WO2007052789A1 - 大血管障害を判別するためのリポタンパク質の分析方法 - Google Patents

大血管障害を判別するためのリポタンパク質の分析方法 Download PDF

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elution
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Hidetoshi Kotake
Koji Kuriyama
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Skylight Biotech Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing lipoproteins for determining macrovascular disorders.
  • a method of separating lipoproteins contained in a test sample by gel filtration liquid chromatography depending on the particle size, and then quantifying cholesterol and triacylglycerol contained in the separated lipoproteins A method of fractionating the obtained chromatogram into chylomicron, ultra-low density lipoprotein, low density lipoprotein and high density lipoprotein by waveform processing such as Gaussian distribution curve approximation is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-15225 ( It is disclosed in Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 discloses a method of separating the subclasses.
  • Glyceric nephropathy, diabetic retinopathy, etc. are mainly caused by disorders of relatively small blood vessels such as arterioles and capillaries, and are called diabetic microangiopathy and are characteristic of diabetes. It is considered to be a serious lesion.
  • diabetic macrovascular disorder a relatively large artery is often damaged by diabetes, which is called diabetic macrovascular disorder.
  • This macrovascular disorder is said to have a relatively large effect such as hyperlipidemia, which often accompanies diabetes. It is known that angiogenesis and myocardial infarction are more likely to occur when blood vessels that supply blood to the heart are damaged by macrovascular disorders, and strokes are more likely to occur when blood vessels to the brain are damaged.
  • Non-Patent Document 2 a carotid echo test is known as a method for determining a macrovascular disorder.
  • This carotid echocardiography can measure the carotid intima-media thickness (hereinafter referred to as IMT) and determine the risk of macrovascular injury. You can.
  • IMT carotid intima-media thickness
  • the carotid echocardiography that measures this IMT needs to restrain the non-invasive patient in terms of time and place, and also requires a high-performance ultrasonic tomography device. It cannot be said that this is a simple and low-cost inspection.
  • it is necessary to know the risk of macrovascular disorder frequently and it can be said that a test to replace the carotid echocardiogram is desired.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 9-15225
  • Non-Patent Document 2 “Hyperlipidemia Navigator” p232-233, Medical Review, Inc. Disclosure of Invention
  • an object of the present invention is to provide a simple and low-cost inspection method that can inspect the risk of macrovascular disorders.
  • the present invention includes the following.
  • a lipoprotein analysis method for distinguishing macrovascular disorders by analyzing a small particle size low specific gravity lipoprotein contained in a test sample.
  • the analysis of the small particle size low specific gravity lipoprotein is performed by separating the lipoprotein contained in the test sample by liquid chromatography and detecting a signal derived from a component contained in the separated lipoprotein. And calculating an approximate waveform that also has a peak force corresponding to each subclass using the detected signal, assuming that at least the low-density lipoprotein is composed of a plurality of subclasses defined by the particle size. Based on the step and the obtained approximate waveform, the step of calculating the total amount of the above components contained in the small particle size low density lipoprotein in the peak corresponding to the low density lipoprotein, and the calculated total amount A method for comparing with a reference value, and the analysis method according to (1). [0012] (4) The analysis method according to (3), wherein the small particle size low specific gravity lipoprotein is a subclass having an average particle size equal to or less than the low specific gravity lipoprotein for which the signal power is also calculated.
  • the low specific gravity lipoprotein has a peak at an elution position of 28.0-28.61 nm, a peak at an elution position of 25.4-25.64 nm, and an elution position of 22.9-23. It is assumed that a peak with an elution position of 20.6-20.8 nm, a peak with an elution position of 18.5_18.7 nm, and a peak force with an elution position of 16.6-16.8 nm are also assumed. (3) The analysis method described.
  • the small particle size low specific gravity lipoprotein has an elution position of 22.
  • the small particle size low specific gravity lipoprotein has an elution position of 20.
  • the analysis method according to (6) which is a subclass corresponding to a peak at 6-20.8 nm, a peak at an elution position of 18.5-18.7 nm, and a peak at an elution position of 16.6-16.8.
  • the above approximate waveform shows a peak with an elution position greater than 90 °, a peak with an elution position of 75 °, a peak with an elution position of 64nm, a peak with an elution position of 53.6nm, and an elution Position force S44.5nm peak, elution position 36.56_36.8m peak, elution position 31.3-32.17nm peak, elution position 28.0-28.61nm peak, elution position 25.4_25.64n m peak, elution position 22.9-23.lnm peak, elution position 20.6_20.8nm peak, elution position 18.5-18.7nm peak, elution position 16.6_16.8nm peak A peak with an elution position of 14.9-15.lnm, a peak with an elution position of 13.4_13.6nm, a peak with an elution position of
  • the reference value is an average value of the total of the components contained in the small particle size low density lipoprotein among the peaks corresponding to the low density lipoprotein measured in the healthy subject group.
  • a total amount calculating means for calculating a total amount of components contained in the small particle size low density lipoprotein in a peak corresponding to the low specific gravity lipoprotein based on the obtained approximate waveform;
  • a lipoprotein analysis apparatus for determining macrovascular disorders in diabetic patients, comprising a comparison processing means for comparing the total value with a reference value
  • the total amount calculating means calculates the total amount by setting a subclass having an average particle size equal to or less than the average particle size of the low specific gravity lipoprotein for which the signal power is also calculated as the small particle size low specific gravity lipoprotein.
  • the analyzer according to (15).
  • the approximate waveform calculation means uses the low specific gravity lipoprotein for the peak at the elution position of 28.0-2 8.61 nm, the peak at the elution position of 25.4_25.64 nm, the elution position force ⁇ 2.9-23.1 The peak at nm, the elution position is 20.6-20.8 nm, the elution position is 18.5_18.7 nm (15) The analyzer according to (15), which calculates an approximate waveform assuming that a certain peak and a peak force at an elution position of 16.6-16.8 nm are obtained.
  • the total amount calculating means includes a peak having an elution position of 22.9-23.lnm and an elution position of 20.6-20.8nm in the approximate waveform of the small particle size low specific gravity lipoprotein.
  • the total amount is calculated by defining the subclass corresponding to the peak whose elution position is 18.5-18.7 nm and the peak whose elution position is 16.6-16.8 nm. (18) apparatus.
  • the total amount calculating means includes a peak having an elution position of 20.6-20.8 nm, a peak having an elution position of 18.5-18.7 nm in the above approximate waveform,
  • the detection means includes a cholesterol reaction part that quantifies cholesterol contained in the lipoprotein and a tridallylide reaction part that quantifies triglyceride contained in the lipoprotein ( 15) The analytical device described.
  • the approximate waveform calculating means may include the peak having an elution position greater than 90 °, the peak having an elution position of 75 nm, the peak having an elution position of 64 nm, and an elution position of 53.6.
  • the comparison processing means calculates the average value of the total of the components contained in the small particle size low density lipoprotein among the peaks corresponding to the low density lipoprotein measured in the healthy subject group.
  • FIG. 1 is a system configuration diagram of a lipoprotein analyzer for quantifying TC and TG contained in serum lipoprotein.
