KR20010075176A - 리포단백질 중의 콜레스테롤의 분별 정량 방법 및 정량용시약 - Google Patents

리포단백질 중의 콜레스테롤의 분별 정량 방법 및 정량용시약 Download PDF

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Abstract

본 발명에 의해 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 정량 방법 및 이 방법에 사용하는 정량 시약이 제공된다. 또한 본 발명에 의해 고밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 및 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 연속 분별 정량 방법 및 이 방법에 사용하는 시약 키트 및 고밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 및 총콜레스테롤의 연속 분별 정량 방법 및 이 방법에 사용하는 정량 시약 키트가 제공된다.

Description

리포단백질 중의 콜레스테롤의 분별 정량 방법 및 정량용 시약 {METHODS FOR FRACTIONAL QUANTIFICATION OF CHOLESTEROL IN LIPOPROTEINS AND QUANTIFICATION REAGENTS}
HDL 은 동맥벽의 콜레스테롤을 제거하여 간장으로 운반하는 작용이 있어 통칭 선옥(善玉)이라고 불리고, 또한 LDL 은 동맥벽 등의 말초조직에 콜레스테롤을 운반하는 작용이 있어 통상 악옥(惡玉)이라고 불리고 있다. 임상 검사 분야에서 HDL 콜레스테롤 농도, LDL 콜레스테롤 농도 및 총콜레스테롤 농도는 동맥경화증등의 지질에 관한 질병의 종합판단의 지표로 이용되고 있다.
이들 콜레스테롤 농도는 각각의 콜레스테롤에 특이성이 있는 전용 시약으로 개별적으로 정량되고 있고, 자동분석기도 따로 따로 정량하도록 설정되어 있으나, 각각의 콜레스테롤에 대한 특이성의 추가적인 향상이 요망되고 있다. 또한 동일 검출계에 있어서 HDL 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 총콜레스테롤 등을 연속적으로 분별 정량하는 간편하며 자동분석가능한 방법은 알려져 있지 않다.
발명의 개시
본 발명의 목적은 LDL 콜레스테롤의 정량 방법 및 이에 사용하는 정량 시약을 제공하는 데 있다.
또한 본 발명의 목적은 동일검체의 HDL 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤의 연속 분별 정량 방법 및 이에 사용하는 정량 시약 키트를 제공하는 데 있다. 또한, 본 발명의 목적은 동일검체의 HDL 콜레스테롤 및 총콜레스테롤의 연속 분별 정량 방법 및 이에 사용하는 정량 시약 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 다음의 (1) 내지 (27) 에 관한 것이다.
(1) a) 생체시료,
b) 콜레스테롤에스테라제와 콜레스테롤옥시다제 또는 콜레스테롤데히드로게나제 (이하, CH 효소류라고 함) 및
c) LDL 콜레스테롤에만 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약의 존재하, 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 LDL 콜레스테롤 농도를 정량하는 것을 특징으로 하는 생체시료 중의 LDL 콜레스테롤의 정량 방법.
(2) LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약이 적어도 폴리옥시에틸렌 유도체와 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 함유하는 시약인 (1) 기재의 정량 방법.
(3) 폴리옥시에틸렌 유도체가 폴리옥시에틸렌알킬에테르 또는 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르인 (2) 기재의 정량 방법.
(4) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 일반식 (Ⅰ)
HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H (I)
[식중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하며 1 내지 200 의 정수이다.]
로 표현되는 계면활성제인 (2) 또는 (3) 기재의 정량 방법.
(5) a) 생체시료,
b) CH 효소류 및
c) HDL 콜레스테롤에만 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약의 존재하, 제 1 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 HDL 콜레스테롤 농도를 정량하고, 이어서,
d) LDL 콜레스테롤에만 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약을 첨가하여 제 2 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 LDL 콜레스테롤 농도를 정량하는 것을 특징으로 하는 생체시료 중의 HDL 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤의 분별 정량 방법.
(6) a) 생체시료,
b) CH 효소류 및
c) HDL 콜레스테롤에만 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약의 존재하, 제 1 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 HDL 콜레스테롤 농도를 정량하고, 이어서,
d) CH 효소류 및
e) LDL 콜레스테롤에만 d) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약을 첨가하여 제 2 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 LDL 콜레스테롤 농도를 정량하는 것을 특징으로 하는 생체시료 중의 HDL 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤의 분별 정량 방법.
(7) LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약이 적어도 폴리옥시에틸렌 유도체와 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 함유하는 시약인 (5) 또는 (6) 기재의 정량 방법.
(8) 폴리옥시에틸렌 유도체가 폴리옥시에틸렌알킬에테르 또는 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르인 (7) 기재의 정량 방법.
(9) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 일반식 (Ⅰ)
HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H (I)
[식중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하며 1 내지 200 의 정수이다.]
로 표현되는 계면활성제인 (7) 또는 (8) 기재의 정량 방법.
(10) a) 생체시료,
b) CH 효소류 및
c) HDL 콜레스테롤에만 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약의 존재하, 제 1 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 HDL 콜레스테롤 농도를 정량하고, 이어서,
d) 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약을 첨가하여 제 2 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 총콜레스테롤을 정량하는 것을 특징으로 하는 생체시료 중의 HDL 콜레스테롤 및 총콜레스테롤의 분별 정량 방법.
(11) a) 생체시료,
b) CH 효소류 및
c) HDL 콜레스테롤에만 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약의 존재하, 제 1 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 HDL 콜레스테롤 농도를 정량하고, 이어서,
d) CH 효소류 및
e) 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 d) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약을 첨가하여 제 2 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 발생되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 총콜레스테롤을 정량하는 것을 특징으로 하는 생체시료 중의 HDL 콜레스테롤 및 총콜레스테롤의 분별 정량 방법.
(12) HDL 중의 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약이 HDL 이외의리포단백질을 응집시키는 시약인 (5) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 정량 방법.
(13) HDL 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약이 더욱 응집된 리포단백질을 용해하지 않는 비이온성 계면활성제를 함유하는 (12) 기재의 정량 방법.
(14) HDL 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약이 헤파린 또는 그의 염, 인텅스텐산 또는 그의 염, 덱스트란황산 또는 그의 염, 폴리에틸렌글리콜, 황산화시클로덱스트린 또는 그의 염, 황산화올리고당 또는 그의 염, 또는 이들의 혼합물, 및 2 가의 금속염으로 이루어지는 시약인 (12) 또는 (13) 기재의 정량 방법.
(15) 제 1 콜레스테롤의 반응에 사용하는 CH 효소류가 화학수식된 효소이고, 제 2 콜레스테롤의 반응에 사용하는 CH 효소류가 화학수식되어 있지 않은 효소인 (6) 또는 (11) 기재의 정량 방법.
(16) 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 CH 효소류를 작용시키는 시약이 리포단백질을 용해하는 계면활성제를 함유하는 시약인 (10) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 정량 방법.
(17) CH 효소류 및 LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약으로 이루어지는 LDL 콜레스테롤 정량용 시약.
(18) LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약이 적어도 폴리옥시에틸렌 유도체와 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 함유하는 시약인 (17) 기재의 LDL 콜레스테롤 정량용 시약.
(19) 폴리옥시에틸렌 유도체가 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르인 (18) 기재의 정량용 시약.
(20) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 일반식 (Ⅰ)
HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H (I)
[식중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하며 1 내지 200 의 정수이다.]
로 표현되는 계면활성제인 (18) 또는 (19) 기재의 LDL 콜레스테롤 정량용 시약.
(21) 제 1 시약에 HDL 리포단백질 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약 및 CH 효소류를 함유하는 시약 및 제 2 시약에 LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약을 함유하는 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤을 분별 정량하기 위한 시약 키트.
(22) LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약이 폴리옥시에틸렌 유도체와 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 함유하는 시약인 (21) 기재의 시약 키트.
(23) 폴리옥시에틸렌 유도체가 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르인 (21) 기재의 시약 키트.
(24) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 일반식 (Ⅰ)
HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H (I)
[식중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하며 1 내지 200 의 정수이다.]
로 표현되는 계면활성제인 (21) 또는 (22) 기재의 시약 키트.
(25) 제 1 시약에 HDL 리포단백질 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약 및CH 효소류를 함유하는 시약 및 제 2 시약에 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 CH 효소류를 작용시키는 시약을 함유하는 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤과 전체 콜레스테롤을 분별 정량하기 위한 시약 키트.
(26) 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 CH 효소류를 작용시키는 시약이 리포단백질을 용해하는 계면활성제를 함유하는 시약인 (25) 기재의 시약 키트.
