ES2968257T3 - Método y reactivo para cuantificar el colesterol en lipoproteína rica en triglicéridos - Google Patents

Método y reactivo para cuantificar el colesterol en lipoproteína rica en triglicéridos Download PDF

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Makoto Ikaida
Yuhko Hirao
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Description

DESCRIPCIÓN
Método y reactivo para cuantificar el colesterol en lipoproteína rica en triglicéridos
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método y a un reactivo para cuantificar el colesterol (en lo sucesivo en el presente documento, cuando se exprese como colesterol de "nombre de lipoproteína" o "nombre de lipoproteína"-C, significa el colesterol en la lipoproteína descrita entre comillas) en lipoproteína rica en triglicéridos (en lo sucesivo en el presente documento, también denominada "LRT").
Antecedentes de la técnica
Las lipoproteínas presentes en la sangre se clasifican, de acuerdo con la diferencia en las densidades observada en la ultracentrifugación, en quilomicrón, lipoproteína de muy baja densidad (en lo sucesivo en el presente documento, también denominada "VLDL", por sus siglas en inglés), lipoproteína de densidad intermedia (en lo sucesivo en el presente documento, también denominada "IDL", por sus siglas en inglés), lipoproteína de baja densidad (en lo sucesivo en el presente documento, también denominada "LDL", por sus siglas en inglés) y lipoproteína de alta densidad (en lo sucesivo en el presente documento, también denominada "HDL", por sus siglas en inglés). Se sabe que estas lipoproteínas contienen cantidades variables de lípidos y proteínas, tales como los triglicéridos y el colesterol, cada uno presentando diferentes accionesin vivo.
LRT es un nombre genérico para las lipoproteínas con alto contenido en triglicéridos, incluyendo quilomicrón, VLDL, metabolitos intermedios de los mismos y partículas de lipoproteínas similares a remanentes (RLP, por sus siglas en inglés) y también pueden incluir IDL.
Hasta ahora, se conoce la implicación de las LDL y RLP en la enfermedad arteriosclerótica. Se ha notificado que las LRT, incluyendo IDL, están profundamente implicadas en el desarrollo de la enfermedad arteriosclerótica, principalmente en Europa y Estados Unidos y ha llamado la atención.
Los métodos de medición de LRT actualmente conocidos incluyen el método de ultracentrifugación y el método de RMN. El método de ultracentrifugación es un método que utiliza la diferencia en las densidades de las lipoproteínas sometidas a centrifugación; tiene las desventajas de que requiere habilidad y jornadas de trabajo y un coste elevado. El método de RMN es un método para medir el número de partículas de lipoproteínas mediante resonancia magnética, necesita instrumentos especiales y por tanto, no es común.
Otros métodos para medir LRT-C incluyen un método de cálculo. Dado que las LRT también pueden considerarse lipoproteínas distintas de LDL y HDL, el nivel de LRT-C se calcula restando los niveles de LDL-C y HDL-C del nivel total de colesterol. Como método para medir el LDL-C, el método estándar internacional es el método de cuantificación p (método BQ, por sus siglas en inglés) de los Centros para el control de enfermedades de EE. UU. Sin embargo, dado que este método considera lipoproteínas que tienen una densidad de 1,006 a 1,063 g/cm3 como LDL, el LDL-C en el método BQ incluye el IDL-C. Por tanto, cuando el LRT-C se calcula utilizando el LDL-C medido mediante el método BQ, el IDL-C también se resta como LDL-C. Esto también se aplica a otros métodos de medición de LDL-C que se correlacionan con el método BQ, tal como la ecuación de Friedewald. Al utilizar estos métodos de medición de LDL-C, dado que el LRT-C calculado no incluye IDL-C, la LRT que incluye IDL, que se dice que es más significativa clínicamente, no se mide.
Por tanto, existe la necesidad de inventar un método y un reactivo para cuantificar de manera conveniente y precisa el LRT-C, que incluya IDL.
En lo sucesivo en el presente documento, cuando se describe simplemente como LRT y LRT-C, se refieren a LRT que incluye IDL y LRT-C que incluye IDL-C, respectivamente.
Se han notificado métodos para medir RLP-C, una parte de LRT-C, en los Documentos de patente 1 a 4. Todos los métodos permiten la medición utilizando un analizador automático de uso general, pero dado que en los métodos solo se miden RLP, son diferentes de la presente invención, en la que se mide la LRT completa.
