CN104237522A - 脂联素含量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂联素含量检测试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、保护剂、螯合剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被脂联素抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂、保护剂和水。本发明检测试剂盒的包被脂联素抗体的胶乳颗粒粒径为80-200nm，在此粒径范围内，检测的灵敏度及线性范围要明显优于其它粒径的胶乳颗粒。本发明采用化学交联法制备致敏胶乳颗粒，脂联素抗体与胶乳颗粒结合紧密，不易从胶乳颗粒上脱落，提高了抗体结合的稳定性，最终有效提高了试剂盒的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及脂联素含量检测试剂盒，尤其涉及一种人体内脂联素含量的检测试剂盒及其制备方法，本发明进一步涉及该检测试剂盒在检测人体内脂联素含量的使用方法，属于脂联素含量的检测领域。
背景技术
脂肪组织（adipose tissue）主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质。正常人血清中脂联素的浓度范围在3～30μg/mL，占血浆蛋白总量的0.01％，不随饮食或昼夜节律而改变，女性血清中的脂联素含量大于男性。随着对脂联素研究的不断深入，已发现，脂联素在肥胖症患者和II型糖尿病患者血清中的浓度明显低于非肥胖者，其浓度的降低导致了胰岛素抵抗和高胰岛素血症，而脂联素有防止动脉粥样硬化斑块形成的作用，因此，脂联素与肥胖症患者II型糖尿病及冠心病的发生发展密切相关，即脂联素的明显降低预示着II型糖尿病及冠心病的发生明显增加。测定血中脂联素水平，对这些疾病的诊断和预后有重要意义。
目前，脂联素常用的检测方法有：放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)、胶乳颗粒增强免疫透射比浊等方法。放射免疫法由于要用到放射性的原料，因此存在严重的环境污染问题，且操作过程中工作人员必须采用严格的保护措施；酶联免疫法检测的准确度较高，但是检测过程繁琐，耗时较长，且样本需要批量检测，不适用于及时检测；胶乳免疫比浊法也是测定人血浆或尿液中脂联素浓度的常用方法，它是基于普通的免疫比浊法，但是它克服了普通免疫比浊法灵敏度不高的缺陷，同时还克服了RIA和ELISA方法的缺陷，具有操作简单、检测时间短、灵敏度高、线性范围 宽、无污染、应用范围广等优点。但是现有的脂联素胶乳免疫比浊法试剂盒存在着线性范围窄、抗干扰能力差、试剂盒稳定性差等方面的问题，有待改进。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种脂联素含量的检测试剂盒及其制备方法；
本发明的目的之二是提供一种上述脂联素含量的检测试剂盒的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种脂联素含量检测试剂盒，由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂II组成；所述的试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、保护剂、螯合剂和水；所述试剂II的组分包括：包被脂联素抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂、保护剂和水；其中，所述的包被脂联素抗体的胶乳颗粒的粒径为80-200nm，优选为130-170nm，最优选为140nm。
本发明通过大量的试验发现，包被脂联素抗体的胶乳颗粒的粒径的大小对于检测的灵敏性、准确性及线性范围等有着非常显著的影响，本发明通过大量的试验最终确定，当包被脂联素抗体的胶乳颗粒的粒径为80-200nm时，相比于其它的粒径的胶乳颗粒，其检测的灵敏度及线性范围等特性有非常显著的改善。由此，本发明试剂盒中的包被脂联素抗体的胶乳颗粒的粒径优选为80-200nm，采用此粒径的胶乳颗粒制备的检测试剂盒其灵敏度及线性范围等特性明显优于其它粒径的包被脂联素抗体的胶乳颗粒。其中，当包被脂联素抗体的胶乳颗粒的粒径为130-170nm时，检测的灵敏度及线性范围有更好的效果，当包被脂联素抗体的胶乳颗粒的粒径为140nm时，检测的灵敏度及线性范围能达到最好的效果。
制备包被脂联素抗体的胶乳颗粒可以有多种制备方法，诸如化学交联法、物理吸附法等；本发明通过实验发现，采用化学交联法制备的致敏胶乳颗，脂联素抗体与胶乳颗粒结合紧密，不容易从胶乳颗粒上脱落，提高了抗体结合的稳定性，可显著提高检测试剂盒的稳定性。其中，采用下述方法制备的包被脂联素抗体的胶乳颗粒，试剂盒的稳定性为最好：
（1）洗涤胶乳：将活化缓冲液和表面活性剂依次加入到粒径为80-200nm的胶乳溶液中混合均匀，离心弃上清，保留沉淀；
（2）活化胶乳：将步骤（1）所得的胶乳沉淀用活化缓冲液复溶，超声震荡后加入溶有1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）及N-羟基硫代琥珀酰亚胺（硫代NHS）的活化缓冲液，混合均匀，置于恒温摇床上反应；
（3）淬灭反应：向步骤（2）的反应产物中加入2-巯基乙醇淬灭未反应的EDC，混合均匀，继续置于恒温摇床上反应；
（4）致敏胶乳：向步骤（3）的反应产物中加入脂联素抗体溶液，震荡混合均匀，置于摇床上反应；
（5）封闭胶乳：向步骤（4）的反应产物中加入乙醇胺和甘氨酸溶液，置于摇床上反应后，再加入BSA溶液，置于摇床上反应；
（6）洗涤胶乳：将步骤（5）的反应产物离心，弃上清，用水重复洗涤沉淀多次，即得。
其中步骤（1）或（2）中所述的活化缓冲液优选为PBS缓冲液；步骤（1）中所述的表面活性剂优选是吐温-20。
