JP5766426B2 - レムナント様リポ蛋白コレステロールの定量方法及びそのためのキット - Google Patents

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Description

本発明は、レムナント様リポ蛋白(RLP)中のコレステロールの定量方法及びそのためのキットに関する。
血液中に含まれるリポ蛋白は、超遠心分離による密度の違いから、カイロミクロン、超低密度リポ蛋白(VLDL)、中間密度リポ蛋白(IDL)、低密度リポ蛋白(LDL)、高密度リポ蛋白(HDL)に分けられる。これらのリポ蛋白は、トリグリセリドやコレステロールなどの脂質や蛋白等の含有量が違っており、それぞれ生体内で異なった作用を示すことが知られている。
RLPは、カイロミクロンやVLDLなどのトリグリセリドの含有量が多いリポ蛋白の中間代謝産物で、通常は速やかに代謝され血液中より消失するが、代謝に何らかの異常が生じた場合、血液中に停滞、蓄積する。RLPは動脈壁に沈着しやすく、動脈硬化惹起性のリポ蛋白の１つと考えられている。
RLP中のコレステロールの定量方法としては、抗アポA−Iモノクローナル抗体および抗アポB−100モノクローナル抗体を含有するアフィニティーゲルにより、血清からRLPを分離し、分離したRLPに含まれるコレステロールを測定する方法が知られており、そのための試薬が市販されている。
一方、最近になり分離操作を必要としないRLPコレステロールの定量方法として、検体試料にコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ、およびホスホリパーゼを作用させる方法が報告されている（特許文献１）。また他にも、2種類の界面活性剤を用いる方法（特許文献2）、リポ蛋白リパーゼ活性とコレステロールエステラーゼ活性の比率が12〜7000であるコレステロールエステラーゼを用いる方法（特許文献3）、ベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤またはポリアクリル酸系界面活性剤を用いる方法（特許文献4）が報告されている。
特許4456715号公報 WO2007/066760号公報 WO2006/057377号公報 WO2007/083523号公報
本発明の目的は、検体試料中のRLPコレステロールを、分離操作を必要とせず、簡便、かつ正確に定量するための方法及びそのためのキットを提供することにある。
本願発明者らは、種々のリポ蛋白を含有する被検体試料のコレステロールを酵素的に測定する際、分子量が40kDaを超えるコレステロールエステラーゼであって分子量40kDa以下のサブユニットを持たないコレステロールエステラーゼを作用させるとRLP以外のリポ蛋白が反応し、分子量が40kDa以下のコレステロールエステラーゼ又は分子量40kDa以下のサブユニットを持つコレステロールエステラーゼを作用させるとRLPを含めたすべてのリポ蛋白が反応することを見出した。そして、この知見を利用することにより、分離操作を行うことなく簡便にRLP中のコレステロールを定量できることに想到し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[1] レムナント様リポ蛋白を包含する複数種類のリポ蛋白を含む検体中のレムナント様リポ蛋白コレステロールの定量方法であって、
(1) レムナント様リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程と、
(2) 残存するレムナント様リポ蛋白中のコレステロールを定量する工程とを含み、
前記工程(1)において、分子量が40kDaを超えるコレステロールエステラーゼであって分子量40kDa以下のサブユニットを持たないコレステロールエステラーゼを作用させ、前記工程(2)において分子量が40kDa以下のコレステロールエステラーゼ又は分子量40kDa以下のサブユニットを持つコレステロールエステラーゼを作用させ、
前記工程(1)および前記工程(2)が、HLB値が11以上13以下の非イオン系界面活性剤の存在下で行われ、
前記非イオン系界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも１種である、方法。
[2] 前記工程(1)は、前記コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することを含み、前記工程(2)は、前記コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を定量することを含む[1]記載の方法。
[3] 前記工程(1)において、さらにホスホリパーゼを作用させる[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 少なくとも以下の２種類の試薬組成物を含む、レムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キットであって：
(i) コレステロールエステラーゼとして、分子量が40kDaを超えるコレステロールエステラーゼであって分子量40kDa以下のサブユニットを持たないコレステロールエステラーゼを含む、被検体試料中のレムナント様リポ蛋白以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し反応系外に導くための試薬組成物；
