JP7251722B2 - 糖尿病に関する情報を取得する方法及びその利用 - Google Patents
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Description
本実施形態の糖尿病に関する情報を取得するための方法(以下、単に「方法」ともいう)では、被検者の生体試料中のリポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する。
被検者は、糖尿病と診断されていない限り、特に限定されない。被検者としては、例えば健常者、心血管疾患の既往歴がない者、過食、肥満、運動不足などの糖尿病発症の環境的要因を有する者などが挙げられる。心血管疾患の既往歴がない者とは、例えば心筋梗塞、脳梗塞及び冠動脈形成術のいずれも経験していない者が挙げられる。
生体試料は、被検者のリポタンパク質を含む試料であれば、特に限定されない。そのような生体試料としては、例えば血液試料が挙げられる。血液試料としては、例えば血液(全血)、血漿、血清などが挙げられ、特に血清が好ましい。
本実施形態では、生体試料中のリポタンパク質のステロール取り込み能を、無細胞系で測定することが好ましい。無細胞系とは、リポタンパク質のステロール取り込み能の測定に利用する目的で、細胞を添加することがないことを意味する。リポタンパク質のステロール取り込み能を無細胞系で測定する方法自体は、当該技術分野において公知であり、例えばUS 2017/0315112 A1に記載されている(US 2017/0315112 A1は、参照により本明細書に組み込まれる)。具体的には、生体試料中のリポタンパク質と、標識ステロールとを接触することにより、該標識ステロールを取り込んだリポタンパク質を調製し、リポタンパク質に取り込まれた標識ステロールの標識に基づいて、標識ステロールの取り込み能を測定する。この測定方法では、試料中のリポタンパク質に標識ステロールを直接取り込ませるので、従来のコレステロール排出機能の測定法のように、マクロファージなどのコレステロールを溜め込んだ細胞を用いなくともよい。本実施形態では、生体試料に被検者由来の細胞が含まれている場合であっても、その細胞自体は、リポタンパク質の標識ステロールの取り込みには影響をほとんど及ぼさないと考え、測定方法は無細胞系であるとみなす。
標識ステロールは、標識物質を有するステロールである。以下、標識ステロールが有する標識物質を「第1の標識」ともいう。標識ステロールに用いられるステロールは、リポタンパク質に取り込まれる限り、特に限定されない。そのようなステロールとしては、例えば、コレステロール及びその誘導体が挙げられる。コレステロール誘導体としては、例えば、胆汁酸の前駆体、ステロイドの前駆体などが挙げられる。具体的には、3β-ヒドロキシ-Δ5-コレン酸、24-アミノ-5-コレン-3β-オルなどが好ましい。
X及びYは、同一又は異なって、-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C=O)-NH-、-(C=O)-NH-R2-、-R2-NH-(C=O)-、-NH-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-、-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-O-、-(C=O)-O-R2-、-R2-O-(C=O)-、-O-(C=O)-R2-、-R2-(C=S)-NH-、-(C=S)-NH-R2-、-R2-NH-(C=S)-、-NH-(C=S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、又は-S-R2-で表され、ここで、R2は、それぞれ独立して、結合手、置換基を有していてもよい炭素数1~10のアルキレン基、置換基を有していてもよい炭素数6~12のアリーレン基若しくはヘテロアリーレン基、又は、置換基を有していてもよい炭素数3~8のシクロアルキレン基若しくはヘテロシクロアルキレン基であり、
Lは、-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、又は-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-で表わされ、ここで、R3は、酸素原子、硫黄原子、-NH-、-NH-(C=O)-又は-(C=O)-NH-であり、
TAGは、タグであり、
a及びcは、同一又は異なって、0~6の整数であり、
bは、0又は1であり、
d及びeは、同一又は異なって、0~12の整数であり、
fは、0~24の整数である。)
本実施形態では、生体試料中のリポタンパク質と、標識ステロールとの接触は、例えば、生体試料と、標識ステロールを含む溶液とを混合することにより行うことができる。これらを混合した後、リポタンパク質が標識ステロールを取りこみ始め、標識ステロールを取り込んだリポタンパク質が得られる。混合における温度及び時間の条件は、特に限定されない。例えば、生体試料と標識ステロールとの混合液を20~48℃、好ましくは25~42℃にて、1分間~24時間、好ましくは10分間~2時間インキュベーションしてもよい。インキュベーションの間、混合液は静置してもよいし、攪拌又は振とうしてもよい。
