TWI731088B - 富含三酸甘油酯脂蛋白中之膽固醇之定量方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係揭示不需要繁雜操作，便可更特異性定量受檢試料中之富含三酸甘油酯脂蛋白中膽固醇(TRL-C)的方法及試藥。富含三酸甘油酯脂蛋白中膽固醇之定量方法，係包括有：藉由使分子量超過50kDa的膽固醇酯酶、及界面活性劑產生作用，而選擇性消除富含三酸甘油酯脂蛋白(TRL)以外的脂蛋白中之膽固醇的步驟(1)；針對殘存TRL中的膽固醇(TRL-C)進行定量的步驟(2)。

Description

富含三酸甘油酯脂蛋白中之膽固醇之定量方法
本發明係關於富含三酸甘油酯脂蛋白(以下亦稱「TRL」)中之膽固醇(以下稱「脂蛋白名」膽固醇或「脂蛋白名」-C時，係指「」內所記載脂蛋白中的膽固醇)的定量方法及定量試藥。
血液中所含的脂蛋白因為利用超高速離心分離施行的密度不同，因而區分為；乳糜微粒(chylomicron)、超低密度脂蛋白(以下亦稱「VLDL」)、中密度脂蛋白(以下亦稱「IDL」)、低密度脂蛋白(以下亦稱「LDL」)、高密度脂蛋白(以下亦稱「HDL」)。已知該等脂蛋白係三酸甘油酯、膽固醇等脂質、蛋白等之含有量不同，各自在活體內呈現不同的作用。
TRL係三酸甘油酯含有量較多的脂蛋白總稱，包含有：乳糜微粒、VLDL、該等的中間代謝產物、殘粒樣脂蛋白(remnant-like lipoprotein，RLP)，甚至亦有包含IDL的情況。
自習知起已知LDL、RLP係與動脈硬化性疾病之關聯性，以歐美為中心的報告指出含有IDL的TRL與促進動脈硬化性疾病進展 有密切關聯，備受矚目。
截至目前已知的TRL測定法，係有存在例如：超高速離心法、NMR法等。超高速離心係藉由離心利用脂蛋白的密度差而分層的方法，存在有：需要熟練的操作、耗費時日、且費用亦高的缺點。NMR法係利用核磁共振測量脂蛋白粒子數的方法，需要特殊機械，不具一般性。
TRL-C的其它測定方法係有如計算法。因為TRL亦可謂為LDL、HDL以外的脂蛋白，因而指從總膽固醇值中扣除掉LDL-C與HDL-C而求得。LDL-C的測定法係有如美國疾病管制中心的β-Quantification法(BQ法)，已然為國際基準法，該方法係將密度1.006~1.063g/cm3的脂蛋白設為LDL，因而BQ法的LDL-C中包含有IDL-C。所以，計算求取TRL-C時，當使用由BQ法所測定LDL-C的情況，IDL-C亦會被視為LDL-C而被扣除。以BQ法為基準而開發的其他LDL-C測定法，例如使用Friedewald式等的情況亦同樣。使用該等LDL-C的測定方法時，所計算出的TRL-C中並未含有IDL-C，難謂測定含有臨床具更高意義IDL的TRL。
所以，需求簡便且正確地定量含有IDL的TRL-C之方法及試藥之發明。
以下簡稱「TRL」、「TRL-C」的情況，分別係指含有IDL的TRL、含有IDL-C的TRL-C。
另外，屬於TRL-C其中一部分的RLP-C之測定方法，在專利文獻1~3中有報導。任一者均係可利用通用自動分析裝置進行測定的方法，但屬於僅測定RLP而已，係與測定全體TRL的本發明迥異。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利4456715號公報
[專利文獻2]日本專利5027648號公報
[專利文獻3]日本專利5766426號公報
本發明目的係提供：不需要繁雜操作，更特異性定量受檢試料中之TRL-C的方法及試藥。
本案發明者等經深入鑽研，結果針對含有各種脂蛋白的受檢體試料，在界面活性劑存在下，使分子量超過50kDa的膽固醇酯酶產生作用，則TRL以外的脂蛋白便會特異性產生反應。利用此項見解，構思到不用施行分離操作，便可簡便且正確地定量TRL-C，遂完成本發明。
即，本發明係如下。
[1]一種TRL-C之定量方法，係包括有：藉由使分子量超過50kDa的膽固醇酯酶、及界面活性劑產生作用，而選擇性消除富含三酸甘油酯脂蛋白(TRL)以外的脂蛋白中之膽固醇的步驟(1)；針對殘存TRL中的膽固醇(TRL-C)進行特異性定量的步驟(2)。