(27) HDL 리포단백질 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약이 헤파린 또는 그의 염, 인텅스텐산 또는 그의 염, 덱스트란황산 또는 그의 염, 폴리에틸렌글리콜, 황산화시클로덱스트린 또는 그의 염, 황산화올리고당 또는 그의 염, 또는 이들의 혼합물, 및 2 가의 금속염으로 이루어지는 시약인 (21) 내지 (26) 중 어느 하나에 기재된 시약 키트.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 상기와 같은 각종 리포단백질을 함유하는 생체시료에 LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 특정의 시약 (이하, 시약 A 라고 함) 을 첨가하여 LDL 콜레스테롤을 정량하는 방법 및 이에 사용하는 시약에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기와 같은 각종 리포단백질을 함유하는 생체시료에 HDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 특정한 시약 (이하, 시약 B 라고 함) 을 첨가하여 HDL 콜레스테롤을 정량하고, 이어서 시약 A 를 첨가하여 LDL 콜레스테롤을 정량하는 분별 정량 방법 및 이에 사용하는 시약 키트에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기와 같은 각종 리포단백질을 함유하는 생체시료에 시약 B 를 첨가하여 HDL 콜레스테롤을 정량하고, 이어서 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 CH 효소류를 작용시키는 시약 (이하, 시약 C 라고 함) 을 첨가하여 총콜레스테롤을 정량하는 분별 정량 방법 및 이에 사용하는 시약 키트에 관한 것이다.
본 발명을 적용하는 생체시료는 특별히 한정되지 않으며, 구체적으로는 혈액 자체 또는 혈장, 혈청 등 혈액 분획을 그 시료로 사용할 수 있다.
본 발명의 콜레스테롤을 정량하기 위한 반응은 수성매체 중, 특히 완충액 중에서 실시된다.
완충액에 사용하는 완충제로는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 인산 완충제, 붕산 완충제 및 굿 완충제 등을 들 수 있다. 굿 완충제로는 N-(2-아세타미드)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), N-(2-아세타미드)이미노2아세트산 (ADA), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO), N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (이하, MES 라고 함), 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (이하, MOPS 라고 함), 3-(N-모르폴리노)-2-히드록시프로판술폰산 (MOPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (이하, PIPES 라고 함), 피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판-3-술폰산) (POPSO) 등을 들 수 있다.
완충액의 pH 는 5 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9 이다. 완충제의 사용농도는 5 내지 500 mM, 바람직하게는 20 내지 200 mM 이다.
LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약 A 는 HDL, VLDL 및 CM 중의 콜레스테롤에는 그들 CH 효소류를 작용시키지 않는 시약이다. 시약 A 는 후술하는 HDL 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약의 존재하에서도 LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시킬 수 있다.
상기 시약 A 로는 예컨대 적어도 폴리옥시에틸렌 유도체와 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 함유하는 시약 등을 들 수 있다.
폴리옥시에틸렌 유도체로는 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬에테르 등을 들 수 있고, 그 알킬로는 탄소수 8 이상의 예컨대 옥틸, 노닐 등을 들 수 있고, 그 아릴로는 페닐 등을 들 수 있다.
구체적인 폴리옥시에틸렌 유도체로는 예컨대 비이온 HS-210, 비이온 HS-215, 비이온 NS-208.5, 비이온 HS-208 (이상, 닛뽕유시사 제조), 에멀겐 L-40, 에멀겐 911, 에멀겐 810 (이상, 카오사 제조) 등의 시판품을 들 수 있다. 폴리옥시에틸렌 유도체의 친수성·친유성 밸런스 (이하, HLB 라고 함) 는 9 내지 20 이 바람직하다.
폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체로는 폴리옥시에틸렌과 폴리옥시프로필렌의 랜덤 공중합체라도 좋고, 블록 공중합체라도 좋으며, 예컨대 일반식 (Ⅰ)
HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H (I)
[식중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하며 1 내지 200 의 정수이다.]
로 표현되는 화합물을 들 수 있다.
일반식 (Ⅰ) 로 표현되는 화합물로는 예컨대 플로닉 L-121, 플로닉 L-122, 플로닉 L-101, 플로닉 P-103, 플로닉 F-108 등의 시판품 (모두 아사히덴카사 제조)을 들 수 있다. 또한 일반식 (Ⅰ) 로 표현되는 화합물 중의 폴리프로필렌글리콜기의 분자량은 2,050 이상이 바람직하고, 2,750 이상이 보다 바람직하고, 3,250 이상이 특히 바람직하다. 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체의 HLB 는 1 내지 6 이 바람직하다.
폴리옥시에틸렌 유도체 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체의 사용농도는 특별히 한정되지 않지만, 각각 독립적으로 0.001 내지 10 % 가 바람직하고, 0.01 내지 5 % 가 보다 바람직하고, 0.05 내지 1 % 가 특히 바람직하다.
HDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약 B 로는 HDL 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약, 및 HDL 이외의 리포단백질에 대한 항체 등을 들 수 있다.
HDL 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약은 이 리포단백질의 응집제 및/또는 2 가의 금속염을 포함하는 것이 사용된다. 응집제로는 헤파린 또는 그의 염, 인텅스텐산 또는 그의 염, 덱스트란황산 또는 그의 염, 폴리에틸렌글리콜, 황산화시클로덱스트린 또는 그의 염, 황산화올리고당 또는 그의 염, 또는 이들의 혼합물 등을 들 수 있고, 시클로덱스트린으로는 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린 등을 들 수 있고, 올리고당으로는 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스 등을 들 수 있고, 염으로는 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 암모늄염, 마그네슘염 등을 들 수 있다. 2 가의 금속염으로는 마그네슘염, 칼슘염, 망간염, 니켈염 등을 들 수 있다.
응집제로는 0.02 내지 10 mM 의 분자량 5,000 내지 20,000 의 헤파린 또는 그의 염, 0.1 내지 10 mM 의 분자량 4,000 내지 8,000 의 인텅스텐산 또는 그의염, 0.01 내지 5 mM 의 분자량 10,000 내지 500,000 의 덱스트란황산 또는 그의 염, 0.1 내지 20 mM 의 분자량 1,000 내지 10,000 의 덱스트란황산 또는 그의 염, 0.3 내지 100 mM 의 분자량 4,000 내지 25,000 의 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 0.1 내지 50 mM 의 분자량 1,000 내지 3,000 의 황산화시클로덱스트린 또는 그의 염, 0.1 내지 50 mM 의 분자량 400 내지 3,000 의 황산화올리고당 또는 그의 염, 또는 이들의 혼합물 등이 사용된다. 바람직하게는 0.03 내지 1 mM 의 분자량 14,000 내지 16,000 의 헤파린 또는 그의 염, 0.1 내지 3 mM 의 분자량 5,000 내지 7,000 의 인텅스텐산 또는 그의 염, 0.01 내지 5 mM 의 분자량 150,000 내지 250,000 의 덱스트란황산 또는 그의 염, 0.1 내지 10 mM 의 분자량 1,000 내지 5,000 의 덱스트란황산 또는 그의 염, 1.0 내지 50 mM 의 분자량 5,000 내지 22,000 의 PEG, 0.1 내지 10 mM 의 분자량 1,000 내지 2,000 의 황산화시클로덱스트린 또는 그의 염, 0.1 내지 10 mM 의 분자량 400 내지 2,000 의 황산화올리고당 또는 그의 염, 또는 이들의 혼합물 등이 사용된다.
2 가의 금속염으로는 0.1 내지 50 mM 의 마그네슘염, 칼슘염, 망간염, 니켈염, 코발트염 등을 들 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 50 mM 의 마그네슘염이 사용된다.
HDL 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약에는 응집된 리포단백질을 용해하지 않는 비이온성 계면활성제를 함유시키는 것이 바람직하다.
응집된 리포단백질을 용해하지 않는 비이온성 계면활성제로는 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌공중합체, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염, 알킬벤젠술폰산염 등을 들 수 있다. 이들 중 폴리옥시에틸렌알킬에테르로는 폴리옥시에틸렌에테르 [에멀겐 220 (카오사 제조) 등] 가, 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르로는 시판품으로서 에멀겐 B66 등이, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물로는 시판품으로서 플루로닉 F88 (아사히덴카사 제조) 등이, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산나트륨 [시판품으로는 에마르 20C (카오사 제조) 등] 이, 알킬벤젠술폰산염으로는 도데실벤젠술폰산나트륨이 바람직하다.
응집된 리포단백질을 용해하지 않는 비이온성 계면활성제는 LDL 콜레스테롤에 CH 효소류를 작용시키지 않는 한 조합하여 사용할 수 있지만, 단독으로 사용하는 것이 바람직하다. 사용농도는 특별히 한정되지 않지만 0.01 내지 10 % 가 바람직하고, 0.1 내지 5 % 가 특히 바람직하다.