  • FIG. 2 Characteristic diagram in which the horizontal axis is the elution time (min) and the vertical axis is the detection value (mV), the TC chromatogram and the TG chromatogram are superimposed.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing data used as a basis for defining an anchor peak, obtained using a TSKgel Lipopropal XL column (manufactured by Tosoichi Co., Ltd.).
  • FIG. 4 is a characteristic diagram showing data used as a basis for defining as an anchor peak, obtained using a Superose 6HR 10/30 column (manufactured by Amersham Falmacia).
  • a lipoprotein analyzer to which the present analysis method is applied includes, for example, a column 1 for separating lipoprotein components contained in a test sample and a lipoprotein eluted from the column 1, as shown in FIG.
  • Splitter 2 that distributes the eluate containing protein 2; first flow path 3 and second flow path 4 distributed by splitter 2; and cholesterol disposed in first flow path 3 (hereinafter referred to as ⁇ TC Reaction section 5, triglyceride (hereinafter referred to as “TG”) reaction section 6 disposed in the second flow path 4, and TC disposed downstream of the TC reaction section 5 in the first flow path 3.
  • ⁇ TC Reaction section 5 triglyceride (hereinafter referred to as “TG”) reaction section 6 disposed in the second flow path 4
  • TC disposed downstream of the TC reaction section 5 in the first flow path 3.
  • test sample is not particularly limited, and biologically derived fluids such as serum, plasma spinal fluid, tissue fluid and lymph fluid It means a body sample, as well as a sample containing secreted particles from a cell culture system.
  • the lipoprotein analyzer also includes a sampler 11 for supplying a serum sample to the column 1, a first pump 12 for supplying an eluent to the column 1, and an elution for supplying the column 1 to the column 1 by the first pump 12. And a degasser 13 for removing gas from the liquid.
  • the column 1 in the lipoprotein analyzer is not particularly limited, but it is particularly preferable to use a column filled with a gel filtration filler.
  • column 1 can be exemplified by a column having a filler having an average pore size of 800 to 1200 angstroms. With fillers with an average pore size of less than 800 angstroms, lipoproteins with large molecular sizes such as CM and VLDL are difficult to enter the pores, whereas with fillers with an average pore size of more than 1200 angstroms, LDL, HDL, etc.
  • the average pore size is 800 to 1200 angstroms because the separation of lipoproteins having a small molecular size deteriorates.
  • a filler having an average pore diameter of 900 to L: 100 angstroms is excellent in resolution, so that it is possible to finally analyze lipoprotein with higher accuracy.
  • packing material it is necessary to select a packing material that has sufficient mechanical strength to withstand use in liquid chromatography.
  • fillers are based on, for example, silica gel, polyvinyl alcohol, polyhydroxymethacrylate and other hydrophilic resins.
  • TSKgel Lipopropak trade name, manufactured by Tosoh Corporation
  • TSKgel Lipopropak trade name, manufactured by Tosoh Corporation
  • Examples of the eluent include phosphate buffer, Tris buffer, bis-tris buffer, and the like, but are not particularly limited as long as they can separate lipoproteins.
  • the concentration of the buffer is 20 to 200 mM, particularly preferably 50 to 100 mM. If the buffer concentration is less than 20 mM, the buffer capacity is small. If it exceeds 200 mM, the reaction between the enzyme reagent described below and TC or TG may be inhibited.
  • the pH of the buffer is 5-9, particularly preferably 7-8. This is because if the pH of the buffer solution is less than 5 or exceeds 9, the reaction with the enzyme reagent may be inhibited as described above. However, this is not the case when measuring TC and Z or TG without using an enzyme.
  • the TC reaction unit 5 includes a TC contained in the eluate containing the lipoprotein eluted from the column 1. It is connected via a second pump 15 to a TC reagent tank 14 having a reagent for quantifying the amount of water.
  • the reagent for quantifying TC is not particularly limited.
  • enzymes such as cholesterol monoreesterase, cholesterono reoxidase, peroxidase, and N-ethyl-N- (3-methylphenol- ) - ⁇ '-succinylethylenediamine, 4-aminoantipyrine, ⁇ -ethyl- ⁇ - (3-sulfopropyl) -m-amino-dyne and other enzyme-dye reagents
  • the reagent for example, commercially available Detamina I LTCII (Kyowa Medettas Co., Ltd.), L type CHO'H (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) reagent can be suitably used.
  • These reagents react with TC to give reaction products having fluorescence and absorption that can be detected with a spectroscope such as a fluorescence detector or an ultraviolet-visible detector.
  • the TG reaction unit 6 is connected via a second pump 15 and a TC reagent tank 16 having a reagent for quantifying TG contained in the eluate containing lipoprotein eluted from the column 1.
  • the reagent for quantifying TG is not particularly limited, and examples thereof include enzymes such as ascorbate oxidase, glycerol kinase, glycerol triphosphate oxidase, lipoprotein lipase and peroxidase, and quinone series.
  • An enzyme-one dye reagent in combination with a dye such as a coloring dye can be used.
  • the quinone coloring dyes include N-ethyl N— (3-methylphenol) N, mono-succinyl ethylenediamine or N-ethyl N- (3-sulfopropyl) m-amino-idine and 4-antiaminopyrine.
  • Examples include acid-sodium condensates.
  • the reagent for example, commercially available Detamina L TGIK Kyowa Medettas Co., Ltd.), L type TG'H (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) reagent can be suitably used.
  • the TC reaction unit 5 and the TG reaction unit 6 are each provided with a reaction coil for controlling the reaction temperature of the above-described reagent and TC or TG.
  • the reaction temperature between the above-described reagent and TC or TG is 35 to 50 ° C, preferably 45 to 50 ° C. If the reaction temperature is less than 35 ° C, the reaction becomes insufficient, and if it exceeds 50 ° C, the enzyme may deteriorate during the reaction.
  • the TC detection unit 7 includes, for example, an ultraviolet-visible light detector for detecting the absorbance of the reaction product generated by the reaction of TC with the reagent in the TC reaction unit 5.
  • the TG detector 8 For example, an ultraviolet-visible light detector is provided for detecting the absorbance of the reaction product produced by the reaction of TG with the reagent in the TG reaction section 6.
  • the measurement wavelength of the UV-visible detector may be 540 to 560 nm.
  • the system controller 9 has a function of receiving output signals from the TC detection unit 7 and the TG detection unit 8 and outputting a TC chromatogram and a TG chromatogram as a result based on these signals.
  • the chromatograms output from the system controller 9 are, for example, as shown in Fig. 2, where the horizontal axis is the elution time (min) and the vertical axis is the detection value (mV). Can be displayed in a superimposed manner.
  • the computing device 10 for example, a computer in which an analysis program to be described later is installed can be used.
  • the computing device 10 is connected to the system controller 9, processes the chromatogram output from the system controller 9 by an analysis program, separates lipoproteins contained in the test sample into, for example, 20 subclasses, and TC It has a function to calculate the amount and TG amount.
  • the arithmetic unit 10 may be connected to the system controller 9 via an information communication network such as the Internet, LAN, or intranet.
  • Lipoproteins are classified into several classes based on differences in properties such as particle size, hydration density, and electrophoretic mobility.
