KR20190012168A - 트리글리세리드 리치 리포단백 중의 콜레스테롤의 정량 방법 및 정량 시약 - Google Patents

트리글리세리드 리치 리포단백 중의 콜레스테롤의 정량 방법 및 정량 시약 Download PDF

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Abstract

복잡한 조작을 필요로 하지 않고, 피검 시료 중의 트리글리세리드 리치 리포단백 중 콜레스테롤(TRL-C)을 보다 특이적으로 정량하는 방법 및 시약이 개시되어있다. 트리글리세리드 리치 리포단백 중 콜레스테롤의 정량 방법은 분자량이 50kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제 및 계면활성제를 작용시킴으로써 트리글리세리드 리치 리포단백(TRL) 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 선택적으로 소거하는 공정 1과, 잔존하는 TRL 중의 콜레스테롤(TRL-C)을 정량하는 공정 2를 포함한다.

Description

트리글리세리드 리치 리포단백 중의 콜레스테롤의 정량 방법 및 정량 시약
본 발명은 트리글리세리드 리치 리포단백(이하, TRL이라고 부르는 경우가 있음) 중의 콜레스테롤(이하, 「리포단백명」콜레스테롤 또는 「리포단백명」-C라고 표기한 경우, 「」 내에 기재된 리포단백 중의 콜레스테롤을 의미함)의 정량 방법 및 정량 시약에 관한 것이다.
혈액 중에 포함되는 리포단백은 초원심분리에 의한 밀도의 차이로부터, 킬로 미크론, 초저밀도 리포단백(이하, VLDL이라고 부르는 경우가 있음), 중간 밀도 리포단백(이하, IDL이라고 부르는 경우가 있음), 저밀도 리포단백(이하, LDL이라고 부르는 경우가 있음), 고밀도 리포단백(이하, HDL이라고 부르는 경우가 있음)으로 나뉜다. 이들 리포단백은 트리글리세리드나 콜레스테롤 등의 지질이나 단백 등의 함유량이 다르고, 각각 생체 내에서 다른 작용을 나타내는 것이 알려져 있다.
TRL은 트리글리세리드의 함유량이 많은 리포단백의 총칭이며, 킬로미크론, VLDL, 그것들의 중간 대사산물이나 렘넌트 유사 리포단백(RLP)이 포함되고, IDL이 더 포함되는 경우도 있다.
종래까지, LDL이나 RLP에 대해서는 동맥경화성 질환에의 관여가 알려져 있지만, IDL을 포함한 TRL이 보다 동맥경화성 질환의 진전에 깊이 관여하고 있는 것이 구미를 중심으로 보고되어 주목을 모으고 있다.
현재까지, 알려져 있는 TRL의 측정법으로서 초원심법, NMR법 등이 존재한다. 초원심은 원심에 의해 리포단백의 밀도의 차를 이용하여 획분하는 방법이며, 작업에 숙련이 필요한 점, 시간이 걸리는 점, 또한 비용도 고액이 되는 결점이 있다. NMR법은 자기공명에 의해 리포단백의 입자수를 계측하는 방법이지만, 특수한 기계가 필요하여 일반적이지 않다.
TRL-C의 기타 측정 방법으로서 계산법이 예시된다. TRL은 LDL이나 HDL 이외의 리포단백이라고도 말할 수 있기 때문에 총 콜레스테롤값으로부터 LDL-C와 HDL-C를 차감하여 구하는 것이다. LDL-C의 측정법으로서, 미국질병관리센터의 β-Quantification법(BQ법)이 국제기준법으로 되어 있지만, 이 방법은 밀도 1.006~1.063g/㎤의 리포단백을 LDL로 하고 있기 때문에, BQ법에 있어서의 LDL-C에는 IDL-C가 포함된다. 그 때문에, TRL-C를 계산하여 구할 때에 BQ법으로 측정한 LDL-C를 이용한 경우, IDL-C도 LDL-C로서 공제하게 된다. BQ법을 기준으로 해서 개발된 기타 LDL-C의 측정법, 예를 들면 Friedewald식 등을 이용한 경우도 마찬가지이다. 이들 LDL-C의 측정 방법을 이용한 경우, 산출되는 TRL-C에는 IDL-C가 포함되지 않아, 임상적으로 보다 의의가 높다고 전해지고 있는 IDL을 포함한 TRL을 측정하고 있다고는 말할 수 없다.