HDL 이외의 리포단백질에 대한 항체로는 항아포리포단백질 B 항체, 항아포리포단백질 C 항체, 항아포리포단백질 E 항체, 항β리포단백질 항체 등을 들 수 있고, 단독 또는 조합하여 사용된다. 항체로는 폴리크로날항체라도, 모노크로날항체라도 좋다. 또한 이들 항체는 효소적 또는 화학적으로 분해, 수식된 것일 수 있다.
모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 CH 효소류를 작용시키는 시약 C 로서는 예컨대 모든 리포단백질을 용해하는 계면활성제를 들 수 있다.
이 계면활성제로는 HDL, LDL, VLDL 및 CM 의 리포단백질을 용해하는 비이온성 계면활성제 등이 사용된다. 구체적으로는 시판품으로서 트리톤 X-100 등의비이온 계면활성제, 에멀겐 106, 에멀겐 108, 에멀겐 709 등의 폴리옥시에틸렌알킬에테르류 등을 들 수 있다. 이들 계면활성제는 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다. 사용농도는 특별히 한정되지 않지만 0.01 내지 10 % 가 바람직하고, 0.1 내지 5 % 가 특히 바람직하다.
본 발명에 사용하는 콜레스테롤에스테라제, 콜레스테롤옥시다제 및 콜레스테롤데히드로게나제의 활성을 갖는 효소로는 콜레스테롤에스테르를 가수분해하는 능력을 갖는 미생물 또는 동물 유래의 콜레스테롤에스테라제나 리포프로테인리파제, 콜레스테롤을 산화시켜 과산화수소를 생성하는 미생물 유래의 콜레스테롤옥시다제, 미생물 또는 동물 유래의 콜레스테롤데히드로게나제 등을 들 수 있다.
이들 효소는 기질에 대한 특이성에 맞춰 사용될 수 있다. 예컨대 HDL 콜레스테롤의 정량시에는 이 콜레스테롤에 특이적인 효소를 사용하고, LDL 콜레스테롤의 정량시에는 이 콜레스테롤에 특이적인 효소를 사용하는 것이 바람직하다. 이들 효소의 특이성, 안전성을 더욱 높이기 위해서 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 수용성 올리고당 잔기, 술포프로필기 등으로 이 효소를 화학적으로 수식한 것도 사용할 수 있다. 또한 유전자조작에 의해 얻어지는 효소도 사용할 수 있다.
효소를 수식하기 위한 시약 (화학수식제) 으로는 폴리에틸렌글리콜에 아미노기와 결합가능한 기를 결합시킨 화합물, 예컨대 폴리에틸렌글리콜에 N-히드록시숙신이미드기 등의 아미노기와 결합가능한 기를 결합시킨 선블라이트 VFM4101 [닛뽕유시 (주) 제조] 등, 폴리알킬렌글리콜 구조 및 산무수물 구조를 갖는 선블라이트AKM 시리즈, 동 ADM 시리즈, 동 ACM 시리즈 [모두 닛뽕유시 (주) 제조 : 화학공학논문집, 제 20 권, 제 3 호, 459 페이지, 1994 년], 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체에 아미노기와 결합가능한 기를 결합시킨 화합물, 폴리에틸렌글리콜모노메타크릴모노메틸에테르와 무수말레인산의 공중합체 등을 들 수 있다. 또한, 폴리우레탄의 화학수식제인 활성화 폴리우레탄 P4000 (베링거만하임사 제조 Enzyme modification set 능서), 덱스트란의 화학수식제인 덱스트란 T40, 활성화 TCT (동), 1,3-프로판살톤 등도 사용할 수 있다. 이들 화학수식제에 의해 효소를, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 구조에 당류를 포함하는 기, 술포프로필기, 폴리우레탄기 등으로 수식할 수 있다.
효소에 상기 화학수식제를 반응시키는 방법은 단백질의 하이브리드, 이나다유지 저술, 쿄리츠 출판 (1987 년) 등에 기재된 방법이 사용된다. 예컨대 선블라이트를 사용하는 경우에는 효소를 pH 8 이상의 헤페스 완충액 등의 완충액 중에 용해시키고, 0 내지 50 ℃ 에서 예컨대 0.01 내지 500 배 몰량의 선블라이트를 첨가하여 5 내지 60 분간 교반한다. 이 반응액을 그대로 또는 필요에 따라 한외 여과막에 의해 저분자물을 제거하여 사용한다.
본 발명의 콜레스테롤에스테라제, 콜레스테롤옥시다제 및 콜레스테롤데히드로게나제의 사용량은 반응액 중, 각각 0.01 내지 200 U/㎖ 가 바람직하고, 0.1 내지 100 U/㎖ 가 더욱 바람직하다.
본 발명에서는 HDL 콜레스테롤의 정량에 사용하는 CH 효소류를 LDL 콜레스테롤 또는 HDL 이외의 콜레스테롤 또는 총콜레스테롤의 정량에 그대로 사용할 수도 있고, LDL 콜레스테롤 또는 HDL 이외의 콜레스테롤 또는 총콜레스테롤의 정량시에 새로 동일하거나 기질특이성이 다른 CH 효소류를 첨가할 수도 있다.
HDL 콜레스테롤의 정량에 사용하는 CH 효소류는 화학수식한 것을 사용하고, LDL 또는 HDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤 또는 총콜레스테롤의 정량에는 화학수식하고 있지 않은 CH 효소류를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 콜레스테롤의 반응에서는 반응의 특이성에 영향을 미치지 않는 범위에서 CH 효소류를 활성화하기 위해 자주 사용되는 계면활성제 또는 콜산류도 사용가능하며, 또한 글로불린 등을 가용화하기 위한 각종 염류를 사용할 수도 있다.
CH 효소류를 활성화하기 위한 계면활성제로는 예컨대 음이온 계면활성제가 0 내지 1 % 의 범위에서 사용된다. 콜산류로는 콜산, 데옥시콜산, 타우로콜산, 케노데옥시콜산 등이 0 내지 5 % 의 범위에서 사용된다. 음이온 계면활성제로는 1-펜타술폰산염, 1-헥사술폰산염, 1-헵타술폰산염, 1-옥타술폰산염 등의 알킬술폰산염을 들 수 있고 0 내지 5 % 의 범위에서 사용된다.
염류로는 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 아세트산마그네슘, 염화리튬, 황산리튬, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산마그네슘, 질산칼슘 등이 0 내지 100 mM 의 범위에서 사용된다.
콜레스테롤의 반응이 콜레스테롤에스테라제와 콜레스테롤옥시다제에 의해 실시되는 경우에는 과산화수소가 발생한다. 발생한 과산화수소는 예컨대 퍼옥시다제의 존재하, 4-아미노안티피린과 페놀류, 4-아미노안티피린과 톨린더 시약 또는고감도의 색소원을 사용하여 정량할 수 있다.
페놀류로는 예컨대 페놀, 4-클로로페놀, m-크레졸, 3-히드록시-2,4,6-트리요오드벤조산 (HTIB) 등을 들 수 있다.
톨린더 시약 (도징카가꾸 연구소 제 19 판 종합 카탈로그, 1994 년) 으로는 N-술포프로필아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘 (TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-술포프로필-m-톨루이딘 (TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-m-톨루이딘, N,N-디술포프로필-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-술포프로필-m-아니시딘, N-에틸-N-술포프로필아닐린, N-에틸-N-술포프로필-3,5-디메톡시아닐린, N-술포프로필-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-술포프로필-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-아니시딘, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 등의 아닐린류 또는 N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민 등을 들 수 있다.
고감도의 색소원으로는 특공소 60-33479 호에 기재된 10-(N-메틸카르바모일) -3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진 (MCDP), 특공평 4-27839 호에 기재된 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA), 특개소 62-296 호에 기재된 화합물 등을 들 수 있다.
이들 색소원의 농도로는 0.01 내지 10 ㎎/㎖ 이 바람직하다.
콜레스테롤의 반응이 기질로서 산화형 보효소인 NAD(P) 존재하에, 콜레스테롤에스테라제와 콜레스테롤데히드로게나제에 의해 실시되는 경우에는 환원형 보효소인 NAD(P)H 가 발생한다. NAD(P)H 는 300 내지 500 ㎚, 바람직하게는 330 내지 400 ㎚, 특히 바람직하게는 약 340 ㎚ 에서의 반응액의 흡광도를 측정함으로써 정량할 수 있다. 그리고, NAD(P)H 의 정량은 디아포라제, 테트라졸륨염을 첨가하여 포르마잔 색소의 발색을 유도하여 포르마잔 색소를 비색하여 실시할 수도 있다.
