CN1888863A - 高密度脂蛋白胆固醇的定量测定方法、试剂及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种定量测定血清样品中高密度脂蛋白胆固醇含量的试剂,该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成,其中,所述试剂I含有多聚阴离子化合物、二价阳离子盐及分散型表面活性剂;所述试剂II含有苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚。此外,本发明还提供了一种装有本发明试剂I和试剂II的试剂盒,以及一种测定高密度脂蛋白胆固醇含量的方法。
Description
技术领域
本发明涉及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的定量测定方法、试剂及试剂盒。
背景技术
胆固醇等脂质在血清中与脱辅蛋白质配合生成脂蛋白。根据其物理性质的差异,脂蛋白被分为乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等。1977年Frammingham大规模的流行病学调查表明,血浆高密度脂蛋白胆固醇(血浆HDL-C)下降是缺血性心脏病的主要危险因素,自此以后,HDL-C的测定日益受到临床上的普遍重视。高密度脂蛋白(HDL)可以通过酶和受体的作用,将周围组织的胆固醇移至肝脏降解处理,同时抑止细胞结合和摄取低密度脂蛋白胆固醇,阻止胆固醇在动脉壁的沉积。因此,HDL-C被认为是动脉粥样硬化的预防因子。也就是因为这一原因,HDL-C的测定在动脉硬化症发病方面有重要的预测作用。
临床上,实验室直接分离、测定HDL-C含量的常规方法包括化学沉淀法、磁珠DS-Mg2+分离法和匀相测定法。
其中,化学沉淀法常用的沉淀剂为多聚阴离子,如磷钨酸(PTA)、硫酸葡聚糖(DS)、肝素,或去污剂如SDS、聚乙二醇与某些二价阳离子(如镁、钙、锰的二价阳离子)合用。
化学沉淀法测定HDL-C含量的具体步骤是,向待测血清样品中加入沉淀剂以凝集除HDL外的脂蛋白,离心分离除去凝集物,然后测量通过该分离所获得的仅含有HDL的血清胆固醇。由于该方法使用沉淀剂,同时需进行沉淀分离等操作,因此样本用量大,易产生误差的环节相对较多,尤其是无法实现整个分析步骤的完全自动化,因而限制了该项技术的使用。
磁珠DS-Mg2+分离法省去了化学沉淀法所必需的离心步骤,但需要使用特殊装置,而且该方法所使用的试剂不适于推广应用,因此其使用范围也受到相当的限制。
匀相测定法包括选择性抑制法、PEG修饰酶法、清除法、免疫分离法等。匀相测定法因其标本用量少,不需沉淀处理,可用自动生化分析仪进行测定,以及精确度和准确度适当而被临床广为采用。
匀相测定法中的选择性抑制法是通过应用两种不同的表面活性剂及多聚阴离子,根据脂蛋白的酶反应选择性,直接测定待测血清样品中的HDL-C。该方法所使用的试剂通常包括试剂I及试剂II两种。在进行测定时,首先加入试剂I。其中,试剂I含有多聚阴离子化合物、二价金属盐和分散型表面活性剂(亦称反应抑制剂)。待测血清样品中的CM、VLDL、LDL在多聚阴离子和二价金属盐的存在下发生凝聚。由于反应抑制剂与CM、VLDL、LDL的疏水性基团具有高度亲和力,故其吸附在凝聚的脂蛋白颗粒表面形成遮蔽圈,抑制该表面游离胆固醇的反应,与除HDL外的其他脂蛋白形成稳定的复合物。
与此同时,游离的HDL表面也吸附有少量的反应抑制剂,但由于二者的亲和力较弱,其结合是可逆的。随后加入的试剂II中含有对于HDL颗粒中亲水性基团具有高亲和力的可溶性表面活性剂(亦称反应促进剂)、胆固醇脂酶(ChER)、胆固醇氧化酶(ChoD)及反应显色剂。该促进剂对HDL表面的吸附不仅可以置换出HDL表面吸附的反应抑制剂,而且使全部HDL形成可溶性复合体,从而使HDL-C可直接与酶试剂反应,并继而在显色剂的作用下发色。而CM、VLDL、LDL在与反应抑制剂反应发生凝聚和结合后,不再与胆固醇脂酶和胆固醇氧化酶发生作用,因此对于经过上述处理的待测血清样品可以不进行分离而直接测定HDL-C的含量。
中国专利申请1268185A中公开了上述选择性抑制法直接测定HDL-C含量的方法和试剂。
但是,目前用于直接测定HDL-C含量的市售试剂均为进口产品,价格偏高。因此,研制适用于上述直接测定HDL-C含量的选择性抑制法,以及性能更为优良、价格更为低廉的试剂一直是所属领域技术人员努力的方向。