步骤（4）中所述的脂联素抗体优选为脂联素单克隆抗体和/或多克隆抗体。
为了达到更好的检测效果，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂5-50g，螯合剂0.05-4g，防腐剂0.1-10g，稳定剂5-60g，表面活性剂1-20mL，促凝剂2-30g，余量为水；
每1升试剂II中各组分的用量为：包被脂联素抗体的胶乳颗粒0.1-5g，生物缓冲剂1-40g，螯合剂0.5-10g，防腐剂0.5-5g，稳定剂30-100g，表面活性剂0.5-6mL，封闭剂5-30g，助悬剂5-50mL，保护剂8-70g，余量为水。
进一步优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂10-30g，螯合剂0.5-3g，防腐剂0.5-3g，稳定剂10-30g，表面活性剂3-10mL，促凝剂5-15g，余量为水；
每1升试剂II中各组分的用量为：包被脂联素抗体的胶乳颗粒0.5-4g，生物缓冲剂5-20g，螯合剂1-4g，防腐剂0.5-2g，稳定剂40-80g，表面活性剂0.8-4mL，封闭剂8-15g，助悬剂7-15mL，保护剂10-30g，余量为水。
最优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂12g，螯合剂1g，防腐剂1g，稳定剂19g，表面活性剂5.5mL，促凝剂8g，余量为水；
每1升试剂II中各组分的用量为：包被脂联素抗体的胶乳颗粒1.5g，生物缓冲剂10.5g，螯合剂2g，防腐剂1g，稳定剂59g，表面活性剂1.5mL，封闭剂10g，助悬剂20mL，保护剂15g，余量为水。
试剂Ⅰ和试剂II中的生物缓冲剂是为了维持反应体系pH值的稳定性，凡是有一定缓冲能力的物质，均可作为本试剂盒的生物缓冲剂，在本检测试剂盒中为了达到更好的检测效果，试剂Ⅰ中的生物缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷（Tris），试剂II中的生物缓冲剂选自3-（N-吗啉）丙磺酸(MOPS)。
试剂Ⅰ和试剂II中的螯合剂能够络合检测样本中的金属离子，以减少金属离子对检测结果的影响；因此，能够络合金属离子的各种螯合剂均能够适用，例如：乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及其盐等，本发明为了达到更好的检测效果试剂Ⅰ和试剂II的螯合剂选用 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）。
试剂Ⅰ和试剂II中的防腐剂，是为了防止微生物的繁殖对产品品质及检测结果带来不良影响，因此，凡是能抑制微生物生长的物质都可以作为本发明试剂Ⅰ和试剂II的防腐剂，本发明为了检测试剂盒各项性能更优越选用叠氮化钠作为防腐剂。
试剂Ⅰ和试剂II中的稳定剂主要作用是保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后使用时间。本发明的试剂Ⅰ和试剂II中的稳定剂选自蔗糖与氯化钠两种物质。
试剂Ⅰ和试剂II中的表面活性剂，主要是促进试剂体系中各组分以及检测样本中各物质的均匀分散及提高检测的精密度，同时减少样本浊度对测定结果的影响；因此，现有的具有增溶性质的表面活性剂都可作为试剂Ⅰ或试剂II中所述的表面活性剂，例如，吐温20、吐温40、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇等。本发明试剂盒为了达到更好的检测效果，试剂Ⅰ中的表面活性剂选自曲拉通100（TX-100）和Thesit，试剂II中的表面活性剂选自曲拉通100和吐温20。
试剂Ⅰ中的促凝剂可以促进抗原抗体反应，有利于胶乳颗粒交联物的形成和增大，提高检测灵敏度和线性范围。本发明检测试剂盒中的促凝剂优选为PEG-6000。
试剂II中的封闭剂是为了与胶乳颗粒中游离的-COOH位点结合，避免游离的羧基位点对检测结果造成不良影响，凡是能和游离羧基位点结合的物质都能作为本发明试剂盒中的封闭剂，本发明试剂II中优选牛血清白蛋白作为封闭剂。
试剂II中的助悬剂是能维持体系中各物质有一个良好的分散状态，防止各组分凝集下沉导致的检测试剂盒的品质及开瓶稳定性变差等问题出现，常用的助悬剂有乙二醇、丙三醇、海藻酸钠、乳糖和麦芽糖等，为 了达到很好的分散效果并且不对产品的品质造成影响，本发明试剂II中的助悬剂选自乙二醇。
试剂II中的保护剂是为了保护抗体的活性，避免抗体失活对试剂盒的品质带来的不良影响，凡是能保护抗体活性的物质都可以作为本发明的保护剂，本发明试剂II中的保护剂优选自海藻糖。
本发明检测试剂盒中所用到的每种成分或原料均能通过商业途径从生物试剂公司或医药公司购买得到。
本发明的另外一个目的是提供一种制备所述检测脂联素试剂盒的方法，包括：
（1）制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；
（2）制备试剂II：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；
（3）将试剂Ⅰ和试剂II单独分装，密封，即得。
本发明的又一目的是提供所述脂联素检测试剂盒检测样品中脂联素含量的检测方法，该方法为两点终点法，包括以下步骤：
向3μL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品）中加入100μL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入25μL试剂II，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2。计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
