JP6175591B2 - リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法及び試薬キット - Google Patents
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Description
X及びYは、同一又は異なって、-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C=O)-NH-、-(C=O)-NH-R2-、-R2-NH-(C=O)-、-NH-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-、-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-O-、-(C=O)-O-R2-、-R2-O-(C=O)-、-O-(C=O)-R2-、-R2-(C=S)-NH-、-(C=S)-NH-R2-、-R2-NH-(C=S)-、-NH-(C=S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、又は-S-R2-で表され、ここで、R2は、それぞれ独立して、結合手、置換基を有していてもよい炭素数1〜10のアルキレン基、置換基を有していてもよい炭素数6〜12のアリーレン基若しくはヘテロアリーレン基、又は、置換基を有していてもよい炭素数3〜8のシクロアルキレン基若しくはヘテロシクロアルキレン基であり、
Lは、-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、又は-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-で表わされ、ここで、R3は、酸素原子、硫黄原子、-NH-、-NH-(C=O)-又は-(C=O)-NH-であり、
TAGは、タグであり、
a及びcは、同一又は異なって、0〜6の整数であり、
bは、0又は1であり、
d及びeは、同一又は異なって、0〜12の整数であり、
fは、0〜24の整数である。)
で表される、タグ付加コレステロールを提供する。
X及びYは、同一又は異なって、-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C=O)-NH-、-(C=O)-NH-R2-、-R2-NH-(C=O)-、-NH-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-、-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-O-、-(C=O)-O-R2-、-R2-O-(C=O)-、-O-(C=O)-R2-、-R2-(C=S)-NH-、-(C=S)-NH-R2-、-R2-NH-(C=S)-、-NH-(C=S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、又は-S-R2-で表され、ここで、R2は、それぞれ独立して、結合手、置換基を有していてもよい炭素数1〜10のアルキレン基、置換基を有していてもよい炭素数6〜12のアリーレン基若しくはヘテロアリーレン基、又は、置換基を有していてもよい炭素数3〜8のシクロアルキレン基若しくはヘテロシクロアルキレン基であり、
Lは、-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、又は-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-で表わされ、ここで、R3は、酸素原子、硫黄原子、-NH-、-NH-(C=O)-又は-(C=O)-NH-であり、
TAGは、タグであり、
a及びcは、同一又は異なって、0〜6の整数であり、
bは、0又は1であり、
d及びeは、同一又は異なって、0〜12の整数であり、
fは、0〜24の整数である。)
で表されるタグ付加コレステロールが挙げられる。
で表されるビオチン付加コレステロールが挙げられる。このタグ付加コレステロールにおいては、タグ(式(II)で表されるビオチン部分)がリンカー(ポリエチレングリコール)を介してコレステロール部分と結合している。ビオチン部分に特異的に結合する捕捉体としては、アビジン又はストレプトアビジンが適している。また、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(ALP)などの標識物質が結合したアビジン又はストレプトアビジンも市販されている。
被験者から得た試料中のリポタンパク質と、タグ付加コレステロールと、リポタンパク質に特異的に結合する抗体とを接触させることにより、該タグ付加コレステロールを取り込んだリポタンパク質と上記抗体とを含む複合体を形成する工程と、