[2]如[1]所記載的方法，其中，上述步驟(1)所使用的上述界面活性劑係含有從聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇至少1種。
[3]如[1]或[2]所記載的方法，其中，上述步驟(1)所使用的上述界面活性劑係1種的情況，該界面活性劑係從HLB值12~14的聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇1種；當上述界面活性劑係2種以上的情況，該界面活性劑係含有從聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇至少1種，且依2種以上界面活性劑整體的HLB值成為12~14方式，組合2種以上的界面活性劑。
[4]如[1]~[3]中任一項所記載的方法，其中，上述步驟(2)係在界面活性劑存在下實施，該界面活性劑係含有從聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯月桂醚、月桂醇烷氧基化合物(lauryl alcohol alkoxylate)、聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇至少1種。
[5]如[2]~[4]中任一項所記載的方法，其中，上述聚氧乙烯多環苯醚係從聚氧乙烯苯乙烯化苯醚所構成群組中選擇至少1種。
[6]如[5]所記載的方法，其中，上述聚氧乙烯苯乙烯化苯醚係從聚氧乙烯二苯乙烯化苯醚所構成群組中選擇至少1種。
[7]如[1]~[6]中任一項所記載的方法，其中，上述步驟(1)係包括有：消除使膽固醇酯酶與膽固醇氧化酶產生作用，而生成的過氧化氫；上述步驟(2)係包括有：定量使膽固醇酯酶與膽固醇氧化酶產生 作用，而生成的過氧化氫。
[8]一種TRL-C之定量套件，係用於[1]~[7]中任一項所記載方法之TRL-C之定量套件；包括有上述步驟(1)所使用的分子量超過50kDa的膽固醇酯酶、及界面活性劑。
[9]如[8]所記載的套件，其中，上述步驟(1)所使用的上述界面活性劑，係含有從聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇至少1種。
[10]如[8]或[9]所記載的套件，其中，當上述步驟(1)所使用的上述界面活性劑係1種的情況，該界面活性劑係從HLB值12~14的聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇1種；當上述界面活性劑係2種以上的情況，該界面活性劑係含有從聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇至少1種，且依2種以上界面活性劑整體的HLB值成為12~14方式，組合2種以上的界面活性劑。
[11]如[8]~[10]中任一項所記載的套件，其中，上述步驟(2)係在界面活性劑存在下實施；上述套件係更進一步含有從：聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯月桂醚、月桂醇烷氧基化合物、聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇至少1種的上述界面活性劑。
[12]如[9]~[11]中任一項所記載的套件，其中，上述聚氧乙烯多環苯醚係從聚氧乙烯苯乙烯化苯醚所構成群組中選擇至少1種。
[13]如[12]記載的套件，其中，上述聚氧乙烯苯乙烯化苯醚係從聚氧乙烯二苯乙烯化苯醚所構成群組中選擇至少1種。
利用本發明可提供：針對受檢試料中的TRL-C，在不需要分離操作情況下，利用自動分析裝置便可簡便且正確定量的新穎方法及 供其使用的套件。
圖1係利用下述實施例4所記載本發明方法求得的TRL-C、與利用超高速離心法所求得TRL-C間之相關關係圖。
脂蛋白中所含的膽固醇係有如酯型膽固醇(膽固醇酯)、及游離型膽固醇。本發明中簡稱「膽固醇」的情況係涵蓋該等二者。
欲利用本發明方法定量的TRL-C，係指乳糜微粒(包含乳糜微粒殘粒在內)、VLDL(包含VLDL殘粒在內)、及包含IDL在內的脂蛋白中之膽固醇、即密度未滿1.019g/cm3的脂蛋白中之膽固醇。
