CN108548927A - 消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原ⅱ检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和标准品；试剂R1包括用于沉淀血清脂类的物质，所述用于沉淀血清脂类的物质包括聚乙烯醇硫酸钾,肝素‑Mn²⁺,硫酸葡聚糖‑Mg²⁺,硅钨酸和磷钼酸钠；试剂R2包括偶联抗体的胶乳颗粒；标准品是添加不同浓度胃蛋白酶原Ⅱ抗原的人血清基质缓冲液，用来与样本比较进行结果计算；该试剂盒不仅可以消除乳糜微粒的干扰，还可以消除高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和极高密度脂蛋白的干扰，使用简单快速，抗干扰能力强，能适应大规模人群普查的需求及日常临床快速、高通量检查的要求，便于临床推广。

Description

消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂 盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物分子检测领域，尤其涉及一种消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒。

背景技术

胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)是胃蛋白酶的无活性前体，是胃粘膜分泌的一种门冬氨酸蛋白酶前体，是分子量42000Da的单链多肽，在胃内转变为具有活性的胃蛋白酶。根据其生化性质和免疫原性将其分成2个亚群，1-5组分的免疫原性相同，称为胃蛋白酶原I，主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；组分 6和7被称为胃蛋白酶原Ⅱ，除由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液颈细胞以及十二指肠上段也能产生胃蛋白酶原Ⅱ。胃蛋白酶原是胃液中胃蛋白酶没有消化活性的前体物质，一般大部分的胃蛋白酶原进入胃腔，只有极少量(约1％)透过毛细血管进入血液。进入血液循环的PG在血液中非常稳定。

血清PG I和PG Ⅱ反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。当胃黏膜发生病理变化时，血清PG含量也随之改变。因此，监测血清中PG的浓度可以作为监测胃黏膜状态的手段。中国是胃癌的高发区，每年新发胃癌患者约40万人，死亡人数近30万人，其发病率和病死率居各种恶性肿瘤之首。早发现、早诊断、早治疗是降低胃癌病死率的关键措施之一，然而中国半数早期胃癌患者无任何症状，检出率低于5％。目前胃癌和其他胃部疾病的诊断仍依靠胃镜和组织病理学来确诊，但胃镜检查有一定痛苦，往往不为患者所接受，容易导致延误诊断和治疗。近年来，血清胃蛋白酶原含量变化与胃部疾病的关系以及其在胃癌早期诊断中的作用越来越引起人们的关注。

目前，市场上定量测定胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒有酶联免疫法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、化学发光微粒子免疫检测法、胶乳增强免疫比浊法等。酶联免疫标记法(ELISA)方法精确、定量、价格较低，具有很高的敏感性，但操作程序繁琐，耗时长，不能适应大规模体检筛查或急诊的需要；RIA方法灵敏度高，特异性强，但放射免疫反应是竞争性的反应，测得的值是相对量而非绝对量，且存在辐射和放射性污染；化学发光微粒子免疫检测法精确度高，检测速度快，但成本高昂，对配套设施要求高，无法应用于广大中、基层的医院和医疗卫生机构，而且有些项目假阳性率偏高；胶乳增强免疫比浊法，即通常所说的高敏测定方法，即是将待测物质相对应的抗体包被在直径为15-60nm的胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高试验的敏感性，该方法通过胶乳增强技术，解决了普通免疫比浊低浓度测定不够精确的问题，同时该试剂可以在普通生化分析仪使用，相对免疫散射速率法节约成本很多，具有操作简便快速、自动化、定量准确、敏感度高等优点，可满足门、急诊和大规模体检筛查等需要。

现有胶乳免疫比浊试剂，由于其检测原理是测定反应形成的免疫复合物的浊度，因此极易受到血清脂蛋白的干扰的影响，其中，血浆脂蛋白分为高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)及乳糜微粒(CM)和极高密度脂蛋白(VHDL)。因此，研制一种能够消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒显得十分必要。

目前应对这个问题的方法，主要是使用专门的消除剂对样本进行预处理，而在大规模的人群普查、健康体检筛查和临床病人检验时，对这些样本进行单独处理，将会极大地增加操作人员的工作量，提高运营成本，也为临床检验的组织安排带来难题；还有的是，对比文件1：申请号为“CN201410010900.4”，专利名称为“一种消除乳糜干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒”，该发明提供的试剂盒用于检测人血清中胃蛋白酶原Ⅱ的含量，灵敏度高、特异性好，可消除样本中的乳糜干扰，操作简便快捷，实用性强，适用范围广泛，但只能消除样本中的乳糜微粒(CM)干扰，而不能消除高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和极高密度脂蛋白(VHDL)的干扰，对于血清脂类的抗干扰能力尚有待提高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒，不仅可以消除乳糜微粒的干扰，还可以消除高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和极高密度脂蛋白的干扰，使用简单、快速，灵敏度高，不仅能够适应大规模人群普查的需求，也能满足日常临床快速、高通量检查的要求，适合产业化，便于临床推广。