  • lipotanc is separated into subclasses based on particle size. Specifically, the subclasses are larger than 90 ⁇ m (> 90nm), 64-90nm, 53.6-75nm, 44.5-64nm, 36.8-53.6nm, 31.3-44.5nm, 2 8.6—36.8nm, 25.5—31.3nm, 23— 28.6 nm, 20.7— 25.5 nm, 18.6— 23 nm, 16.7— 20.7 nm, 15 — 18.6 nm, 13.5— 16.7 nm, 12.1— 15 nm, 10.9— 13.5 nm, 9.8— 12.1 nm, 8.8— 10.9 nm, 7.6— 9.
  • subclasses that are also less than 8nm and 8.8 ( ⁇ 8.8) force.
  • the subclass is preferably greater than 82.5 nm (> 90 nm), 69.5-82.5 nm, 58.8-69.5 nm, 49.05-58.8 nm- 40.65- 49.05 nm ⁇ 34.05-40.65 nm, 29.95-34.05 nm 27.05-29.95nm, 24.25—27.05nm, 21.85—24.25nm, 19.65—21.85nm, 17.65—19.65nm, 15.85—17.65nm, 14.25—15.85nm, 12.8—14.25nm, 11.5—12.8nm, 10.35—11.5 nm, 9.3—10.35 nm, 8.2-9.3 nm, and 20 subclasses with less ( ⁇ 8.2) force than 8.2.
  • the subclass is more preferably larger than 90 nm (> 90 nm), 75 nm, 64 nm, 53.6 nm, 44.5 nm, 3 6.56- 36.8 nm, 31.3- 32.17 nm, 28.0-28.61 nm, 25.4- 25.64 nm, 22.9- 23.1nm ⁇ 20.6-20 • 8nm, 18.5— 18.7nm, 16.6— 16.8nm, 14.9- 15.1nm, 13.4- 13.6nm, 12.0-12.2nm, 10.8-11.0nm, 9.7-9.9nm, 8.7-8.9nm And 20 subclasses of 7.46-7.6 nm.
  • the lipoprotein analyzer quantifies TC and TG contained in each of the 20 subclasses by processing the chromatogram output from the system controller 9 using an analysis program.
  • the analysis program controls the arithmetic unit 10 according to the flowchart consisting of step 1 and step 2.
  • step 1 the chromatogram output from the system controller 9 is input as an input signal via the input means of the arithmetic unit 10. That is, in step 1, the analysis program causes the computer to execute as detection means for inputting the chromatogram output from the system controller 9 as an input signal.
  • Step 1 will be described in detail.
  • the TC chromatogram and the TG chromatogram as shown in FIG. 2 are input via the input means of the arithmetic device 10, for example, the arithmetic device 10
  • the numerical data that is the basis of the chromatogram is stored in a recording medium that can be recorded by the arithmetic unit 10.
  • Step 2 the input chromatogram is subjected to waveform processing and separated into 20 subclasses, and a Gaussian approximate waveform is calculated. That is, in step 2, the analysis program causes the computer to execute as waveform processing means for calculating a Gaussian approximate waveform. Waveform The chromatogram entered in step 1 can be separated into 20 independent peaks by processing means. In the following description, the 20 independent peaks are referred to as G1 to G20 in the order of the largest size, and each peak is referred to as a component peak.
  • G1 and G2 are component peaks corresponding to chylomicron (CM)
  • G3 to G7 are component peaks corresponding to very low specific gravity (specific gravity) lipoprotein (VLDL)
  • G8 to G13 are low specific gravity lipoproteins ( LDL) is a component peak
  • G14 to G20 are component peaks corresponding to high specific gravity lipoprotein (HDL).
  • G3 to G5 are large VLDL
  • G6 is medium VLDL
  • G7 is small VLDL.
  • G8 is a large LDL
  • G9 is a medium LDL
  • G10 is a small LDL
  • G11 to G13 are very small LDL.
  • the component peaks corresponding to HDL G14 and G15 are very large HDL
  • G16 is large HDL
  • G17 is medium HDL
  • G18 is small HDL
  • G19 and G20 are very small HDL. is there.
  • the waveform processing means in step 2 performs processing to calculate the Gaussian approximate waveform including G1 to G20 by separating the chromatogram or numerical data input in step 1 into 20 component peaks. It is a means to make it execute.
  • the 20 component peaks are classified according to the size of the lipoprotein.
  • the peak positions of the 20 component peaks are defined as follows. First, the peak position (elution time) of the reference peak (referred to as an anchor peak) is determined from the 20 peaks consisting of G1 to G20, and then the peak of the component peak excluding the anchor peak ( The peak position of “extra essential peaks” is determined. Specifically, as an example, G5, G6, G7, G9, G10, G15, G17 and G18 are anchor peaks, and G1 to G4, G8, G11 to G14, G16, G19 and G20 are extra essential peaks.
  • Figure 3 shows an example of data that provides the basis for defining G5, G6, G7, G9, G10, G15, G17, and G18 as anchor peaks.
  • triglyceride is passed from VLDL force to LDL by the action of cholesterol ester transfer protein present in blood, and instead, cholesterol ester force LDL is passed to VLD L.
  • LDL becomes triglyceride-rich particles, and triglycerides in LDL are decomposed by sex lipase, and LDL becomes smaller.
  • the size of this miniaturized LDL is significantly smaller than the healthy male LDL size in a population of cases without or very low lipoprotein lipase activity, and is distributed within a range of sizes. Therefore, the average elution position of LDL is defined as the elution position of G10 in the anchor peak (see Fig. 3 (b)).
  • the data shown in FIG. 3 is data obtained using a TSKgel Lipopropal XL column (manufactured by Tosohichi Co., Ltd.). You can use the data obtained by using the column.
  • data can be similarly obtained using a Superose 6HR 10/30 column (manufactured by Amersham Falmacia), and anchor peaks can be defined based on this data. it can.
  • the elution position of profile power G10 and G18 in cases with no or very low lipoprotein lipase activity can be defined ( Figure 4 (b);).
  • the elution position of G7 can be defined from the profile of ApoE2 / 2 type III hyperlipidemia case (Fig. 4 (c)).
  • the elution position of G15 can be defined from the complete defect profile of cholesterol ester transfer protein (Fig. 4 (d)).
  • each elution position is defined with G5, G6, G7, G9, G10, G15, G17, and G18 as anchor peaks.
  • extra essential peaks fixed the size and distribution of component peaks ( (Time and width fixed) These peaks are necessary for analyzing component peaks by Gaussian approximation.
  • the distribution width of the lipoprotein subclass corresponding to extra essential peaks is assumed to be almost the same in LDL and HDL, and the anchor peaks are filled at almost equal intervals.
  • Four extra essential peaks (Gll ⁇ 14) are set between G10 and G15, one extra essential peak (G8) is set between G7 and G9, and 1 between G15 and G17.
  • the position of extra essential peaks (G16-20) belonging to HDL can be defined with reference to the correspondence between the peak observation frequency of the healthy population and the experimental value obtained by rechromatography in an analysis using a separate column for HDL. it can.
  • the component peaks G8 to G20 were determined so that their positions were almost equally spaced and equal in width.
  • the component peaks G2, G3, and G4 are necessary for Gaussian approximation between the Void G1 and the anchor peak G5, and the regularity of the peak interval and width was determined.
  • the minimum value of the component peak width is defined as the FG width (single particle having a molecular weight of 92) obtained in the analytical system, and the maximum value is defined as twice the interval between adjacent peaks. it can.