供進行本發明方法的受檢試料，係在欲定量該試料中之TRL-C的前提下，其餘並無特別的限定，通常係血液(包含全血、血清及血漿)等體液、以及其稀釋物。
本發明中使用對脂蛋白「進行反應」用詞時，係指利用界面活性劑、酵素使脂蛋白的構造起變化，俾使酵素容易對內部的膽固醇產生作用。
本發明的步驟(1)中，係選擇性消除TRL以外的脂蛋白中之膽固醇。此處所謂「消除」係指將膽固醇分解，且該分解物在下一步 驟(2)中不會被檢測出。選擇性消除TRL以外的脂蛋白中所含膽固醇之方法，係可例如將使膽固醇氧化酶、特定膽固醇酯酶(容後述)，對受檢體試料產生作用，而生成的過氧化氫予以除去之方法。除去過氧化氫的方法係可例如：使過氧化氫酶產生作用而分解為水與氧的方法；或利用過氧化酶的作用，將例如與過氧化氫產生反應會生成的無色醌的氫供應體化合物，轉化為無色醌的方法等，惟並不僅侷限於該等。又，所謂「選擇性消除」係指經消除後所殘存膽固醇的90%以上、較佳94%以上、更佳97%以上為TRL中的膽固醇。經消除後所殘存膽固醇中，TRL中的膽固醇比例係利用下述實施例所具體記載，利用與依照超高速離心法的測定結果間之相關關係便可測定，若該相關關係達0.9以上時，便認定經消除後所殘存膽固醇中，TRL中的膽固醇比例達90%以上。
另外，第1步驟中，選擇性消除特定脂蛋白中之膽固醇的方法，廣泛採取LDL膽固醇之定量方法(例如WO98/47005等)、HDL膽固醇之定量方法(例如WO98/26090等)等，均屬於周知方法。本發明的步驟(1)亦是除使用後述特定膽固醇酯酶之外，其餘均可利用該等周知方法實施。
接著在步驟(2)中，針對上述步驟(1)未被消除而殘存TRL中的膽固醇施行酵素性定量。膽固醇的酵素性定量方法在該領域中已屬周知，例如將使膽固醇、與膽固醇氧化酶及膽固醇酯酶產生作用而生成的過氧化氫，利用過氧化酶與氫供應體及氫接受體轉變為醌色素，再針對該色素施行吸光度測定而定量的方法。該等係屬於廣泛 被採用的周知方法，上述WO98/47005、WO98/26090中亦有記載。
另外，當將步驟(1)中所生成的過氧化氫利用過氧化氫酶分解，而在步驟(2)中需要抑制該過氧化氫酶時，便在步驟(2)中，使用例如疊氮化鈉之類的過氧化氫酶抑制劑，抑制過氧化氫酶。
本發明的最大特徵在於：在界面活性劑存在下，使用分子量超過50kDa的膽固醇酯酶，消除TRL以外的脂蛋白中之膽固醇。在TRL內部係大量存在酯型膽固醇與三酸甘油酯，小型的小分子量膽固醇酯酶係可侵入至粒子內部並產生作用，但大型的大分子量膽固醇酯酶則因為三酸甘油酯成為立體障礙，而無法到達粒子內部的酯型膽固醇，推測可能無法產生作用。
膽固醇酯酶及其次單元(subunit)的分子量係利用屬於常法的SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)進行測定。如周知，SDS-PAGE係還原條件下的電泳，因而當膽固醇酯酶係由複數次單元構成的情況，因為膽固醇酯酶會解離為各次單元，因而可測定各次單元的分子量。另一方面，當膽固醇酯酶未具次單元時，便測定膽固醇酯酶的分子量。即，本發明所規定的膽固醇酯酶分子量，當膽固醇酯酶具有次單元的情況便為該次單元的分子量，而當未具次單元的情況便為膽固醇酯酶的分子量。
分子量超過50kDa的膽固醇酯酶已有由旭化成製藥公司、KIKKOMAN公司等市售物，可使用於本發明。另外，因為分子量 在50kDa以下的膽固醇酯酶亦有各種市售物，若將市售物使用於本發明，便必需選擇使用分子量超過50kDa的膽固醇酯酶。
本發明的膽固醇酯酶係只要至少本發明步驟(1)含有分子量超過50kDa之膽固醇酯酶便可，在步驟(2)中亦可沿用步驟(1)所使用者，亦可追加新的相同膽固醇酯酶，亦可追加不同分子量的膽固醇酯酶。
本發明的步驟(1)與步驟(2)係含有至少1種界面活性劑。若使用較佳的界面活性劑，便可促進各步驟中的酵素反應。
本發明步驟(1)的較佳界面活性劑係可例如從聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇至少1種。聚氧乙烯多環苯醚中，較佳係聚氧乙烯苯乙烯化苯醚、更佳係聚氧乙烯二苯乙烯化苯醚，在從聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇之前提下，並不僅侷限於該等。