LDL 콜레스테롤 정량을 위한 반응은 10 내지 50 ℃, 바람직하게는 30 내지 40 ℃, 통상 37 ℃ 에서 1 내지 30 분간, 바람직하게는 2 내지 10 분간 실시한다.
분별 정량에 있어서의 HDL 콜레스테롤 정량을 위한 반응 (이하, 제 1 반응이라고 함) 은 10 내지 50 ℃, 바람직하게는 30 내지 40 ℃, 통상 37 ℃ 에서 1 내지 30 분간, 바람직하게는 2 내지 10 분간 실시하고, LDL 콜레스테롤 또는 총콜레스테롤 정량을 위한 반응 (이하, 제 2 반응이라고 함) 은 10 내지 50 ℃, 바람직하게는 30 내지 40 ℃, 통상 37 ℃ 에서 1 내지 30 분간, 바람직하게는 2 내지 10 분간 실시한다. 제 2 반응의 개시는 제 1 반응에서 반응이 실질적으로 종료한 후에도, 제 1 반응이 진행중에도, HDL 의 정량이 완료하면 어느 시기라도 좋다. 제 2 반응은 LDL 콜레스테롤에 CH 효소류를 특이적으로 작용시키는 시약 A 또는 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 CH 효소류를 작용시키는 시약 C 및 필요에 따라 CH 효소류를 첨가하여 개시한다. 제 2 반응에 의해 발생하는 과산화수소 또는 환원형 보효소 [NAD(P)H] 를 정량하는 시약은 제 1 반응액에 사용한 것을 그대로 사용할 수 있지만 필요하다면 새로 첨가해도 된다.
본 발명에서 HDL 콜레스테롤의 반응후에 LDL 콜레스테롤의 반응을 실시하여 HDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤을 분별 정량하는 경우에는 전술한 바와 같이 LDL 콜레스테롤의 반응은 시약 A 를 첨가하여 개시되지만, 제 1 HDL 콜레스테롤의 반응이 전술한 HDL 이외의 응집한 리포단백질을 용해하지 않는 비이온성 계면활성제, 즉 폴리옥시에틸렌 유도체 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 중 어느 하나를 첨가하여 실시되고 있을 때에는 상기 제 2 LDL 콜레스테롤의 반응은 HDL 콜레스테롤 반응에 사용되고 있는 계면활성제와 합쳐 시약 A 를 구성하는 계면활성제를 첨가함으로써 개시할 수도 있다.
각 리포단백질 중의 콜레스테롤 농도는 검체시료를 사용한 경우의 각 반응전후의 흡광도의 차이 (ΔOD) 및 각종 리포단백질 중의 콜레스테롤 농도 기지의 시료를 사용한 경우의 흡광도의 차이 (ΔODstd) 로부터 하기의 계산을 통해 산출된다.
LDL 콜레스테롤 농도는 ΔOD ÷ΔODstd ×(기지의 LDL 콜레스테롤 농도) 로부터 측정할 수 있다. HDL 콜레스테롤 농도는 예컨대 ΔOD ÷ΔODstd ×(기지의 HDL 콜레스테롤 농도) 의 계산에 의해 측정할 수 있다. 그리고, 분별 정량에 있어서, 제 1 반응과 제 2 반응에서 생성되는 화합물이 동일하고 검출방법이 동일한 경우에는 총콜레스테롤 농도는 제 1 반응전과 제 2 반응후의 흡광도차이를 이용하여 ΔOD ÷ΔODstd ×(기지의 총콜레스테롤 농도) 의 계산에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 LDL 콜레스테롤 정량 시약으로는 CH 효소류 및 폴리옥시에틸렌 유도체 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 함유하는 시약을 함유하는 시약을 들 수 있다. 상기 LDL 정량 시약에는 필요하다면 전술한 완충제, HDL 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약, 콜레스테롤 정량에 사용되는 계면활성제, 콜산류, 각종 염류, 퍼옥시다제 등의 효소, 4-아미노안티피린 및 톨린더 시약 등의 색원체 등, NAD(P) 등의 산화형 보효소를 함유할 수 있다.
본 발명의 HDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤을 분별 정량하기 위한 시약 키트는 제 1 시약과 제 2 시약의 키트로 이루어지고, 예컨대 제 1 시약은 HDL 이외의 리포단백질의 응집제 및 CH 효소류를 함유하는 시약으로 이루어지고, 제 2 시약은 폴리옥시에틸렌 유도체 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 함유하는 시약을 함유하는 시약으로 이루어진다.
또한 본 발명의 HDL 콜레스테롤과 총콜레스테롤을 분별 정량하기 위한 시약 키트는 제 1 시약과 제 2 시약의 키트로 이루어지고, 예컨대 제 1 시약은 HDL 이외의 리포단백질의 응집제 및 CH 효소류를 함유하는 시약으로 이루어지고, 제 2 시약은 모든 리포단백질 (HDL, LDL, VLDL 및 CM) 을 용해하는 비이온성 계면활성제를 함유하는 시약으로 이루어진다.
본 발명의 시약 키트의 제 1 시약 또는 제 2 시약에는 필요하다면 전술한 완충제, 콜레스테롤 정량에 사용되는 계면활성제, 콜산류, 각종 염류, 퍼옥시다제 등의 효소, 4-아미노안티피린 및 톨린더 시약 등의 색원체 등, NAD(P) 등의 산화형 보효소를 함유할 수 있다.
제 2 시약에는 필요하다면 제 1 시약과 동일하거나 상이한 기원의 CH 효소류를 사용해도 된다. 제 1 시약에 사용하는 CH 효소류는 전술한 화학수식된 효소를 사용하고, 제 2 시약에 사용하는 CH 효소류는 화학수식되어 있지 않은 효소를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 임상 진단 분야에서 중요한 저밀도 리포단백질 (이하, LDL 이라고 함) 중의 콜레스테롤 (이하, LDL 콜레스테롤이라고 함) 의 정량 방법 및 이에 사용하는 정량 시약에 관한 것이다. 또한 본 발명은 임상 진단 분야에서 중요한 고밀도 리포단백질 (이하, HDL 이라고 함) 중의 콜레스테롤 (이하, HDL 콜레스테롤이라고 함) 및 LDL 콜레스테롤의 연속 분별 정량 방법 및 이에 사용하는 시약 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 임상 진단 분야에서 중요한 HDL 콜레스테롤 및 총콜레스테롤 [HDL, LDL, 초저밀도 리포단백질 (이하, VLDL 이라고 함) 및 카이로미크론 (이하, CM 이라고 함) 중의 전체 콜레스테롤을 말한다] 의 연속 분별 정량 방법 및 이에 사용하는 정량 시약 키트에 관한 것이다.
도 1 은 본 발명의 방법 (도면중, DB HDL-C 로 표시) 으로 얻어지는 HDL 콜레스테롤 농도와 대조방법 (L HDL-C 방법, 도면중, S HDL-C 로 표시) 으로 얻어지는 HDL 콜레스테롤 농도의 상관을 나타낸다.
도 2 는 본 발명의 방법 (도면중, DB LDL-C 로 표시) 으로 얻어지는 LDL 콜레스테롤 농도와 대조방법 (L LDL-C 방법, 도면중, S LDL-C 로 표시) 으로 얻어지는 LDL 콜레스테롤 농도의 상관을 나타낸다.
도 3 은 본 발명의 방법 (도면중, DB-TC 로 표시) 으로 얻어지는 총콜레스테롤 농도와 대조방법 (데터미너 L TC Ⅱ 방법, 도면중, L TC Ⅱ 로 표시) 으로 얻어지는 총콜레스테롤 농도의 상관을 나타낸다.
도 4 는 본 발명의 방법 (도면중, DB HDL-C 로 표시) 으로 얻어지는 HDL 콜레스테롤 농도와 대조방법 (L HDL-C 방법, 도면중, S HDL-C 로 표시) 으로 얻어지는 HDL 콜레스테롤 농도의 상관을 나타낸다.