上記複合体に、上記タグに特異的に結合する捕捉体と、標識物質とを結合させることにより、複合体を標識する工程と、
前記複合体に結合した標識物質より生じるシグナルを検出する工程と、
検出結果に基づいて、上記の被験者の脂質異常に関する情報を取得する工程。
X及びYは、同一又は異なって、-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C=O)-NH-、-(C=O)-NH-R2-、-R2-NH-(C=O)-、-NH-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-、-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-O-、-(C=O)-O-R2-、-R2-O-(C=O)-、-O-(C=O)-R2-、-R2-(C=S)-NH-、-(C=S)-NH-R2-、-R2-NH-(C=S)-、-NH-(C=S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、又は-S-R2-で表され、ここで、R2は、それぞれ独立して、結合手、置換基を有していてもよい炭素数1〜10のアルキレン基、置換基を有していてもよい炭素数6〜12のアリーレン基若しくはヘテロアリーレン基、又は、置換基を有していてもよい炭素数3〜8のシクロアルキレン基若しくはヘテロシクロアルキレン基であり、
Lは、-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、又は-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-で表わされ、ここで、R3は、酸素原子、硫黄原子、-NH-、-NH-(C=O)-又は-(C=O)-NH-であり、
TAGは、タグであり、
a及びcは、同一又は異なって、0〜6の整数であり、
bは、0又は1であり、
d及びeは、同一又は異なって、0〜12の整数であり、
fは、0〜24の整数である。)
で表される、タグ付加コレステロールが提供される。
実施例1では、HDLに取り込ませたタグ付加コレステロールとHDL捕捉用抗体との複合体を固相上に形成させ、HDLに取り込まれたタグ付加コレステロールの当該タグを検出することによって、HDLのコレステロール取り込み能を測定できるか否かを検討した。
健常者(n=3)の血清(0.1 ml)に等量の22%ポリエチレングリコール4000(和光純薬工業株式会社)を混合して、懸濁液を得た。得られた懸濁液を室温にて20分間静置した後、3000 rpmで15分間室温にて遠心分離した。そして、上清をHDL画分として回収した。3名の健常者の血清から得られたHDL画分を混合し、得られた混合物(以下、「正常検体」とも呼ぶ)を4℃にて保存した。また、脂質異常症の患者(n=4)の血清についても、同様に処理してHDL画分を回収した。4名の患者の血清から得られたHDL画分を混合し、得られた混合物(以下、「異常検体」とも呼ぶ)を4℃にて保存した。本実施例1では、このようにして得た正常検体及び異常検体を生体試料として、以下の操作に用いた。
(i) 測定用プレートの準備(抗ApoAI抗体の固相への固定化)
固相としての96ウェルマイクロプレート(蛍光測定用黒色プレートH、住友ベークライト株式会社製)の各ウェルに50 mM Tris-HCl(pH 7.5)を200μlずつ添加して洗浄した。この洗浄操作を合計2回行った。各ウェルに、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)で10μg/mlの濃度に希釈した抗ApoAI抗体(clone 1C5、Cat.No.MONO5030、SANBIO社)の溶液を100μlずつ添加し、4℃にて一晩以上静置した。抗体溶液を除去し、各ウェルにPBSを200μlずつ添加して洗浄した。この洗浄操作を合計3回行った。各ウェルに2%BSA/PBSを200μlずつ添加し、25℃にて600 rpmで2時間振とうした。