本發明步驟(1)可使用界面活性劑的具體例，聚氧乙烯多環苯醚係可例如：NEWCOL 707、NEWCOL 708、NEWCOL 709、ADEKATOL SP-12(ADEKA製)；聚氧乙烯苯乙烯化苯醚係可例如：BLAUNON DSP-12.5、BLAUNON TSP-16(以上均係青木油脂製)、NOIGEN EA-137(第一工業製藥製)；聚氧乙烯二苯乙烯化苯醚係可例如EMULGEN A60(花王製)。該等界面活性劑係可單獨使用、亦可組合使用2種以上。
本發明步驟(1)所使用界面活性劑的HLB值較佳係12~14，可為單1種界面活性劑且HLB值12~14，亦可為含有2種以上HLB值非為12~14但界面活性劑整體的HLB值成為12~14之組合。上述界面活性劑的具體例係HLB值均在12~14範圍內者全部，但當組合2種以上界面活性劑時，可含有界面活性劑HLB值12~14的界面活性劑、亦可未含有，本發明步驟(1)可使用的界面活性劑並不僅侷限上述具體例。
本發明步驟(2)較佳適用的界面活性劑最好係對所有的脂蛋白均會產生反應的界面活性劑，可例如從聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯月桂醚、月桂醇烷氧基化合物、聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇至少1種。更具體係可例如：EMULGEN 707、EMULGEN 709、EMULGEN 108(以上均係花王製)、ADEKATOL LB83、ADEKATOL LB103、ADEKATOL LB720(以上均係ADEKA製)、BLAUNON DSP-9(青木油脂製)、NOIGEN EA-87(第一工業製藥製)等。
本發明所使用界面活性劑在反應液中的濃度較佳係0.05%~5%、更佳係0.1%~1%、特佳係0.1%~0.75%。另外，本說明書中，「%」在無特別聲明前提下係指「質量%」。
本發明可使用的膽固醇氧化酶係在具有將膽固醇予以氧化而生成過氧化氫能力的酵素前提下，其餘並無特別的限定，可例如源自動物或微生物的膽固醇氧化酶。該等係可利用基因操作製作，有無化學修飾皆可。
本發明步驟(1)係可使用磷脂酶、亦可未使用，磷脂酶的具體例係可例如：磷脂酶C(PLC)、神經髓磷脂酶(SPC)、磷脂酸肌醇特異的磷脂酶C(PI-PLC、以上均係旭化成製藥公司製)；神經髓磷脂酶(源自仙人掌桿菌)、神經髓磷脂酶(源自金黃色葡萄球菌)、磷脂酸肌醇特異的磷脂酶C(源自仙人掌桿菌，以上均係SIGMA公司製)等，惟並不僅侷限於該等。另外，藉由使用磷脂酶，便可在步驟(1)中促進消除TRL以外的脂蛋白中之膽固醇。
本發明所使用膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶及磷脂酶等各酵素的使用量，並無特別的限制，可適當設定，通常係使用0.001U~2000U/mL、較佳係使用0.1~1000U/mL。
本發明所使用的氫供應體較佳係苯胺衍生物，而苯胺衍生物係可例如：N-乙基-N-(2-羥-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羥-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-(3-磺丙基)苯胺(HALPS)、N-(3-磺丙基)-3-甲氧基-5-苯胺(HMMPS)等。
氫接受體係可使用4-胺基安替比林(4-aminoantipyrine)、甲基苯并噻唑酮腙(methyl benzothiazolone hydrazine，MBTH)等。
本發明的各步驟較佳係於pH5~pH10實施、更佳係於pH6~pH8 實施。
反應溫度係各步驟均最好於2℃~45℃實施、更佳係於25℃~40℃實施。反應時間係各步驟均依1~10分鐘實施、更佳係依3~7分鐘實施。
實施本發明定量方法時，可將所使用試藥分為複數試藥組成物。本發明中，試藥係可調製為例如：供執行消除TRL以外的脂蛋白中之膽固醇的步驟(即步驟(1))用之試藥組成物；以及供測定TRL中之膽固醇的步驟(即步驟(2))用之試藥組成物等2種試藥組成物。