그 때문에, 간편하고 또한 정확하게 IDL을 포함한 TRL-C를 정량하는 방법 및 시약의 발명이 필요로 되고 있다.
이하, 단지 TRL, TRL-C라고 기재한 경우, 각각 IDL을 포함한 TRL, IDL-C를 포함한 TRL-C를 의미한다.
또한, TRL-C의 일부인 RLP-C의 측정 방법으로서, 특허문헌 1~3이 보고되어 있다. 모두 범용 자동 분석 장치에 의해 측정이 가능한 방법이지만, RLP만을 측정하는 것이어서 TRL 전체를 측정하는 본 발명과는 다른 것이다.
일본 특허 4456715호 공보 일본 특허 5027648호 공보 일본 특허 5766426호 공보
본 발명의 목적은 복잡한 조작을 필요로 하지 않고, 피검 시료 중의 TRL-C를 보다 특이적으로 정량하는 방법 및 시약을 제공하는 것이다.
본원 발명자들은 예의 연구의 결과, 다양한 리포단백을 함유하는 피검체 시료에 대해, 계면활성제의 존재 하에 있어서 분자량이 50kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시킴으로써 TRL 이외의 리포단백이 특이적으로 반응하는 것을 발견했다. 이 지견을 이용함으로써, 분리 조작을 행하지 않고, 간편하게 또한 정확하게 TRL-C를 정량할 수 있는 것에 상도하고, 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 분자량이 50kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제, 및 계면활성제를 작용시킴으로써 트리글리세리드 리치 리포단백(TRL) 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 선택적으로 소거하는 공정 1과, 잔존하는 TRL 중의 콜레스테롤(TRL-C)을 특이적으로 정량하는 공정 2를 포함하는 TRL-C의 정량 방법.
[2] [1]에 있어서,
상기 공정 1에 있어서 사용되는 상기 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 방법.
[3] [1] 또는 [2]에 있어서,
상기 공정 1에 있어서 사용되는 상기 계면활성제가 1종인 경우, 상기 계면활성제는 HLB값이 12~14인 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1종이며, 또한 계면활성제가 2종 이상인 경우, 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하고, 또한 2종 이상의 계면활성제 전체의 HLB값이 12~14가 되도록 2종 이상의 계면활성제를 조합하는 방법.
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서,
상기 공정 2가 계면활성제의 존재 하에서 행해지고, 상기 계면활성제가 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 라우릴알코올알콕실레이트, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 방법.
[5] [2] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서,
상기 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르가 폴리옥시에틸렌스티렌화 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 방법.
[6] [5]에 있어서,
상기 폴리옥시에틸렌스티렌화 페닐에테르가 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 방법.
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서,
상기 공정 1은 콜레스테롤 에스테라아제와 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 발생된 과산화수소를 소거하는 것을 포함하고, 상기 공정 2는 콜레스테롤 에스테라아제와 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 발생된 과산화수소를 정량하는 것을 포함하는 방법.
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 방법에 사용되는 TRL-C의 정량 키트로서, 상기 공정 1에 사용되는 분자량이 50kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제, 및 계면활성제를 포함하는 TRL-C의 정량 키트.
[9] [8]에 있어서,
상기 공정 1에 있어서 사용되는 상기 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 키트.
[10] [8] 또는 [9]에 있어서,
상기 공정 1에 있어서 사용되는 상기 계면활성제가 1종인 경우, 상기 계면활성제는 HLB값이 12~14인 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1종이며, 상기 계면활성제가 2종 이상인 경우, 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하고, 또한 2종 이상의 계면활성제 전체의 HLB값이 12~14가 되도록 2종 이상의 계면활성제를 조합하고 있는 키트.
[11] [8] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서,
상기 공정 2가 계면활성제의 존재 하에서 행해지고, 상기 키트는 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 라우릴알코올알콕실레이트, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 상기 계면활성제를 더 포함하는 키트.
[12] [9] 내지 [11] 중 어느 하나에 있어서,
상기 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르가 폴리옥시에틸렌스티렌화 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 키트.
[13] [12]에 있어서,
상기 폴리옥시에틸렌스티렌화 페닐에테르가 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 키트.