도 5 는 본 발명의 방법 (도면중, 본 법이라고 표시) 으로 얻어지는 LDL 콜레스테롤 농도와 대조방법 (도면중, 대조방법이라고 표시) 인 프리에데왈드의 계산식으로 얻어지는 LDL 콜레스테롤 농도의 상관을 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
실시예 1 (HDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤의 정량)
시약 1 (pH＝7)
MES (나카라이테스크사 제조) 20 mM
덱스트란황산 (토쿄가세이사 제조) 0.23 ㎎/㎖
황산마그네슘 (칸토카가꾸사 제조) 1.5 ㎎/㎖
HDAOS (도징카가꾸사 제조) 0.23 ㎎/㎖
4-아미노안티피린 (사이꾜가세이사 제조) 0.13 ㎎/㎖
폴리에틸렌글리콜 수식 콜레스테롤에스테라제 (*1) 0.25 U/㎖
폴리에틸렌글리콜 수식 콜레스테롤옥시다제 (*2) 1.65 U/㎖
퍼옥사다제 (토요보세키사 제조) 12.5 U/㎖
*1 : 50 g 의 콜레스테롤에스테라제 (아마노세이야꾸사 제조) 를 1 ℓ의 0.1 M HEPES 완충액 (pH 8.5) 에 용해하고, 25 ℃ 에서 330 g 의 선블라이트 VFM4101 을 첨가하여 2 시간 교반하여 제조한다.
*2 : 50 g 의 콜레스테롤옥시다제 (교와학꼬고오교사 제조) 를 1 ℓ의 0.1 M HEPES 완충액 (pH 8.0) 에 용해하고, 15 ℃ 에서 10 g 의 선블라이트 VFM4101 을 첨가하여 2 시간 교반하여 제조한다.
시약 2 (pH ＝ 7)
MES (나카라이테스크사 제조) 20 mM
콜레스테롤에스테라제 (리포프로테인리파제, 토요보세키사 제조)
3 U/㎖
콜레스테롤옥시다제 (교와학꼬고오교사 제조) 2 U/㎖
플로닉 L-121 (아사히덴카사 제조) 0.7 %
에멀겐 L-40 (카오사 제조) 0.5 %
염화칼슘 (와꼬쥰야꾸고오교사 제조) 0.1 ㎎/㎖
검체로서 정상인의 혈청 30 검체를 준비하고, 하기 조작에 의해 검체 중의 HDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤의 정량을 실시한다. 시약 1, 2.25 ㎖ 에 검체 30 ㎕ 를 첨가, 교반하고, 직후 585 ㎚ 의 흡광도 E1 을 측정한다. 이어서 37 ℃ 에서 5 분간 반응후 동일한 흡수파장의 흡광도 E2 를 측정한다. 이것에 추가로 시약 2, 0.75 ㎖ 를 첨가, 교반하고, 직후의 585 ㎚ 의 흡광도 E3 을 측정한다. 이어서 37 ℃ 에서 5 분간 반응후 동일한 흡수파장의 흡광도 E4 를 측정한다. 한편, 콜레스테롤 기지 농도의 혈청을 동일한 조작으로 하여 각 흡광도 E1std, E2std, E3std 및 E4std 를 산출한다.
HDL 콜레스테롤 농도는 상기 흡광도로부터, (E2－E1) ÷(E2std－E1std) ×(기지 HDL 콜레스테롤 농도) 의 식에 의해 산출한다. 마찬가지로 LDL 콜레스테롤 농도도 상기 흡광도로부터 (E4－E3) ÷(E4std－E3std) ×(기지 LDL 콜레스테롤 농도) 의 식에 의해 산출한다.
또한, 별도 각 콜레스테롤의 개별정량용 시판 키트인 데터미너 L HDL-C (교와 메덱스사 제조) 및 데터미너 L LDL-C (교와 메덱스사 제조) 를 사용하여 각 검체 중의 HDL 콜레스테롤 농도, LDL 콜레스테롤 농도를 정량한다. 그 시판 키트로 얻어진 정량값과 본 발명의 방법으로 얻어진 정량값의 상관관계를 계산한 결과, HDL 콜레스테롤에서는 0.997, LDL 콜레스테롤에서는 0.988 이었다.
도 1 은 본 발명의 방법 (도 1 중, DB HDL-C 로 표시) 으로 얻어지는 HDL 콜레스테롤 농도 (㎎/dL) 와 대조방법 (L HDL-C 방법, 도 1 중, S HDL-C 로 표시) 으로 얻어지는 HDL 콜레스테롤 농도 (㎎/dL) 의 상관도를 나타낸다. 또한 도 2 는 본 발명의 방법 (도 2 중, DB LDL-C 로 표시) 으로 얻어지는 LDL 콜레스테롤 농도 (㎎/dL) 와 대조방법 (L LDL-C 방법, 도 2 중, S LDL-C 로 표시) 으로 얻어지는 LDL 콜레스테롤 농도 (㎎/dL) 의 상관도를 나타낸다.
실시예 2 (HDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤의 정량)
시약 1 (pH＝7)
MES (나카라이테스크사 제조) 20 mM
인텅스텐산 (와꼬쥰야꾸고오교사 제조) 7.5 ㎎/㎖
황산마그네슘 (와꼬쥰야꾸고오교사 제조) 1.5 ㎎/㎖
TOOS (도징카가꾸사 제조) 0.5 ㎎/㎖
에멀겐 B66 (카오사 제조) 10 ㎎/㎖
4-아미노안티피린 (사이꾜가세이사 제조) 0.5 ㎎/㎖
콜레스테롤에스테라제 (LPBP, 아사히가세이사 제조) 4 U/㎖
콜레스테롤옥시다제 (rCO, 오리엔탈 효모사 제조) 2 U/㎖
퍼옥시다제 (토요보세키사 제조) 10 U/㎖
시약 2 (pH＝7)
MES (나카라이테스크사 제조) 50 mM
콜레스테롤에스테라제 (리포프로테인리파제, 토요보세키사 제조)
3 U/㎖
콜레스테롤옥시다제 (교와학꼬고오교사 제조) 2 U/㎖
플로닉 L-121 (아사히덴카사 제조) 0.7 %
에멀겐 L-40 (카오사 제조) 0.5 %
염화칼슘 (와꼬쥰야꾸고오교사 제조) 0.1 ㎎/㎖
실시예 1 과 동일한 검체를 사용하고, 측정파장을 555 ㎚ 로 한 것 이외에는 실시예 1 과 동일한 조작을 실시하여 HDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤의 정량을 실시한다. 시판 키트 (전술한 데터미너 L HDL-C 및 데터미너 L HDL-C) 로 얻어진 정량값과 본 발명의 방법으로 얻어진 정량값의 상관관계를 계산한 결과, HDL 콜레스테롤에서는 0.929, LDL 콜레스테롤에서는 0.911 이었다.
실시예 3 (HDL 콜레스테롤과 총콜레스테롤의 정량)
시약 1 (pH＝7)
MES (나카라이테스크사 제조) 20 mM
덱스트란황산 (토쿄가세이사 제조) 0.23 ㎎/㎖
황산마그네슘 (칸토카가꾸사 제조) 1.5 ㎎/㎖
HDAOS (도징카가꾸사 제조) 0.23 ㎎/㎖
4-아미노안티피린 (사이꾜가세이사 제조) 0.13 ㎎/㎖
폴리에틸렌글리콜 수식 콜레스테롤에스테라제 (*1) 0.25 U/㎖
폴리에틸렌글리콜 수식 콜레스테롤옥시다제 (*1) 1.65 U/㎖
퍼옥사다제 (토요보세키사 제조) 12.5 U/㎖
*1 : 실시예 1 의 *1 과 동일하게 제조
*2 : 실시예 1 의 *2 와 동일하게 제조
시약 2 (pH＝6.75)
MES (나카라이테스크사 제조) 30 mM
트리톤 X-100 (시그마사 제조) 1 g/ℓ
콜레스테롤에스테라제 (토요보세키사 제조) 2.4 U/㎖
콜레스테롤옥시다제 (아미노세이야꾸사 제조) 6.25 U/㎖
검체로서 실시예 1 에서 사용한 정상인의 혈청 30 검체를 준비하고, 하기 조작에 의해 검체 중의 HDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤의 정량을 실시한다.
시약 1, 2.25 ㎖ 에 검체 30 ㎕ 를 첨가, 교반하고, 직후 585 ㎚ 의 흡광도 E1 을 측정한다. 이어서 37 ℃ 에서 5 분간 반응후 동일한 흡수파장의 흡광도 E2 를 측정한다. 이것에 추가로 시약 2, 0.75 ㎖ 를 첨가, 교반하고, 직후의 585 ㎚ 의 흡광도 E3 을 측정한다. 이어서 37 ℃ 에서 5 분간 반응후 동일한 흡수파장의 흡광도 E4 를 측정한다. 한편, 콜레스테롤 기지 농도의 혈청을 동일한 조작을 하여 각 흡광도 E1std, E2std, E3std 및 E4std 를 산출한다.