本发明检测试剂盒采用胶乳免疫比浊技术，克服了现有的脂联素检测方法所存在的缺陷，为脂联素检测提供了一种安全、快捷、简单、准确、无污染的检测手段。本发明检测试剂盒，其稳定性、灵敏度以及特异性等 方面具有优良的品质，且检测操作简便，有利于大规模推广和应用。
附图说明
图1本发明实施例1制备的试剂盒和对比实施例1-2制备的试剂盒的标准曲线。
图2本发明实施例3制备的试剂盒和对比实施例5和8制备的试剂盒的标准曲线。
图3本发明实施例5制备的试剂盒和对比实施例3-4制备的试剂盒的标准曲线。
图4本发明实施例1-5制备的试剂盒的标准曲线。
图5本发明试剂盒37℃热稳定性试验结果。
图6对比试剂盒37℃热稳定性试验结果。
图7本发明检测试剂盒与酶联免疫检测试剂盒测试结果的相关性试验结果。
具体实施方式
预备实施例1包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备
（1）洗涤胶乳：取1mL浓度为10%粒径为80nm的胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL pH7.4的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入5μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清；
（2）活化胶乳：将（1）步的胶乳沉淀用9mL pH7.4的PBS缓冲液复溶，超声震荡60秒，使胶乳颗粒均匀分散。准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和50mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺（硫代NHS），用1mL pH7.4的PBS缓冲液溶解，并将此溶液加入复溶 的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于恒温摇床上，37度，200转/min，反应1h；
（3）淬灭反应：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入1μL2-巯基乙醇，震荡混合均匀，并置于摇床上，室温，200转/min，反应10min；
（4）致敏胶乳：向上述反应体系中加入1.5mL1mg/mL脂联素多克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应4h；
（5）封闭胶乳：步骤（4）反应完成后，向体系中加入100μL1M乙醇胺溶液（pH8.0）和100μL1M甘氨酸溶液（pH8.0），震荡混合均匀，并于室温下静置反应10min，再向反应体系中加入100μL10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
（6）洗涤胶乳：向上述反应完成的体系中加入水，将体积补充至30mL，并置于离心机中，20000转/min，离心30min，弃上清，并将沉淀用水重复洗涤三次，即得包被脂联素抗体的胶乳颗粒。
预备实施例2包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备
（1）洗涤胶乳：取1mL浓度为10%粒径为200nm的胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL pH6.5的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入8μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清；
（2）活化胶乳：将（1）步的胶乳沉淀用9mL pH6.5的PBS缓冲液复溶，超声震荡60秒，使胶乳颗粒均匀分散。准确称取40mgEDC和40mgNHS，用1mL pH6.5的PBS缓冲液溶解，并将此溶液加入复溶的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于恒温摇床上，37度，200转/min，反应1h；
（3）淬灭反应：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入1μL2-巯基乙醇，震荡混合均匀，并置于摇床上，室温，200转/min，反应10min；
（4）致敏胶乳：向上述反应体系中加入1.5mL1mg/mL脂联素多克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应4h；
（5）封闭胶乳：步骤（4）反应完成后，向体系中加入100μL1M乙醇胺溶液（pH8.0）和100μL1M甘氨酸溶液（pH8.0），震荡混合均匀，并于室温下静置反应10min，再向反应体系中加入100μL10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
（6）洗涤胶乳：向上述反应完成的体系中加入一定量的水，将体积补充至30mL，并置于离心机中，20000转/min，离心30min，弃上清，并将沉淀用水重复洗涤三次，即得包被脂联素抗体的胶乳颗粒。
预备实施例3包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备
（1）洗涤胶乳：取1mL浓度为10%粒径为130nm的胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL pH7.0的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入4μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清；
（2）活化胶乳：将步骤（1）所制备的胶乳沉淀用9mL pH7.0的PBS缓冲液复溶，超声震荡60秒，使胶乳颗粒均匀分散。准确称取55mgEDC和55mgNHS，用1mL pH7.0的PBS缓冲液溶解，并将此溶液加入复溶的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于恒温摇床上，37度，200转/min，反应1h；