本実施形態では、環状構造を有さない界面活性剤の存在下で、標識ステロールを取り込んだリポタンパク質を調製してもよい。環状構造を有さない界面活性剤とは、非環式化合物である界面活性剤をいう。この場合、試料中のリポタンパク質と、標識ステロールとの接触は、例えば、生体試料と、標識ステロールを含む溶液と、環状構造を有さない界面活性剤を含む溶液とを混合することにより行うことができる。混合の順序は特に限定されない。あるいは、環状構造を有さない界面活性剤及び標識ステロールを含む溶液(以下、「反応バッファー」ともいう)をあらかじめ調製し、この反応バッファーと、生体試料とを混合してもよい。
本実施形態の方法は、標識ステロールを取り込んだリポタンパク質と、該リポタンパク質に結合する第1の捕捉体とを接触して、標識ステロールを取り込んだリポタンパク質と第1の捕捉体を含む複合体を形成する工程を含むことが好ましい。リポタンパク質と第1の捕捉体との接触により、第1の捕捉体がリポタンパク質に結合して、リポタンパク質と第1の捕捉体との複合体が形成される。
本実施形態では、リポタンパク質と標識ステロールとの接触と、後述のステロール取り込み能の測定との間に、未反応の遊離成分を除去する洗浄工程を行ってもよい。この洗浄工程は、B/F分離及び複合体の洗浄を含む。未反応の遊離成分とは、標識ステロールを取り込んだリポタンパク質を含む複合体を構成しない成分である。例えば、リポタンパク質に取り込まれなかった遊離の標識ステロール、リポタンパク質と結合しなかった遊離の第1の捕捉体などが挙げられる。B/F分離の手段は特に限定されないが、例えば、超遠心分離法などにより複合体だけを回収することで、複合体と、未反応の遊離成分とを分離できる。複合体を固相上に形成させている場合、固相が粒子であれば、遠心分離や磁気分離により粒子を回収し、上清を除去することにより、複合体と、未反応の遊離成分とを分離できる。固相がマイクロプレートやマイクロチューブなどの容器であれば、未反応の遊離成分を含む液を除去することにより、複合体と、未反応の遊離成分とを分離できる。
本実施形態の方法では、標識ステロールを取り込んだリポタンパク質を調製した後、リポタンパク質による標識ステロールの取り込み能を測定する。ステロール取り込み能の測定は、リポタンパク質に取り込まれた標識ステロールに由来するシグナルを検出することにより行われる。このシグナルは、リポタンパク質に取り込まれた標識ステロールの量を反映するので、該シグナルの検出結果は、リポタンパク質のステロール取り込み能の指標となる。
リポタンパク質に取り込まれた標識ステロールに由来するシグナルは、リポタンパク質に取り込まれた標識ステロールを検出するときに発生するシグナルであってもよい。リポタンパク質に取り込まれた標識ステロールを検出するために、本実施形態では、標識ステロールと、該標識ステロールに結合する第2の捕捉体とを接触して、複合体を形成してもよい。この場合、標識ステロールは、タグ付加ステロールが好ましく、タグ付加コレステロールがより好ましい。また、第2の捕捉体は、タグに特異的に結合する物質が好ましい。
第2の捕捉体は、第2の標識で標識されることが好ましい。第2の捕捉体が第2の標識で標識されている場合、標識ステロールと第2の捕捉体との複合体中の第2の標識に由来するシグナルを検出することにより、ステロール取り込み能を測定できる。
第2の標識に由来するシグナルを検出する方法自体は、当該技術分野において公知である。本実施形態では、第2の標識に由来するシグナルの種類に応じて、適切な測定方法を選択できる。例えば、第2の標識が酵素である場合、酵素と該酵素に対する基質とが反応することによって発生する光、色などのシグナルを、公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。そのような測定装置としては、分光光度計、ルミノメータなどが挙げられる。
本実施形態では、必要に応じて、固相に固定化されたリポタンパク質の量(以下、「リポタンパク質の捕捉量」ともいう)を測定してもよい。この測定は、ステロール取り込み能の測定とは別に行ってもよいし、ステロール取り込み能の測定後の固相を用いて行ってもよい。ステロール取り込み能の測定とは別に行う場合、標識ステロールを取り込ませたリポタンパク質を固定化した固相を複数用意する。そして、少なくとも1つの固相をリポタンパク質の捕捉量の測定に用い、残りの固相をステロール取り込み能の測定に用いる。
本実施形態では、リポタンパク質のステロール取り込み能の測定結果を、被検者の糖尿病に関する情報として取得できる。具体的には、被検者の生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値が、糖尿病発症リスクの指標となる。生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値は、次のようにして取得できる。例えば、所定量の生体試料(又は所定量の生体試料から調製したリポタンパク質画分)を希釈せずにステロール取り込み能を測定した場合、取得した測定値自体を、生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値として取得できる。あるいは、取得した測定値を、測定に用いた生体試料の体積(所定量の値)で割って得た値を、生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値として取得してもよい。