发明内容
我们在对血清脂蛋白中胆固醇的选择性直接测定方法进行多年研究以及反复实验后发现,一种特殊表面活性剂,苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚作为反应促进剂,可以充分置换HDL表面吸附的反应抑制剂,该反应促进剂可与HDL结合形成溶解性和反应性良好的可溶性复合体,保证HDL-C与所述酶试剂的反应,进而保证HDL-C含量的准确测定。
本发明的目的之一是,提供一种用于直接测定血清样品中HDL-C含量的试剂。所述试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成,其中,所述试剂I含有多聚阴离子化合物、二价金属阳离子盐和分散型表面活性剂;所述试剂II含有苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚。
本发明的另一个目的是,提供一种定量测定血清样品中HDL-C含量的试剂盒,其特征在于其中装有分别放置有前述试剂I及试剂II。
本发明的再一个目的是提供一种定量测定血清样品中HDL-C含量的方法。
具体实施方式
具体而言,本发明用于直接测定血清样品中HDL-C含量的试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成。
其中,所述试剂I含有多聚阴离子化合物、二价金属阳离子盐和分散型表面活性剂;所述试剂II含有苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚。
所述试剂I的作用在于抑制待测血清样品中的CM、VLDL、LDL与第二反应试剂中的胆固醇脂酶和胆固醇氧化酶反应。所述试剂I含有多聚阴离子表面活性剂、二价金属阳离子盐和分散型表面活性剂。
所述多聚阴离子表面活性剂的具体实例可以包括:环糊精硫酸盐、肝素硫酸盐、硫酸葡聚糖、磷钨酸钠、聚乙烯硫酸盐。所述多聚阴离子表面活性剂的浓度没有特别的限制,优选的浓度范围为0.1mmol/L-10mmol/L。
所述二价阳离子盐中的阳离子选自Mn2+、Mg2+和/或Ca2+。所述二价阳离子盐优选的浓度范围为0.1mmol/L-100mmol/L。
所述分散型表面活性剂选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐和烷基苯磺酸盐。所述分散型表面活性剂优选的浓度范围为0.1g/L-50g/L。
所述试剂I还可以含有下述物质,这些物质包括:pH缓冲液,如GOOD’S系列的2-吗啉代乙磺酸(MES)、3-吗啉代丙磺酸(MPOS)等;去干扰剂,如亚铁氰化钾、抗坏血酸氧化酶等;防腐剂,如迭氮钠等;4-氨基安替吡啉和/或显色剂。优选4-氨基安替吡啉与显色剂不同时存于试剂I中。
可用于本发明的显色剂包括:苯酚、4-氯苯酚、N-乙基-N-(-2羟基-3-磺丙基-)-间甲苯胺钠(TOOS)、N-(-2羟基-3-磺丙基-)-3、5-二甲氧基苯胺钠(HDAOS)等苯酚类衍生物显色剂,优选的浓度范围为0.01g/L-10g/L;
本发明所述试剂II含有反应促进剂。
所述反应促进剂为苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚,所述苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚为已知的市售表面活性剂,例如,可以以农乳601号(Pesticide Emulsifier 601#)的商品名(江苏金陵石化公司化工二厂生产)从市场上购得。该表面活性剂的使用浓度可以根据使用该试剂的分析仪的特性,以及完成HDL-C检测的需要而定。通常情况下,其使用浓度范围为1g/L-20g/L,优选的浓度范围为2g/L-8g/L。
所述试剂II还可以含有下述物质,这些物质包括:pH缓冲液,如GOOD’S系列的2-吗啉代乙磺酸(MES)、3-吗啉代丙磺酸(MPOS)等;去干扰剂,如亚铁氰化钾、抗坏血酸氧化酶等;防腐剂,如迭氮钠等;4-氨基安替吡啉和/或显色剂。优选4-氨基安替吡啉与显色剂不同时存于试剂II中。
本发明的试剂I和试剂II中还需含有下述定量酶试剂,这些酶试剂包括:胆固醇脂酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶。上述三种酶可以全部包含在试剂I中,也可以全部包含在试剂II中,或分别包含在试剂I或II中。其优选的浓度范围分别为0.1ku/L-100ku/L。