（3）淬灭反应：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入2μL2-巯基乙醇，震荡混合均匀，并置于摇床上，室温，200转/min，反应10min；
（4）致敏胶乳：向上述反应体系中加入0.75mL1mg/mL脂联素多克隆抗体和0.75mL1mg/mL脂联素单克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应4h；
（5）封闭胶乳：步骤（4）反应完成后，向体系中加入100μL1M乙醇胺溶液（pH8.0）和100μL1M甘氨酸溶液（pH8.0），震荡混合均匀，并于室温下静置反应10min，再向反应体系中加入100μL10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
（6）洗涤胶乳：向上述反应完成的体系中加入一定量的水，将体积补充至30mL，并置于离心机中，20000转/min，离心30min，弃上清，并将沉淀用水重复洗涤三次，即得包被脂联素抗体的胶乳颗粒。
预备实施例4包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备
（1）洗涤胶乳：取1mL浓度为10%粒径为170nm的胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL pH7.0的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入5μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清；
（2）活化胶乳：将步骤（1）所制备的胶乳沉淀用9mL pH7.0的PBS缓冲液复溶，超声震荡60秒，使胶乳颗粒均匀分散。准确称取50mgEDC和50mgNHS，用1mL pH7.0的PBS缓冲液溶解，并将此溶液加入复溶的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于恒温摇床上，37度，200转/min，反应1h；
（3）淬灭反应：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入1μL2-巯基乙醇，震荡混合均匀，并置于摇床上，室温，200转/min，反应10min；
（4）致敏胶乳：向上述反应体系中加入1.5mL1mg/mL脂联素单克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应4h；
（5）封闭胶乳：步骤（4）反应完成后，向体系中加入100μL1M乙醇胺溶液（pH8.0）和100μL1M甘氨酸溶液（pH8.0），震荡混合均匀，并于室温下静置反应10min，再向反应体系中加入100μL10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
（6）洗涤胶乳：向上述反应完成的体系中加入一定量的水，将体积补充至30mL，并置于离心机中，20000转/min，离心30min，弃上清，并将沉淀用水重复洗涤三次，即得包被脂联素抗体的胶乳颗粒。
预备实施例5包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备
（1）洗涤胶乳：取1mL浓度为10%粒径为140nm的胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL pH7.0的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入5μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清；
（2）活化胶乳：将步骤（1）所制备的胶乳沉淀用9mL pH7.0的PBS缓冲液复溶，超声震荡60秒，使胶乳颗粒均匀分散。准确称取50mgEDC和50mgNHS，用1mL pH7.0的PBS缓冲液溶解，并将此溶液加入复溶的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于恒温摇床上，37度，200转/min，反应1h；
（3）淬灭反应：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入1μL2-巯基乙醇，震荡混合均匀，并置于摇床上，室温，200转/min，反应10min；
（4）致敏胶乳：向上述反应体系中加入1.5mL1mg/mL脂联素单克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应4h；
（5）封闭胶乳：步骤（4）反应完成后，向体系中加入100μL1M乙醇胺溶液（pH8.0）和100μL1M甘氨酸溶液（pH8.0），震荡混合均匀，并于室温下静置反应10min，再向反应体系中加入100μL10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
（6）洗涤胶乳：向上述反应完成的体系中加入一定量的水，将体积补充至30mL，并置于离心机中，20000转/min，离心30min，弃上清，并将沉淀用水重复洗涤三次，即得包被脂联素抗体的胶乳颗粒。