(ii) コレステロールエステラーゼとして、分子量が40kDa以下のコレステロールエステラーゼ又は分子量40kDa以下のサブユニットを持つコレステロールエステラーゼを含む、レムナント様リポ蛋白コレステロールを定量するための試薬組成物；
前記(i)及び(ii)の試薬組成物が、HLB値が11以上13以下の少なくとも１種の非イオン界面活性剤を含み、
前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群から選択される、キット。
[5] 少なくとも前記(i)の試薬組成物が、コレステロールオキシダーゼを含む[4]記載のキット。
[6] 前記(i)の試薬組成物がさらにホスホリパーゼを含む[4]又は[5]に記載のキット。
本発明により、検体試料中のRLPコレステロールを、分離操作を必要とせず、簡便、かつ正確に定量することができる新規な方法及びそのためのキットが提供された。
下記実施例１に記載した本発明の方法によるRLP中コレステロールの定量結果と、抗RLPモノクローナル抗体を用いる公知の方法による定量結果との相関関係を示す図である。 下記実施例２に記載した本発明の方法によるRLP中コレステロールの定量結果と、抗RLPモノクローナル抗体を用いる公知の方法による定量結果との相関関係を示す図である。 下記実施例３に記載した本発明の方法によるRLP中コレステロールの定量結果と、抗RLPモノクローナル抗体を用いる公知の方法による定量結果との相関関係を示す図である。 下記実施例４に記載した本発明の方法によるRLP中コレステロールの定量結果と、抗RLPモノクローナル抗体を用いる公知の方法による定量結果との相関関係を示す図である。 下記実施例５に記載した本発明の方法によるRLP中コレステロールの定量結果と、抗RLPモノクローナル抗体を用いる公知の方法による定量結果との相関関係を示す図である。 下記実施例６に記載した本発明の方法によるRLP中コレステロールの定量結果と、抗RLPモノクローナル抗体を用いる公知の方法による定量結果との相関関係を示す図である。 下記実施例７に記載した本発明の方法によるRLP中コレステロールの定量結果と、抗RLPモノクローナル抗体を用いる公知の方法による定量結果との相関関係を示す図である。
リポ蛋白中に含まれるコレステロールとしては、エステル型コレステロール（コレステロールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本発明において単に「コレステロール」という場合にはこれらの両者を包含する。
本発明の方法で定量しようとするRLPとは、カイロミクロンレムナントとVLDLレムナントを合わせたリポ蛋白を意味する。
本発明の方法に供される検体は、レムナント様リポ蛋白を包含する複数種類のリポ蛋白を含むものであれば特に限定されないが、通常、血液（全血、血清及び血漿を包含する）等の体液やその希釈物である。
本発明における工程(1)では、RLP以外のリポ蛋白中のコレステロールを選択的に消去する。ここで「消去」とはコレステロールを分解し、かつ、その分解物が次の工程(2)で検出されないようにすることを意味する。RLP以外のリポ蛋白に含まれるコレステロールを選択的に消去する方法としては、例えば被検体試料に、コレステロールオキシダーゼ、特定のコレステロールエステラーゼ（後述）を作用させ、生じた過酸化水素を除去する方法があげられる。過酸化水素を除去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、またはペルオキシダーゼの作用により例えば過酸化水素と反応して無色キノンを生じる水素供与体化合物を無色キノンに転化する方法等をあげることができるがこれらに限定されるものではない。
なお、第１工程において特定のリポ蛋白中のコレステロールを選択的に消去する方法は、LDLコレステロールの定量方法（例えばWO98/47005等）やHDLコレステロールの定量方法（例えばWO98/26090等）等に広く採用され、周知となっているものである。本発明の工程(1)も、後述する特定のコレステロールエステラーゼを使用すること以外は、これらの周知の方法により実施することが可能である。
本発明の工程(1)では、ホスホリパーゼを用いても用いなくてもよいが、好適なホスホリパーゼを用いれば、RLP以外のリポ蛋白中コレステロールの消去を促進することができる。ホスホリパーゼの好ましい具体例としては、ホスホリパーゼC(PLC)、スフィンゴミエリナーゼ（SPC）、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC、以上旭化成ファーマ社製）、スフィンゴミエリナーゼ（bacillus cereus由来）、スフィンゴミエリナーゼ（staphylococcus aureus由来）、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC （bacillus cereus由来、以上SIGMA社製）等があげられるが、これらに限定されるものではない。