  • ⁇ It can be set as a numerical value represented by 143 * 60.
  • the peak widths of the 20 component peaks are 0.33 min for G01, 0.40 min for G02, 0.55 min for G03, 0.55 min for G04, 0.55 min for G05, 0.50 min for G06, G07 0.4 0.40 min, G08 ⁇ ! Min 0.38 min, G09 ⁇ ! ⁇ 0.38 min, G10 ⁇ ! ⁇ 0.38 min, Gil ⁇ ! /, 0.3 0.38 min, G12 ⁇ ! /, 0.38 min, G13 ⁇ Katsu! /, 0.33 min, G14 0.33 min, G15 0.33 min, G16 0.38 min, G17 0.38 min, G18 0.38 min, G19 0.38 min, G20 0.48 min Set in advance.
  • the waveform processing means in step 2 can be executed by applying, for example, a Gaussian waveform processing calculation algorithm.
  • a Gaussian waveform processing calculation algorithm it can be separated into 20 component peaks as follows. That is, assuming that the shape of a single peak on the chromatogram is symmetric gaussian distribution, the peak height h (t) at time t is the peak position T and width (standard deviation).
  • h (t) HXexp (-(tT) 2 / 2a 2 )
  • the height hn (t) of the n-th peak is obtained by using the position Tn and the width (standard deviation) ⁇ ⁇ of the n-th peak.
  • hn (t) Hn X exp (- (t- ⁇ ) 2/2 ⁇ n 2) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • a (tl) HI X Gl (tl) + H2 X G2 (tl) + ... + Hn- 1 XGn- l (tl) + HnXGn (tl)
  • a (t2) HI X Gl (t2) + H2 X G2 (t2) + ... + Hn— 1 X Gn- l (t2) + HnX Gn (t2)
  • a (tm) HI X Gl (tm) + H2 X G2 (tm) + + Hn-1 X Gn-l (tm) + HnX Gn (tm)
  • the actual chromatogram waveform at time t is expressed as R (t)
  • R (t) A (t) is not always obtained by the nonlinear least squares method, so (R (t ) -A (t)) 2.
  • a (t2) HI X Gl (t2) + H2 X G2 (t2) + ... + H19 X Gn- l (t2) + H20 X G20 (t2)
  • the number of data points is not 20! / ⁇ , but in this algorithm, 20 points that are easy to calculate for high-speed processing (for example, peak positions in 20 subcrumbs 20 Select the power station for convenience. In this algorithm, it is also possible to obtain by the least squares method without selecting 20 data points.
  • the chromatogram output from the system controller 9 (for example, the chromatogram shown in FIG. 2) is composed of peaks corresponding to 20 subclasses. An approximate waveform can be calculated.
  • the approximate wave obtained by the above analysis program is next. Based on the shape, the total amount of cholesterol contained in the small particle size low density lipoprotein is calculated among the peaks corresponding to the low density lipoprotein.
  • the small particle size low specific gravity lipoprotein means a low specific gravity lipoprotein having a relatively small particle size among low specific gravity lipoproteins. More specifically, the small particle size low specific gravity lipoprotein means a subclass having an average particle size equal to or smaller than the low specific gravity lipoprotein.
  • the peak corresponding to the low density lipoprotein is a peak of G08 to G13, and the average particle diameter of the low density lipoprotein can be 25.5 nm. That is, in the above-described example, the small particle size low specific gravity lipoprotein corresponds to the peak of G10 to G13.
  • the total amount of cholesterol contained in each subclass can be calculated by an arithmetic processing means having an integration circuit using the numerical data of the approximate waveform calculated as described above as an input value. it can.
  • the total amount of cholesterol calculated in the above step is then compared with a reference value.
  • the reference value is a subclass (G10 to G13 peak or lower than the average particle size of low-density lipoprotein among peaks corresponding to low-density lipoprotein measured in a group of healthy subjects). It can be an average value of the total amount of cholesterol contained in the peaks of G11 to G13. As an example, 2 Omg / dl can be used as the reference value as the average value.
  • the amount of total cholesterol contained in subclasses of the average particle size of the low specific gravity lipoprotein can be compared between the healthy subject group and the diabetic patient group. .
  • the total cholesterol contained in the subclass with the average particle size of the low specific gravity lipoprotein is below the reference value or above the reference value Can be determined.
  • the analysis method according to the present invention information for determining the risk of macrovascular disorder in a diabetic patient can be acquired.
  • the patient is suffering from macrovascular disorder or has transitioned to macrovascular disorder. It is highly possible to determine that.
  • the macrovascular disorder may be referred to as a disorder or disease associated with an increase in IMT (carotid intima-media thickness).
  • IMT is a value measured by carotid echocardiography, and is conventionally used to determine the risk of macrovascular disease.
  • disorders associated with increased IMT include cerebrovascular disorders and peripheral neuropathies.
  • disorders associated with increased IMT include ischemic heart disease and coronary artery disease. it can.
  • blood samples were collected from 45 diabetic patients with hyperlipidemia (26 males, 19 females, average age 53.2 years) undergoing outpatient treatment as a diabetic patient group.
  • blood samples collected from 299 medical checkups (186 men, 113 women, average age 46.3 years) were collected.
  • FPG fasting blood glucose level
  • HbAlc glycohemoglobin concentration
  • each of these groups was analyzed for lipoproteins using the analyzer shown in FIG. 1, and the total amount of blood cholesterol (TC), the total amount of triglycerides (TG) in the blood, The total cholesterol content (HDL-C) contained in the high density lipoprotein and the total cholesterol content (LDL—C) contained in the low density lipoprotein in the blood were measured.
  • the profile obtained by the analyzer is divided into 20 subclasses, and the component peak force of G11 to G13 is also calculated.
  • the total cholesterol content (chol) contained in the small particle size LDL) was measured.
  • low-density lipoprotein The elution position force was also measured for the average particle size of low specific gravity lipoprotein. The results are shown in Table 1.
  • * is p ⁇ 0.001
  • ** is p ⁇ 0.01.
  • the diabetic patient group is divided into a group in which the total amount of cholesterol contained in the small particle size LDL is 20 mg / dl or more and a group in which the total is less than 20 mg / dl, and the maximum value of IMT in each group is determined. Average values were calculated and compared.
  • IMT was measured with an ultrasonic diagnostic apparatus Logiq7 (Yokogawa GE Medical) according to the equipment usage manual.
  • the diabetic patient group is divided into a group in which the maximum value of IMT is less than 1. Omm and a group in which the maximum value is 1.0 mm or more, and the amount of cholesterol contained in the small particle size LDL in each group And the average particle size of low density lipoprotein was compared.
  • the results are shown in Table 4.
  • * is p ⁇ 0.01 and ** is p ⁇ 0.05.
  • the risk of macrovascular disorder which has been conventionally determined by the maximum value of IMT, can be determined by the total amount of cholesterol contained in subclasses of the low specific gravity lipoprotein below the average particle size. We were able to obtain such new knowledge.