实施例1脂联素胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂II的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例2脂联素胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂II的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例3脂联素胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂II的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例4脂联素胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂II的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例5脂联素胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂II的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
对比实施例1脂联素胶乳检测试剂盒的制备：
一、包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备
（1）洗涤胶乳：取1mL浓度为10%粒径为70nm的胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL pH7.4的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入5μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清；
（2）活化胶乳：将（1）步的胶乳沉淀用9mL pH7.4的PBS缓冲液复溶，超声震荡60秒，使胶乳颗粒均匀分散。准确称取50mgEDC和50mgNHS，用1mL pH7.4的PBS缓冲液溶解，并将此溶液加入复溶的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于恒温摇床上，37度，200转/min，反应1h；
（3）淬灭反应：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入1μL2-巯基乙醇，震荡混合均匀，并置于摇床上，室温，200转/min，反应10min；
（4）致敏胶乳：向上述反应体系中加入1.5mL1mg/mL脂联素多克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应4h；
（5）封闭胶乳：步骤（4）反应完成后，向体系中加入100μL1M乙醇胺溶液（pH8.0）和100μL1M甘氨酸溶液（pH8.0），震荡混合均匀，并于室温下静置反应10min，再向反应体系中加入100μL10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
（6）洗涤胶乳：向上述反应完成的体系中加入一定量的水，将体积补充至30mL，并置于离心机中，20000转/min，离心30min，弃上清，并将沉淀用水重复洗涤三次，既得包被脂联素抗体的胶乳颗粒。
二、试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂II的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
对比实施例2脂联素胶乳检测试剂盒的制备：
一、包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备
（1）洗涤胶乳：取1mL浓度为10%粒径为210nm的胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL pH6.5的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入8μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清；
（2）活化胶乳：将（1）步的胶乳沉淀用9mL pH6.5的PBS缓冲液复溶，超声震荡60秒，使胶乳颗粒均匀分散。准确称取40mgEDC和40mgNHS，用1mL pH6.5的PBS缓冲液溶解，并将此溶液加入复溶的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于恒温摇床上，37度，200转/min，反应1h；
（3）淬灭反应：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入1μL2- 巯基乙醇，震荡混合均匀，并置于摇床上，室温，200转/min，反应10min；
（4）致敏胶乳：向上述反应体系中加入0.75mL1mg/mL脂联素多克隆抗体和0.75mL1mg/mL脂联素单克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应4h；
（5）封闭胶乳：步骤（4）反应完成后，向体系中加入100μL1M乙醇胺溶液（pH8.0）和100μL1M甘氨酸溶液（pH8.0），震荡混合均匀，并于室温下静置反应10min，再向反应体系中加入100μL10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min；
（6）洗涤胶乳：向上述反应完成的体系中加入一定量的水，将体积补充至30mL，并置于离心机中，20000转/min，离心30min，弃上清，并将沉淀用水重复洗涤三次，既得包被脂联素抗体的胶乳颗粒。
二、试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂II的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
对比实施例3脂联素胶乳检测试剂盒的制备：
一、包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备（采用物理吸附法包被）