REFERENCIAS DE LA TÉCNICA ANTERIOR
DOCUMENTOS DE PATENTE
Documento de patente 1: JP 4456715 B
Documento de patente 2: JP 5027648 B
Documento de patente 3: JP 5766426 B
Documento de patente 4: US 2009/170139 A1
Sumario de la invención
[Problemas a resolver con la invención]
Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para cuantificar LRT-C en una muestra de prueba de una manera más específica, sin requerir operaciones laboriosas.
Medios para resolver los problemas
Los presentes inventores estudiaron intensamente para hallar que la colesterol esterasa que tiene un peso molecular de más de 50 kDa y a la que se permite actuar sobre una muestra de prueba, que contiene diversos tipos de lipoproteínas en presencia de un(os) tensioactivo(s), reacciona específicamente con lipoproteínas distintas de la LRT. Los presentes inventores concibieron que el uso de este hallazgo permite una cuantificación conveniente y precisa de LRT-C sin una operación de separación, completando de este modo la presente invención.
Es decir, la presente invención proporciona lo siguiente.
[1] Un método para cuantificar el colesterol en lipoproteínas ricas en triglicéridos (LRT-C), en donde el LRT-C es colesterol en quilomicrones y remanentes de los mismos, colesterol en VLDL y remanentes del mismo y colesterol en IDL, comprendiendo el método las etapas de:
(1) eliminación de forma selectiva del colesterol en lipoproteínas distintas de la lipoproteína rica en triglicéridos (LRT), permitiendo que actúe una esterasa de colesterol que tiene un peso molecular de más de 50 kDa, medido mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y un(os) tensioactivo(s); y
(2) cuantificación de forma específica del LRT-C restante,
en donde en los casos en los que dicho tensioactivo usado en dicha etapa (1) es un tensioactivo, dicho tensioactivo es uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter policíclico, que tiene un valor de HLB de 12 a 14; y
en donde en los casos en los que se usan dos o más tensioactivos, dichos tensioactivos comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter policíclico y los dos o más tensioactivos se combinan de manera que los tensioactivos combinados tengan un valor de h Lb total de 12 a 14.23456789
[2] El método de acuerdo con el punto [1], en donde la etapa (2) se lleva a cabo en presencia de un(os) tensioactivo(s) y en donde el (los) tensioactivo(s) comprende(n) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen alquil éter, polioxietilen lauril éter, alcoxilato de alcohol laurílico y polioxietilen fenil éter policíclico.
[3] El método de acuerdo con el punto [2], en donde el polioxietilen fenil éter policíclico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter estirenado.
[4] El método de acuerdo con el punto [3], en donde el polioxietilen fenil éter estirenado es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter distirenado.
[5] El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos [1] a [4], en donde la etapa (1) comprende permitir que actúen la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa y a continuación, descomponer el peróxido de hidrógeno producido; y en donde la etapa (2) comprende permitir que actúen la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa y a continuación, cuantificar el peróxido de hidrógeno producido.
[6] Uso de un kit en un método de cuantificación de colesterol en lipoproteína rica en triglicéridos LRT-C, de acuerdo con cualquiera de los puntos [1] a [5], el kit que comprende la colesterol esterasa que tiene un peso molecular de más de 50 kDa, medido mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y el (los) tensioactivo(s) usado(s) en la etapa (1) del método,
en donde en los casos en los que dicho tensioactivo usado en dicha etapa (1) es un tensioactivo, dicho tensioactivo es uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter policíclico, que tiene un valor de HLB de 12 a 14; y
en donde en los casos en los que se usan dos o más tensioactivos, dichos tensioactivos comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter policíclico y los dos o más tensioactivos se combinan de manera que los tensioactivos combinados tengan un valor de HLB total de 12 a 14.
[7] El uso de acuerdo con el punto [6], en donde el kit comprende además un(os) tensioactivo(s) para usar en la etapa (2), tensioactivo(s) que es (son) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen alquil éter, polioxietilen lauril éter, alcoxilato de alcohol laurílico y polioxietilen fenil éter policíclico.
[8] El uso de acuerdo con el punto [7], en donde el polioxietilen fenil éter policíclico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter estirenado.
[9] El uso de acuerdo con el punto [8], en donde el polioxietilen fenil éter estirenado es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter distirenado.
