CN116124548A - 一种降低全血样本免疫发光检测干扰的全血处理液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫检测技术领域,尤其涉及一种能降低全血样本检测干扰的全血处理液,所述全血处理液,包括如下组分:表面活性剂和抗红细胞抗体;所述表面活性剂为非溶血性表面活性剂;所述表面活性剂与所述抗红细胞抗体的浓度比为20~5000。本发明中全血处理液的利用表活和抗红细胞抗体的配合,实现了抗干扰的检测,且表活优选两性表面活性剂或非离子表面活性剂,均具有一定的分散能力和抗静电作用,可提高磁珠悬浮的稳定性,从而提高反应体系一定的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域,尤其涉及一种降低全血样本免疫发光检测干扰的全血处理液。
背景技术
在临床上,对于一些炎症、心肌标志物等检测项目,若能快速且有效地检测出结果,则可以方便医生做出治疗方向、减少患者痛苦。在实际场景中,化学发光免疫技术检测所需的常规样本是血清或血浆,血清或血浆的制备都需要离心设备将全血样本离心。而全血样本离心过程繁琐费时,所需血液样本量比较大,检测速度也比较慢,不能与其他常规的全血手段同时进行,无法满足医院急诊、重症病人的快速诊断需求。另一种检测方式则是全血检测,全血检测所需要的样本量比较少,缩短样本前期的处理时间,采血后即可测试,操作简单方便,特别适用于无条件做标本离心、需快速出结果的临床科室。
目前,虽然全血检测具有即时检测、快速出诊断结果的优点,但由于全血成分复杂,血细胞的凝集、破裂、血细胞与磁珠的黏附等因素对免疫反应的干扰比较大,使得检测结果不准确、重复性差。
因此,为解决血细胞带来的干扰问题,需对全血样本进行处理,减少血细胞对免疫反应的干扰。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能减少血细胞干扰的全血处理液。
为解决上述技术问题,本发明的目的是通过以下技术方案实现的:提供一种能降低全血样本检测干扰的全血处理液,所述全血处理液,包括如下组分:表面活性剂和抗红细胞抗体;
所述表面活性剂为非溶血性表面活性剂;
非溶血性表面活性剂指不具有溶血作用的表面活性剂。
所述表面活性剂与所述抗红细胞抗体的浓度比为20~5000。
本发明“表面活性剂”选择分散稳定、不溶血、可降低磁珠抗体与全血中非特异性物质的结合、提高试剂反应灵敏性等作用的表面活性剂。
所述“不溶血”指对红细胞温和,不会造成红细胞破裂,从而释放红细胞内的物质,对实验结果产生干扰。
本发明“抗红细胞抗体”:对样本中的红细胞具有高度亲和性,能有效固定/捕捉人全血中的红细胞,而不干扰正常的检测。
本发明创造性的发现,在全血检测中配合使用抗红细胞抗体和非溶血性表面活性剂能够实现全血的高灵敏、准确检测。
进一步地,所述表面活性剂的浓度为1%~5%,所述抗红细胞抗体的浓度为0.01mg/mL~0.5mg/mL。
进一步地,所述表面活性剂选自:TETRONIC 1307、十二烷基羟丙基磺基甜菜碱、磺丙基十四烷基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、Surfynol(tm)465、Surfynol(tm)485或SILWETL7600。
进一步地,所述全血处理液还包括:缓冲液、渗透压维持剂、稳定剂、保护剂、聚合物、防腐剂。
进一步地,所述缓冲液选自PBS体系、Tris-HCl体系、HEPES体系或MES体系,浓度为10-50mM;
所述缓冲体系可以提供合适的离子浓度和酸碱度,维持环境恒定的pH值,防止红细胞破裂。
更进一步地,所述缓冲体系为Tris-HCl体系。其可使环境的pH在7.0附近,缓冲能力较强,可以抵抗全血对试剂反应pH环境的破坏。
所述渗透压维持剂选自NaCl或KCL。
所述渗透压维持剂终浓度约0.9%,与人体的浓度相当,维持血细胞的渗透压,能够保持细胞内外的水平衡和形态,防止细胞裂解。
所述稳定剂选自BSA、HAS或酪蛋白,浓度为0.5%~5%;
所述稳定剂能够保护血液样本中的蛋白,维持血液稳定性。
所述保护剂选自蔗糖、松三糖、乳糖、海藻糖、透明质酸或葡聚糖,浓度为1%-5%;
所述保护剂可以有效地保护蛋白分子不变性失活,保持细胞活性。
所述聚合物选自葡聚糖(5000、10000、20000、40000)、葡聚糖硫酸钠或PEG(8000、20000);
所述聚合物选择一些温和的聚合物,可分散红细胞,防止红细胞聚集,消除红细胞对体系的干扰。如葡聚糖硫酸钠、PEG等。葡聚糖硫酸钠具有阻止红细胞聚集成团的作用,可提高细胞活力,减少红细胞破裂;PEG具有分散红细胞作用。
所述防腐剂选自叠氮化钠、BND或proclin300,浓度为0.02%~0.05%;可以防止细菌生长,延长试剂的保存期。
另一方面,本发明还公开了一种免疫检测试剂盒,其所述试剂盒包含所述全血处理液。
进一步地,所述免疫检测试剂盒为化学发光免疫检测试剂盒。