(발명의 효과)
본 발명에 의해, 피검 시료 중의 TRL-C를 분리 조작을 필요로 하지 않고 자동 분석 장치에 의해 간편하게 또한 정확하게 정량할 수 있는 신규한 방법 및 그것을 위한 키트가 제공되었다.
도 1은 하기 실시예 4에 기재한 본 발명의 방법에 의한 TRL-C와 초원심법에 의해 구한 TRL-C의 상관관계를 나타내는 도면이다.
리포단백 중에 포함되는 콜레스테롤로서는 에스테르형 콜레스테롤(콜레스테롤에스테르) 및 유리형 콜레스테롤이 있다. 본 발명에 있어서, 단지 「콜레스테롤」이라고 하는 경우에는 이들 양자를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 정량하려고 하는 TRL-C란 킬로미크론(킬로미크론 렘넌트를 포함함), VLDL(VLDL 렘넌트를 포함함), 및 IDL을 합한 리포단백 중의 콜레스테롤, 즉 밀도 1.019g/㎤ 미만의 리포단백 중의 콜레스테롤을 의미한다.
본 발명의 방법에 제공되는 피검 시료로서는, 그 시료 중의 TRL-C를 정량하려고 하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 통상 혈액(전혈, 혈청 및 혈장을 포함함) 등의 체액이나 그 희석물이다.
본 발명 중에 있어서 리포단백에 대하여 「반응하는」이라고 하는 용어를 사용하는 경우에는 계면활성제나 효소에 의해 리포단백의 구조가 변화하여, 내부의 콜레스테롤에 대하여 효소가 작용하기 쉬워지는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서의 공정 1에서는 TRL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 선택적으로 소거한다. 여기서, 「소거」란 콜레스테롤을 분해하고, 또한 그 분해물이 다음의 공정 2에서 검출되지 않도록 하는 것을 의미한다. TRL 이외의 리포단백에 포함되는 콜레스테롤을 선택적으로 소거하는 방법으로서는, 예를 들면 피검체 시료에 콜레스테롤 옥시다아제, 특정 콜레스테롤 에스테라아제(후술)를 작용시켜 발생된 과산화수소를 제거하는 방법이 예시된다. 과산화수소를 제거하는 방법으로서는 카탈라아제를 작용시켜 물과 산소로 분해하는 방법, 또는 퍼옥시다아제의 작용에 의해, 예를 들면 과산화수소와 반응하여 무색 퀴논을 발생시키는 수소 공여체 화합물을 무색 퀴논으로 전화하는 방법 등을 예시할 수 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 「선택적으로 소거하는」이란 소거된 후에 잔존하는 콜레스테롤의 90% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상이 TRL 중의 콜레스테롤인 것을 의미한다. 소거된 후에 잔존하는 콜레스테롤 중의 TRL 중의 콜레스테롤의 비율은 하기 실시예에 구체적으로 기재하는 초원심법에 의한 측정 결과와의 상관관계에 의해 측정할 수 있으며, 이 상관관계가 0.9 이상인 경우에 소거된 후에 잔존하는 콜레스테롤 중의 TRL 중의 콜레스테롤의 비율이 90% 이상인 것으로 한다.
또한, 제 1 공정에 있어서 특정 리포단백 중의 콜레스테롤을 선택적으로 소거하는 방법은 LDL 콜레스테롤의 정량 방법(예를 들면, WO98/47005 등)이나 HDL 콜레스테롤의 정량 방법(예를 들면, WO98/26090 등) 등에 널리 채용되어 주지가 되고 있는 것이다. 본 발명의 공정 1도, 후술하는 특정 콜레스테롤 에스테라아제를 사용하는 것 이외에는 이들 주지의 방법에 의해 실시하는 것이 가능하다.
계속되는 공정 2에서는 상기 공정 1에서 소거되지 않고 잔존하는 TRL 중의 콜레스테롤을 효소적으로 정량한다. 콜레스테롤의 효소적인 정량 방법 자체는 이 분야에 있어서 주지이며, 예를 들면 콜레스테롤에 콜레스테롤 옥시다아제 및 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시켜 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제와 수소 공여체 및 수소 수용체에 의해 퀴논 색소로 변화시키고, 상기 색소를 흡광도 측정하여 정량하는 방법이 예시된다. 이들은 널리 이용되고 있는 주지의 방법이며, 상기한 WO98/47005나 WO98/26090에 기재되어 있다.