Efectos de la invención
Mediante la presente invención, se proporciona un método novedoso mediante el cual el LRT-C en una muestra de prueba se puede cuantificar de manera conveniente y precisa, con un analizador automático, sin requerir ninguna operación de separación y el uso de un kit para el mismo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una correlación entre el LRT-C determinado mediante el método de la presente invención descrito en el Ejemplo 4 a continuación y el LRT-C determinado mediante el método de ultracentrifugación.
Modo de llevar a cabo la invención
El colesterol contenido en las lipoproteínas incluye el colesterol esterificado (colesterol éster) y el colesterol libre. Como se utiliza en el presente documento, el término "colesterol" se utiliza simplemente, el término incluye tanto el colesterol esterificado como el colesterol libre.
El LRT-C a cuantificar mediante el método de la presente invención significa colesterol en lipoproteínas que son quilomicrones (incluido el remanente de quilomicrones), VLDL (incluido el remanente de VLDL) e IDL, es decir, colesterol en lipoproteínas que tienen densidades inferiores a 1,019 g/cm3
Como muestra de prueba a someter al método de la presente invención, se puede utilizar cualquier muestra de prueba que contenga LRT-C a cuantificar y la muestra de prueba suele ser un fluido corporal, tal como sangre (incluyendo sangre entera, suero y plasma) o una dilución de los mismos, pero la muestra de prueba no se limita a esto.
El término "reaccionar" con una lipoproteína, como se utiliza en el presente documento, significa que la estructura de la lipoproteína cambia mediante un tensioactivo y/o una enzima y es probable que una enzima actúe sobre el colesterol interno.
En la etapa (1) en la presente invención, el colesterol en lipoproteínas distintas de LRT se elimina específicamente. En el presente documento, el término "eliminado" significa descomponer el colesterol y hacer que los productos descompuestos sean indetectables en la etapa (2) posterior. Un ejemplo de método para eliminar específicamente el colesterol contenido en lipoproteínas distintas de LRT implica permitir que la colesterol oxidasa, una esterasa de colesterol específica (descrita más adelante), actúe sobre una muestra de prueba y descomponga el peróxido de hidrógeno producido. Los métodos para descomponer el peróxido de hidrógeno incluyen, pero sin limitación, un método para permitir que la catalasa actúe sobre el peróxido de hidrógeno y lo descomponga en agua y oxígeno; y un método de conversión, por ejemplo, un compuesto donante de hidrógeno que produce una quinona incolora en respuesta al peróxido de hidrógeno, en la quinona incolora por la acción de la peroxidasa. La expresión "eliminar específicamente" significa que un 90 % o más, preferentemente un 94 % o más, más preferentemente un 97 % o más, del colesterol restante después de la eliminación es colesterol en LRT. El porcentaje de colesterol en LRT entre el colesterol restante después de la eliminación puede determinarse basándose en la correlación con los resultados de medición obtenidos en el método de ultracentrifugación, como se describe en detalle en los Ejemplos siguientes. Cuando la correlación es 0,9 o más, se supone que un 90 % o más del colesterol que queda después de la eliminación es colesterol en LRT.
El método de eliminar específicamente el colesterol en lipoproteínas específicas, como en la primera etapa, está ampliamente adoptado, por ejemplo, en un método para determinar el colesterol LDL (por ejemplo, documento WO98/47005) y en un método para determinar el colesterol HDL (por ejemplo, documento WO98/26090) y es bien conocido. La etapa (1) en la presente invención también se puede llevar a cabo de la misma manera que estos métodos bien conocidos, excepto que se usa una colesterol esterasa particular que se describe más adelante.
Posteriormente, en la etapa (2) se cuantifica enzimáticamente el colesterol en LRT que queda sin que sea eliminado en la etapa (1) anteriormente descrita. El método de cuantificar el colesterol enzimáticamenteper sees bien conocido en la técnica, incluyendo un método que comprende permitir que la colesterol oxidasa y la colesterol esterasa actúen sobre el colesterol; convertir el peróxido de hidrógeno producido en colorante de quinona mediante peroxidasa y donante de hidrógeno y aceptor de hidrógeno; y determinar la absorbancia y cuantificar el colorante. Este es un método ampliamente utilizado y conocido y también se describe en los documentos WO98/47005 y WO98/26090 antes mencionados.