另一方面,本发明公开了所述全血处理液在化学发光检测中的应用。本发明所述“浓度”为各组分添加到溶液中的终浓度。
另一方面,本发明公开了一种降低检测干扰的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1:配置如上所述的全血处理液;
S2:混合全血样本与全血处理液,进行孵育后检测。
进一步地,在步骤S2孵育后检测前还可以对所述孵育后的样本进行超声处理。
在磁微粒化学发光中进行超声处理可以避免部分异常样本血细胞易于试剂中的磁珠产生聚集,磁珠与血细胞裹挟或非特异性吸附导致重复性变差,出现假阳结果。
本发明的有益效果在于:本发明中全血处理液的利用表活和抗红细胞抗体的配合,实现了抗干扰的检测,且表活优选两性表面活性剂或非离子表面活性剂,均具有一定的分散能力和抗静电作用,可提高磁珠悬浮的稳定性,从而提高反应体系一定的灵敏度。本发明中全血处理液可以稳定细胞形态、分散血细胞、减少血细胞与磁珠黏附、从而减少血液样本中非特异性物质的干扰。另外本发明采用超声的处理方法,在体系反应完成后进行超声分散,然后再加入底物进行反应,解决因血细胞与磁珠聚集导致结果不准确的问题。即本发明通过以上方式,实现了快速、准确及具有良好重复性的全血检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的配方1的检测效果图;
图2为本发明实施例4提供的部分异常样本血细胞易于试剂中的磁珠产生聚集图;
图3为本发明实施例4提供是PCT、IL-6处理情况图;
图4为本发明实施例4提供的CTnI、MYO处理情况图;
图5为本发明实施例4提供PCT、IL-6超声处理对比图;
图6为本发明实施例4提供CTnI、MYO超声处理对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
应当理解,当在本说明书和所附权利要求书中使用时,术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在,但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解,在此本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样,除非上下文清楚地指明其它情况,否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
还应当进一步理解,在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合,并且包括这些组合。
此外,“大致”、“基本”等用语旨在说明相关内容并不是要求绝对的精确,而是可以有一定的偏差。例如:“大致相等”并不仅仅表示绝对的相等,由于实际生产、操作过程中,难以做到绝对的“相等”,一般都存在一定的偏差。因此,除了绝对相等之外,“大致等于”还包括上述的存在一定偏差的情况。以此为例,其他情况下,除非有特别说明,“大致”、“基本”等用语均为与上述类似的含义。
全血检测,全血检测所需要的样本量比较少,缩短样本前期的处理时间,采血后即可测试,操作简单方便,特别适用于无条件做标本离心、需快速出结果的临床科室。
在目前的全血检测中,全血处理液包括溶血处理液及不溶血处理液两种方式的处理液,其中,溶血处理液中一般包含溶解血细胞的成分,加入到全血样本后可以溶解血细胞,以达到减少血细胞对磁珠干扰的目的。比如在处理液中加入皂苷,可以将血液样本中的红细胞进行溶解,同时加入高分子聚合物(PVP10000)促进血细胞裂解物的溶解,吸附血细胞裂解后产生的碎片;或者在处理液中加入咪唑,消除全血中的血细胞,避免血细胞吞噬磁珠的可能。但在实际应用过程中,血液样本中的血细胞可能消除不完全,仍会对磁珠造成一定的干扰,造成重复性差;且血细胞裂解后会释放出更多的物质,对反应体系造成更多不可控的干扰,导致检测结果不正确。
在不溶血的处理液中,一般包含非溶血性、稳定血细胞、防止血细胞聚集的表面活性剂。全血样本比血清或血浆粘稠,容易导致磁珠聚集,同时全血样本中的血细胞可能会影响抗原与抗体的结合,因此不溶血的处理液起着稀释样本、防止血细胞聚集等作用。如在样本稀释液中加入分散剂(C16PB),可使抗原和抗体充分反应,同时对CV影响不大。但不溶血处理液在实际应用过程中,血细胞易黏附磁珠,与磁珠聚集成团,导致反应体系稳定性较差,影响检测的灵敏度;且全血对反应环境的pH值影响较大,容易影响磁珠抗体和标记抗体的稳定性;另外则是血液成分复杂,含有比血清或血浆更多的非特异性物质,容易与磁珠抗体发生非特性结合,导致检测结果不准确。
总结来说,虽然全血检测具有即时检测、快速出诊断结果的优点,但由于全血成分复杂,血细胞的凝集、破裂、血细胞与磁珠的黏附等因素对免疫反应的干扰比较大,使得检测结果不准确、重复性差。
以下结合实施例进行具体说明
实施例1
实施例中选择化学发光免疫检测验证本发明全血处理液的效果。