上記の正常検体及び異常検体のそれぞれから一部を取り、ApoAI測定用キット(N-アッセイ TIA ApoAI-H、ニットーボーメディカル株式会社)を用いてApoAI濃度を測定した。ApoAI濃度は、正常検体が883μg/mlであり、異常検体が691μg/mlであった。なお、濃度測定の具体的な操作は、該キットに添付のマニュアルに従って行った。測定後、正常検体及び異常検体を反応バッファー(2%BSA及び2mM リポソーム(日本精化株式会社製)を含むPBS)で希釈して、ApoAI濃度が0.05、0.1又は0.3μg/mlのHDL画分含有希釈液を調製した。また、HDL画分を含まない対照検体(ApoAI濃度0μg/ml)として、反応バッファーを用いた。なお、反応バッファーに含まれるリポソームの組成は、2mM ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)、2mM コレステロール及び4mM 水素添加大豆ホスファチジルコリン(HSPC)である。PBSは、Phosphate buffered saline tablet (Sigma-Aldrich社)を水に溶解して調製した。
抗ApoAI抗体を固定化したプレートからBSA溶液を除去し、各測定用試料を100μlずつウェルに添加した。そして、プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうして、HDLと抗ApoAI抗体との複合体を形成させた。なお、本実施例1では、このようにして複合体を捕捉したプレートを2枚調製した。
上記(1.2)で調製した2枚のプレートのうちの1枚において、10 mM シクロデキストリン/PBSを100μlずつ各ウェルに添加し、該プレートを25℃にて600 rpmで30分間振とうした。そして、蛍光強度を蛍光プレートリーダー(Infinite(登録商標)200 Pro、TECAN社製)で測定した(励起光485 nm/蛍光535 nm)。測定後のプレートからシクロデキストリン溶液を除去し、各ウェルをPBSで3回洗浄した。ApoAI測定用キット(N-アッセイ TIA ApoAI-H、ニットーボーメディカル株式会社)のヤギ抗ApoAI血清をブロッキングバッファー(StartingBlock、Thermo Scientific社)で1000倍に希釈し、得られた希釈液を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうした後、希釈液を除去して、各ウェルをPBSで3回洗浄した。HRP標識ウサギ抗ヤギIgGポリクローナル抗体(P0449、Dako社)をブロッキングバッファー(StartingBlock、Thermo Scientific社)で1000倍に希釈し、得られた希釈液を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうした後、希釈液を除去して、各ウェルをPBSで5回洗浄した。化学発光基質溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific社)を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで2分間振とうした後、発光量をマイクロプレートリーダー(Infinite(登録商標)F200 Pro、TECAN社製)で測定した。
上記(1.2)で調製した2枚のプレートのうち、残りの1枚をPBSで5回洗浄した。ウサギ抗BODIPY抗体(BODIPY FL Rabbit IgG Fraction、A-5770、Lifetechnologies社)をPBSで100倍に希釈し、得られた希釈液を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうした後、希釈液を除去して、各ウェルをPBSで5回洗浄した。HRP標識ヤギ抗ウサギIgGポリクローナル抗体(P0448、Dako社)をブロッキングバッファー(StartingBlock、Thermo Scientific社)で1000倍に希釈し、得られた希釈液を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうした後、希釈液を除去して、各ウェルをPBSで5回洗浄した。化学発光基質溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific社)を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで2分間振とうした後、発光量をマイクロプレートリーダー(Infinite(登録商標)F200 Pro、TECAN社製)で測定した。
上記(1.3)のサンドイッチELISA法の結果を、図1に示す。図1に示されるように、抗ApoAI抗体を固定化したプレートに捕捉された複合体の量は、測定用試料のApoAI濃度に依存して増加していた。捕捉された複合体の量は、正常検体と異常検体との間に大きな差は認められなかった。また、捕捉された複合体におけるBODIPYから生じた蛍光の強度は、捕捉した複合体の量に応じて上昇していた(図示せず)。よって、BODIPY付加コレステロールはHDLに取り込まれていることが確認できた。なお、正常検体におけるHDLのコレステロール取り込み量は、異常検体に比べて2倍以上高かった。