Cuando el peróxido de hidrógeno producido en la etapa (1) se descompone mediante catalasa y es necesario inhibir la catalasa en la etapa (2), la catalasa se inhibe usando un inhibidor de catalasa tal como azida sódica en la etapa (2).
El rasgo más característico de la presente invención reside en la eliminación del colesterol en lipoproteínas distintas de LRT con una colesterol esterasa que tiene un peso molecular superior a 50 kDa en presencia de un tensioactivo. Se asume que los triglicéridos presentes en LRT en grandes cantidades junto con el colesterol esterificado obstaculizan estéricamente una colesterol esterasa de gran peso molecular y evitan que alcance y actúe sobre el colesterol esterificado dentro de las partículas, si bien una colesterol esterasa de pequeño peso molecular puede penetrar en el interior de las partículas y actuar.
Los pesos moleculares de la colesterol esterasa y sus subunidades se determinan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS convencional (SDS-PAGE). Como es bien sabido, dado que SDS-PAGE es un método de electroforesis en condiciones reductoras, cuando la colesterol esterasa está compuesta de múltiples subunidades, la colesterol esterasa se descompone en subunidades y así se determinan los pesos moleculares de las distintas subunidades. Por otra parte, cuando la colesterol esterasa no tiene subunidad, se mide el peso molecular de la colesterol esterasa. Por tanto, el peso molecular de la colesterol esterasa en la presente invención se define como los pesos moleculares de las subunidades, cuando la colesterol esterasa tiene las subunidades o como el peso molecular de la colesterol esterasa, cuando la colesterol esterasa no tiene una subunidad.
Las colesterol esterasas que tienen un peso molecular de más de 50 kDa están disponibles en el mercado, por ejemplo, en Asahi Kasei Pharma y Kikkoman y puede usarse en la presente invención. Dado que también están disponibles en el mercado diversas esterasas de colesterol que tienen un peso molecular de 50 kDa o menos, cuando en la presente invención se utilizan productos disponibles comercialmente, debe seleccionarse y utilizarse una colesterol esterasa que tenga un peso molecular superior a 50 kDa.
En la presente invención, la colesterol esterasa que tiene un peso molecular de más de 50 kDa se usa al menos en la etapa (1) en la presente invención. En la etapa (2), se puede usar directamente la colesterol esterasa usada en la etapa (1) o se puede añadir nuevamente la misma colesterol esterasa o puede añadirse una colesterol esterasa que tenga un peso molecular diferente.
Las etapas (1) y (2) de la presente invención implican al menos un tensioactivo. El uso de un(os) tensioactivo(s) adecuado(s) puede mejorar la reactividad enzimática en las etapas.
El (los) tensioactivo(s) adecuado(s) para la etapa (1) en la presente invención incluye(n) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter policíclico que tenga un valor de HLB de 12 a 14.
Entre el polioxietilen fenil éter policíclico, se prefiere el polioxietilen fenil éter estirenado y más preferido es el polioxietilen fenil éter distirenado. Sin embargo, se puede(n) usar cual(es)quier tensioactivo(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter policíclico que tenga un valor de HLB de 12 a 14.
Los ejemplos específicos del tensioactivo que se pueden usar en la etapa (1) en la presente invención incluyen Newcol 707, Newcol 708, Newcol 709 y Adekatol SP-12 (fabricado por ADEKA) como polioxietilen fenil éter policíclico; Blaunon DSP-12.5, Blaunon TSP-16 (ambos fabricados por Aoki Oil Industrial) y Noigen EA-137 (fabricado por DKS) como polioxietilen fenil éter estirenado; y Emulgen A60 (fabricado por Kao) como polioxietilen fenil éter distirenado. Estos tensioactivos se pueden usar solos o en combinación de dos o más.
El valor de HLB del (de los) tensioactivo(s) utilizado(s) en la etapa (1) en la presente invención es de 12 a 14. Se puede usar un tensioactivo que tenga un valor de HLB dentro del intervalo de 12 a 14 o también se pueden usar dos o más tensioactivos, cada uno de los cuales puede tener un valor de HLB fuera del intervalo de 12 a 14, siempre que los tensioactivos se combinen de manera que el valor total del HLB está dentro del intervalo de 12 a 14. Aunque todos los ejemplos específicos del tensioactivo descritos anteriormente tienen valores de HLB dentro del intervalo de 12 a 14, se puede(n) incluir o no un(os) tensioactivo(s) que tenga(n) un valor de HLB de 12 a 14 cuando se combinan dos o más tensioactivos y los tensioactivos que se pueden usar en la etapa (1) en la presente invención no se limitan a los ejemplos específicos descritos anteriormente.