또한, 공정 1에 있어서 발생된 과산화수소를 카탈라아제에 의해 분해하고, 공정 2에서 이 카탈라아제를 저해할 필요가 있는 경우에는, 공정 2에 있어서 예를 들면, 아지드화 나트륨과 같은 카탈라아제 억제제를 사용하여 카탈라아제를 저해한다.
본 발명은 계면활성제의 존재 하에 있어서, 분자량이 50kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제를 사용하여 TRL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 것에 가장 큰 특징이 있다. TRL 내부에는 에스테르형 콜레스테롤과 함께 트리글리세리드가 다량으로 존재하고 있으며, 소형의 분자량이 작은 콜레스테롤 에스테라아제는 입자 내부까지 침투하여 작용할 수 있지만, 대형의 분자량이 큰 콜레스테롤 에스테라아제는 트리글리세리드가 입체 장해가 되어 입자 내부의 에스테르형 콜레스테롤에 도달할 수 없어 작용할 수 없는 것이 아닌가라고 생각된다.
콜레스테롤 에스테라아제 및 그 서브유닛의 분자량은 상법인 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 측정된다. 주지와 같이, SDS-PAGE는 환원 조건하에서의 전기영동이므로, 콜레스테롤 에스테라아제가 복수의 서브유닛으로 구성되는 경우 콜레스테롤 에스테라아제는 각 서브유닛으로 분리되므로, 각 서브유닛의 분자량이 측정된다. 한편, 콜레스테롤 에스테라아제가 서브유닛을 갖지 않는 경우에는 콜레스테롤 에스테라아제의 분자량이 측정된다. 즉, 본 발명에 있어서 규정되는 콜레스테롤 에스테라아제의 분자량은 콜레스테롤 에스테라아제가 서브유닛을 갖는 경우에는 상기 서브유닛의 분자량이며, 서브유닛을 갖지 않는 경우에는 콜레스테롤 에스테라아제의 분자량이다.
분자량이 50kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제는 ASAHI KASEI CORPORATION이나 KIKKOMAN CORPORATION 등으로부터 시판되고 있으며, 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, 분자량이 50kDa 이하인 콜레스테롤 에스테라아제도 여러가지 시판되고 있으므로, 본 발명에 시판품을 사용한 것이면, 분자량이 50kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제를 선택하여 사용할 필요가 있다.
본 발명에 있어서의 콜레스테롤 에스테라아제는 적어도 본 발명의 공정 1에 분자량 50kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제가 포함되어 있으면 좋고, 공정 2에서는 공정 1에서 사용한 것을 그대로 사용할 수도 있고, 새롭게 같은 콜레스테롤 에스테라아제를 추가해도 좋고, 다른 분자량의 콜레스테롤 에스테라아제를 추가해도 좋다.
본 발명의 공정 1 및 공정 2에는 적어도 1종의 계면활성제가 포함된다. 적합한 계면활성제를 이용하면, 각각의 공정에 있어서의 효소 반응을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 공정 1에 적합한 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종이 예시된다. 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 중, 폴리옥시에틸렌스티렌화 페닐에테르가 바람직하고, 또한 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르가 보다 바람직하지만, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 것이면, 이것들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 공정 1에 사용될 수 있는 계면활성제의 구체예로서, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로서는 Newcol 707, Newcol 708, Newcol 709, Adekatol SP-12(ADEKA CORPORATION제), 폴리옥시에틸렌스티렌화 페닐에테르로서는 BLAUNON DSP-12.5, BLAUNON TSP-16(이상, AOKI OIL INDUSTRIAL CO., LTD.제), NOIGEN EA-137(DKS Co. Ltd.제), 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르로서는 EMULGEN A60(Kao Corporation제)이 예시된다. 이들 계면활성제는 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 공정 1에 사용되는 계면활성제의 HLB값은 12~14가 바람직하고, 1종의 계면활성제이고 HLB값이 12~14이어도 좋고, HLB값이 12~14가 아닌 것을 포함하여 2종 이상을 계면활성제 전체의 HLB값이 12~14에 들어가도록 조합해도 좋다. 상기 계면활성제의 구체예는 모두 HLB값이 12~14의 범위 내인 것이지만, 2종 이상의 계면활성제를 조합하는 경우, 계면활성제의 HLB값이 12~14인 계면활성제가 포함되어 있어도 좋고 포함되어 있지 않아도 좋고, 본 발명의 공정 1에 사용될 수 있는 계면활성제는 상기 구체예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 공정 2에 적합한 계면활성제로서는 모든 리포단백에 대하여 반응하는 계면활성제가 바람직하고, 예를 들면 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 라우릴알코올알콕실레이트, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종이 예시된다. 보다 구체적으로는, EMULGEN 707, EMULGEN 709, EMULGEN 108(이상, Kao Corporation제) Adekatol LB83, Adekatol LB103, Adekatol LB720(이상, ADEKA CORPORATION제), BLAUNON DSP-9(AOKI OIL INDUSTRIAL CO., LTD제), NOIGEN EA-87(DKS Co. Ltd.제) 등이 예시된다.