本发明是这样实现的：

本发明目的之一在于提供一种消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和标准品；

所述试剂R1包括用于沉淀血清脂类的物质，所述用于沉淀血清脂类的物质包括聚乙烯醇硫酸钾,肝素-Mn²⁺,硫酸葡聚糖-Mg²⁺,硅钨酸和磷钼酸钠；

所述试剂R2包括偶联抗体的胶乳颗粒；

所述标准品是添加不同浓度胃蛋白酶原Ⅱ抗原的人血清基质缓冲液，用来与样本比较进行结果计算。

本发明的目的之二在于提供一种消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒的制备方法，包括根据所述的试剂R1和试剂R2的配方，分别配制所述试剂R1和所述试剂R2，其中所述试剂R2配制步骤包括，配制 R2缓冲液和配制1％偶联抗体的胶乳颗粒。

本发明提供的消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒，采用胶乳增强免疫比浊法定量检测人血清中胃蛋白酶原Ⅱ含量，且包括用于沉淀血清脂类的物质，可以消除血清脂类的干扰。其原理是：被测样本中的胃蛋白酶原Ⅱ与包被在胶乳颗粒上的抗人胃蛋白酶原Ⅱ单克隆和多克隆抗体发生抗原抗体反应，形成的抗原-抗体-胶乳颗粒的复合物交织成网状并发生凝集，导致浊度上升，保持反应体系中抗体过量时，检测此浊度在700nm波长处的吸光度，对照校准曲线即可求出样本中胃蛋白酶原Ⅱ的含量，即Ig浓度(g/L)＝ (样本管吸光度/校准管吸光度)×Ig校准浓度(g/L)。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

1、本发明首次公开了消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒，不仅可以消除乳糜微粒的干扰，还可以消除高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和极高密度脂蛋白的干扰，检测手段简单，对医疗设施要求不高，能应用于各种全自动、半自动生化分析仪。

2、本发明提供的消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒，对乳糜微粒(CM)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和极高密度脂蛋白(VHDL)的抗干扰能力强，不需要对样本进行预处理，节约了人力、资源，能够应用于大规模的体检筛查和人群普查，有利于项目的广泛开展；

3、本发明提供的消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒，与对照试剂盒(北京九强厂家的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒)对临床样本进行对比检测的数据分析，相关性良好，临床意义显著。

附图说明

图1为本发明提供的消除血清脂类干扰的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒的线性标准曲线；

图2为本发明提供的消除血清脂类干扰的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒和其他厂家的试剂盒相关性比较。

具体实施方式

实施例1 消除血清脂类干扰的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒的制备

一、试剂R1的制备：500mL

搅拌均匀用17％盐酸溶液(危化品)调pH为8.20±0.05(25℃)，即得到消除血清脂类干扰的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒试剂R1。

二、试剂R2的制备：

1、配制R2缓冲液200mL

检测pH值＝7.20±0.05(25℃)

2、配制封闭液50mL

封闭液1 称量

三乙醇胺60mL/L 3mL

甘氨酸150.14g/L 7.507g

用20％NaOH溶液(危化品)调pH为8.00±0.05(25℃)；

封闭液2 称量

牛血清白蛋白100g/L 5g

3、配制胶乳

(1)胶乳洗涤：用8mL的50mM HEPES pH 7.40缓冲液稀释2mL(胶乳230nm)，17900RPM离心45min，用2mL 50mM HEPES pH 7.40缓冲液复溶，制备好的胶乳充分搅拌；利用超声波分散(超声波破碎功率50Hz、时间5min、间隔30S)3次，得到混合均匀的胶乳微粒；

(2)活化剂溶液配制及活化：NHS、EDC活化剂：用50mM HEPES pH 7.40 缓冲液分别溶解成20mg/mL、40mg/mL，各取400μL在搅拌的过程中，滴加到胶乳溶液中，并充分搅拌；37℃，200转/min，反应30min；

(3)淬灭及胶乳洗涤：加入淬灭剂(3-巯基-1，2-丙二醇)用纯化水1：10 稀释后加入400μL 37℃200转/min淬灭10min,17900RPM离心45min，用各管活化缓冲液复溶，制备好的胶乳充分利用超声波分散；

(4)连接：分散后的胶乳溶液中，添加0.8mg抗人PG Ⅱ抗体-1、抗人PG Ⅱ抗体-2，并充分混合。37℃，转速为200转/分钟，反应2h；

(5)封闭：加入2mL封闭液1混合溶液后37℃200转/min反应30min，再加入2mL封闭液2，37℃200转/min反应30min

(6)胶乳洗涤、胶乳复溶、定容：17900rpm，离心45min后，用100mL 配制R2缓冲液复溶，即得到消除血清脂类干扰的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒试剂 R1。