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Abstract

　糖尿病患者においては大血管障害のリスクを検査することができる、簡便かつ低コストな検査方法を提供する。 　糖尿病患者から採取した被検試料に含まれる複数クラスのリポタンパク質を液体クロマトグラフィーで分離し、分離したリポタンパク質に含まれるコレステロールに由来する信号を検出する工程と、少なくとも低比重リポタンパク質が粒子径により規定される複数のサブクラスにより構成されていると仮定し、上記検出した信号を用いて、各サブクラスに対応するピークからなる近似波形を算出する工程と、得られた近似波形に基づいて、低比重リポタンパク質に相当するピークの中で、低比重リポタンパク質の平均粒子径以下のサブクラスに含まれるコレステロール量の合計を算出する工程と、算出したコレステロール量の合計を基準値と比較する工程とを含む。

Description

明 細 書
大血管障害を判別するためのリポタンパク質の分析方法
技術分野
[0001] 本発明は、大血管障害を判別するためのリポタンパク質の分析方法に関する。
背景技術
[0002] ゲル濾過液体クロマトグラフィー法により被検試料に含まれるリポタンパク質を粒子 サイズに依存して分離し、その後、分離したリポタンパク質に含まれるコレステロール 及びトリァシルグリセロールを定量する方法にぉ 、て、得られたクロマトグラムをガウス 分布曲線近似法等の波形処理によって、カイロミクロン、超低比重リポタンパク質、低 比重リポタンパク質及び高比重リポタンパク質に分画する方法が特開平 9— 15225 号公報 (特許文献 1)に開示されている。
[0003] ゲル濾過液体クロマトグラフィー法により被検試料に含まれるリポタンパク質を粒子 サイズに依存して分離し、その後、分離したリポタンパク質に含まれる成分を定量す る方法において、リポタンパク質を 20個のサブクラスに分離する方法が非特許文献 1 に開示されている。
[0004] ところで、糖尿病の合併症の多くが血管の病気と絡んでいることが知られている。糖 尿病性腎症、糖尿病性網膜症などは、細動脈や毛細血管などの比較的小さな血管 の障害が中心となっておこる病気で、糖尿病性細小血管障害とよばれ、糖尿病に特 徴的な病変であると考えられて 、る。
[0005] 一方、比較的大きな動脈に対しても糖尿病によって障害をうけることが多ぐこれは 糖尿病性の大血管障害と呼ばれる。この大血管障害は、糖尿病にしばしば併発する 高脂血症などの影響が比較的大きい事がしられている。大血管障害によって心臓に 血液を送る血管が障害をうけると狭心症や心筋梗塞が、脳への血管が障害を受ける と脳卒中がおこりやすくなることが知られている。
[0006] 現在、大血管障害を判断する手法としては、非特許文献 2に示すように、頸動脈ェ コー検査が知られている。この頸動脈エコー検査によれば、頸動脈内膜中膜複合体 肥厚度 (以下、 IMTと称する）を測定することができ、大血管障害のリスクを判定するこ とができる。ところが、この IMTを測定する頸動脈エコー検査は、非浸襲性ではあるも のの被検者を時間的及び場所的に拘束する必要があり、高性能な超音波断層装置 も必要であるため、簡便かつ低コストな検査であるとは言えない。し力も、糖尿病患者 においては大血管障害のリスクを頻繁に知る必要があり、頸動脈エコー検査に代わ る検査が渴望されて 、ると言える。
特許文献 1：特開平 9 - 15225号公報
特干文献 1 identification of Unique Lipoprotein Subclasses for Visceral Obesity b y Component Analysis orし holesterol Profile in High— Performance Liquid Chromatog raphy( Arterioscler Thromb Vase Biol.2005;25:1-8)
非特許文献 2 :「高脂血症ナビゲーター」 p232— 233、メディカルレビュー社 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、大血管障害のリスクを検査することができ る、簡便かつ低コストな検査方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明は以下を包含する。
[0009] (1)被検試料に含まれる小粒子径低比重リポタンパク質の分析により大血管障害を 判別するためのリポタンパク質の分析方法。
[0010] (2)上記被検試料は糖尿病患者力 採取されたものであることを特徴とする（1)記 載の分析方法。
[0011] (3)上記小粒子径低比重リポタンパク質の分析は、上記被検試料に含まれるリポタ ンパク質を液体クロマトグラフィーで分離し、分離したリポタンパク質に含まれる成分 に由来する信号を検出する工程と、少なくとも低比重リポタンパク質が粒子径により 規定される複数のサブクラスにより構成されて ヽると仮定し、上記検出した信号を用 いて、各サブクラスに対応するピーク力もなる近似波形を算出する工程と、得られた 近似波形に基づいて、低比重リポタンパク質に相当するピークの中で、小粒子径低 比重リポタンパク質に含まれる上記成分の合計量を算出する工程と、算出した合計 量を基準値と比較する工程と、を含むことを特徴とする（1)記載の分析方法。 [0012] (4) 上記小粒子径低比重リポタンパク質は、上記信号力も算出される低比重リポ タンパク質の平均粒子径以下のサブクラスであることを特徴とする（3)記載の分析方 法。
[0013] (5)上記リポタンパク質の平均粒子径が 25.5應であることを特徴とする (4)記載の 分析方法。
[0014] (6)上記低比重リポタンパク質は、上記近似波形にぉ ヽて溶出位置が 28.0-28.61n mであるピーク、溶出位置が 25.4-25.64nmであるピーク、溶出位置が 22.9-23. lnmで あるピーク、溶出位置が 20.6-20.8nmであるピーク、溶出位置が 18.5_18.7nmであるピ ーク及び溶出位置が 16.6-16.8nmであるピーク力もなるものと仮定することを特徴とす る（3)記載の分析方法。
[0015] (7)上記小粒子径低比重リポタンパク質は、上記近似波形にぉ ヽて溶出位置が 22.
9-23. lnmであるピーク、溶出位置が 20.6_20.8nmであるピーク、溶出位置が 18.5-18. 7nmであるピーク及び溶出位置が 16.6-16.8nmであるピークに相当するサブクラスで あることを特徴とする（6)記載の分析方法。
[0016] (8)上記小粒子径低比重リポタンパク質は、上記近似波形にお!ヽて溶出位置が 20.