所述4-氨基安替吡啉在试剂I和II中应择一使用。其优选的浓度范围为0.01g/L-1g/L。
本发明所述定量测定HDL-C试剂盒中装有分别放置的上述试剂I和试剂II。
本发明所述直接测定血清样品中HDL-C含量的方法包括:首先向待测血清样品中加入试剂I,恒温定时孵育,测定一定波长下的吸光度A1。然后向样品中加入试剂II,继续孵育,在上述波长下测定吸光度A2。用同样的方法测定校准液的吸光度值A1’值与A2’值。血清样品中的HDL-C含量可通过下式计算得到:
HDL-C含量=(A1-A2)÷(A1’-A2’)×(校准液HDL-C浓度)
(mmol/L或mg/dL)
本发明所述校准液是与试剂盒或试剂配套使用的、以血请为基质的次级标准(也可称为定标物或校正物Calibrator),校准液的浓度与吸光度(OD)的关系可用于待测样品浓度的计算。
本发明的方法只需几微升血清,无需离心或电泳等分离处理,操作简便,可满足全自动分析的要求。
下面实施例是对本专利申请的具体描述,但是,本专利申请不限于这些实施例,这些实施例也不能解释为对本专利申请的限制。
实施例1:
一、按照下述成分和比例配制下述本发明试剂I及试剂II:
试剂I:
MOPS缓冲液,pH7.0 30mM
硫酸葡聚糖钠 1g/L
MgCl2·6H2O 2mM
显色剂TOOS 0.2g/L
NaN3 1g/L
环糊精硫酸盐 0.5g/L
试剂II:
MOPS缓冲液,pH7.0 30mM
4-氨基安替吡啉 0.1g/L
胆固醇酯酶(CEH) 1520u/L
胆固醇氧化酶(COD) 1070u/L
过氧化物酶(POD) 8000u/L
农乳剂601号 5g/L
NaN3 1g/L
二、在样品管中将300μl试剂I和3μl血清样品混合,在37℃下孵育5分钟,使用HITACHI7060全自动生化分析仪,在主波长600nm,副波长700nm处测定吸光度A1,然后向样品中加入100μl试剂II,混匀,在37℃下孵育5分钟后,测定同一波长下的吸光度A2。用同样的方法和条件测定校准液的吸光度值A1’值与A2’值,然后按下述公式计算样品的HDL-C含量:
HDL-C含量=(A1-A2)÷(A1’-A2’)×(校准液HDL-C浓度)
(mmol/L或mg/dL)
对低、中、高HDL-C含量的血清样品进行测定,重复测定20次,按照下述公式计算测定值的平均值(
x)和标准差(s):
x=∑x/n
然后按下述公式计算变异系数CV*:
CV%=s/
x×100%
其中,所述校准液为市售“直接高密度脂蛋白胆固醇校准液”(批号:中生230401,中生北控生物科技股份有限公司生产)
结果列于下表1。
表1
高值 | 中值 | 低值 | |
重复次数 | 20 | 20 | 20 |
平均值(mg/dL) | 69.96 | 56.2 | 39.69 |
s(mg/dL) | 0.59 | 0.36 | 0.27 |
CV(%) | 0.84 | 0.64 | 0.67 |
*变异系数(CV)通常用于衡量一项方法的精密度,变异系数越小,说明该方法越精密。CV小于5%的方法的精密度被认为是可以接受的。
表1中所有的CV均小于1%,表明本发明方法具有优良的精密度。
实施例2:
使用本发明实施例1试剂,按照实施例1所述方法和条件对11份健康人血清样品中的HDL-C含量进行测定。对同一样品同时使用市售沉淀法试剂盒(高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)磷钨酸-镁沉淀法试剂盒,批号:中生19051,中生北控生物科技股份有限公司生产)进行对照性定量测定,结果如下表2所示:
表2
样本号 | HDL-C(mg/dl) | |
本发明方法 | 沉淀法 | |
1 | 50 | 52 |
2 | 45 | 42 |
3 | 47 | 50 |
4 | 64 | 68 |
5 | 46 | 48 |
6 | 45 | 44 |
7 | 63 | 67 |
8 | 57 | 60 |
9 | 79 | 80 |
10 | 34 | 32 |
11 | 41 | 44 |
通过与沉淀法(对照方法)的相关性实验来衡量本方法的准确性。相关系数r表示两组数值的相关程度,r越接近1表明两组数据的相关性越好。通常认为r大于0.9时的相关性为良好。本方法与市售试剂盒沉淀法对于HDL-C含量的测定值的相关系数r=0.9878,表明本方法的准确性优良。