三、胃蛋白酶原Ⅱ标准品的制备：在pH6.8、含有20mmol/L Tris-HCl缓冲物的预处理人血清基质缓冲液中，人血清比例为5％，加入浓度分别为0.0625、 0.125、0.25、0.5ng/ml自人体体液提取、纯化而得的，纯度≥95％的胃蛋白酶原Ⅱ抗原，搅拌均匀，作为胃蛋白酶原Ⅱ多点标准品。此外，预处理的人血清基质缓冲液中还包括2.5％氯化钠、0.8％EDTA、0.02％Proclin3000。

1、检测方法及实验参数如下：

分析方法：两点终点法；

试剂的用量：试剂R1和试剂R2用量分别为160μl和30μl；

样本的用量：6μl；

检测波长：700nm。

2、检测步骤：160μL试剂1加入6μl样本，于37℃5min后加入30μL试剂 R2后开始读点，反应5min后读取另一点，得到吸光度的差值。

绘制本实施例制备的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒标准品的标准曲线：

采用本实施例制备的4种不同含量，分别为0.0625、0.125、0.25、0.5、

1.0μg/mL的胃蛋白酶原Ⅱ标准品，在日立7080全自动生化分析仪上，按照上述检测步骤测得本发明PG Ⅱ标准品的标准曲线(如图1所示)。图1为本实施例制备的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒标准品的标准曲线中曲线上的每个点代表一个含量的标准品。其中X轴表示胃蛋白酶原Ⅱ的含量(ng/mL)；Y轴表示吸光度。

取待测样本，同样按照上述检测步骤检测样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可计算出待测样本中胃蛋白酶原Ⅱ的含量如下表1。备注：如果样本中胃蛋白酶原Ⅱ的浓度超出校准曲线范围，为了保证检测的准确性，需要对样本进行适当稀释后再进行检测。

表1

用本发明提供的消除血清脂类干扰的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒对样本进行检测时，测出样本管的吸光度，即可得出Ig浓度。Ig浓度(g/L)＝(样本管吸光度/校准管吸光度)×Ig校准浓度(g/L)。

实验例1 消除血清脂类干扰的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒的抗干扰能力

按照如下的操作方法本发明的试剂盒的抗血清脂蛋白干扰性能：

(1)收集较低范围的测值相近的无溶血、黄疸、乳糜、浑浊现象的人血清样本，进行混合，对该混合人血清样本进行测定，得到其胃蛋白酶原Ⅱ的值为 3.6ng/mL；

(2)按照下表1、表2所示，在混合人血清中添加不同浓度梯度的乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白四大类干扰物；

(3)分别使用本实施例免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒(本试验中，简称试剂盒A)和北京万泰德瑞诊断技术有限公司制备的PG Ⅱ检测试剂盒(即对比文件1，本试验中，简称试剂盒B)，对添加了不同血清脂蛋白单位浓度的血清样本进行对照测定，重复3遍，计算均值、干扰度，其中干扰度＝(测定均值-空白均值)/空白均值×100％，干扰度在±2％以内视为无干扰，干扰度超过±2％视为干扰。

表2试剂盒A检测添加不同浓度血清脂蛋白干扰物血清样本的结果

表3试剂盒B检测添加不同浓度血清脂类干扰物血清样本的结果

表1结果显示，随血清脂蛋白浊度从0到最大值的范围变化，试剂盒A的检测值偏差的变化较小，检测值与未添加干扰时检测值的偏差均在±2％以内，判定为不存在干扰。

表2结果显示，随血清脂蛋白浊度从0到最大值的范围变化，试剂盒B的检测值偏差也随之增大，当血清脂蛋白浓度增大时，检测值与未添加干扰时检测值的偏差均大于2％，判定为存在干扰。

相比现有的免疫比浊方法试剂盒，本发明提供的消除血清脂类干扰的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒明显提高了对乳糜微粒(CM)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和极高密度脂蛋白(VHDL) 的抗干扰能力。

实验例2 本发明提供的消除血清脂类干扰的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒和对照试剂盒的相关性分析

使用本实施例制备的PG Ⅱ检测试剂盒(本发明中，简称“本发明PG Ⅱ试剂盒”)，采用日立7080全自动生化分析仪，对300份无乳糜、溶血、黄疸、浑浊现象的新鲜人血清进行检测，和对照试剂盒(北京某厂家的胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒)的检测结果进行相关性分析。本发明PG Ⅱ试剂盒按照上述进行检测，其他厂家试剂盒按照其说明书进行检测，测定结果如表4所示。