HDL 콜레스테롤 농도는 상기 흡광도로부터, (E2－E1) ÷(E2std－E1std) ×(기지 HDL 콜레스테롤 농도) 의 식에 의해 산출한다. 마찬가지로 총콜레스테롤 농도는 상기 흡광도로부터 (E4－E1) ÷(E4std－E1std) ×(기지 총콜레스테롤 농도)의 식에 의해 산출한다.
또한, 별도 각 콜레스테롤의 개별정량용 시판 키트인 데터미너 L HDL-C (교와 메덱스사 제조) 및 데터미너 L TC Ⅱ (교와 메덱스사 제조) 를 사용하여 각 검체 중의 HDL 콜레스테롤, 총콜레스테롤 농도를 정량한다. 그 시판 키트로 얻어진 정량값과 본 발명의 방법으로 얻어진 정량값의 상관관계를 계산한 결과, HDL 콜레스테롤에서는 0.992, 총콜레스테롤에서는 0.999 이었다.
도 3 은 본 법 (도 3 중, DB-TC 로 표시) 으로 얻어지는 총콜레스테롤 농도 (㎎/dL) 와 대조방법 (데터미너 TC Ⅱ 방법, 도 3 중, L TC Ⅱ 로 표시) 으로 얻어지는 총콜레스테롤 농도 (㎎/dL) 의 상관도를 나타낸다.
도 4 는 본 발명의 방법 (도 4 중, DB HDL-C 로 표시) 으로 얻어지는 HDL 콜레스테롤 농도 (㎎/dL) 와 대조방법 (L HDL-C 방법, 도 4 중, S HDL-C 로 표시) 으로 얻어지는 HDL 콜레스테롤 농도 (㎎/dL) 의 상관도를 나타낸다.
실시예 4
제 1 시약 (pH 7.25)
PIPES (나카라이테스크사 제조) 50 mM
HDAOS (도징카가꾸사 제조) 0.3 ㎎/㎖
제 2 시약 (pH 7.25)
PIPES (나카라이테스크사 제조) 50 mM
콜레스테롤에스테라제 (리포프로테인리파제, 토요보세키사 제조)
5 U/㎖
콜레스테롤옥시다제 (교와학꼬고오교사 제조) 1 U/㎖
퍼옥시다제 (토요보세키사 제조) 20 U/㎖
4-아미노안티피린 (사이꾜가세이사 제조) 0.51 ㎎/㎖
염화칼슘 (와꼬쥰야꾸고오교사 제조) 0.1 ㎎/㎖
계면활성제 (표 1 에 기재된 종류와 농도)
검체로서 초원심법에 의해 인간 혈청에서 분리된 HDL, LDL, VLDL, CM 을 사용한다. 그리고, 각 리포단백질의 분획은 복지의료기술진행회로부터 얻었다. 이 분획은 어드밴스드·리피드·리서치 (Adv. Lipid. Res.), 6 (1968) [Practical methods for plasma lipoprotein analysis, Hatch F & Lees R] 에 따라 제조된 것이다. 그리고, 본 실험에 사용한 각 리포단백질 중의 콜레스테롤 농도를 데터미너 L TC Ⅱ (교와 메덱스사 제조) 에 의해 정량한 결과, HDL 에서 73 ㎎/dL, LDL 에서 264 ㎎/dL, VLDL 에서 84 ㎎/dL, CM 에서 17 ㎎/dL 이었다.
제 1 시약 300 ㎕ 에 각 검체 4 ㎕ 을 혼합하여 5 분간, 37 ℃ 에서 보온한다. 이 때의 흡광도를 측정하고, 이어서 제 2 시약 100 ㎕ 을 첨가하여 반응시키고, 5 분후의 흡광도를 측정한다. 히다치 7070 자동분석장치를 사용하고, 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 를 사용한다.
시료로서 LDL 분획을 사용하여 얻어진 반응전후의 흡광도차를 ALDL, HDL 분획을 사용하여 얻어진 반응전후의 흡광도차를 AHDL, VLDL 분획을 사용하여 얻어진 반응전후의 흡광도차를 AVLDL및 CM 분획을 사용하여 얻어진 반응전후의 흡광도차를 ACM으로 한다.
결과를 표 1 에 나타낸다. 결과는 AHDL/ALDL값, AVLDL/ALDL값 및 ACM/ALDL값을 나타냈다. 이들 값이 작을수록 LDL 에 특이적인 정량조건임을 나타낸다.
계면활성제 농도 (%) AHDL/ALDL AVLDL/ALDL ACM/ALDL
플로닉 L-121에멀겐 L40 0.20.16 7.3 6.6 4.6
플로닉 L-121비이온 HS-210 0.20.1 9.6 13.5 3.2
플로닉 L-121에멀겐 911 0.20.1 10.2 7.7 1.2
플로닉 L-122에멀겐 L40 0.20.16 8.1 8.2 3.4
플로닉 L-121(비교예 1) 0.2 34.7 47.9 16.8
에멀겐 L-40(비교예 2) 0.16 27.8 39.7 9.7
비이온 HS-210(비교예 3) 0.1 35.5 35.5 6.1
비이온 HS-215(비교예 4) 0.16 76.8 33.6 4.7
비이온 NS-208.5(비교예 5) 0.24 44.5 32.4 51.2
비이온 NS-208(비교예 6) 0.08 30.2 47.3 28.3
에멀겐 911(비교예 7) 0.1 22.6 15.9 3.0
에멀겐 810(비교예 8) 0.2 24.7 36.8 5.8
플로닉 L-122(비교예 9) 0.2 38.1 64.1 19.0
표 1 에 나타내는 바와 같이 계면활성제를 조합하여 사용함으로써 계면활성제를 단독으로 사용하는 경우에 비해 콜레스테롤의 반응이 LDL 콜레스테롤에 특이적으로 된다.
실시예 5
제 1 시약 (pH 6.75)
MOPS (나카라이테스크사 제조) 50 mM
HDAOS (도징카가꾸사 제조) 0.3 ㎎/㎖
제 2 시약 (pH 6.75)
MOPS (나카라이테스크사 제조) 50 mM
콜레스테롤에스테라제 (리포프로테인리파제, 토요보세키사 제조)
1 U/㎖
콜레스테롤옥시다제 (교와학꼬고오교사 제조) 3 U/㎖
퍼옥시다제 (토요보세키사 제조) 20 U/㎖
4-아미노안티피린 (사이꾜가세이사 제조) 0.51 ㎎/㎖
염화칼슘 (와꼬쥰야꾸고오교사 제조) 0.1 ㎎/㎖
계면활성제 (표 2 에 기재된 종류와 농도)
표 2 의 계면활성제를 사용하는 것 이외에는 실시예 4 와 동일하게 시험하고, ALDL, AHDL, AVLDL및 ACM을 산출하고, AHDL/ALDL값, AVLDL/ALDL및 ACM/ALDL을 산출한다. 그리고, 본 실험에 사용한 각 리포단백질 중의 콜레스테롤 농도를 데터미너 L TC Ⅱ (교와 메덱스사 제조) 에 의해 정량한 결과는 HDL 에서 81 ㎎/dL, LDL 에서 263 ㎎/dL, VLDL 에서 72 ㎎/dL, CM 에서 14 ㎎/dL 이었다.
결과를 표 2 에 나타낸다.
계면활성제 농도 (%) AHDL/ALDL AVLDL/ALDL ACM/ALDL
플로닉 L-101에멀겐 L40 0.20.16 8.7 7.3 2.6
플로닉 P-103에멀겐 L-40 0.20.16 13.0 3.9 1.7
플로닉 F-108에멀겐 L-40 0.20.16 15.0 4.5 1.4
에멀겐 L-40(비교예 10) 0.16 26.5 24.6 4.7
플로닉 L-101(비교예 11) 0.2 19.0 14.3 5.6
플로닉 P-103(비교예 12) 0.2 24.8 3.5 1.1
플로닉 F-108(비교예 13) 0.2 28.8 17.8 1.6
표 2 에 나타내는 바와 같이 계면활성제를 조합하여 사용함으로써 계면활성제를 단독으로 사용하는 경우에 비해 콜레스테롤의 반응이 LDL 콜레스테롤에 특이적으로 된다.
