
11.根据权利要求8~10任意一项所述的试剂盒制备方法,其中,
在所述标记抗体试剂制备步骤中,所述磁微粒的粒径为1~5μm,表面电荷密度为5~50μmol/g。
12.根据权利要求8~11任意一项所述的试剂盒制备方法,其中,
在所述激发物制备步骤中,所述激发物溶液包括第一激发物溶液和第二激发物溶液,并且,所述第一激发物为硝酸过氧化氢水溶液,所述第二激发物为氢氧化钠水溶液。
13.根据权利要求8所述的试剂盒制备方法,其中,
所述样本稀释液中包含三羟甲基氨基甲烷和牛血清白蛋白。
14.一种使用权利要求1~7任意一项所述的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒或权利要求8~13任意一项所述的制备方法所制备的血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒来检测血清淀粉样蛋白A的方法,该检测方法包括以下步骤:
样本稀释步骤:以样本稀释液对样本进行稀释;
加样反应步骤:在反应管中加入校准品、稀释后的样本、标记抗体和所述磁微粒试剂,震荡混匀后,进行孵育;
清洗步骤:对孵育后的混合物进行磁性分离,加入清洗液,待所述磁微粒试剂吸附完全后,弃去上清;
检测步骤:加入激发物,检测并读取信号值;以及
计算步骤:对所述校准品的浓度和发光值进行logistic四参数拟合,通过所述样本的RLU值计算所述样本的浓度。
15.根据权利要求14所述的检测肺炎支原体的方法,其中,
在所述加样反应步骤中,孵育时间为5~15min。
Priority Applications (1)
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