表4本发明试剂盒与其他试剂盒临床比对数据

由上表4统计结果得出的直观图如附图2，有图2可以看出，北京某公司试剂盒和本发明试剂盒在结果判断上是一一对应的,并且两个单项结果及其比值都存在临床许可范围内的吻合。两种方法的原理和参考范围虽然有一定的区别，但是从临床应用的角度来判断，二者的相关性良好，临床意义显著。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和标准品；

所述试剂R1包括用于沉淀血清脂类的物质，所述用于沉淀血清脂类的物质包括聚乙烯醇硫酸钾,肝素-Mn²⁺,硫酸葡聚糖-Mg²⁺,硅钨酸和磷钼酸钠；

所述试剂R2包括偶联抗体的胶乳颗粒；

所述标准品是添加不同浓度胃蛋白酶原Ⅱ抗原的人血清基质缓冲液，用来与样本比较进行结果计算。

2.如权利要求1所述的消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒，其特征在于，

所述试剂R1还包括Tris、聚乙二醇6000、氯化钠和ProClin 300；

所述试剂R2还包括十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、牛血清白蛋白、Tween-20和ProClin 300。

3.如权利要求2所述的消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒，其特征在于，

所述试剂R1为：Tris 12.1g/L，聚乙二醇6000 1.2g/L，氯化钠2.7g/L，聚乙烯醇硫酸钾6g/L，肝素-Mn²⁺5.4g/L，硫酸葡聚糖-Mg²⁺2.7g/L，硅钨酸0.1g/mL，磷钼酸钠1～1.2％，ProClin 3001mL/L，用17％盐酸溶液调pH为8.20±0.05(25℃)；

所述试剂R2包括R2缓冲液和1％偶联抗体的胶乳颗粒，其中所述R2缓冲液包括十二水合磷酸氢二钠4.5g/L，二水合磷酸二氢钠0.48g/L，氯化钠0.9g/L，牛血清白蛋白1.0g/L，Tween-20 1.5mL/L，ProClin 3001mL/L。

4.一种消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒的制备方法，其特征在于，根据权利要求1-3任一所述的试剂R1和试剂R2的配方，分别配制所述试剂R1和所述试剂R2，其中所述试剂R2配制步骤包括，配制R2缓冲液和配制1％偶联抗体的胶乳颗粒。

5.如权利要求4所述的消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述配制偶联抗体的胶乳的具体步骤包括：

(1)胶乳洗涤：用缓冲液稀释胶乳；

(2)活化剂溶液配制及活化：配制NHS、EDC活化剂，用HEPES缓冲液分别溶解，在搅拌的过程中，分别滴加到胶乳溶液中，并充分搅拌；

(3)淬灭及胶乳洗涤：加入淬灭剂到活化胶乳，离心，用各管活化缓冲液复溶，制备好的胶乳充分利用超声波分散；

(4)连接：分散后的胶乳溶液中，添加抗人PGⅡ抗体-1、抗人PGⅡ抗体-2，并充分混合；

(5)封闭：加入封闭液混合溶液后反应，胶乳洗涤离心后，用R2缓冲液复溶胶乳即得到所述试剂R2。

6.如权利要求5所述的消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述胶乳洗涤中用50mM HEPES pH 7.40缓冲液稀释胶乳，胶乳为230nm的粒径。

7.如权利要求5所述的消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒的制备方法，其特征在于，配制NHS、EDC活化剂中用50mM HEPES pH 7.40缓冲液分别溶解成20mg/mL、40mg/mL，各取400μL在搅拌的过程中，滴加到胶乳溶液中，并充分搅拌，37℃，200转/min，反应30min。

8.如权利要求5所述的消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒的制备方法，其特征在于，淬灭及胶乳洗涤时加入的淬灭剂为3-巯基-1，2-丙二醇，所述淬灭剂用纯化水1：10稀释后，加入400μL到活化胶乳，37℃200转/min淬灭10min,17900RPM离心45min，用各管活化缓冲液复溶，制备好的胶乳充分利用超声波分散。

9.如权利要求5所述的消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒的制备方法，其特征在于：胶乳连接抗体时，分散后的胶乳溶液中，添加0.8mg抗人PGⅡ抗体-1、抗人PGⅡ抗体-2，并充分混合，37℃，转速为200转/分钟，反应2h。

10.如权利要求5所述的消除血清脂类干扰的胶乳免疫比浊法胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂盒的制备方法，其特征在于：封闭时，加入2mL封闭液1混合溶液后37℃200转/min反应30min，再加入2mL封闭液2，37℃200转/min反应30min，胶乳洗涤、用R2缓冲液复溶胶乳后定容，所述封闭液1包括三乙醇胺和甘氨酸，所述封闭液2包括牛血清白蛋白。