Los tensioactivos adecuados para la etapa (2) de la presente invención son preferentemente los que reaccionan con todas las lipoproteínas, incluyendo al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen alquil éter, polioxietilen lauril éter, alcoxilato de alcohol laurílico y polioxietilen fenil éter policíclico. Más específicamente, entre los ejemplos de tensioactivos adecuados se incluyen Emulgen 707, Emulgen 709, Emulgen 108 (todos fabricados por Kao), Adekatol LB83, Adekatol LB103, Adekatol LB720 (todos fabricados por ADEKA), Blaunon DSP-9 (fabricado por Aoki Oil Industrial) y Noigen EA-87 (fabricado por DKS).
La concentración del tensioactivo utilizado en la presente invención en una solución de reacción es preferentemente de un 0,05 % a un 5 %, más preferentemente de un 0,1 % a un 1 %, aún más preferentemente de 0,1 % a 0,75 %. Nótese que como se utiliza en el presente documento, % significa % en masa, a menos que se indique lo contrario.
Se puede usar cualquier colesterol oxidasa, siempre que la colesterol oxidasa sea capaz de oxidar el colesterol para producir peróxido de hidrógeno en la presente invención, incluyendo las colesterol oxidasas derivadas de animales o de microorganismos. La colesterol oxidasa puede ser una producida por ingeniería genética, con o sin modificación química.
En la etapa (1) en la presente invención, puede usarse o no una fosfolipasa. Entre los ejemplos específicos de la fosfolipasa se incluyen, pero sin limitación, fosfolipasa C (PLC), esfingomielinasa (SPC), fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC, todas fabricadas por Asahi Kasei Pharma); esfingomielinasa (derivada deBacillus cereus),esfingomielinasa (derivada deStaphylococcus aureus)y fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (derivada deBacillus cereus,todas fabricadas por SIGMA). Al usar fosfolipasa, se puede mejorar la eliminación del colesterol en lipoproteínas distintas de LRT en la etapa (1).
Las cantidades de enzimas utilizadas en la presente invención, tal como la colesterol esterasa, colesterol oxidasa y fosfolipasa, no están particularmente limitadas y se pueden configurar según corresponda, normalmente de 0,001 a 2000 U/ml, preferentemente de 0,1 a 1000 U/ml.
Los donantes de hidrógeno utilizados en la presente invención son preferentemente un derivado de anilina y entre los ejemplos del derivado de anilina se incluyen N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina (TOOS), N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetilanilina (MAOS), N-etil-N-(3-sulfopropil)-3-metilanilina (TOPS), N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina (HDAOS), W-(3-sulfopropil)anilina (HALPS) y W-(3-sulfopropil)-3-metoxi-5-anilina (HMMPS).
Como aceptor de hidrógeno, se puede utilizar 4-aminoantipirina, metilbenzotiazolona hidrazona o similares.
Cada una de las etapas de la presente invención se lleva a cabo preferentemente en un intervalo de pH de 5 a 10, más preferentemente en un intervalo de pH desde 6 a 8.
Cada una de las etapas se lleva a cabo preferentemente a una temperatura de reacción de 2 °C a 45 °C, más preferentemente de 25°C a 40°C. Cada una de las etapas se lleva a cabo preferentemente en un tiempo de reacción de 1 a 10 minutos, más preferentemente de 3 a 7 minutos.
Al llevar a cabo el método de cuantificación de la presente invención, el reactivo usado se puede dividir en una pluralidad de composiciones de reactivo. En la presente invención, se pueden preparar dos composiciones de reactivo, por ejemplo, una es una composición de reactivo para llevar a cabo una etapa de eliminación de colesterol en lipoproteínas distintas de LRT (es decir, etapa (1)) y otra es una composición de reactivo para llevar a cabo una etapa de medición del colesterol en LRT (es decir, etapa (2)).
La composición de reactivo para llevar a cabo la etapa (1) comprende al menos una colesterol esterasa que tiene un peso molecular de más de 50 kDa y el tensioactivo descrito anteriormente. La composición de reactivo puede contener además colesterol oxidasa, un donante de hidrógeno, tal como un derivado de anilina y catalasa, para descomponer el peróxido de hidrógeno.