①取1mL浓度为10%粒径为80nm的胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL pH6.5的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入8μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，并用10mL pH6.5的PBS缓冲液复溶沉淀；
②向上述复溶的胶乳溶液中加入0.5mL1mg/mL脂联素多克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），于37℃搅拌反应1小时，离心弃上清，用pH6.5的PBS缓冲液洗涤沉淀2次，并用20mL pH6.5的PBS缓冲液复溶沉淀；
③向②步所制得的溶液中加入4mL10%BSA溶液，于25℃搅拌反应1小时，以封闭胶乳微球上多余的基团，离心弃上清，后用pH6.5的PBS 缓冲液洗涤沉淀2次，既得物理法包被脂联素抗体的胶乳颗粒。
二、试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂II的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
对比实施例4脂联素胶乳检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液的粒径为50nm外，其余均与对比实施例1完全相同。
对比实施例5脂联素胶乳检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液的粒径为220nm外，其余均与对比实施例1完全相同。
对比实施例6脂联素胶乳检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液的粒径为230nm外，其余均与对比实施例2完全相同。
对比实施例7脂联素胶乳检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液的粒径为250nm外，其余均与对比实施例2完全相同。
对比实施例8脂联素胶乳检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液的粒径为300nm外，其余均与对比实施例2完全相同。
试验例1本发明检测试剂盒的线性范围及灵敏度测定
1、试验样品
（1）供试样品：本发明实施例1-5所制备的脂联素检测试剂盒；
（2）对照样品：对比实施例1-8所制备的脂联素检测试剂盒；
2、试验方法
取浓度为0mg/L，5mg/L，10mg/L，20mg/L，40mg/L的脂联素标准品溶液，用本发明实施例1-5所制备的脂联素检测试剂盒、对比实施例1-8所制备的脂联素检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲 线。
各脂联素检测试剂盒检测样品中脂联素含量的方法为两点终点法，包括以下步骤：向3μL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品）中加入100μL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入25μL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2。计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
3、试验结果
根据各试剂盒检测结果所绘制的标准工作曲线可见，不论是实施例1还是实施例2-5所制备的检测试剂盒的线性范围及灵敏度均显著优于对比实施例1-8检测试剂盒的线性范围及灵敏度；此外，无论是在高浓度还是低浓度时，本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒相对于对比实施例1-8的检测试剂盒更能保持良好的线性（图1、图2、图3）;此外,本发明非常意外的发现,当包被脂联素抗体的胶乳颗粒的粒径为140nm时,试剂盒的标准工作曲线的线性在所有的试剂盒中最为优良(图4）。
试验例2本发明检测试剂盒与对比例检测试剂盒高值线性范围试验
1、试验样品
（1）供试样品：本发明实施例3所制备的脂联素检测试剂盒；
（2）对照样品：对比实施例2所制备的脂联素检测试剂盒；
2、试验方法
用本发明实施例3制备的检测试剂盒与对比实施例2制备的检测试剂盒对系列稀释后的高值质控品（浓度为28.5mg/L）进行检测，分别测定不同稀释倍数时质控品的浓度并计算其线性偏差。
3、试验结果
试验结果见表1和表2：
表1本发明实施例3制备的检测试剂盒高值线性范围结果
| 稀释倍数 | 测量值1 | 测量值2 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差（%） |
| 0.1 | 902 | 898 | 900 | 896 | 0.44 |
| 0.2 | 1794 | 1796 | 1795 | 1792 | 0.17 |
| 0.3 | 2671 | 2674 | 2672.5 | 2688 | -0.58 |
| 0.4 | 3602 | 3585 | 3593.5 | 3584 | 0.26 |
| 0.5 | 4452 | 4454 | 4453 | 4480 | -0.61 |
| 0.6 | 5405 | 5386 | 5395.5 | 5376 | 0.36 |
| 0.7 | 6314 | 6298 | 6306 | 6272 | 0.54 |
| 0.8 | 7164 | 7146 | 7155 | 7168 | -0.18 |
| 0.9 | 8076 | 8088 | 8082 | 8064 | 0.22 |
| 1.0 | 9056 | 8814 | 8935 | 8960 | -0.28 |
表2对比实施例2制备的检测试剂盒高值线性范围结果