続く工程(2)では、前記工程(1)の産物に後述する特定のコレステロールエステラーゼを加えてRLP中のコレステロールを酵素的に定量する。コレステロールの酵素的な定量方法自体はこの分野において周知であり、例えばコレステロールにコレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼを作用させ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼと水素供与体および水素受容体によりキノン色素に変え、該色素を吸光度測定して定量する方法があげられる。これらは広く用いられている周知の方法であり、上記したWO98/47005やWO98/26090にも記載されている。
なお、工程(1)において生じた過酸化水素をカタラーゼで分解し、工程(2)でこのカタラーゼを阻害する必要がある場合は、工程(2)において例えばアジ化ナトリウムのようなカタラーゼ阻害剤を用いてカタラーゼを阻害する。
本発明の工程(1)および工程(2)には、非イオン系界面活性剤を共存させる。好適な界面活性剤を用いれば、それぞれの工程における酵素反応を促進することができる。前記非イオン系界面活性剤は、HLB値が11以上13以下であって、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも１種である。界面活性剤の具体例として、エマルゲンA-60、エマルゲン707、エマルゲン709、エマルゲン909（以上花王社製）、ブラウノンDSP-9、ブラウノンDSP-12.5（以上青木油脂社製）等があげられる。
工程(1)および工程(2)で共存させる界面活性剤は、同一でも異なっても良い。界面活性剤の反応液中の濃度は0.05%〜5%が好ましく、0.1%〜1%がより好ましい。
本発明で使用するコレステロールオキシダーゼとしては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば動物または微生物由来のコレステロールエステラーゼがあげられる。これらは、遺伝子操作により作られたものでも良く、化学修飾の有無も問わない。
本発明で使用する各酵素の使用量は、酵素によって異なり、特に制限されるものではないが通常、0.001U〜2000U/mLで、好ましくは0.1〜1000U/mLで使用される。
本発明で使用する水素供与体としてはアニリン誘導体が好ましく、アニリン誘導体としてはN−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3−メチルアニリン（TOOS）、N−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメチルアニリン（MAOS）、N−エチル−N−（3−スルホプロピル）−3−メチルアニリン（TOPS）、N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメトキシアニリン（HDAOS）、N−（3−スルホプロピル）アニリン（HALPS）、N−（3−スルホプロピル）−3−メトキシ−5−アニリン（HMMPS）等があげられる。
水素受容体としては4−アミノアンチピリンやメチルベンゾチアゾロンヒドラゾン等を用いることができる。
本発明の各工程は、pH5〜pH10で行うことが好ましく、pH6〜pH8で行うことがさらに好ましい。
反応温度は各工程とも2℃〜45℃で行うことが好ましく、25℃〜40℃で行うことがさらに好ましい。反応時間は各工程とも1〜10分間で行うことが好ましく、3〜7分で行うことがさらに好ましい。
本発明は、工程(1)と工程(2)において、それぞれ異なる特定のコレステロールエステラーゼを用いることに最大の特徴がある。上記の通り、本願発明者らは、種々のリポ蛋白を含有する被検体試料のコレステロールを酵素的に測定する際、分子量が40kDaを超えるコレステロールエステラーゼであって分子量40kDa以下のサブユニットを持たないコレステロールエステラーゼ（以下、便宜的に「高分子量コレステロールエステラーゼ」と呼ぶことがある）を作用させるとRLP以外のリポ蛋白が反応し、分子量が40kDa以下のコレステロールエステラーゼ又は分子量40kDa以下のサブユニットを持つコレステロールエステラーゼ（以下、便宜的に「低分子量コレステロールエステラーゼ」と呼ぶことがある）を作用させるとRLPを含めたすべてのリポ蛋白が反応することを見出した。理論に縛られるものではないが、RLP内部にはエステル型コレステロールと共にトリグリセリドが多量に存在しており、これが立体障害となり、大型の高分子量コレステロールエステラーゼは粒子内部のエステル型コレステロールに接近できず、反応できないのではないかと考えられる。
上記知見を利用し、本発明の方法では、工程(1)において、高分子量コレステロールエステラーゼを作用させ、工程(2)において低分子量コレステロールエステラーゼを作用させる。上記の通り、工程(1)では、生じたコレステロール（RLP以外のリポ蛋白由来のコレステロール）が消去されるので、工程(2)では、RLPコレステロールのみが定量される。
コレステロールエステラーゼ及びそのサブユニットの分子量は、常法であるSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）により測定される。周知の通り、SDS-PAGEは、還元条件下での電気泳動であるので、コレステロールエステラーゼが複数のサブユニットから構成される場合、コレステロールエステラーゼは各サブユニットに解離されるので、各サブユニットの分子量が測定される。一方、コレステロールエステラーゼがサブユニットを持たない場合には、コレステロールエステラーゼの分子量が測定される。