La composición de reactivo para llevar a cabo la etapa (2) comprende al menos el tensioactivo descrito anteriormente. La composición de reactivo puede contener además un aceptor de hidrógeno tal como la 4-aminoantipirina y peroxidasa.
A la composición de reactivo para llevar a cabo la etapa (1) y a la composición de reactivo para llevar a cabo la etapa (2) puede añadirse catión monovalente (por ejemplo, ion metálico monovalente), catión divalente (por ejemplo, ion metálico divalente) o sales de los mismos, polianión (por ejemplo, heparina, sal de sulfato de dextrano, sal de ácido fosfotúngstico) o albúmina sérica, según sea necesario. Cada composición de reactivo tiene un pH cercano al neutro, por ejemplo, un pH de 5 a 9, preferentemente un pH de 6 a 8. El pH se puede ajustar añadiendo un tampón.
El colesterol en LRT se puede cuantificar de acuerdo con el método de la presente invención, añadiendo una composición de reactivo para la etapa (1) a una muestra de prueba y permitiendo que la mezcla reaccione; a continuación, añadiendo una composición de reactivo para la etapa (2) y permitiendo que la mezcla reaccione; y midiendo la absorbancia.
La presente invención se describirá a continuación en detalle con referencia a ejemplos, pero sin limitarse a los mismos.
Ejemplos
Ejemplo 1
La composición de reactivo A para la etapa (1) (las composiciones de reactivo para la etapa (1) también en el Ejemplo 2 y en los ejemplos posteriores, se denominan "composición de reactivo A") y la composición de reactivo B para la etapa (2) (composiciones de reactivo para la etapa (2) también en el Ejemplo 2 y en los ejemplos posteriores, se denomina "composición de reactivo B") se prepararon como se describe a continuación.
Composición de reactivo A
Tampón de PIPES, pH 6,8 50 mmol/l
Diversos tipos de colesterol esterasa (véase la Tabla 1) 3 U/ml Colesterol oxidasa 3 U/ml Catalasa 1200 U/ml
TOOS 2,0 mmol/l
Polioxietilen fenil éter distirenado [HLB: 12,8] 0,25 % (p/v)
Composición de reactivo B
Tampón de PIPES, pH 6,8 50 mmol/l
4-aminoantipirina 4,0 mmol/l
Peroxidasa 20 Unidad/ml
Azida sódica 0,05 % (p/v)
Polioxietilen alquil éter 0,5 % (p/v)
A 3 |jl de una muestra de suero, se añadieron 150 j l de la composición de reactivo A y se dejó reaccionar la mezcla durante 5 minutos a 37 °C. A continuación, se añadieron 50 j l de la composición de reactivo B y se dejaron reaccionar durante 5 min. A continuación, se midió la absorbancia a una longitud de onda principal de 600 nm y una longitud de onda secundaria de 700 nm. La Tabla 1 muestra los coeficientes de correlación en comparación con la concentración de LRT-C medida mediante el método de ultracentrifugación como método comparativo.
T l 11
Como se muestra en la Tabla 1, el uso de la colesterol esterasa superior a 50 kDa en la etapa (1) dio como resultado una buena correlación con el método de ultracentrifugación.
Ejemplo 2
La composición de reactivo A y la composición de reactivo B se prepararon como se describe a continuación.
Composición de reactivo A
Tampón de PIPES, pH 6,8 50 mmol/l
Colesterol esterasa [62 kDa1 3 U/ml
Colesterol oxidasa 3 U/ml
Catalasa 1200 U/ml
TOOS 2,0 mmol/l
Diversos tipos de tensioactivo (véase la Tabla 2)*________________ 0,25 % (p/v) ;*Cuando se combinan dos o más tensioactivos, la cantidad de 0,25 % (p/v) es el total.
Composición de reactivo B
Tampón de PIPES, pH 6,8 50 mmol/l
4-aminoantipirina 4,0 mmol/l
Peroxidasa 20 U/ml
Azida sódica 0,05 % (p/v)
Polioxietilen alquil éter 0,5 % (p/v)
A 3 j l de una muestra de suero, se añadieron 150 j l de la composición de reactivo A y se dejó reaccionar la mezcla durante 5 minutos a 37 °C. A continuación, se añadieron 50 j l de la composición de reactivo B y se dejaron reaccionar durante 5 minutos. A continuación, se midió la absorbancia a la longitud de onda principal de 600 nm y a la longitud de onda secundaria de 700 nm. La Tabla 2 muestra los coeficientes de correlación en comparación con la concentración de LRT-C medida mediante el método de ultracentrifugación como método comparativo.