供執行步驟(1)的試藥組成物係至少含有分子量超過50kDa的膽固醇酯酶、與上述界面活性劑。該試藥組成物中最好更進一步含有例如：膽固醇氧化酶、苯胺衍生物等氫供應體、消除過氧化氫的過氧化氫酶等。
供執行步驟(2)用的試藥組成物係至少含有上述界面活性劑。該試藥組成物中可更進一步含有4-胺基安替比林等氫接受體、過氧化酶等。
在供執行步驟(1)用的試藥組成物、及供執行步驟(2)用的試藥組成物中，視需要亦可添加一價陽離子(例如一價金屬離子)、二價陽離子(例如二價金屬離子)或該等的鹽、多價陰離子(例如肝素、葡聚 糖硫酸鹽(dextran sulfate)、磷鎢酸鹽)、血清白蛋白。又，各試藥組成物的pH係中性附近(例如pH5~pH9)、較佳係pH6~8，只要添加緩衝液調整pH便可。
當利用本發明方法定量TRL中的膽固醇時，只要在受檢體試料中添加供執行步驟(1)用的試藥組成物而使產生反應，接著添加供執行步驟(2)用的試藥組成物並使產生反應，再藉由測定吸光度便可實施。
以下，針對本發明根據實施例進行具體說明，惟本發明並不僅侷限於下述實施例。
[實施例] [實施例1]
供執行步驟(1)用的試藥組成物A(實施例2以後將供執行步驟(1)用的試藥組成物，稱「試藥組成物A」)、供執行步驟(2)用的試藥組成物B(實施例2以後將供執行步驟(2)用的試藥組成物，稱「試藥組成物B」)，係依如下述調製。
試藥組成物A
Figure 106117150-A0101-12-0013-1
Figure 106117150-A0101-12-0014-2
試藥組成物B
Figure 106117150-A0101-12-0014-3
在血清試料3μL中添加試藥組成物A：150μL，於37℃下反應5分鐘後，添加試藥組成物B：50μL並使進行5分鐘反應，測定主波長600nm、副波長700nm下的吸光度。比較對象法係與利用超高速離心法測定的TRL-C濃度進行比較，相關係數係如表1所示。
Figure 106117150-A0101-12-0014-4
如表1所示，當步驟(1)使用超過50kDa之膽固醇酯酶時，則與超高速離心法呈良好的相關性。
[實施例2]
試藥組成物A及試藥組成物B係依如下述調製。
試藥組成物A
Figure 106117150-A0101-12-0015-5
※組合2種以上時合計0.25%(w/v)
試藥組成物B
Figure 106117150-A0101-12-0015-6
在血清試料3μL中添加試藥組成物A：150μL，於37℃下反應5分鐘後，添加試藥組成物B：50μL並使進行5分鐘反應，測定主波長600nm、副波長700nm下的吸光度。比較對象法係與利用超高速離心法測定的TRL-C濃度進行比較，相關係數係如表2所示。
Figure 106117150-A0101-12-0016-7
如表2所示，當步驟(1)使用從HLB值12~14之聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇的界面活性劑時，則與超高速離心法呈良好相關性。又，即便從單獨使用時無法獲得良好相關性，HLB值非為12~14的聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇的界面活性劑，若依全體HLB值成為12~14的方式組合時，仍可與超高速離心法呈現良好相關性。
[實施例3]
試藥組成物A及試藥組成物B係依如下述調製。
試藥組成物A
Figure 106117150-A0101-12-0016-8
Figure 106117150-A0101-12-0017-9
試藥組成物B
Figure 106117150-A0101-12-0017-11
在血清試料3μL中添加試藥組成物A：150μL，於37℃下反應5分鐘後，添加試藥組成物B：50μL並使進行5分鐘反應，測定主波長600nm、副波長700nm下的吸光度。比較對象法係與利用超高速離心法測定的TRL-C濃度進行比較，相關係數係如表3所示。
Figure 106117150-A0101-12-0018-12