| 稀释倍数 | 测量值1 | 测量值2 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差（%） |
| 0.1 | 375 | 386 | 380.5 | 398.6 | -4.76 |
| 0.2 | 765 | 779 | 772 | 797.2 | -3.26 |
| 0.3 | 1059 | 1056 | 1057.5 | 1195.8 | -13.08 |
| 0.4 | 1508 | 1498 | 1503 | 1594.4 | -6.08 |
| 0.5 | 1902 | 1895 | 1898.5 | 1993 | -4.98 |
| 0.6 | 2401 | 2411 | 2406 | 2391.6 | 0.6 |
| 0.7 | 2706 | 2685 | 2695.5 | 2790.2 | -3.51 |
| 0.8 | 3256 | 3234 | 3245 | 3188.8 | 1.73 |
| 0.9 | 3605 | 3614 | 3609.5 | 3587.4 | 0.61 |
| 1.0 | 4128 | 4206 | 4167 | 3986 | 4.34 |
由表1和表2中的结果可见，本发明检测试剂盒高值线性范围要明显优于对照检测试剂盒，且对比例检测试剂盒在测值时其线性偏差较大，必然对检测结果带来不良影响。
试验例3本发明检测试剂盒与对比检测试剂盒低值线性范围试验
1、试验样品
（1）供试样品：本发明实施例4所制备的脂联素检测试剂盒；
（2）对照样品：对比实施例4所制备的脂联素检测试剂盒；
2、试验方法
取本发明实施例4制备的检测试剂盒与对比实施例4制备的检测试剂盒对系列稀释后的低值质控品（浓度为8.2mg/L）进行检测，分别测定不同稀释倍数时质控品的浓度并计算其线性偏差。
3、试验结果
试验结果见表3和表4：
表3本发明实施例4制备的检测试剂盒低值线性范围结果
| 稀释倍数 | 测量值1 | 测量值2 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差（%） |
| 0.1 | 221 | 223 | 222 | 218.1 | 1.76 |
| 0.2 | 440 | 441 | 440.5 | 436.2 | 0.98 |
| 0.3 | 674 | 672 | 673 | 654.3 | 2.78 |
| 0.4 | 865 | 869 | 867 | 872.4 | -0.62 |
| 0.5 | 1085 | 1083 | 1084 | 1090.5 | -0.6 |
| 0.6 | 1296 | 1293 | 1294.5 | 1308.6 | -1.09 |
| 0.7 | 1520 | 1524 | 1522 | 1526.7 | -0.31 |
| 0.8 | 1751 | 1753 | 1752 | 1744.8 | 0.41 |
| 0.9 | 1971 | 1965 | 1968 | 1962.9 | 0.26 |
| 1.0 | 2196 | 2194 | 2195 | 2181 | 0.64 |
表4对比实施例4制备的检测试剂盒低值线性范围结果
| 稀释倍数 | 测量值1 | 测量值2 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差（%） |
| 0.1 | 345 | 358 | 351.5 | 335.6 | 4.52 |
| 0.2 | 745 | 732 | 738.5 | 671.2 | 9.11 |
| 0.3 | 1102 | 1098 | 1100 | 1006.8 | 8.47 |
| 0.4 | 1414 | 1425 | 1419.5 | 1342.4 | 5.43 |
| 0.5 | 1732 | 1742 | 1737 | 1678 | 3.4 |
| 0.6 | 2156 | 2186 | 2171 | 2013.6 | 7.25 |
| 0.7 | 2432 | 2465 | 2448.5 | 2349.2 | 4.06 |
| 0.8 | 2738 | 2714 | 2726 | 2684.8 | 1.51 |
| 0.9 | 3078 | 3084 | 3081 | 3020.4 | 1.97 |
| 1.0 | 3578 | 3556 | 3567 | 3356 | 5.92 |
由表3和表4中的结果可见，本发明实施例4制备的检测试剂盒检测不同稀释倍数低值质控品时，其平行性比对比实施例4制备的检测试剂盒好很多，而且测值更接近于理论值，说明在测定较低浓度样品时，本发明检测试剂盒的可信度及稳定性要明显优于对比例检测试剂盒。
试验例4本发明检测试剂盒热稳定性试验
1、试验样品
（1）供试样品：本发明实施例1-5制备的脂联素检测试剂盒；
（2）对照样品：对比实施例3制备的脂联素检测试剂盒；
2、试验方法
将本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒与对比实施例3制备的检测试剂盒，于37℃分别热处理0天、3天、5天和7天，并于不同的处理时间之后分别测定脂联素校准品，记录其ΔA值，并绘制其变化曲线。
3、试验结果
本发明检测试剂盒的37℃热稳定性试验结果见图5，对比实施例3检测试剂盒37℃热稳定性试验结果见图6。
从图5及图6的结果可知，本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒37℃热处理稳定性好，其优良的稳定性保证其测值的可靠性，从而决定其更适合于临床诊断。
试验例5本发明检测试剂盒与酶联免疫检测试剂盒测试结果的相关性
试验
1、试验样品
（1）供试样品：本发明实施例4所制备的脂联素检测试剂盒；
（2）对照样品：市售脂联素酶联免疫试剂盒（购自深圳市惠安生物科技有限公司）；
2、试验方法