본 발명에서 사용하는 계면활성제의 반응액 중의 농도는 0.05%~5%가 바람직하고, 0.1%~1%가 보다 바람직하고, 0.1%~0.75%가 더욱 바람직하다. 또한, 본 명세서에 있어서, %는 특별히 명시가 없는 경우에는 질량%를 의미한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 콜레스테롤 옥시다아제로서는 콜레스테롤을 산화하여 과산화수소를 생성하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 동물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤 옥시다아제가 예시된다. 이것들은 유전자 조작에 의해 만들어진 것이어도 좋고, 화학 수식의 유무도 상관없다.
본 발명의 공정 1에서는 포스포리파아제를 사용해도 좋고 사용하지 않아도 좋고, 포스포리파아제의 구체예로서는 포스포리파아제 C(PLC), 스핑고미엘리나아제(SPC), 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파아제 C(PI-PLC, 이상 ASAHI KASEI PHARMA CORPORATION제), 스핑고미엘리나아제(bacillus cereus 유래), 스핑고미엘리나아제(staphylococcus aureus 유래), 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파아제 C(bacillus cereus 유래, 이상 SIGMA사제) 등이 예시되지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포스포리파아제를 이용함으로써 공정 1에 있어서의 TRL 이외의 리포단백 중 콜레스테롤의 소거를 촉진할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 옥시다아제 및 포스포리파아제 등의 각 효소의 사용량은 특별히 제한되는 것은 아니며, 적절히 설정할 수 있지만, 통상 0.001U~2000U/mL로, 바람직하게는 0.1~1000U/mL로 사용된다.
본 발명에서 사용하는 수소 공여체로서는 아닐린 유도체가 바람직하고, 아닐린 유도체로서는 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린(MAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS), N-(3-술포프로필)아닐린(HALPS), N-(3-술포프로필)-3-메톡시-5-아닐린(HMMPS) 등이 예시된다.
수소 수용체로서는 4-아미노안티피린이나 메틸벤조티아졸론히드라존 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 각 공정은 pH5~pH10에서 행하는 것이 바람직하고, pH6~pH8에서 행하는 것이 더욱 바람직하다.
반응 온도는 각 공정 모두 2℃~45℃에서 행하는 것이 바람직하고, 25℃~40℃에서 행하는 것이 더욱 바람직하다. 반응 시간은 각 공정 모두 1~10분간에서 행하는 것이 바람직하고, 3~7분에서 행하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 정량 방법을 실시함에 있어서, 이용하는 시약을 복수의 시약 조성물로 나누어도 좋다. 본 발명에 있어서는, 시약으로서는 예를 들면, TRL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정(즉, 공정 1)을 행하기 위한 시약 조성물과, TRL 중의 콜레스테롤을 측정하는 공정(즉, 공정 2)을 행하기 위한 시약 조성물의 2종류의 시약 조성물을 조제할 수 있다.
공정 1을 행하기 위한 시약 조성물에는 적어도 분자량 50kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제와 상기한 계면활성제가 포함된다. 상기 시약 조성물에는 콜레스테롤 옥시다아제, 아닐린 유도체 등의 수소 공여체, 과산화수소를 소거하는 카탈라아제 등을 더 포함시키면 좋다.
공정 2를 행하기 위한 시약 조성물에는 적어도 상기한 계면활성제가 포함된다. 상기 시약 조성물에는 4-아미노안티피린 등의 수소 수용체, 퍼옥시다아제 등을 더 포함시킬 수 있다.