T l 21
Como se muestra en la Tabla 2, el (los) uso(s) de un(os) tensioactivo(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en polioxietilen fenil éteres policíclicos que tienen un valor de HLB de 12 a 14 en la etapa (1) dio como resultado una buena correlación con el método de ultracentrifugación. Los tensioactivos seleccionados del grupo formado por polioxietilen fenil éteres policíclicos que tienen un valor de HLB distinto de 12 a 14 que no dieron buenos resultados de correlación cuando se usaron solos, dieron buenos resultados de correlación con la ultracentrifugación cuando se usaron en combinación, de modo que el valor total de HLB fue de 12 a 14.
Ejemplo 3
La composición de reactivo A y la composición de reactivo B se prepararon como se describe a continuación.
Composición de reactivo A
Tampón de PIPES, pH 6,8 50 mmol/l
Colesterol esterasa [62 kDa] 3 U/ml
Colesterol oxidasa 3 U/ml
Catalasa 1200 U/ml
TOOS 2,0 mmol/l
Polioxietilen fenil éter policíclico [HLB: 12,8] diversas concentraciones (véase la
Tabla 3)
Composición de reactivo B
Tampón de PIPES, pH 6,8 50 mmol/l
4-aminoantipirina 4,0 mmol/l
Peroxidasa 20 Unidad/ml
Azida sódica 0,05 % p/v
Polioxietilen alquil éter 0,5 % p/v
A 3 |jl de una muestra de suero, se añadieron 150 j l de la composición de reactivo A y se dejó reaccionar la mezcla durante 5 minutos a 37 °C. A continuación, se añadieron 50 j l de la composición de reactivo B y se dejaron reaccionar durante 5 minutos. A continuación, se midió la absorbancia a una longitud de onda principal de 600 nm y una longitud de onda secundaria de 700 nm. La Tabla 3 muestra los coeficientes de correlación en comparación con la concentración de LRT-C medida mediante el método de ultracentrifugación como método comparativo.
T l
Como se muestra en la Tabla 3, el uso de un tensioactivo seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éteres policíclicos en una concentración de un 0,1 a un 1,0 % p/v en la etapa (1) dio como resultado una buena correlación con el método de ultracentrifugación. Además, cuando la concentración del tensioactivo fue de un 0,1 a un 0,75 % p/v, se demostró una mejor correlación con la ultracentrifugación.
Ejemplo 4
La composición de reactivo A y la composición de reactivo B se prepararon como se describe a continuación.
Composición de reactivo A
Tampón de PIPES, pH 6,8 50 mmol/l
Colesterol esterasa [62 kDa] 3 U/ml
Colesterol oxidasa 3 U/ml
Catalasa 1200 U/ml
TOOS 2,0 mmol/l
Polioxietilen fenil éter distirenado [HLB: 12,8] 0,4 % (p/v)
Composición de reactivo B
Tampón de PIPES, pH 6,8 50 mmol/l
4-aminoantipirina 4,0 mmol/l
Peroxidasa 20 U/ml
Azida sódica 0,05 % (p/v)
Polioxietilen alquil éter 0,5 % (p/v)
A 3 pl de una muestra de suero, se añadieron 150 pl de la composición de reactivo A y se dejó reaccionar la mezcla durante 5 minutos a 37 °C. A continuación, se añadieron 50 pl de la composición de reactivo B y se dejaron reaccionar durante 5 minutos. A continuación, se midió la absorbancia a la longitud de onda principal de 600 nm y a la longitud de onda secundaria de 700 nm. La Fig. 1 muestra un diagrama de correlación en comparación con la concentración de LRT-C medida mediante el método de ultracentrifugación como método comparativo.
Como se muestra en la Fig. 1, el LRT-C medido de acuerdo con la presente invención mostró una buena correlación con la ultracentrifugación.
Ejemplo 5
La composición de reactivo A y la composición de reactivo B se prepararon como se describe a continuación.