6-20.8nmであるピーク、溶出位置が 18.5-18.7nmであるピーク及び溶出位置が 16.6- 16.8應であるピークに相当するサブクラスであることを特徴とする（6)記載の分析方 法。
[0017] (9)上記リポタンパク質に含まれる成分は、コレステロール及び/又はトリグリセリドで あることを特徴とする（3)記載の分析方法。
[0018] (10)上記近似波形は、溶出位置が 90應より大であるピーク、溶出位置が 75應であ るピーク、溶出位置が 64nmであるピーク、溶出位置が 53.6nmであるピーク、溶出位置 力 S44.5nmであるピーク、溶出位置が 36.56_36.8mであるピーク、溶出位置が 31.3-32. 17nmであるピーク、溶出位置が 28.0-28.61nmであるピーク、溶出位置が 25.4_25.64n mであるピーク、溶出位置が 22.9-23. lnmであるピーク、溶出位置が 20.6_20.8nmであ るピーク、溶出位置が 18.5-18.7nmであるピーク、溶出位置が 16.6_16.8nmであるピー ク、溶出位置が 14.9-15.lnmであるピーク、溶出位置が 13.4_13.6nmであるピーク、溶 出位置が 12.0-12.2nmであるピーク、溶出位置が 10.8-1 l.Onmであるピーク、溶出位 置が 9.7-9.9nmであるピーク、溶出位置が 8.7-8.9nmであるピーク及び溶出位置が 7.4 6-7.6應であるピーク力もなることを特徴とする（3)記載の分析方法。
[0019] (11)上記基準値は、健常者群において測定された低比重リポタンパク質に相当す るピークの中で、小粒子径低比重リポタンパク質に含まれる上記成分の合計の平均 値であることを特徴とする（3)記載の分析方法。
[0020] (12)上記リポタンパク質に含まれる成分は、コレステロールであり、かつ、上記基準 値は 20mg/dlであることを特徴とする（3)記載の分析方法。
[0021] (13)上記大血管障害は、頸動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加と関連する障害 又は疾患であることを特徴とする（1)記載の分析方法。
[0022] (14)上記障害は脳血管障害及び/又は末梢神経障害であり、上記疾患は虚血性 心疾患及び/又は冠動脈疾患であることを特徴とする（13)記載の分析方法。
[0023] (15)被検試料に含まれる複数クラスのリポタンパク質を分離する液体クロマトグラフ ィ一と、上記液体クロマトグラフィーで分離したリポタンパク質に含まれる成分に由来 する信号を検出する検出手段と、少なくとも低比重リポタンパク質が粒子径により規 定される複数のサブクラスにより構成されて 、ると仮定し、上記検出した信号を用 ヽ て、各サブクラスに対応するピークからなる近似波形を算出する近似波形算出手段と 、得られた近似波形に基づいて、低比重リポタンパク質に相当するピークの中で、小 粒子径低比重リポタンパク質に含まれる成分の合計量を算出する合計量算出手段と 、算出した合計値を基準値と比較する比較処理手段とを含む、糖尿病患者における 大血管障害を判別するためのリポタンパク質の分析装置。
[0024] (16)上記合計量算出手段は、上記信号力も算出される低比重リポタンパク質の平 均粒子径以下のサブクラスを上記小粒子径低比重リポタンパク質として上記合計量 を算出することを特徴とする（15)記載の分析装置。
[0025] (17)上記合計量算出手段は、上記リポタンパク質の平均粒子径を 25.5應とするこ とを特徴とする（16)記載の分析装置。
[0026] (18)上記近似波形算出手段は、上記低比重リポタンパク質を、溶出位置が 28.0-2 8.61nmであるピーク、溶出位置が 25.4_25.64nmであるピーク、溶出位置力 ^2.9-23.1 nmであるピーク、溶出位置が 20.6-20.8nmであるピーク、溶出位置が 18.5_18.7nmで あるピーク及び溶出位置が 16.6-16.8nmであるピーク力もなるものと仮定した近似波 形を算出することを特徴とする（15)記載の分析装置。
[0027] (19)上記合計量算出手段は、小粒子径低比重リポタンパク質を、上記近似波形に おいて溶出位置が 22.9-23.lnmであるピーク、溶出位置が 20.6-20.8nmであるピーク 、溶出位置が 18.5-18.7nmであるピーク及び溶出位置が 16.6-16.8nmであるピークに 相当するサブクラスであると規定して上記合計量を算出することを特徴とする（18)記 載の分析装置。
[0028] (20)上記合計量算出手段は、小粒子径低比重リポタンパク質を、上記近似波形に おいて溶出位置が 20.6-20.8nmであるピーク、溶出位置が 18.5-18.7nmであるピーク 及び溶出位置が 16.6-16.8nmであるピークに相当するサブクラスであると規定して上 記合計量を算出することを特徴とする（18)記載の分析装置。
[0029] (21)上記検出手段は、上記リポタンパク質に含まれるコレステロールを定量するコ レステロール反応部と、上記リポタンパク質に含まれるトリグリセリドを定量するトリダリ セリド反応部とを備えることを特徴とする（15)記載の分析装置。
[0030] (22)上記近似波形算出手段は、上記リポタンパク質を、溶出位置が 90應より大で あるピーク、溶出位置が 75nmであるピーク、溶出位置が 64nmであるピーク、溶出位 置が 53.6nmであるピーク、溶出位置力 4.5nmであるピーク、溶出位置が 36.56_36.8n mであるピーク、溶出位置が 31.3-32.17nmであるピーク、溶出位置力 ¾8.0-28.61nmで あるピーク、溶出位置力 ¾5.4-25.64nmであるピーク、溶出位置が 22.9-23. lnmである ピーク、溶出位置が 20.6-20.8nmであるピーク、溶出位置が 18.5_18.7nmであるピーク 、溶出位置が 16.6-16.8nmであるピーク、溶出位置が 14.9_15.lnmであるピーク、溶出 位置が 13.4-13.6nmであるピーク、溶出位置が 12.0_12.2nmであるピーク、溶出位置 力 S 10.8-1 l.Onmであるピーク、溶出位置が 9.7-9.9nmであるピーク、溶出位置が 8.7-8. 9nmであるピーク及び溶出位置が 7.46-7.6nmであるピークからなるものと仮定した近 似波形を算出することを特徴とする（15)記載の分析装置。
[0031] (23)上記比較処理手段は、健常者群において測定された低比重リポタンパク質に 相当するピークの中で、小粒子径低比重リポタンパク質に含まれる上記成分の合計 の平均値を上記基準値とすることを特徴とする（15)記載の分析装置。 [0032] (24)上記リポタンパク質に含まれる成分は、コレステロールであり、かつ、上記比較 処理手段は、 20mg/dlを上記基準値とすることを特徴とする（15)記載の分析装置。 発明の効果
[0033] 本発明によれば、糖尿病患者にぉ 、ては大血管障害のリスクを検査することができ る、簡便かつ低コストな分析方法を提供することができる。
[0034] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-321327号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0035] [図 1]血清リポタンパク質に含まれる TC及び TGを定量するリポタンパク質分析装置の システム構成図である。
[図 2]横軸を溶出時間（min)とし、縦軸を検出値 (mV)として、 TCに関するクロマトダラ ムと TGに関するクロマトグラムとを重ねて表示した特性図である。
[図 3]TSKgel LipopropalXLカラム (東ソ一 (株)製）を使用して得られた、アンカーピー クとして定義する際の根拠となるデータを示す特性図である。
[図 4]Superose 6HR 10/30カラム（アマシャムフアルマシア社製）を使用して得られた、 アンカーピークとして定義する際の根拠となるデータを示す特性図である。
発明を実施するための最良の形態