= [(ステロール取り込み能の測定値)/(リポタンパク質の捕捉量の測定値)]×(生体試料中のアポリポタンパク質の濃度の測定値) ・・・(1)
本実施形態では、上記の方法で得られたリポタンパク質のステロール取り込み能の結果を、被検者の糖尿病発症リスクの判定に利用できる。本実施形態の被検者の糖尿病発症リスクを判定する方法(以下、「判定方法」ともいう)では、まず、被検者から採取した生体試料中のリポタンパク質のステロール取り込み能を測定する。この測定の詳細は、本実施形態の糖尿病に関する情報を取得するための方法について述べたことと同じである。
(1) 生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値が、所定の閾値以下の場合、糖尿病発症リスクが高いと判定する;
(2) 生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値が、所定の閾値より高い場合、糖尿病発症リスクが低いと判定する。
(1) 生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値が、所定の閾値より低い場合、糖尿病発症リスクが高いと判定する;
(2) 生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値が、所定の閾値以上の場合、糖尿病発症リスクが低いと判定する。
(1) 生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値が、第1の閾値以下の場合、糖尿病発症リスクが高いと判定する;
(2) 生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値が、第1の閾値より高く且つ第2の閾値より低い場合、経過観察を要すると判定する;
(3) 生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値が、第2の閾値以上の場合、糖尿病発症リスクが低いと判定する。
本発明の範囲には、本実施形態の方法及び判定方法に用いられる試薬キットも含まれる。すなわち、標識ステロールと、リポタンパク質に結合する捕捉体とを含む、糖尿病に関する情報を取得するための試薬キット(以下、「試薬キット」ともいう)が提供される。標識ステロール及びリポタンパク質に結合する捕捉体の詳細は、本実施形態の方法に用いる標識ステロール及び第1の捕捉体について述べたことと同じである。
本発明の範囲には、本実施形態の糖尿病発症リスクの判定方法を実施するための装置及びコンピュータプログラムも含まれる。本実施形態の糖尿病発症リスクの判定装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本実施形態は、この例に示される形態のみに限定されない。図3に示された判定装置10は、測定装置20と、該測定装置20と接続されたコンピュータシステム30とを含む。
久山町研究(福岡県糟屋郡久山町の住民を対象に行われている疫学研究)の血液試料を用いて、HDLのコレステロール取り込み能と糖尿病発症との関連性を検討した。
対象集団の情報を表1に示す。除外対象は、登録時までに、糖尿病を発症していた者、糖負荷試験を受けていない者又は心血管疾患の既往歴のある者であった。糖負荷試験を受けていない者は、糖尿病を発症しているか否か不明であるため、除外対象とした。心血管疾患の既往歴のある者とは、登録時までに、心筋梗塞、脳梗塞又は冠動脈形成術を経験した者をいう。
(2.1) 生体試料
生体試料として、凍結保存された各被検者の血清を用いた。解凍した血清(0.1 mL)に等量の22%ポリエチレングリコール4000(ナカライテスク株式会社)を混合して、懸濁液を得た。得られた懸濁液を室温にて20分間静置した後、3000 rpmで15分間室温にて遠心分離した。得られた上清をHDL画分として用いた。
(i) 測定用プレートの準備(抗ApoAI抗体の固相への固定化)
固相としての96ウェルマイクロプレート(蛍光測定用黒色プレートH、住友ベークライト株式会社製)の各ウェルに50 mM Tris-HCl(pH 7.5)を200μlずつ添加して洗浄した。この洗浄操作を合計2回行った。各ウェルに、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)で10μg/mlの濃度に希釈した抗ApoAI抗体(clone 1C5、Cat.No. MONO5030、SANBIO社)の溶液を100μlずつ添加し、4℃にて一晩以上静置した。抗体溶液を除去し、各ウェルにPBSを200μlずつ添加して洗浄した。この洗浄操作を合計3回行った。各ウェルに2%BSA/PBSを200μlずつ添加し、25℃にて600 rpmで2時間振とうした。