如表3所示，當步驟(1)係使用0.1~1.0w/v%之從聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇界面活性劑時，則與超高速離心法呈良好相關性。又，若該界面活性劑的濃度為0.1~0.75w/v%，則與超高速離心法呈更良好相關性。
[實施例4]
試藥組成物A及試藥組成物B係依如下述調製。
試藥組成物A
Figure 106117150-A0101-12-0018-13
聚氧乙烯二苯乙烯化苯醚[HLB：12.8] 0.4%(w/v)
試藥組成物B
Figure 106117150-A0101-12-0019-14
在血清試料3μL中添加試藥組成物A：150μL，於37℃下反應5分鐘後，添加試藥組成物B：50μL並使進行5分鐘反應，測定主波長600nm、副波長700nm下的吸光度。比較對象法係與利用超高速離心法測定的TRL-C濃度進行比較，相關圖係圖1所示。
如圖1所示，本發明所測定的TRL-C係與超高速離心法呈良好相關性。
[實施例5]
試藥組成物A及試藥組成物B係依如下述調製。
試藥組成物A
Figure 106117150-A0101-12-0019-15
Figure 106117150-A0101-12-0020-16
試藥組成物B
Figure 106117150-A0101-12-0020-17
在血清試料3μL中添加試藥組成物A：150μL，於37℃下反應5分鐘後，添加試藥組成物B：50μL並使進行5分鐘反應，測定主波長600nm、副波長700nm下的吸光度。比較對象法係與利用超高速離心法測定的TRL-C濃度進行比較，相關係數係如表4所示。
Figure 106117150-A0101-12-0020-18
如表4所示，若步驟(2)係使用從聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯月桂醚、月桂醇烷氧基化合物所構成群組中選擇的界面活性劑時，則與超高速離心法呈良好相關性。

Claims (6)

  1. 一種TRL-C之定量方法，係包括有：藉由使分子量超過50kDa的膽固醇酯酶、及界面活性劑產生作用，而選擇性消除富含三酸甘油酯脂蛋白(TRL)以外的脂蛋白中之膽固醇的步驟(1)；與針對殘存TRL中的膽固醇(TRL-C)進行定量的步驟(2)；上述步驟(1)所使用的上述界面活性劑係含有從聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇之至少1種；上述步驟(2)中亦使用分子量超過50kDa的膽固醇酯酶。
  2. 如請求項1之方法，其中，在上述步驟(1)所使用的上述界面活性劑為1種的情況，該界面活性劑係從HLB值12~14的聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇1種；在上述界面活性劑為2種以上的情況，該界面活性劑係含有從聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇至少1種，且依2種以上界面活性劑整體的HLB值成為12~14方式，組合2種以上的界面活性劑。
  3. 如請求項1或2之方法，其中，上述步驟(2)係在界面活性劑存在下實施，該界面活性劑係含有從聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯月桂醚、月桂醇烷氧基化合物(lauryl alcohol alkoxylate)、聚氧乙烯多環苯醚所構成群組中選擇至少1種。
  4. 如請求項1之方法，其中，上述聚氧乙烯多環苯醚係從聚氧乙烯苯乙烯化苯醚所構成群組中選擇至少1種。
  5. 如請求項4之方法，其中，上述聚氧乙烯苯乙烯化苯醚係從聚氧乙烯二苯乙烯化苯醚所構成群組中選擇至少1種。
  6. 如請求項1或2之方法，其中，上述步驟(1)係包括有消除使膽固醇酯酶與膽固醇氧化酶產生作用而生成的過氧化氫；上述步驟 (2)係包括有：定量使膽固醇酯酶與膽固醇氧化酶產生作用而生成的過氧化氫。
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