실시예 6
제 1 시약 (pH 6.75)
MOPS (나카라이테스크사 제조) 20 mM
HDAOS (도징카가꾸사 제조) 0.3 ㎎/㎖
제 2 시약 (pH 6.75)
MOPS (나카라이테스크사 제조) 20 mM
콜레스테롤에스테라제 (리포프로테인리파제, 토요보세키사 제조)
2 U/㎖
콜레스테롤옥시다제 (교와학꼬고오교사 제조) 3 U/㎖
퍼옥시다제 (토요보세키사 제조) 20 U/㎖
4-아미노안티피린 (사이꾜가세이사 제조) 0.51 ㎎/㎖
염화칼슘 (와꼬쥰야꾸고오교사 제조) 0.1 ㎎/㎖
계면활성제 (표 3 에 기재된 종류와 농도)
표 3 의 계면활성제를 사용하는 것 이외에는 실시예 4 와 동일하게 시험하고, ALDL, AHDL, AVLDL및 ACM을 산출하고, AHDL/ALDL값, AVLDL/ALDL및 ACM/ALDL을 산출한다. 그리고, 본 실험에 사용한 각 리포단백질 중의 콜레스테롤 농도를 데터미너 L TC Ⅱ (교와 메덱스사 제조) 에 의해 정량한 결과는 HDL 에서 85 ㎎/dL, LDL 에서 252 ㎎/dL, VLDL 에서 75 ㎎/dL, CM 에서 19 ㎎/dL 이었다.
결과를 표 3 에 나타낸다.
계면활성제 농도 (%) AHDL/ALDL AVLDL/ALDL ACM/ALDL
플로닉 L-121에멀겐 L-40 0.70.5 4.0 5.0 3.4
표 3 에 나타내는 바와 같이 계면활성제를 조합하여 사용함으로써 LDL 콜레스테롤을 특이적으로 측정할 수 있다.
실시예 7
제 1 시약 (pH 7.0)
MOPS (나카라이테스크사 제조) 10 mM
HDAOS (도징카가꾸사 제조) 0.3 ㎎/㎖
제 2 시약 (pH 7.0)
MOPS (나카라이테스크사 제조) 50 mM
콜레스테롤에스테라제 (리포프로테인리파제, 토요보세키사 제조)
1 U/㎖
콜레스테롤옥시다제 (교와학꼬고오교사 제조) 3 U/㎖
퍼옥시다제 (토요보세키사 제조) 20 U/㎖
4-아미노안티피린 (사이꾜가세이사 제조) 0.51 ㎎/㎖
염화칼슘 (와꼬쥰야꾸고오교사 제조) 0.1 ㎎/㎖
계면활성제 (표 4 에 기재된 종류와 농도)
표 4 의 계면활성제를 사용하는 것 이외에는 실시예 4 와 동일하게 시험하고, ALDL, AHDL, AVLDL및 ACM을 산출하고, AHDL/ALDL값, AVLDL/ALDL및 ACM/ALDL을 산출한다. 그리고, 본 실험에 사용한 각 리포단백질 중의 콜레스테롤 농도를 데터미너 L TC Ⅱ (교와 메덱스사 제조) 에 의해 정량한 결과는 HDL 에서 79 ㎎/dL, LDL 에서 273 ㎎/dL, VLDL 에서 76 ㎎/dL, CM 에서 16 ㎎/dL 이었다.
결과를 표 4 에 나타낸다.
계면활성제 농도 (%) AHDL/ALDL AVLDL/ALDL ACM/ALDL
플로닉 L-121에멀겐 L-40 0.40.32 2.5 5.8 1.3
표 4 에 나타내는 바와 같이 계면활성제를 조합하여 사용함으로써 LDL 콜레스테롤을 특이적으로 측정할 수 있다.
실시예 8
제 1 시약 (pH 7.0)
MOPS (나카라이테스크사 제조) 10 mM
HDAOS (도징카가꾸사 제조) 0.3 ㎎/㎖
염화마그네슘6수염 (칸토카가꾸사 제조) 7 ㎎/dL
덱스트란황산나트륨 (토쿄가세이사 제조) 0.7 ㎎/dL
제 2 시약 (pH 6.75)
MOPS (나카라이테스크사 제조) 50 mM
콜레스테롤에스테라제 (리포프로테인리파제, 토요보세키사 제조)
1 U/㎖
콜레스테롤옥시다제 (교와학꼬고오교사 제조) 3 U/㎖
퍼옥시다제 (토요보세키사 제조) 20 U/㎖
4-아미노안티피린 (사이꾜가세이사 제조) 0.51 ㎎/㎖
염화칼슘 (와꼬쥰야꾸고오교사 제조) 0.1 ㎎/㎖
계면활성제 (표 5 에 기재된 종류와 농도)
표 5 의 계면활성제를 사용하여 제 2 시약 첨가직후의 흡광도와 제 2 시약 첨가 5 분후의 흡광도를 측정하여 이 흡광도의 차이를 ALDL, AHDL, AVLDL및 ACM을 산출하는 것 이외에는 실시예 4 와 동일하게 시험하고, AHDL/ALDL값, AVLDL/ALDL및 ACM/ALDL을 산출한다. 그리고, 본 실험에 사용한 각 리포단백질 중의 콜레스테롤 농도를 데터미너 L TC Ⅱ (교와 메덱스사 제조) 에 의해 정량한 결과는 HDL 에서 79 ㎎/dL, LDL 에서 273 ㎎/dL, VLDL 에서 76 ㎎/dL, CM 에서 16 ㎎/dL 이었다.
결과를 표 5 에 나타낸다.
계면활성제 농도 (%) AHDL/ALDL AVLDL/ALDL ACM/ALDL
플로닉 L-121에멀겐 L-40 0.40.32 2.6 4.6 1.3
표 5 에 나타내는 바와 같이 계면활성제를 조합하여 사용함으로써 LDL 콜레스테롤을 특이적으로 측정할 수 있다.
실시예 9
제 1 시약 (pH 7.0)
MOPS (나카라이테스크사 제조) 10 mM
HDAOS (도징카가꾸사 제조) 0.3 ㎎/㎖
염화마그네슘6수염 (칸토카가꾸사 제조) 7 ㎎/dL
덱스트란황산나트륨 (토쿄가세이사 제조) 0.7 ㎎/dL
제 2 시약 (pH 7.0)
MOPS (나카라이테스크사 제조) 50 mM
콜레스테롤에스테라제 (리포프로테인리파제, 토요보세키사 제조)
1 U/㎖
콜레스테롤옥시다제 (교와학꼬고오교사 제조) 0.6 U/㎖
퍼옥시다제 (토요보세키사 제조) 20 U/㎖
4-아미노안티피린 (사이꾜가세이사 제조) 0.51 ㎎/㎖
염화칼슘 (와꼬쥰야꾸고오교사 제조) 0.1 ㎎/㎖
계면활성제 (표 6 에 기재된 종류와 농도)
표 6 의 계면활성제를 사용하는 것 이외에는 실시예 8 과 동일하게 시험하고, ALDL, AHDL, AVLDL및 ACM을 산출하고, AHDL/ALDL값, AVLDL/ALDL및 ACM/ALDL을 산출한다. 그리고, 본 실험에 사용한 각 리포단백질 중의 콜레스테롤 농도를 데터미너 L TC Ⅱ (교와 메덱스사 제조) 에 의해 정량한 결과는 HDL 에서 82 ㎎/dL, LDL 에서 270 ㎎/dL, VLDL 에서 73 ㎎/dL, CM 에서 14 ㎎/dL 이었다.
결과를 표 6 에 나타낸다.
계면활성제 농도 (%) AHDL/ALDL AVLDL/ALDL ACM/ALDL
플로닉 L-121에멀겐 L-40 0.3750.30 2.5 4.3 1.4
플로닉 L-121에멀겐 L-40 0.71250.57 2.5 2.2 1.8
표 6 에 나타내는 바와 같이 계면활성제를 조합하여 사용함으로써 LDL 콜레스테롤을 특이적으로 측정할 수 있다.
실시예 10
제 1 시약 (pH 7.25)
PIPES (나카라이테스크사 제조) 50 mM
HDAOS (도징카가꾸사 제조) 0.3 ㎎/㎖
제 2 시약 (pH 7.25)
PIPES (나카라이테스크사 제조) 50 mM
콜레스테롤에스테라제 (리포프로테인리파제, 토요보세키사 제조)
2 U/㎖
콜레스테롤옥시다제 (교와학꼬고오교사 제조) 3 U/㎖
퍼옥시다제 (토요보세키사 제조) 20 U/㎖
4-아미노안티피린 (사이꾜가세이사 제조) 0.51 ㎎/㎖
염화칼슘 (와꼬쥰야꾸고오교사 제조) 0.1 ㎎/㎖
에멀겐 L-40 (카오사 제조) 0.16 %
플로닉 L-121 (아사히덴카사 제조) 0.2 %
검체로서 환자의 혈청 88 검체를 준비하고, 하기의 조작에 의해 검체중의 LDL 콜레스테롤의 정량을 실시한다. 제 1 시약 300 ㎕ 에 각 검체 4 ㎕ 를 혼합하고 5 분간 37 ℃ 에서 보온한다. 이 때의 흡광도를 측정하고, 이어서 제 2 시약 100 ㎕ 를 첨가하여 반응시키고, 5 분후의 흡광도를 측정한다. 한편 LDL 콜레스테롤 기지 농도의 혈청을 동일한 조작을 하여 흡광도를 측정함으로써 검체중의 콜레스테롤을 정량한다. 측정에는 히다치 7070 자동분석장치를 사용하고, 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 로 한다.