上記の被検者の血清から一部を取り、ApoAI測定用キット(N-アッセイ TIA ApoAI-H、ニットーボーメディカル株式会社)を用いてApoAI濃度を測定した。濃度測定の具体的な操作は、該キットに添付のマニュアルに従って行った。HDL画分は、PEGで2倍に希釈された血清より調製されたので、HDL画分のApoAI濃度は、測定により得られた血清のApoAI濃度の1/2とした。HDL画分におけるApoAI濃度が1.25~2μg/mlとなるように各HDL画分を希釈して、HDL画分含有希釈液を調製した。HDL画分の希釈には、2%BSA及び2mM リポソーム(日本精化株式会社製)を含むPBS(以下、「バッファー」ともいう)を用いた。HDL画分を含まない対照検体(ApoAI濃度0μg/ml)として、上記のバッファーを用いた。上記のバッファーに含まれるリポソームの組成は、2mM ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)、2mM コレステロール及び4mM 水素添加大豆ホスファチジルコリン(HSPC)であった。PBSは、Phosphate buffered saline tablet (Sigma-Aldrich社)を水に溶解して調製した。
抗ApoAI抗体を固定化したプレートからBSA溶液を除去し、各測定用試料を100μlずつウェルに添加した。そして、プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうして、HDLと抗ApoAI抗体との複合体をプレート上に形成した。
HDLに取り込まれたBODIPY付加コレステロールに由来する蛍光の強度を、次のようにして測定した。HDLと抗ApoAI抗体との複合体が捕捉されたプレートの各ウェルに、10 mM シクロデキストリン/PBSを100μlずつ添加し、該プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうした。そして、蛍光強度を蛍光プレートリーダー(Infinite(登録商標)200 Pro、TECAN社製)で測定した(励起光485 nm/蛍光535 nm)。
捕捉されたHDLの量を、プレート上の複合体中のHDLに含まれるApoAIの濃度に基づいて測定した。具体的には、次のとおりであった。上記(2.3)の測定後のプレートからシクロデキストリン溶液を除去し、各ウェルをPBSで3回洗浄した。ApoAI測定用キット(N-アッセイ TIA ApoAI-H、ニットーボーメディカル株式会社)のヤギ抗ApoAI血清をブロッキングバッファー(StartingBlock、Thermo Scientific社)で1000倍に希釈し、得られた希釈液を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうした後、希釈液を除去して、各ウェルをPBSで3回洗浄した。HRP標識ウサギ抗ヤギIgGポリクローナル抗体(P0449、Dako社)をブロッキングバッファー(StartingBlock、Thermo Scientific社)で1000倍に希釈し、得られた希釈液を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうした後、希釈液を除去して、各ウェルをPBSで5回洗浄した。化学発光基質溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific社)を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで2分間振とうした後、発光量をマイクロプレートリーダー(Infinite(登録商標)F200 Pro、TECAN社製)で測定した。
上記のとおり、実施例1では、所定量の血清から調製したHDL画分を、ApoAIの濃度が一定となるよう希釈して、コレステロール取り込み能の測定に用いた。そこで、上記(2.3)で得た測定値を、下記の式(2)により、血清の単位体積あたりの標識コレステロール取り込み能の測定値に換算した。式中、「標識コレステロール取り込み能の測定値」は、上記(2.3)で得た測定値であり、「HDLの捕捉量」は、上記(2.4)で得た測定値であり、「血清のApoA1濃度」は、上記(2.2)(ii)で得た測定値であった。
= [(標識コレステロール取り込み能の測定値)/(HDLの捕捉量)]×(血清のApoA1濃度) ・・・(2)
被検者2091例のうち、観察期間中に糖尿病を発症した者は219例であった。ハザード比は、Cox比例ハザードモデルを用いて計算し、潜在的交絡因子(年齢、性別、糖尿病家族歴、収縮期血圧、降圧薬、総コレステロール値、中性脂肪値、脂質改善薬、肥満・過体重、喫煙、飲酒、及び運動)を調整した。血清の単位体積あたりのコレステロール取り込み能の値に基づいて、被検者を4群に分類した。各群のコレステロール取り込み能及びハザード比を、表2に示す。
実施例1で除外対象とした心血管疾患の既往歴のある者(66例)を被検者に加えたこと以外は実施例1と同様にして、HDLのコレステロール取り込み能と糖尿病発症リスクとの関連性を検討した。結果を表3に示す。
12、22: 第1容器
13,23: 第2容器
14、24: 箱
15、25: 添付文書
26: 固相(96ウェルマイクロプレート)
10: 判定装置
20: 測定装置
30: コンピュータシステム
Claims (18)
- 被検者の生体試料中のリポタンパク質のステロール取り込み能を測定することを含み、前記生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値が、糖尿病発症リスクの指標となる、被検者の糖尿病に関する情報を取得する方法。
- 前記被検者が、心血管疾患の既往歴がない被検者である請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が、血液試料である請求項1又は2に記載の方法。