高分子量コレステロールエステラーゼの市販例としては、コレステロールエステラーゼ（CEBP-M；旭化成ファーマ社製、分子量62kDa）、コレステロールエステラーゼ（CHE-XE；キッコーマン社製、分子量54kDa）、等があげられる。
低分子量コレステロールエステラーゼの市販例としては、コレステロールエステラーゼ（CEN；旭化成ファーマ社製、分子量29.5kDa）、コレステロールエステラーゼ”Amano”2（CHE2；天野エンザイム社製、分子量30kDa）、コレステロールエステラーゼ”Amano”3（CHE3；天野エンザイム社製、分子量30kDa）、等があげられる。
本発明の定量方法を実施するに当たり、用いる試薬を複数の試薬組成物に分けてもよい。本発明においては、試薬としては例えばRLP以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程（すなわち工程(1))を行うための試薬組成物と、RLPのコレステロールを測定する工程（すなわち工程(2)）を行うための試薬組成物の、2種類の試薬組成物を調製することができる。
工程(1)を行うための試薬組成物には、少なくとも高分子量コレステロールエステラーゼと上記した界面活性剤が含まれる。該試薬組成物にはさらに、コレステロールオキシダーゼ、アニリン誘導体等の水素供与体、過酸化水素を消去するカタラーゼ等を含ませればよい。
工程(2)を行うための試薬組成物には、少なくとも低分子量コレステロールエステラーゼと上記した界面活性剤が含まれる。該試薬組成物にはさらに、4-アミノアンチピリン等の水素受容体、ペルオキシダーゼ等を含ませることができる。

工程(1)を行うための試薬組成物及び工程(2)を行うための試薬組成物には、必要に応じて、１価の陽イオン（例えば一価の金属イオン）、２価の陽イオン（例えば二価の金属イオン）もしくはそれらの塩、ポリアニオン（例えばヘパリン、デキストラン硫酸塩、リンタングステン酸塩）、血清アルブミンを添加してもよい。また、各試薬組成物のpHは、中性付近、例えばpH5〜pH9、好ましくはpH6〜8であり、緩衝液を添加してpHを調整すればよい。
本発明の方法によりをRLP中のコレステロールを定量するには、被検体試料に工程(1)を行うための試薬組成物を添加し反応させ、次いで工程(2)を行うための試薬組成物を添加し反応させ、吸光度を測定することにより行えばよい。なお、上記の通り、工程(1)と工程(2)において、上記したそれぞれ特定のコレステロールエステラーゼを用いること以外は、通常の方法で行うことができる。
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
工程(1)を行うための試薬組成物Ａ（実施例２以降でも工程(1)を行うための試薬組成物を「試薬組成物Ａ」と呼ぶ）、工程(2)を行うための試薬組成物Ｂ（実施例２以降でも工程(2)を行うための試薬組成物を「試薬組成物Ｂ」と呼ぶ）を以下のように調製した。
試薬組成物Ａ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［旭化成ファーマ製 CEBP-M］ 5U/mL
コレステロールオキシダーゼ 2.5U/mL
カタラーゼ 1000U/mL
TOOS 2.0mmol/L
エマルゲンA-60（商品名） 0.1%(w/v)
試薬組成物Ｂ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［旭化成ファーマ製 CEN］ 4U/mL
４−アミノアンチピリン 4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ 20単位/mL
アジ化ナトリウム 0.05%(w/v)
エマルゲンA-60（商品名） 0.1%(w/v)
血清試料5μLに試薬組成物Ａ270μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、試薬組成物Ｂ90μLを加え5分間反応させ、主波長600nm、副波長700nmでの吸光度を測定した。
比較対象法として、抗RLPモノクローナル抗体を用いる、大塚製薬社製のRLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）を用いてRLPコレステロール濃度を比較した。その結果を図１に示す。
図１に示すように、本実施例の方法はRLPコレステロール測定用試薬RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）を用いた方法と良好な相関性を示した。
実施例２
試薬組成物Ａ及び試薬組成物Ｂを以下のように調製した。
試薬組成物Ａ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［旭化成ファーマ製 CEBP-M］ 5U/mL
コレステロールオキシダーゼ 2.5U/mL
スフィンゴミエリナーゼ［旭化成ファーマ製 SPC］ 2.5U/mL
カタラーゼ 1000U/mL
TOOS 2.0mmol/L
エマルゲンA-60（商品名） 0.1%(w/v)
試薬組成物Ｂ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［旭化成ファーマ製 CEN］ 4U/mL
４−アミノアンチピリン 4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ 20単位/mL
アジ化ナトリウム 0.05%(w/v)
エマルゲンA-60（商品名） 0.1%(w/v)