実施例2では、リンカーとしてのPEGを介してビオチンが付加されたコレステロールを調製した。なお、ビオチン付加コレステロールの合成スキームを以下に示す。
実施例1のBODIPY付加コレステロールと、実施例2のビオチン付加コレステロールとを用いてHDLによるコレステロール取り込み能を測定して、タグ付加コレステロールにおけるリンカーの効果を検討した。
HDL画分を含む試料として、実施例1で調製した異常検体を用いた。
(i) 測定用プレートの準備
実施例1と同様にして、96ウェルマイクロプレートに抗ApoAI抗体を固定化して、測定用プレートを準備した。
異常検体を反応バッファー(PBS)で希釈して、ApoAI濃度が0.1μg/mlのHDL画分含有希釈液を調製した。また、HDL画分を含まない対照検体(ApoAI濃度0μg/ml)として、反応バッファーを用いた。なお、PBSは、Phosphate buffered saline tablet (Sigma-Aldrich社)を水に溶解して調製した。反応バッファーに、0.5 mM ビオチン付加コレステロールを終濃度5μMとなるように添加した後、さらに上記のHDL画分含有希釈液を全体量の1/100の量で添加した。得られた混合物を37℃にて800 rpmで2時間振とうして、ビオチン付加コレステロールを取り込ませたHDLを含む測定用試料を得た。
抗ApoAI抗体を固定化したプレートからBSA溶液を除去し、PBSを200μlずつ添加して洗浄した。この洗浄操作を合計3回行った。各測定用試料を100μlずつウェルに添加し、プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうして、HDLと抗ApoAI抗体との複合体を形成させた。なお、実施例3では、このようにして複合体を捕捉したプレートを1枚調製した。
上記(3.2)で調製したプレートをPBSで5回洗浄した。HRP標識ストレプトアビジン(N100, Life technologies社)をブロッキングバッファー(StartingBlock、Thermo Scientific社)で3000倍に希釈し、得られた希釈液を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうした後、希釈液を除去して、各ウェルをPBSで5回洗浄した。化学発光基質溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific社)を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで2分間振とうした後、発光量をマイクロプレートリーダー(Infinite(登録商標)F200 Pro、TECAN社製)で測定した。
上記(3.3)の測定の後、PBSを200μlずつ各ウェルに添加して洗浄した。この洗浄操作を合計3回行った。ApoAI測定用キット(N-アッセイ TIA ApoAI-H、ニットーボーメディカル株式会社)のヤギ抗ApoAI血清をブロッキングバッファー(StartingBlock、Thermo Scientific社)で1000倍に希釈し、得られた希釈液を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうした後、希釈液を除去して、各ウェルをPBSで3回洗浄した。HRP標識ウサギ抗ヤギIgGポリクローナル抗体(P0449、Dako社)をブロッキングバッファー(StartingBlock、Thermo Scientific社)で1000倍に希釈し、得られた希釈液を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうした後、希釈液を除去して、各ウェルをPBSで5回洗浄した。化学発光基質溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific社)を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで2分間振とうした後、発光量をマイクロプレートリーダー(Infinite(登録商標)F200 Pro、TECAN社製)で測定した。