[0036] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0037] 本分析方法が適用されるリポタンパク質分析装置は、例えば、図 1に示すように、被 検試料に含まれるリポタンパク質成分を分離するためのカラム 1と、カラム 1から溶出 されたリポタンパク質を含む溶離液を 2分配するスプリツター 2と、スプリツター 2によつ て分配された第 1流路 3及び第 2流路 4と、第 1流路 3に配置されたコレステロール (以 下「TC」と称する)反応部 5と、第 2流路 4に配置されたトリグリセリド (以下「TG」と称す る）反応部 6と、第 1流路 3における TC反応部 5の下流に配置された TC検出部 7と、 第 2流路 4における TG反応部 6の下流に配置された TG検出部 8と、本装置の動作制 御及び TC検出部 7並びに TG反応部 8から信号が入力されるシステムコントローラー 9 と、システムコントローラー 9に接続された演算装置 10とを備えている。ここで、被検 試料とは、特に限定されず、血清、血漿髄液、組織液及びリンパ液等の生体由来液 体サンプル、並びに細胞培養系由来の分泌粒子を含有するサンプルを意味する。
[0038] また、リポタンパク質分析装置は、血清試料をカラム 1に供給するサンプラー 11と、 カラム 1に溶離液を供給するための第 1ポンプ 12と、第 1ポンプ 12によってカラム 1に 供給する溶離液から気体を除去するデガッサー 13とを備えている。
[0039] リポタンパク質分析装置においてカラム 1としては、特に限定されないが、ゲルろ過 用充填剤を充填してなるカラムを用いることが特に好ましい。特に、カラム 1としては、 800〜 1200オングストロームの平均細孔径の充填剤を有するものを例示できる。平 均細孔径が 800オングストローム未満の充填剤では CMや VLDLなどの分子サイズ の大きいリポタンパク質は細孔内に入り難くなり、一方、平均細孔径が 1200オングス トロームを超える充填剤では LDLや HDLなどの分子サイズの小さいリポタンパク質 の分離が悪化するため、前述の通り平均細孔径が 800〜 1200オングストロームのも のが好ましい。中でも平均細孔径が 900〜： L 100オングストロームの充填剤は、分離 能に優れるため、最終的により精度の高いリポタンパク質の分析を行うことを可能とす る。
[0040] また、充填剤としては、液体クロマトグラフィーでの使用に充分耐える機械的強度を 有するものを選択する必要がある。このような充填剤は、例えば、シリカゲル、ポリビ- ルアルコール、ポリヒドロキシメタタリレート及びその他の親水性榭脂を基材とするもの
(例えば TSKgel Lipopropak、商品名、東ソー (株)製)を一例として例示することで きる。
[0041] 溶離液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ビス一トリス緩衝液等を例示できるが 、リポタンパク質を分離できるものであれば特に制限はない。緩衝液の濃度としては 2 0〜200mM、特に好ましくは 50〜100mMの範囲が良い。緩衝液の濃度が 20mM 未満では緩衝能が小さぐ 200mMを超えると後述の酵素試薬と TC又は TGの反応 が阻害される恐れが生じる力もである。緩衝液の pHは、 5〜9、特に好ましくは 7〜8 である。緩衝液の pHが 5未満、あるいは pHが 9を超えると、前記同様、酵素試薬との 反応が阻害される恐れが生じるからである。しかし、 TC及び Z又は TGの測定を、酵 素を用いな 、で行う場合等はこの限りではな 、。
[0042] TC反応部 5は、カラム 1から溶出されたリポタンパク質を含む溶離液に含まれる TC を定量するための試薬を備える TC用試薬タンク 14と第 2ポンプ 15を介して連結され ている。ここで、 TCを定量するための試薬としては、特に限定されないが、例えば、コ レステロ一ノレエステラーゼ、コレステローノレオキシダーゼ、パーォキシダーゼなどの 酵素と、 N-ェチル - N- (3-メチルフエ-ル)- Ν'-サクシ-ルエチレンジァミン、 4-ァミノ アンチピリン、 Ν-ェチル -Ν- (3-スルホプロピル)- m-ァ-シジンなどの色素とを組み合 わせた酵素—色素試薬を用いることができる。試薬としては、例えば、市販のデタミナ 一 L TCII (協和メデッタス株式会社)、 Lタイプ CHO 'H (和光純薬工業株式会社)試薬 を好適に用いることができる。なお、これらの試薬は、 TCと反応して、蛍光検出器や 紫外可視検出器などの分光器で検出可能な蛍光や吸収を有する反応生成物を与え る。
[0043] TG反応部 6は、カラム 1から溶出されたリポタンパク質を含む溶離液に含まれる TG を定量するための試薬を備える TC用試薬タンク 16と第 2ポンプ 15を介して連結され ている。ここで、 TGを定量するための試薬としては、特に限定されないが、例えば、ァ スコルビン酸ォキシダーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール 3リン酸ォキシダ ーゼ、リポタンパク質リパーゼ及びパーォキシダーゼ等の酵素と、キノン系発色色素 等の色素とを組み合わせた酵素一色素試薬を用いることができる。キノン系発色色 素としては、 N ェチル N— (3—メチルフエ-ル） N，一サクシ-ルエチレンジァ ミン又は N—ェチル N— (3—スルホプロピル） m—ァ-シジンと 4—アンチアミノ ピリンの酸ィ匕縮合体が挙げられる。試薬としては、例えば、市販のデタミナ一 L TGIK 協和メデッタス株式会社)、 Lタイプ TG'H (和光純薬工業株式会社)試薬を好適に用 いることがでさる。
[0044] なお、これら、 TC反応部 5及び TG反応部 6は、上述した試薬と TC又は TGとの反応 温度を制御するための反応コイルをそれぞれ備えて!/、る。 TC反応部 5及び TG反応 部 6において、上述した試薬と TC又は TGとの反応温度は、 35〜50°C、好ましくは 4 5〜50°Cとする。反応温度が 35°C未満では反応が不十分になりやすぐまた、 50°C を超えると反応中に酵素が劣化する恐れが生じるからある。
[0045] TC検出部 7は、 TC反応部 5で TCと試薬とが反応して生成した反応生成物の吸光 度を検出するための、例えば紫外可視光検出器を備えている。また、 TG検出器 8は 、TG反応部 6で TGと試薬とが反応して生成した反応生成物の吸光度を検出するた めの、例えば紫外可視光検出器を備えている。例えば、上述した試薬としてキノン系 発色色素を用いた場合、紫外可視検出器の測定波長は、 540〜560nmとすれば良 い。
[0046] システムコントローラー 9は、 TC検出部 7及び TG検出部 8からの出力信号が入力さ れ、この信号に基づいて TCに関するクロマトグラム及び TGに関するクロマトグラムを 結果として出力する機能を備えている。システムコントローラー 9から出力されるクロマ トグラムとしては、例えば、図 2に示すように、横軸を溶出時間（min)とし、縦軸を検出 値 (mV)として、 TCに関するクロマトグラムと TGに関するクロマトグラムとを重ねて表示 することができる。
[0047] 演算装置 10としては、例えば、後述する分析プログラムをインストールしたコンビュ ータを使用することができる。演算装置 10は、システムコントローラー 9と接続されて おり、システムコントローラー 9から出力されるクロマトグラムを分析プログラムによって データ処理し、被検試料に含まれるリポタンパク質を例えば 20個のサブクラスに分離 するとともに TC量及び TG量を算出する機能を有する。なお、この演算装置 10は、ィ ンターネット、 LAN或いはイントラネット等の情報通信回線網を介してシステムコント口 一ラー 9と接続されて ヽても良 ヽ。
[0048] 上述したリポタンパク質分析装置によれば、先ず、カラム 1によって粒子サイズに依 存して各種リポタンパク質を分離し、その後、カラム 1から溶出された溶出液に含まれ る TC及び TGを定量している。したがって、リポタンパク質分析装置によれば、カラム 1 の分離能に依存して、リポタンパク質のサブクラス毎に TC及び TGを定量することがで きる。