한편, 시판되고 있는 키트인 데터미너 L TC (교와 메덱스사 제조) 에 의해 총콜레스테롤을, 데터미너 L HDL-C (교와 메덱스사 제조) 에 의해 HDL-콜레스테롤을,데터미너 L TG (교와 메덱스사 제조) 에 의해 중성 지방을 측정하고, 하기 프리에데왈드 (Friedewald) 의 계산식으로부터 LDL 콜레스테롤 농도를 산출한다.본 발명의 방법으로 얻어지는 LDL 콜레스테롤 농도와 프리에데왈드의 계산식으로부터 산출한 LDL 콜레스테롤 농도의 상관계수를 계산한 결과, 0.9767 이 되었다.
프리에데왈드의 계산식 :
(LDL 콜레스테롤 농도) ＝ (총콜레스테롤 농도) － (HDL 콜레스테롤 농도) － (중성 지방 농도) / 5
도 5 는 본 발명의 방법 (도 5 중, 본 법이라고 표시) 으로 얻어지는 LDL 콜레스테롤 농도와 대조방법 (도 5 중, 대조방법이라고 표시) 으로 얻어지는 LDL 콜레스테롤 농도의 상관도이다.
본원 발명에 의해 LDL 콜레스테롤을 정량하는 방법 및 이 방법에 사용하는 시약 키트가 제공된다. 또한 본원 발명에 의해 동일 시료 중의 HDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤 또는 총콜레스테롤을 동일계내에서 연속적으로 분별 정량하는 방법 및 이 방법에 사용하는 시약 키트가 제공된다.

Claims (27)

  1. a) 생체시료,
    b) 콜레스테롤에스테라제와 콜레스테롤옥시다제 또는 콜레스테롤데히드로게나제 (이하, CH 효소류라고 함) 및
    c) 저밀도 리포단백질 (이하, LDL 이라고 함) 중의 콜레스테롤 (이하, LDL 콜레스테롤이라고 함) 에만 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약의 존재하, 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 LDL 콜레스테롤 농도를 정량하는 것을 특징으로 하는 생체시료 중의 LDL 콜레스테롤의 정량 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약이 적어도 폴리옥시에틸렌 유도체와 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 함유하는 시약인 정량 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌 유도체가 폴리옥시에틸렌알킬에테르 또는 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르인 정량 방법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 일반식 (Ⅰ)
    HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H (I)
    [식중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하며 1 내지 200 의 정수이다.]
    로 표현되는 계면활성제인 정량 방법.
  5. a) 생체시료,
    b) CH 효소류 및
    c) 고밀도 리포단백질 (이하, HDL 이라고 함) 중의 콜레스테롤 (이하, HDL 콜레스테롤이라고 함) 에만 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약의 존재하, 제 1 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 HDL 콜레스테롤 농도를 정량하고, 이어서,
    d) LDL 콜레스테롤에만 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약을 첨가하여 제 2 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 LDL 콜레스테롤 농도를 정량하는 것을 특징으로 하는 생체시료 중의 HDL 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤의 분별 정량 방법.
  6. a) 생체시료,
    b) CH 효소류 및
    c) HDL 콜레스테롤에만 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약의 존재하, 제 1 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를측정함으로써 HDL 콜레스테롤 농도를 정량하고, 이어서,
    d) CH 효소류 및
    e) LDL 콜레스테롤에만 d) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약을 첨가하여 제 2 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 LDL 콜레스테롤 농도를 정량하는 것을 특징으로 하는 생체시료 중의 HDL 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤의 분별 정량 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약이 적어도 폴리옥시에틸렌 유도체와 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 함유하는 시약인 정량 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌 유도체가 폴리옥시에틸렌알킬에테르 또는 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르인 정량 방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 일반식 (Ⅰ)
    HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H (I)
    [식중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하며 1 내지 200 의 정수이다.]
    로 표현되는 계면활성제인 정량 방법.
  10. a) 생체시료,
    b) CH 효소류 및
    c) HDL 콜레스테롤에만 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약의 존재하, 제 1 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 HDL 콜레스테롤 농도를 정량하고, 이어서,
    d) 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약을 첨가하여 제 2 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 총콜레스테롤 (HDL, LDL, VLDL, 및 CM 중의 모든 콜레스테롤을 말함) 을 정량하는 것을 특징으로 하는 생체시료 중의 HDL 콜레스테롤 및 총콜레스테롤의 분별 정량 방법.
  11. a) 생체시료,
    b) CH 효소류 및
    c) HDL 콜레스테롤에만 b) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약의 존재하, 제 1 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정함으로써 HDL 콜레스테롤 농도를 정량하고, 이어서,
    d) CH 효소류 및
    e) 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 d) 기재의 CH 효소류를 작용시키는 시약을 첨가하여 제 2 콜레스테롤의 반응을 실시하고, 발생되는 과산화수소 또는환원형 보효소를 측정함으로써 총콜레스테롤을 정량하는 것을 특징으로 하는 생체시료 중의 HDL 콜레스테롤 및 총콜레스테롤의 분별 정량 방법.
  12. 제 5 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, HDL 중의 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약이 HDL 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약인 정량 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, HDL 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약이 더욱 응집된 리포단백질을 용해하지 않는 비이온성 계면활성제를 함유하는 정량 방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, HDL 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약이 헤파린 또는 그의 염, 인텅스텐산 또는 그의 염, 덱스트란황산 또는 그의 염, 폴리에틸렌글리콜, 황산화시클로덱스트린 또는 그의 염, 황산화올리고당 또는 그의 염, 또는 이들의 혼합물, 및 2 가의 금속염으로 이루어지는 시약인 정량 방법.
  15. 제 6 항 또는 제 11 항에 있어서, 제 1 콜레스테롤의 반응에 사용하는 CH 효소류가 화학수식된 효소이고, 제 2 콜레스테롤의 반응에 사용하는 CH 효소류가 화학수식되어 있지 않은 효소인 정량 방법.
  16. 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 CH 효소류를 작용시키는 시약이 리포단백질을 용해하는 계면활성제를 함유하는 시약인 정량 방법.
  17. CH 효소류 및 LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약으로 이루어지는 LDL 콜레스테롤 정량용 시약.
  18. 제 17 항에 있어서, LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약이 적어도 폴리옥시에틸렌 유도체와 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 함유하는 시약인 LDL 콜레스테롤 정량용 시약.
  19. 제 18 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌 유도체가 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르인 정량용 시약.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 일반식 (Ⅰ)
    HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H (I)
    [식중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하며 1 내지 200 의 정수이다.]
    로 표현되는 계면활성제인 LDL 콜레스테롤 정량용 시약.
  21. 제 1 시약에 HDL 리포단백질 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약 및 CH 효소류를 함유하는 시약 및 제 2 시약에 LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약을 함유하는 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤을 분별 정량하기 위한 시약 키트.
  22. 제 21 항에 있어서, LDL 콜레스테롤에만 CH 효소류를 작용시키는 시약이 폴리옥시에틸렌 유도체와 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 함유하는 시약인 시약 키트.
  23. 제 21 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌 유도체가 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르인 시약 키트.
  24. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 일반식 (Ⅰ)
    HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H (I)
    [식중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하며 1 내지 200 의 정수이다.]
    로 표현되는 계면활성제인 시약 키트.
  25. 제 1 시약에 HDL 리포단백질 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약 및 CH 효소류를 함유하는 시약 및 제 2 시약에 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 CH 효소류를 작용시키는 시약을 함유하는 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤과 전체 콜레스테롤을 분별 정량하기 위한 시약 키트.
  26. 제 25 항에 있어서, 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤에 CH 효소류를 작용시키는 시약이 리포단백질을 용해하는 계면활성제를 함유하는 시약인 시약 키트.
  27. 제 21 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, HDL 리포단백질 이외의 리포단백질을 응집시키는 시약이 헤파린 또는 그의 염, 인텅스텐산 또는 그의 염, 덱스트란황산 또는 그의 염, 폴리에틸렌글리콜, 황산화시클로덱스트린 또는 그의 염, 황산화올리고당 또는 그의 염, 또는 이들의 혼합물, 및 2 가의 금속염으로 이루어지는 시약인 시약 키트.
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