上記(3.4)の測定結果より、HDL及び抗ApoAI抗体を含む複合体がプレート上に形成されていることが確認できた(図示せず)。上記(3.3)の測定結果を、表1及び図4に示す。なお、表1及び図4では、比較のために、実施例1の異常検体由来のHDL画分含有希釈液(ApoAI濃度0.1μg/ml)及び対照検体におけるHDLのBODIPY付加コレステロール取り込み量のデータを並べた。表1は、異常検体由来のHDL画分含有希釈液及び対照検体における発光量の平均値(RLU)及びSDの値を示す。図4のグラフは、異常検体由来のHDL画分含有希釈液の発光量の平均値から、対照検体の発光量の平均値(バックグラウンド)を差し引いた値を表す。表1中、「BODIPY」とは、BODIPY付加コレステロールを表し、「PEG4-Biotin」とは、実施例2で調製したビオチン付加コレステロールを表し、「異常検体」とは、異常検体由来のHDL画分含有希釈液(ApoAI濃度0.1μg/ml)を表す。図4中、「リンカーなし」とは、BODIPY付加コレステロールを表し、「リンカーあり」とは、ビオチン付加コレステロールを表す。
様々な長さのPEGリンカーを介してビオチンを付加したコレステロールを調製した。これらのビオチン付加コレステロールと、実施例1のBODIPY付加コレステロールとを用いてHDLによるコレステロール取り込み能を測定した。
実施例2の第3ステップにおいて、Biotin-PEG4-Amineに代えて、EZ-Link(商標) Amine-PEG2-Biotin (Life technologies社)、Biotin-PEG7-amine (BroadPharm社)、O-(2-アミノエチル)-O'-[2-(ビオチニルアミノ)エチル]オクタエチレングリコール(Sigma Ardrich社)、又はEZ-Link(商標) Amine-PEG11-Biotin (Life technologies社)を0.075 mmol用いたこと以外は実施例2と同様にして、PEGリンカーの長さの異なるビオチン付加コレステロールを調製した。得られたビオチン付加コレステロールは、それぞれ、上記の式(V)においてnが2、7、9及び11であるタグ付加コレステロールに該当する。
HDL画分を含む試料として、実施例1で調製した異常検体を用いた。
(i) 測定用プレートの準備
実施例1と同様にして、96ウェルマイクロプレートに抗ApoAI抗体を固定化して、測定用プレートを準備した。
実施例1と同様にして、BODIPY付加コレステロールを用いて、異常検体から測定用試料を調製した。実施例3と同様にして、PEG2-Biotin、PEG3-Biotin、PEG4-Biotin、PEG7-Biotin、PEG9-Biotin及びPEG11-Biotinのそれぞれを用いて、異常検体から測定用試料を調製した。
実施例3と同様にして、プレート上にHDLと抗ApoAI抗体との複合体を形成させた。なお、実施例4では、このようにして複合体を捕捉したプレートを1枚調製した。
BODIPY付加コレステロールについては、実施例1と同様にして、ウサギ抗BODIPY抗体及びHRP標識ヤギ抗ウサギIgGポリクローナル抗体を用いて化学発光により、HDLに取り込まれたコレステロール量を測定した。ビオチン付加コレステロールについては、実施例3と同様にして、HRP標識ストレプトアビジンを用いて化学発光により、HDLに取り込まれたコレステロール量を測定した。捕捉された複合体の量は、実施例3と同様にして測定した。
捕捉された複合体の量の測定結果より、HDL及び抗ApoAI抗体を含む複合体がプレート上に形成されていることが確認できた。HDLに取り込まれたコレステロール量の測定結果を、表3に示す。表3は、異常検体由来のHDL画分含有希釈液及び対照検体における発光量の平均値(RLU)及びSDの値を示す。表3中、「BODIPY」とは、BODIPY付加コレステロールを表し、「異常検体」とは、異常検体由来のHDL画分含有希釈液(ApoAI濃度0.1μg/ml)を表す。
実施例5では、タグとしてDNPが付加されたコレステロールを調製した。DNP付加コレステロールと、実施例1のBODIPY付加コレステロールとを用いてHDLによるコレステロール取り込み能を測定した。測定は、固相として磁性粒子を用いるELISA法により行った。
実施例2の第1ステップと同様にして、3β-ヒドロキシ-Δ5-コレン酸と水溶性カルボジイミドとをDMFに溶解して、室温、アルゴン雰囲気下で反応させた。実施例2の第2ステップと同様にして、第1ステップで得られた反応液に、DMFに溶解したN-ヒドロキシスクシンイミドの溶液を添加し、室温、アルゴン雰囲気下で反応させた。第1ステップで得られた反応液、及び第2ステップで得られた反応液をそれぞれシリカゲルプレートにスポットし、展開溶媒(ヘキサン:酢酸エチル = 4:6)で展開した。第1ステップの生成物のRf値は0.45であり、第2ステップの生成物のRf値は0.5であった。
回収したDNP付加コレステロールを高速液体クロマトグラフィ(HPLC)で分取精製し、得られた精製物を核磁気共鳴法(NMR)及び液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)によって分析した。JNM-ECX400P(日本電子株式会社製)を用いて、1H-NMRスペクトルを400 MHzで測定し、13C-NMRスペクトルを100 MHzで測定した。HPLC及びLC-MSの測定条件は下記のとおりである。なお、HPLCによる精製とNMR及びLC-MSによる分析は、株式会社ナード研究所に委託した。