공정 1을 행하기 위한 시약 조성물 및 공정 2를 행하기 위한 시약 조성물에는 필요에 따라서 1가의 양이온(예를 들면, 1가의 금속 이온), 2가의 양이온(예를 들면, 2가의 금속 이온) 또는 그것들의 염, 폴리 음이온(예를 들면, 헤파린, 덱스트란황산염, 인텅스텐산염), 혈청 알부민을 첨가해도 좋다. 또한, 각 시약 조성물의 pH는 중성 부근, 예를 들면 pH5~pH9, 바람직하게는 pH6~8이며, 완충액을 첨가하여 pH를 조정하면 좋다.
본 발명의 방법에 의해 TRL 중의 콜레스테롤을 정량하기 위해서는 피검체 시료에 공정 1을 행하기 위한 시약 조성물을 첨가하여 반응시키고, 이어서 공정 2를 행하기 위한 시약 조성물을 첨가하여 반응시켜 흡광도를 측정함으로써 행하면 좋다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
공정 1을 행하기 위한 시약 조성물 A(실시예 2 이후에도 공정 1을 행하기 위한 시약 조성물을 「시약 조성물 A」라고 함), 공정 2를 행하기 위한 시약 조성물 B(실시예 2 이후에도 공정 2를 행하기 위한 시약 조성물을 「시약 조성물 B」라고 함)를 이하와 같이 조제했다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/L
각종 콜레스테롤 에스테라아제(표 1 참조) 3U/mL
콜레스테롤 옥시다아제 3U/mL
카탈라아제 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르[HLB:12.8] 0.25%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 20단위/mL
아지드화 나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르 0.5%(w/v)
혈청 시료 3㎕에 시약 조성물 A 150㎕를 첨가하고, 37℃에서 5분간 반응시킨 후에 시약 조성물 B 50㎕를 첨가하여 5분간 반응시키고, 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서의 흡광도를 측정했다. 비교 대상법으로서 초원심법에 의해 측정한 TRL-C 농도와 비교한 상관계수를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
(콜레스테롤 에스테라아제는 모두 시판품)
표 1에 나타내는 바와 같이, 공정 1에 50kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제를 이용한 경우에 초원심법과 양호한 상관성을 나타냈다.
실시예 2
시약 조성물 A 및 시약 조성물 B를 이하와 같이 조제했다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/L
콜레스테롤 에스테라아제[62kDa] 3U/mL
콜레스테롤 옥시다아제 3U/mL
카탈라아제 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
각종 계면활성제(표 2 참조)※ 0.25%(w/v)
※2종류 이상을 조합하고 있는 경우에는 합쳐서 0.25%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 20단위/mL
아지드화 나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르 0.5%(w/v)
혈청 시료 3㎕에 시약 조성물 A 150㎕를 첨가하고, 37℃에서 5분간 반응시킨 후에 시약 조성물 B 50㎕를 첨가하여 5분간 반응시키고, 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서의 흡광도를 측정했다. 비교 대상법으로서 초원심법에 의해 측정한 TRL-C 농도와 비교한 상관계수를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
표 2에 나타내는 바와 같이, 공정 1에 HLB값이 12~14인 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 계면활성제를 사용한 경우에 초원심법과 양호한 상관성을 나타냈다. 또한, 단독으로는 양호한 상관성이 얻어지지 않았던 HLB값이 12~14가 아닌 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 계면활성제라도, 전체의 HLB값이 12~14가 되도록 조합한 경우에 초원심법과 양호한 상관성을 나타냈다.
실시예 3
시약 조성물 A 및 시약 조성물 B를 이하와 같이 조제했다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/L
콜레스테롤 에스테라아제[62kDa] 3U/mL
콜레스테롤 옥시다아제 3U/mL
카탈라아제 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르[HLB: 12.8] 각종 농도(표 3 참조)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 20단위/mL
아지드화 나트륨 0.05w/v%
폴리옥시에틸렌알킬에테르 0.5w/v%
혈청 시료 3㎕에 시약 조성물 A 150㎕를 첨가하고, 37℃에서 5분간 반응시킨 후에 시약 조성물 B 50㎕를 첨가하여 5분간 반응시키고, 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서의 흡광도를 측정했다. 비교 대상법으로서 초원심법에 의해 측정한 TRL-C 농도와 비교한 상관계수를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
표 3에 나타내는 바와 같이, 공정 1에 0.1~1.0w/v%의 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 계면활성제를 사용한 경우에 초원심법과 양호한 상관성을 나타냈다. 또한, 상기 계면활성제의 농도가 0.1~0.75w/v%에서는 초원심법과 보다 양호한 상관성을 나타냈다.