- 前記リポタンパク質が、高比重リポタンパク質である請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記測定工程が、無細胞系で行われる請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記測定工程が、
前記生体試料中のリポタンパク質と、標識ステロールとを接触することにより、前記標識ステロールを取り込んだリポタンパク質を調製する工程と、
前記リポタンパク質に取り込まれた標識ステロールの標識に基づいて、前記標識ステロールの取り込み能を測定する工程と
を含む請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記調製工程が、環状構造を有さない界面活性剤の存在下で行われる請求項6に記載の方法。
- 前記標識ステロールが、標識コレステロールである請求項6又は7に記載の方法。
- 前記標識コレステロールが、下記の式(I):
(式中、R1は、メチル基を有していてもよい炭素数1~6のアルキレン基であり、
X及びYは、同一又は異なって、-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C=O)-NH-、-(C=O)-NH-R2-、-R2-NH-(C=O)-、-NH-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-、-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-O-、-(C=O)-O-R2-、-R2-O-(C=O)-、-O-(C=O)-R2-、-R2-(C=S)-NH-、-(C=S)-NH-R2-、-R2-NH-(C=S)-、-NH-(C=S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、又は-S-R2-で表され、ここで、R2は、それぞれ独立して、結合手、置換基を有していてもよい炭素数1~10のアルキレン基、置換基を有していてもよい炭素数6~12のアリーレン基若しくはヘテロアリーレン基、又は、置換基を有していてもよい炭素数3~8のシクロアルキレン基若しくはヘテロシクロアルキレン基であり、
Lは、-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、又は-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-で表わされ、ここで、R3は、酸素原子、硫黄原子、-NH-、-NH-(C=O)-又は-(C=O)-NH-であり、
TAGは、タグであり、
a及びcは、同一又は異なって、0~6の整数であり、
bは、0又は1であり、
d及びeは、同一又は異なって、0~12の整数であり、
fは、0~24の整数である。)
で表されるタグ付加コレステロールである請求項8に記載の方法。 - 前記測定工程が、前記標識ステロールを取り込んだリポタンパク質と、前記リポタンパク質に結合する捕捉体とを接触して、前記標識ステロールを取り込んだリポタンパク質と前記捕捉体を含む複合体を形成する工程を含む請求項6~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記捕捉体が、前記リポタンパク質に特異的に結合する抗体である請求項11に記載の方法。
- 前記捕捉体が、固相に固定化されており、前記リポタンパク質が固相上に固定される請求項11又は12に記載の方法。
- 前記固相に固定化されたリポタンパク質が、前記標識ステロールを取り込んだ前記リポタンパク質である請求項13に記載の方法。
- 前記測定工程が、前記リポタンパク質に取り込まれた前記標識ステロールに由来するシグナルを検出することにより行われる請求項6~14のいずれか1項に記載の方法。
- 標識ステロールと、リポタンパク質に結合する捕捉体とを含む、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法に用いられる、糖尿病に関する情報を取得するための試薬キット。
- プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、
被検者の生体試料中のリポタンパク質のステロール取り込み能の測定値を取得するステップと、
前記生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値に基づいて、糖尿病発症リスクを判定するステップと、
前記判定の結果を出力するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
糖尿病発症リスクの判定装置。 - コンピュータに読み取り可能な媒体に記録されているコンピュータプログラムであって、下記のステップ:
被検者の生体試料中のリポタンパク質のステロール取り込み能の測定値を取得するステップと、
前記生体試料の単位体積あたりのステロール取り込み能の測定値に基づいて、糖尿病発症リスクを判定するステップと、
前記判定の結果を出力するステップと
を前記コンピュータに実行させる、
糖尿病発症リスクの判定のためのコンピュータプログラム。
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