装置: LC-2010 (株式会社島津製作所製)
カラム: Kinetex(登録商標) 5μm EVO C18 100A 4.6 x 150 mm (株式会社島津ジーエルシー製)
カラム温度:40℃
流速: 1 mL/min
移動相A: 1 mM リン酸緩衝液(pH 7.4)
移動相B: アセトニトリル(MeCN)
装置
MS検出器: waters 3100 Mass Detector (Waters社製)
FAD検出器: waters 2996 Photodiode Array Detector (Waters社製)
ELSD: waters 2424 ELS Detector (Waters社製)
ポンプ: waters 2545 Binary Gradient Module (Waters社製)
SFO: waters SFO System Fluidics Organizer (Waters社製)
カラム: Atlantis(登録商標) 3.5μm 4.6 x 50 mm (Waters社製)
カラム温度:室温
流速: 2 mL/min
移動相A: 0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液
移動相B: MeCN
Mass電圧: 30 V
Positive mode
1H-NMR (CDCl3) δ: 9.14 (1H, d, J = 2.3 Hz), 8.74 (1H, s), 8.30 (1H, dd, J = 9.4, 2.5 Hz), 7.11 (1H, d, J = 9.6 Hz), 5.83-5.72 (1H, br m), 5.35 (1H, d, J = 5.0 Hz), 3.66-3.47 (5H, m), 2.29-2.23 (3H, m), 2.15-2.07 (1H, m), 2.00-1.94 (2H, m), 1.89-1.75 (4H, m), 1.53-1.23 (10H, m), 1.19-0.88 (12H, m), 0.66 (3H, s).
13C-NMR (CDCl3) δ: 174.8 (C), 148.4 (C), 140.7 (C),136.4 (C), 133.7 (C), 130.5 (CH),124.3 (CH), 121.6 (CH), 114.0 (CH),71.8 (CH), 56.7 (CH), 55.7 (CH),50.0 (CH), 43.0 (CH2), 42.4 (CH2), 42.3 (C), 39.7 (CH2), 38.5 (CH2), 37.2 (CH2), 36.5 (C),35.5 (CH), 33.4 (CH2), 31.9 (CH), 31.8 (CH2), 31.6 (CH2), 28.2 (CH2), 24.2 (CH2), 22.9 (CH), 21.0 (CH), 19.4 (CH3), 18.4 (CH3), 11.8 (CH3).
(i) 測定用試料の調製
実施例1の異常検体を反応バッファー(PBS)で希釈して、ApoAI濃度が0.2μg/mlのHDL画分含有希釈液を調製した。また、HDL画分を含まない対照検体(ApoAI濃度0μg/ml)として、反応バッファーを用いた。なお、PBSは、Phosphate buffered saline tablet (Sigma-Aldrich社)を水に溶解して調製した。反応バッファーに、0.5 mM DNP付加コレステロール又は0.5 mM BODIPY付加コレステロール(TopFluor Cholesterol、AvantiPolar Lipids社)を終濃度5μMとなるように添加した後、さらに上記のHDL画分含有希釈液を全体量の1/100の量で添加した。得られた混合物を37℃にて800 rpmで2時間振とうして、測定用試料を得た。
測定用試料を30μl取り、別のチューブに移した。ここに、2.5 ng/μlビオチン化ApoAI抗体(抗ApoA1抗体(SANBIO社)を2-メルカプトエチルアミン塩酸塩(ナカライテスク)で還元し、Biotin-PEAC5-maleimide(Dojindo)で標識して得た)を30μl添加して、42℃で12分間反応させた。ここに、HISCL磁性粒子(シスメックス株式会社)を30μl添加して、42℃で10分間反応させた。HISCL磁性粒子の表面にはアビジンが固定されているので、複合体中のビオチン化抗ApoAI抗体は磁性粒子の表面に結合する。反応液中の磁性粒子を集磁して上清を除去し、HISCLライン洗浄液(シスメックス株式会社)を添加して、磁性粒子を洗浄した。この洗浄操作をさらに2回行った。そして、磁性粒子を集磁して上清を除去した。