실시예 4
시약 조성물 A 및 시약 조성물 B를 이하와 같이 조제했다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/L
콜레스테롤 에스테라아제[62kDa] 3U/mL
콜레스테롤 옥시다아제 3U/mL
카탈라아제 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르[HLB: 12.8] 0.4%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 20단위/mL
아지드화 나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르 0.5%(w/v)
혈청 시료 3㎕에 시약 조성물 A 150㎕을 첨가하고, 37℃에서 5분간 반응시킨 후에 시약 조성물 B 50㎕를 첨가하여 5분간 반응시키고, 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서의 흡광도를 측정했다. 비교 대상법으로서 초원심법에 의해 측정한 TRL-C 농도와 비교한 상관도를 도 1에 나타낸다.
도 1에 나타내는 바와 같이, 본 발명에서 측정한 TRL-C는 초원심법과 양호한 상관성을 나타냈다.
실시예 5
시약 조성물 A 및 시약 조성물 B를 이하와 같이 조제했다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/L
콜레스테롤 에스테라아제[62kDa] 3U/mL
콜레스테롤 옥시다아제 3U/mL
카탈라아제 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르[HLB:12.8] 0.25%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 20단위/mL
아지드화 나트륨 0.05%(w/v)
각종 계면활성제(표 4 참조) 각종 농도(표 4 참조)
혈청 시료 3㎕에 시약 조성물 A 150㎕를 첨가하고, 37℃에서 5분간 반응시킨 후에 시약 조성물 B 50㎕를 첨가하여 5분간 반응시키고, 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서의 흡광도를 측정했다. 비교 대상법으로서 초원심법에 의해 측정한 TRL-C 농도와 비교한 상관계수를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
표 4에 나타내는 바와 같이, 공정 2에 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 라우릴알코올알콕실레이트로 이루어지는 군에서 선택되는 계면활성제를 이용한 경우에 초원심법과 양호한 상관성을 나타냈다.

Claims (13)

  1. 분자량이 50kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제, 및 계면활성제를 작용시킴으로써 트리글리세리드 리치 리포단백(TRL) 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 선택적으로 소거하는 공정 1과, 잔존하는 TRL 중의 콜레스테롤(TRL-C)을 정량하는 공정 2를 포함하는 TRL-C의 정량 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 공정 1에 있어서 사용되는 상기 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 공정 1에 있어서 사용되는 상기 계면활성제가 1종인 경우, 상기 계면활성제는 HLB값이 12~14인 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1종이고, 상기 계면활성제가 2종 이상인 경우, 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하고, 또한 2종 이상의 계면활성제 전체의 HLB값이 12~14가 되도록 2종 이상의 계면활성제를 조합하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정 2가 계면활성제의 존재 하에서 행해지고, 상기 계면활성제가 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 라우릴알코올알콕실레이트, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 방법.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르가 폴리옥시에틸렌스티렌화 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌스티렌화 페닐에테르가 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정 1은 콜레스테롤 에스테라아제와 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 발생된 과산화수소를 소거하는 것을 포함하고, 상기 공정 2는 콜레스테롤 에스테라아제와 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 발생된 과산화수소를 정량하는 것을 포함하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용되는 TRL-C의 정량 키트로서, 상기 공정 1에 사용되는 분자량이 50kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제, 및 계면활성제를 포함하는 TRL-C의 정량 키트.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 공정 1에 있어서 사용되는 상기 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 키트.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    상기 공정 1에 있어서 사용되는 상기 계면활성제가 1종인 경우, 상기 계면활성제는 HLB값이 12~14인 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1종이며, 상기 계면활성제가 2종 이상인 경우, 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하고, 또한 2종 이상의 계면활성제 전체의 HLB값이 12~14가 되도록 2종 이상의 계면활성제를 조합하고 있는 키트.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정 2가 계면활성제의 존재 하에서 행해지고, 상기 키트는 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 라우릴알코올알콕실레이트, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 상기 계면활성제를 더 포함하는 키트.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르가 폴리옥시에틸렌스티렌화 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 키트.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌스티렌화 페닐에테르가 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 키트.
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