所述相关系数的计算方法如下:
其中,X为使用本发明方法测得的HDL-C含量浓度值;
X为上述测得的X值的平均数;
Y为使用沉淀法测得的HDL-C含量浓度值;
Y为上述测得的Y值的平均数。
根据上述测定结果我们可以得出这样的结论:本发明试剂在稳定性、重复性、准确性、线性等方面,均满足临床HDL-C含量分析要求,适用于直接测定新鲜血清或血浆中的HDL-C含量。
Claims (14)
1.一种定量测定血清样品中高密度脂蛋白胆固醇含量的试剂,该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成,其中,所述试剂I含有多聚阴离子化合物、二价金属阳离子盐和分散型表面活性剂;所述试剂II含有苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚。
2.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述多聚阴离子化合物选自:环糊精硫酸盐、肝素硫酸盐、硫酸葡聚糖、磷钨酸钠、聚乙烯硫酸盐。
3.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述二价阳离子盐的阳离子选自Mn2+、Mg2+和/或Ca2+。
4.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述分散型表面活性剂选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐和烷基苯磺酸盐。
5.根据权利要求2-4之一所述的试剂,其特征在于,所述多聚阴离子化合物的浓度范围为0.1mmol/L-10mmol/L;二价阳离子盐的浓度范围为0.1mmol/L-100mmol/L;分散型表面活性剂的浓度范围为0.1g/L-50g/L。
6.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚的浓度范围为1g/L-20g/L,优选2g/L-8g/L。
7.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述试剂I和试剂II还可以含有pH缓冲液、去干扰剂、防腐剂、4-氨基安替吡啉和/或显色剂。
8.根据权利要求7所述的试剂,其特征在于,所述pH缓冲液选自2-吗啉代乙磺酸、3-吗啉代丙磺酸;去干扰剂选自亚铁氰化钾、抗坏血酸氧化酶;防腐剂选自迭氮钠;显色剂选自苯酚、4-氯苯酚、N-乙基-N-(-2羟基-3-磺丙基-)-间甲苯胺钠、N-(-2羟基-3-磺丙基-)-3、5-二甲氧基苯胺钠;且4-氨基安替吡啉与显色剂不同时存于试剂I或试剂II中。
9.根据权利要求7或8所述的试剂,其特征在于,所述4-氨基安替吡啉的浓度范围为0.01g/L-1g/L;显色剂的浓度范围为0.01g/L-10g/L。
10.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述试剂I和试剂II中还含有选自胆固醇脂酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶的定量酶试剂。
11.根据权利要求10的试剂,其特征在于,所述三种酶可以全部包含在所述试剂I中,也可以全部包含在所述试剂II中,或分别包含在所述试剂I或所述试剂II中。
12.根据权利要求11的试剂,其特征在于,所述三种酶各自的浓度范围分别为0.1ku/L-100ku/L。
13.一种定量测定血清样品中高密度脂蛋白胆固醇含量的试剂盒,其特征在于其中装有分别放置的权利要求1-12所述的试剂I及试剂II。
14.一种定量测定血清样品中高密度脂蛋白胆固醇含量的方法,该方法包括首先向血清样品中加入所述试剂I,恒温定时孵育,测定一定波长下的吸光度A1;然后向样品中加入所述试剂II,继续孵育后,在上述波长下测定吸光度A2;用同样的方法测定校准液的吸光度值A1’值与A2’值;然后通过下式计算得到血清样品的HDL-C含量:
HDL-C含量=(A1-A2)÷(A1’-A2’)×(校准液HDL-C浓度)。
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