実施例１と同様の手順で測定を行い、RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）によって得られる値と比較した。その結果を図２に示す。
図２に示すように、本実施例の方法はRLPコレステロール測定用試薬RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）を用いた方法と良好な相関性を示した。
実施例３
試薬組成物Ａ及び試薬組成物Ｂを以下のように調製した。
試薬組成物Ａ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［旭化成ファーマ製 CEBP-M］ 5U/mL
コレステロールオキシダーゼ 2.5U/mL
スフィンゴミエリナーゼ［旭化成ファーマ製 SPC］ 2.5U/mL
カタラーゼ 1000U/mL
TOOS 2.0mmol/L
エマルゲンA-60（商品名） 0.1%(w/v)
試薬組成物Ｂ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［旭化成ファーマ製 CEN］ 4U/mL
４−アミノアンチピリン 4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ 20単位/mL
アジ化ナトリウム 0.05%(w/v)
エマルゲン709（商品名） 0.1%(w/v)
実施例１と同様の手順で測定を行い、RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）によって得られる値と比較した。その結果を図３に示す。
図３に示すように、本実施例の方法はRLPコレステロール測定用試薬RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）を用いた方法と良好な相関性を示した。
実施例４
試薬組成物Ａ及び試薬組成物Ｂを以下のように調製した。
試薬組成物Ａ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［旭化成ファーマ製 CEBP-M］ 5U/mL
コレステロールオキシダーゼ 2.5U/mL
スフィンゴミエリナーゼ［旭化成ファーマ製 SPC］ 2.5U/mL
カタラーゼ 1000U/mL
TOOS 2.0mmol/L
ブラウノンDSP-12.5（商品名） 0.1%(w/v)
試薬組成物Ｂ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［旭化成ファーマ製 CEN］ 4U/mL
４−アミノアンチピリン 4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ 20単位/mL
アジ化ナトリウム 0.05%(w/v)
エマルゲンA-60（商品名） 0.1%(w/v)
実施例１と同様の手順で測定を行い、RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）によって得られる値と比較した。その結果を図４に示す。
図４に示すように、本実施例の方法はRLPコレステロール測定用試薬RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）を用いた方法と良好な相関性を示した。
実施例５
試薬組成物Ａ及び試薬組成物Ｂを以下のように調製した。
試薬組成物Ａ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［旭化成ファーマ製 CEBP-M］ 5U/mL
コレステロールオキシダーゼ 2.5U/mL
スフィンゴミエリナーゼ［旭化成ファーマ製 SPC］ 2.5U/mL
カタラーゼ 1000U/mL
TOOS 2.0mmol/L
エマルゲンA-60（商品名） 0.1%(w/v)
ウシ血清アルブミン 0.1%(w/v)
試薬組成物Ｂ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［旭化成ファーマ製 CEN］ 4U/mL
４−アミノアンチピリン 4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ 20単位/mL
アジ化ナトリウム 0.05%(w/v)
エマルゲンA-60（商品名） 0.1%(w/v)
実施例１と同様の手順で測定を行い、RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）によって得られる値と比較した。その結果を図５に示す。
図５に示すように、本実施例の方法はRLPコレステロール測定用試薬RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）を用いた方法と良好な相関性を示した。
実施例６
試薬組成物Ａ及び試薬組成物Ｂを以下のように調製した。
試薬組成物Ａ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［キッコーマン製 CHE-XE］ 5U/mL
コレステロールオキシダーゼ 2.5U/mL
スフィンゴミエリナーゼ［旭化成ファーマ製 SPC］ 2.5U/mL
カタラーゼ 1000U/mL
TOOS 2.0mmol/L
エマルゲンA-60（商品名） 0.1%(w/v)
ウシ血清アルブミン 0.1%(w/v)