检测过程如下:向反应杯中加待测样本,加与待测样本等体积的处理液混匀,然后按照试剂盒说明书(所述试剂盒为中元汇吉股份有限公司IL-6检测试剂盒)加其他组分进行孵育反应。
本实施例中配方中均包含0.03mg/mL的抗红细胞抗体,5%的S11(Surfynol(tm)485)表面活性剂。
表1各组分对全血处理液的影响情况
本实施例检测血液中IL-6,其中配方1中的结果如图1所示R2=0.923
配方2-7,R2分别为0.927、0.915、0.925、0.933、0.916、0.919。
可以看出缺乏或者更换缓冲液、渗透压维持剂、稳定剂、保护剂、聚合物、防腐剂,对全血处理液的效果影响较小。
实施例2抗红细胞抗体(RBC pAb)对全血处理液的影响
A、试剂准备
本实施例全血处理液配方如下:50mmol/L Tris-HCl缓冲液,1%BSA,5%蔗糖,1%S9(TETRONIC 1307),1%葡聚糖硫酸钠,0.05%proclin300和抗红细胞抗体。
配制抗红细胞抗体的浓度分别为:0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2(单位:mg/mL)
溶液pH值为7.4,溶液配置完后用0.22um滤膜进行过滤,置于2-8℃条件保存。
B、临床验证
本实施例检测全血中IL-6
检测结果如下:其中0.01mg/mL的R2=0.912、0.05mg/mL的R2=0.922、0.1mg/mL的R2=0.933、0.2mg/mL的R2=0.925、0.5mg/mL的R2=0.932、1mg/mL的R2=0.451、2mg/mL的R2=0.533。
可以看出抗红细胞抗体浓度为0.01mg/mL-0.5mg/mL时检测效果好,抗红细胞抗体浓度过高(≥1mg/mL)会引起红细胞聚集,增加体系干扰,影响检测效果。
实施例3表面活性剂对全血处理液的影响
A、表面活性剂的浓度影响
(1)试剂准备
本实施例全血处理液配方如下:50mmol/L Tris-HCl缓冲液,1%BSA,5%海藻糖,表面活性剂,1%葡聚糖硫酸钠,0.05%proclin300和0.5%抗红细胞抗体。
本实施例选择表面活性剂S11(Surfynol(tm)485),浓度分别为:0.01、0.1、1、2、5、10、20(单位%)
检测结果如下:其中0.01%的R2=0.654、0.1%的R2=0.735、1%的R2=0.927、2%的R2=0.935、5%的R2=0.944、10%的R2=0.641、20%的R2=0.653。
可以看出表面活性剂的浓度范围在1-5%检测效果最好。
(2)表面活性剂的种类影响
本实施例选择浓度为2%,具体列举如下:
表2表面活性剂的种类影响
可以看出两性表活和非离子表活的检测效果较好,阳离子型和阴离子型表活效果较差,所以本发明优选两性表活和非离子表活。
实施例4增加超声的影响
操作如下:
S1:配置如权利要求全血处理液;
S2:混合全血样本与全血处理液,进行孵育后检测。
S3:在步骤S2孵育后检测前还可以对所述孵育后的样本进行超声处理。
本处理液可作为单独组分应用到现有的多种试剂盒中,本实施例选择MYO、IL-6、PCT、CTnI化学发光检测试剂盒(来自中元汇吉生物技术有限公司)进行验证,同时需要带有细胞容积(HCT)检测模块的化学发光仪配合使用。操作方式是:全血样本分两部分,一部分样本进行在机HCT检测,计算出血细胞占比;另一部分样本用于测试,加入与样本量等体积的处理液,混匀,加入试剂盒其他组分进行反应。
所述超声操作步骤具体如下:100uL全血样本+180uL R2液+100uL R1液+100uL M液,混匀,37℃孵育5min,使用配套清洗液磁分离清洗3次,去除上清液保留磁珠固相免疫复合物。再加入1000uL的全血处理液,涡旋混匀,使用新芝超声细胞破碎仪,选定Φ6变幅杆,设定功率30%,样本量>500uL(2mL离心管,液面高度高于1.5cm),每次超声1s,间隔3s,共计超声3次。超声完毕再使用配套清洗液磁分离清洗3次,去除上清液保留磁珠固相免疫复合物,再加入300uL的全血处理液分散复合物,加入AMPPD底物,测光。
在临床全血样本测试中,部分异常样本血细胞易于试剂中的磁珠产生聚集(图2),磁珠与血细胞裹挟或非特异性吸附导致重复性变差,出现假阳结果。
为解决磁珠与血细胞聚集现象,本发明用超声破碎仪处理聚集样本,同时用血浆样本做对比,比较超声前后聚集样本信号值变化、聚集样本超声后与血浆样本的信号值差异,得出该方法是否具有可行性。
全血处理液的应用
(1)临床样本评估
将全血处理液应用到炎症、心肌等项目,收集临床全血样本,每例样本分成两份,一份离心获得血浆样本,另一份不做处理作为全血样本。将所有样本的检测方式分为用处理液和不用处理液,处理液选用上述配方之一,比较两种方式检测的血浆与全血回算值的相关性。
检测结果如图3、图4所示:
由图3~图4可知,低值样本测试项目不加处理液时,低值全血样本比对点较散,相关性较差;测试项目配合全血处理液后,低值全血样本比对点较集中,相关性变好。以上表明全血处理液对低值样本具有很好的收敛作用,出现跳值的样本减少。
(2)重复性评估
用加处理液方式对临床样本进行重复性测试,结果如表3、4所示,CV值均在5%以内,表明重复性较好。
表3IL-6项目
表4cTnI项目
综上,该全血处理液的应用,可以减少血浆与全血样本间的相对偏差,降低全血样本检测时出现的干扰,提高全血检测准确度。
超声+全血处理液结果
由图3、4中可以看到,各项目用加处理液的方式,虽然对低值样本具有很好的收敛作用,出现跳值的样本减少,但仍存在少数跳值的异常样本。为解决这部分异常样本,本发明采用超声的处理方式。筛选异常样本,然后用处理液+超声分散方式处理异常本,对比处理前与处理后的检测结果如图5、图6。
由图5、图6可知,用全血处理液+超声分散方式处理样本后,极大的提高了全血样本与血浆样本测值相关性,缩小了全血样本与血浆样本的测值偏差,表明该方法具有可行性。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到各种等效的修改或替换,这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种能降低全血样本检测干扰的全血处理液,其特征在于,所述全血处理液,包括如下组分:表面活性剂和抗红细胞抗体;所述表面活性剂为非溶血性表面活性剂;
所述表面活性剂与所述抗红细胞抗体的浓度比为20~5000。
2.如权利要求1所述的全血处理液,其特征在于:所述表面活性剂的浓度为1%~5%,所述抗红细胞抗体的浓度为0.01mg/mL~0.5mg/mL。
3.如权利要求2所述的全血处理液,其特征在于:所述表面活性剂为非离子表面活性剂或两性表面活性剂。
4.如权利要求3所述的全血处理液,其特征在于,所述表面活性剂选自:TETRONIC1307、十二烷基羟丙基磺基甜菜碱、磺丙基十四烷基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、Surfynol(tm)465、Surfynol(tm)485或SILWET L7600。
5.如权利要求1-4任一条所述的全血处理液,其特征在于,所述全血处理液还包括:缓冲液、渗透压维持剂、稳定剂、保护剂、聚合物、防腐剂。
6.如权利要求5所述的全血处理液,其特征在于:所述缓冲液选自PBS体系、Tris-HCl体系、HEPES体系或MES体系,浓度为10-50mM;
所述渗透压维持剂选自NaCl、KCL;
所述稳定剂选自BSA、HAS或酪蛋白,浓度为0.5%~5%;
所述保护剂选自蔗糖、松三糖、乳糖、海藻糖、透明质酸,浓度为1%-5%;
所述聚合物选自葡聚糖、葡聚糖硫酸钠或PEG;
所述防腐剂选自叠氮化钠、BND或proclin300,浓度为0.02%~0.05%。
7.一种免疫检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含上述权利要求1-5中任意一项全血处理液。
8.如权利要求1-6中任意一项所述的全血处理液在化学发光检测中的应用。
9.一种降低磁微粒化学发光检测干扰的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1:配置如权利要求1-6所述的全血处理液;
S2:混合全血样本与全血处理液,进行孵育后检测。
10.如权利要求9所述的降低磁微粒化学发光检测干扰的方法,其特征在于,在步骤S2孵育后检测前还可以对所述孵育后的样本进行超声处理。
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---|---|---|---|---|
EP4300072A1 (en) * | 2022-07-01 | 2024-01-03 | Canon Kabushiki Kaisha | Staining method, liquid composition for staining, and kit for staining |
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- 2022-12-30 CN CN202211730078.XA patent/CN116124548A/zh active Pending
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EP4300072A1 (en) * | 2022-07-01 | 2024-01-03 | Canon Kabushiki Kaisha | Staining method, liquid composition for staining, and kit for staining |
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