Composición de reactivo A
Tampón de PIPES, pH 6,8 50 mmol/l Colesterol esterasa [62 kDa] 3 U/ml
Colesterol oxidasa 3 U/ml
Catalasa 1200 U/ml
TOOS 2,0 mmol/l Polioxietilen fenil éter distirenado [HLB: 12,8] 0,25 % (p/v)
Composición de reactivo B
Tampón de PIPES, pH 6,8 50 mmol/l
4-aminoantipirina 4,0 mmol/l
Peroxidasa 20 Unidad/ml
Azida sódica 0,05 % (p/v)
Diversos tipos de tensioactivo (véase la
Tabla 4) diversas concentraciones (véase la Tabla 4)
A 3 pl de una muestra de suero, se añadieron 150 pl de la composición de reactivo A y se dejó reaccionar la mezcla durante 5 minutos a 37 °C. A continuación, se añadieron 50 |jl de la composición de reactivo B y se dejaron reaccionar durante 5 minutos. A continuación, se midió la absorbancia a la longitud de onda principal de 600 nm y a la longitud de onda secundaria de 700 nm. La Tabla 4 muestra los coeficientes de correlación en comparación con la concentración de LRT-C medida por el método de ultracentrifugación como método comparativo.
T l 41
Como se muestra en la Tabla 4, el uso de un tensioactivo seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen alquil éter, polioxietilen lauril éter y el alcoxilato de alcohol laurílico en la etapa (2), dieron como resultado una buena correlación con el método de ultracentrifugación.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un método para cuantificar el colesterol en lipoproteínas ricas en triglicéridos (LRT-C),
en donde el l RT-C es colesterol en quilomicrones y remanentes de los mismos, colesterol en VLDL y remanentes del mismo y colesterol en IDL,
comprendiendo el método las etapas de:
(1) eliminación de forma selectiva del colesterol en lipoproteínas distintas de la lipoproteína rica en triglicéridos (LRT), permitiendo que actúe una esterasa de colesterol que tiene un peso molecular de más de 50 kDa, medido mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y un(os) tensioactivo(s); y
(2) cuantificación del LRT-C restante,
en donde en los casos en los que dicho tensioactivo usado en dicha etapa (1) es un tensioactivo, dicho tensioactivo es uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter policíclico, que tiene un valor de HLB de 12 a 14; y
en donde en los casos en los que se usan dos o más tensioactivos, dichos tensioactivos comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter policíclico y los dos o más tensioactivos se combinan de manera que los tensioactivos combinados tengan un valor de HLB total de 12 a 14.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha etapa (2) se lleva a cabo en presencia un(os) tensioactivo(s) y en donde dicho(s) tensioactivo(s) comprende(n) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen alquil éter, polioxietilen lauril éter, alcoxilato de alcohol laurílico y polioxietilen fenil éter policíclico.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho polioxietilen fenil éter policíclico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter estirenado.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho polioxietilen fenil éter estirenado es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter distirenado.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha etapa (1) comprende permitir que actúen la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa y a continuación, descomponer el peróxido de hidrógeno producido; y en donde dicha etapa (2) comprende permitir que actúen la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa y a continuación, cuantificar el peróxido de hidrógeno producido.
6. Uso de un kit en el método de cuantificación de colesterol en lipoproteína rica en triglicéridos (LRT-C) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,
comprendiendo dicho kit
(a) dicha colesterol esterasa que tiene un peso molecular de más de 50 kDa medido mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y
(b) dicho(s) tensioactivo(s) usado(s) en dicha etapa (1) del método,
en donde en los casos en los que dicho tensioactivo usado en dicha etapa (1) es un tensioactivo, dicho tensioactivo es uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter policíclico, que tiene un valor de HLB de 12 a 14; y
en donde en los casos en los que se usan dos o más tensioactivos, dichos tensioactivos comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter policíclico y los dos o más tensioactivos se combinan de manera que los tensioactivos combinados tengan un valor de HLB total de 12 a 14.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho kit comprende además un(os) tensioactivo(s) para usar en la etapa (2), tensioactivo(s) que es (son) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen alquil éter, polioxietilen lauril éter, alcoxilato de alcohol laurílico y polioxietilen fenil éter policíclico.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho polioxietilen fenil éter policíclico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter estirenado.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho polioxietilen fenil éter estirenado es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polioxietilen fenil éter distirenado.
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