以实施例4制备的脂联素检测试剂盒与市售脂联素酶联免疫试剂盒测定血清样本中的脂联素含量，对两个试剂盒测定的结果进行比较，并对测试结果进行回归分析，考察两种试剂盒检测结果的相关性。
3、试验结果
试验结果见图7。
从试验结果可见，本发明检测试剂盒与深圳市惠安生物科技有限公司生产的脂联素酶联免疫检测试剂盒测值相关性良好。
Claims (10)
1.一种脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；所述试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、保护剂、螯合剂和水；所述试剂Ⅱ的组分包括：包被脂联素抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂、保护剂和水。
2.按照权利要求1所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：所述包被脂联素抗体的胶乳颗粒的粒径为80-200nm，优选为130-170nm，最优选的粒径为140nm。
3.按照权利要求1或2所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：所述包被脂联素抗体的胶乳颗粒采用下述方法制备得到：
（1）洗涤胶乳：将活化缓冲液和表面活性剂依次加入到粒径为80-200nm的胶乳溶液中混合均匀，离心弃上清，保留沉淀；
（2）活化胶乳：将步骤（1）所得的胶乳沉淀用活化缓冲液复溶，超声震荡后加入溶有1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺及N-羟基硫代琥珀酰亚胺的活化缓冲液，混合均匀，置于恒温摇床上反应；
（3）淬灭反应：向步骤（2）的反应产物中加入2-巯基乙醇淬灭未反应的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺，混合均匀，继续置于恒温摇床上反应；
（4）致敏胶乳：向步骤（3）的反应产物中加入脂联素抗体溶液，震荡混合均匀，置于摇床上反应；
（5）封闭胶乳：向步骤（4）的反应产物中加入乙醇胺和甘氨酸溶液，置于摇床上反应后，再加入BSA溶液，置于摇床上反应；
（6）洗涤胶乳：将步骤（5）的反应产物离心，弃上清，用水重复洗涤沉淀，即得。
4.按照权利要求3所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：步骤（1）或（2）中所述的活化缓冲液为PBS缓冲液；步骤（1）中所述的表面活性剂是吐温-20；步骤（4）中所述的脂联素抗体为脂联素多克隆抗体和/或单克隆抗体。
5.按权利要求1所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：
试剂Ⅰ中所述的生物缓冲剂是三羟甲基氨基甲烷，试剂Ⅱ中所述的生物缓冲剂是3-（N-吗啉）丙磺酸；
所述的螯合剂是乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸或二亚乙基三胺五乙酸；
所述的防腐剂是叠氮化钠；
所述的稳定剂是氯化钠和/或蔗糖；
试剂Ⅰ中所述的表面活性剂是曲拉通100和/或Thesit，试剂Ⅱ中所述的表面活性剂是曲拉通100或/和吐温20；
所述促凝剂是聚乙二醇6000；
所述的封闭剂是牛血清白蛋白；
所述的助悬剂是乙二醇；
所述的保护剂是海藻糖。
6.按权利要求1所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂5-50g，螯合剂0.05-4g，防腐剂0.1-10g，稳定剂5-60g，表面活性剂1-20mL，促凝剂2-30g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被脂联素抗体的胶乳颗粒0.1-5g，生物缓冲剂1-40g，螯合剂0.5-10g，防腐剂0.5-5g，稳定剂30-100g，表面活性剂0.5-6mL，封闭剂5-30g，助悬剂5-50mL，保护剂8-70g，余量为水。
7.按权利要求6所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂10-30g，螯合剂0.5-3g，防腐剂0.5-3g，稳定剂10-30g，表面活性剂3-10mL，促凝剂5-15g；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被脂联素抗体的胶乳颗粒0.5-4g，生物缓冲剂5-20g，螯合剂1-4g，防腐剂0.5-2g，稳定剂40-80g，表面活性剂0.8-4mL，封闭剂8-15g，助悬剂7-15mL，保护剂10-30g。
8.按权利要求7所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂12g，螯合剂1g，防腐剂1g，稳定剂19g，表面活性剂5.5mL，促凝剂8g；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被脂联素抗体的胶乳颗粒1.5g，生物缓冲剂10.5g，螯合剂2g，防腐剂1g，稳定剂59g，表面活性剂1.5mL，封闭剂10g，助悬剂20mL，保护剂15g。
9.按照权利要求1-8任何一项的检测试剂盒，其特征在于：试剂Ⅰ的pH值的范围为7.2-8.5，试剂Ⅱ的pH值的范围为6.5-7.5。
10.一种制备权利要求1-8任何一项所述检测试剂盒的方法，包括：（1）制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；（2）制备试剂Ⅱ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；（3）将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
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