試薬組成物Ｂ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［旭化成ファーマ製 CEN］ 4U/mL
４−アミノアンチピリン 4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ 20単位/mL
アジ化ナトリウム 0.05%(w/v)
エマルゲン709（商品名） 0.1%(w/v)
実施例１と同様の手順で測定を行い、RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）によって得られる値と比較した。その結果を図６に示す。
図６に示すように、本実施例の方法はRLPコレステロール測定用試薬RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）を用いた方法と良好な相関性を示した。
実施例７
試薬組成物Ａ及び試薬組成物Ｂを以下のように調製した。
試薬組成物Ａ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［旭化成ファーマ製 CEBP-M］ 5U/mL
コレステロールオキシダーゼ 2.5U/mL
スフィンゴミエリナーゼ［旭化成ファーマ製 SPC］ 2.5U/mL
カタラーゼ 1000U/mL
TOOS 2.0mmol/L
エマルゲンA-60（商品名） 0.1%(w/v)
試薬組成物Ｂ
PIPES緩衝液，pH6.8 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ［天野エンザイム製 CHE-2］ 4U/mL
４−アミノアンチピリン 4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ 20単位/mL
アジ化ナトリウム 0.05%(w/v)
エマルゲン709（商品名） 0.1%(w/v)
実施例１と同様の手順で測定を行い、RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）によって得られる値と比較した。その結果を図７に示す。
図７に示すように、本実施例の方法はRLPコレステロール測定用試薬RLP−コレステロール「JIMRO」II（商品名）を用いた方法と良好な相関性を示した。

Claims (6)

  1. レムナント様リポ蛋白を包含する複数種類のリポ蛋白を含む検体中のレムナント様リポ蛋白コレステロールの定量方法であって、
    (1) レムナント様リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程と、
    (2) 残存するレムナント様リポ蛋白中のコレステロールを定量する工程とを含み、
    前記工程(1)において、分子量が40kDaを超えるコレステロールエステラーゼであって分子量40kDa以下のサブユニットを持たないコレステロールエステラーゼを作用させ、前記工程(2)において分子量が40kDa以下のコレステロールエステラーゼ又は分子量40kDa以下のサブユニットを持つコレステロールエステラーゼを作用させ、
    前記工程(1)および前記工程(2)が、HLB値が11以上13以下の非イオン系界面活性剤の存在下で行われ、
    前記非イオン系界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも１種である、方法。
  2. 前記工程(1)は、前記コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することを含み、前記工程(2)は、前記コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を定量することを含む請求項１記載の方法。
  3. 前記工程(1)において、さらにホスホリパーゼを作用させる請求項１又は２記載の方法。
  4. 少なくとも以下の２種類の試薬組成物を含む、レムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キットであって：
    (i) コレステロールエステラーゼとして、分子量が40kDaを超えるコレステロールエステラーゼであって分子量40kDa以下のサブユニットを持たないコレステロールエステラーゼを含む、被検体試料中のレムナント様リポ蛋白以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し反応系外に導くための試薬組成物；
    (ii) コレステロールエステラーゼとして、分子量が40kDa以下のコレステロールエステラーゼ又は分子量40kDa以下のサブユニットを持つコレステロールエステラーゼを含む、レムナント様リポ蛋白コレステロールを定量するための試薬組成物；
    前記(i)及び(ii)の試薬組成物が、HLB値が11以上13以下の少なくとも１種の非イオン界面活性剤を含み、
    前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群から選択される、キット。
  5. 少なくとも前記(i)の試薬組成物が、コレステロールオキシダーゼを含む請求項４記載のキット。
  6. 前記(i)の試薬組成物がさらにホスホリパーゼを含む請求項４又は５記載のキット。
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