(i) DNP付加コレステロール量の測定
DNP付加コレステロールを取り込んだHDLを有する磁性粒子には、333 ng/μl ALP標識抗DNP抗体(抗DNP抗体(北山ラベス株式会社に作製委託した)を、ALP Labeling Kit-SH (Dojindo)を用いてALP標識して得た)を100μl添加して、42℃で10分間反応させた。反応液中の磁性粒子を集磁して上清を除去し、HISCLライン洗浄液(シスメックス株式会社)を添加して、磁性粒子を洗浄した。この洗浄操作をさらに2回行った。磁性粒子を別のチューブに移し、磁性粒子を集磁して上清を除去した。そして、HISCL発光基質(シスメックス株式会社)のR4試薬を50μlとR5試薬を100μl添加し、42℃で5分間反応させた。反応後、磁性粒子を集磁して上清を96ウェルプレートに移し、発光量をマイクロプレートリーダー(Infinite(登録商標)F200 Pro、TECAN社製)で測定した。
BODIPY付加コレステロールを取り込んだHDLを有する磁性粒子には、実施例1と同様にウサギ抗BODIPY抗体(Lifetechnologies社)の希釈液を100μl添加して、25℃で60分間反応させた。反応液中の磁性粒子を集磁して上清を除去し、HISCLライン洗浄液(シスメックス株式会社)を添加して、磁性粒子を洗浄した。この洗浄操作をさらに2回行い、磁性粒子を集磁して上清を除去した。磁性粒子に、実施例1と同様にHRP標識ヤギ抗ウサギIgGポリクローナル抗体(Dako社)の希釈液を100μl添加して、25℃で60分間反応させた。反応後、HISCLライン洗浄液(シスメックス株式会社)による磁性粒子の洗浄を3回行った。磁性粒子を別のチューブに移し、磁性粒子を集磁して上清を除去した。そして、化学発光基質溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific社)を100μl添加し、25℃で2分間反応させた。反応後、磁性粒子を集磁して上清を96ウェルプレートに移し、発光量をマイクロプレートリーダー(Infinite(登録商標)F200 Pro、TECAN社製)で測定した。
測定結果を、図5に示す。図5に示されるように、BODIPY付加コレステロール及びDNP付加コレステロールのいずれを用いても、バックグラウンドに対して高い発光量を得ることができた。本実施形態の測定方法では、BODIPY付加コレステロールと同様に、DNP付加コレステロールを用いても、リポタンパク質のコレステロール取り込み能の測定が可能であることが示された。
22:第2容器
33:第3容器
44:第4容器
55:第5容器
66:固相(96ウェルマイクロプレート)
Claims (17)
- 試料中のリポタンパク質と、タグ付加コレステロールと、前記リポタンパク質に特異的に結合する抗体とを接触させることにより、前記タグ付加コレステロールを取り込んだ前記リポタンパク質と前記抗体とを含む複合体を形成する工程と、
前記複合体に、前記タグに特異的に結合する捕捉体と、標識物質とを結合させることにより、前記複合体を標識する工程と、
前記複合体に結合した標識物質により生じるシグナルを検出する工程と
を含み、
前記複合体において、前記タグが、リポタンパク質の外表面に露出しており、前記捕捉体が、リポタンパク質の外表面に露出している前記タグと特異的に結合する、
リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法。 - 前記タグ付加コレステロールが、コレステロールのC20位〜C27位のいずれかに直接又はリンカーを介してタグが結合したコレステロールである、請求項1に記載の方法。
- 前記形成工程において、前記複合体を固相上に形成させる請求項1又は2に記載の方法。
- 前記形成工程と前記標識工程との間に、複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去するB/F分離工程をさらに含む請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識工程と前記検出工程の間に、複合体に結合していない未反応の遊離成分を除去するB/F分離工程をさらに含む請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識物質が酵素であり、前記シグナルが、前記酵素と基質とを接触させることにより生じる化学発光シグナルである請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素が、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼである請求項6に記載の方法。
- 前記捕捉体が、前記タグに特異的に結合する抗体、アビジン又はストレプトアビジンである請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リポタンパク質に結合する抗体が、抗ApoAl抗体である請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タグ付加コレステロールが、下記の式(III):
X及びYは、同一又は異なって、−R2−NH−、−NH−R2−、−R2−(C=O)−NH−、−(C=O)−NH−R2−、−R2−NH−(C=O)−、−NH−(C=O)−R2−、−R2−(C=O)−、−(C=O)−R2−、−R2−(C=O)−O−、−(C=O)−O−R2−、−R2−O−(C=O)−、−O−(C=O)−R2−、−R2−(C=S)−NH−、−(C=S)−NH−R2−、−R2−NH−(C=S)−、−NH−(C=S)−R2−、−R2−O−、−O−R2−、−R2−S−、又は−S−R2−で表され、ここで、R2は、それぞれ独立して、結合手、置換基を有していてもよい炭素数1〜10のアルキレン基、置換基を有していてもよい炭素数6〜12のアリーレン基若しくはヘテロアリーレン基、又は、置換基を有していてもよい炭素数3〜8のシクロアルキレン基若しくはヘテロシクロアルキレン基であり、
Lは、−(CH2)d−[R3−(CH2)e]f−、又は−[(CH2)e−R3]f−(CH2)d−で表わされ、ここで、R3は、酸素原子、硫黄原子、−NH−、−NH−(C=O)−又は−(C=O)−NH−であり、
TAGは、タグであり、
a及びcは、同一又は異なって、0〜6の整数であり、
bは、0又は1であり、
d及びeは、同一又は異なって、0〜12の整数であり、
fは、0〜24の整数である。)
で表される請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。 - 前記タグが、下記の式(I):
を含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。 - 前記タグ付加コレステロールが、下記の式(IV):
又は、下記の式(VI):
- 前記試料が、血液、血清又は血漿である請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リポタンパク質が、高比重リポタンパク質である請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- タグ付加コレステロールと、リポタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記タグに特異的に結合する捕捉体と、標識物質とを含む、リポタンパク質のコレステロール取り込み能測定用試薬キット。
- 固相をさらに含む、請求項15に記載の試薬キット。
- 下記の式(III):
X及びYは、同一又は異なって、−R2−NH−、−NH−R2−、−R2−(C=O)−NH−、−(C=O)−NH−R2−、−R2−NH−(C=O)−、−NH−(C=O)−R2−、−R2−(C=O)−、−(C=O)−R2−、−R2−(C=O)−O−、−(C=O)−O−R2−、−R2−O−(C=O)−、−O−(C=O)−R2−、−R2−(C=S)−NH−、−(C=S)−NH−R2−、−R2−NH−(C=S)−、−NH−(C=S)−R2−、−R2−O−、−O−R2−、−R2−S−、又は−S−R2−で表され、ここで、R2は、それぞれ独立して、結合手、置換基を有していてもよい炭素数1〜10のアルキレン基、置換基を有していてもよい炭素数6〜12のアリーレン基若しくはヘテロアリーレン基、又は、置換基を有していてもよい炭素数3〜8のシクロアルキレン基若しくはヘテロシクロアルキレン基であり、
Lは、−(CH2)d−[R3−(CH2)e]f−、又は−[(CH2)e−R3]f−(CH2)d−で表わされ、ここで、R3は、酸素原子、硫黄原子、−NH−、−NH−(C=O)−又は−(C=O)−NH−であり、
TAGは、タグであり、
a及びcは、同一又は異なって、0〜6の整数であり、
bは、0又は1であり、
d及びeは、同一又は異なって、0〜12の整数であり、
fは、0〜24の整数である。)
で表される化合物を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法に用いられる試薬組成物。
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