[0049] なお、リポタンパク質は、その粒子の大きさ、水和密度、及び電気泳動度などの性 質の違いにより幾つかのクラスに分類されている。本分析装置においては、リポタン ノ ク質を粒子サイズによるサブクラスに分離する。具体的に、サブクラスとしては、 90η mより大（〉90nm)、 64- 90nm、 53.6- 75nm、 44.5- 64nm、 36.8- 53.6nm、 31.3- 44.5nm、 2 8.6— 36.8nm、 25.5— 31.3nm、 23— 28.6nm、 20.7— 25.5nm、 18.6— 23nm、 16.7— 20.7nm、 15 — 18.6nm、 13.5— 16.7nm、 12.1— 15nm、 10.9— 13.5nm、 9.8— 12.1nm、 8.8— 10.9nm、 7.6—9. 8nm及び 8.8より小（< 8.8)力もなる 20個のサブクラスを挙げることができる。また、サ ブクラスとしては、好ましくは、 82.5nmより大（〉90nm)、 69.5- 82.5nm、 58.8- 69.5nm、 49 .05- 58.8nmゝ 40.65- 49.05nmゝ 34.05-40.65nm, 29.95- 34.05nm、 27.05-29.95nm, 24. 25— 27.05nm、 21.85— 24.25nm、 19.65— 21.85nm、 17.65— 19.65nm、 15.85— 17.65nm、 14. 25— 15.85nm、 12.8— 14.25nm、 11.5— 12.8nm、 10.35— 11.5nm、 9.3— 10.35nm、 8.2- 9.3nm 及び 8.2より小（< 8.2)力もなる 20個のサブクラスを挙げることができる。さらに、サブク ラスとしては、より好ましくは、 90nmより大（〉90nm)、 75nm、 64nm、 53.6nm、 44.5nm、 3 6.56- 36.8nm、 31.3- 32.17nm、 28.0-28.61nm, 25.4- 25.64nm、 22.9- 23.1nmゝ 20.6-20 •8nm、 18.5— 18.7nm、 16.6— 16.8nm、 14.9- 15.1nm、 13.4- 13.6nm、 12.0- 12.2nm、 10.8- 11.0nm、 9.7- 9.9nm、 8.7- 8.9nm及び 7.46- 7.6nmからなる 20個のサブクラスを挙げる ことができる。
[0050] リポタンパク質分析装置においては、システムコントローラー 9から出力されるクロマ トグラムを分析プログラムによってデータ処理することで、上記の 20個の各サブクラス に含まれる TC及び TGを定量する。
[0051] 以下、分析プログラムについて説明する。分析プログラムは、ステップ 1及びステツ プ 2からなるフローチャートに従って演算装置 10を制御する。
[0052] 先ず、ステップ 1では、演算装置 10の入力手段を介してシステムコントローラー 9か ら出力されるクロマトグラムを入力信号として入力する。すなわち、分析プログラムは、 ステップ 1によって、システムコントローラー 9から出力されるクロマトグラムを入力信号 として入力する検出手段としてコンピュータを実行させる。
[0053] ステップ 1を詳細に説明すると、先ず、演算装置 10の入力手段を介して、図 2に示 したような TCに関するクロマトグラムと TGに関するクロマトグラムとを入力すると、例え ば、演算装置 10に内在する記憶装置或!、は演算装置 10により記録可能な記録媒 体にこれらクロマトグラム及び/又はクロマトグラムの基となる数値データが記憶される
[0054] 次に、ステップ 2では、入力したクロマトグラムを波形処理して 20個のサブクラスに 分離し、ガウス近似波形を算出する。すなわち、分析プログラムは、ステップ 2によつ て、ガウス近似波形を算出する波形処理手段としてコンピュータを実行させる。波形 処理手段により、ステップ 1で入力したクロマトグラムを 20個の独立したピークに分離 することができる。以下の説明において、 20個の独立したピークを、サイズの大きいも の力 順に G1〜G20と称し、各ピークをコンポーネントピークと称する。 G1及び G2は カイロミクロン (CM)に相当するコンポーネントピークであり、 G3〜G7は超低比重（比 重）リポタンパク（VLDL)に相当するコンポーネントピークであり、 G8〜G13は低比重リ ポタンパク（LDL)に相当するコンポーネントピークであり、 G14〜G20は高比重リポタ ンパク（HDL)に相当するコンポーネントピークである。 VLDLに相当するコンポーネン トピークの中で、 G3〜G5は large VLDLであり、 G6は medium VLDLであり、 G7は small VLDLである。 LDLに相当するコンポーネントピークのなかで、 G8は large LDLであり、 G9は medium LDLであり、 G10は small LDLであり、 G11〜G13は very small LDLである 。 HDLに相当するコンポーネントピークのなかで、 G14及び G15は very large HDLであ り、 G16は large HDLであり、 G17は medium HDLであり、 G18は small HDLであり、 G19 及び G20は very small HDLである。
[0055] ステップ 2における波形処理手段は、ステップ 1で入力したクロマトグラム或いは数 値データを 20個のコンポーネントピークに分離して、 G1〜G20を含むガウス近似波 形を算出する処理を演算装置 10に実行させる手段である。ここで、 20個のコンポ一 ネントピークは、リポタンパク質のサイズにより分類される。
[0056] 20個のコンポーネントピークの各ピーク位置は、以下のように定義される。 G1〜G2 0からなる 20個のピークにっ 、て、先ず基準となるピーク（アンカーピークと称する）の ピーク位置 (溶出時間）が決められ、次に、コンポーネントピークのうちアンカーピーク を除くピーク（extra essential peaksと称する）のピーク位置が決められる。具体的に、 一例として、 G5、 G6、 G7、 G9、 G10、 G15、 G17及び G18をアンカーピークとし、 G1〜G 4、 G8、 G11〜G14、 G16、 G19及び G20を extra essential peaksとする。 G5、 G6、 G7、 G 9、 G10、 G15、 G17及び G18をアンカーピークとして定義する際の根拠となるデータの 例を図 3に示す。
[0057] 健常中年男性（30〜40歳代）の集団における VLDLサイズ、 LDLサイズ、 HDLサイ ズはある範囲の幅に分布することから、アンカーピークのうち G6、 G9及び G17の溶出 位置を決定する（図 3(a)参照)。より具体的には、複数の健常中年男性 (30〜40歳代 )について、採取した血清試料を用いて図 2に示したような TCに関するクロマトグラム 及び TGに関するクロマトグラムを取得する。取得したクロマトグラムには、大分類とし ての VLDL、 LDL及び HDLに相当するピークがこの順に出現している。複数の健常中 年男性について取得したクロマトグラムにおける、 VLDL、 LDL及び HDLに相当する ピーク位置の平均値を算出し、平均 VLDLサイズ、平均 LDLサイズ及び平均 HDLサイ ズをそれぞれ G6、 G9及び G17の溶出位置 (粒子サイズ)として定義する。
[0058] また、リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例では、 TGリッチリポ タンパクのトリグリセリドが分解されず、 VLDLは大サイズのまま血中に留まっている。 従ってリポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低くい症例の集団は VLDLの サイズは健常男性より有意に大きぐ所定のサイズの範囲内に分布している。この VL DLの平均溶出位置を、アンカーピークのうち G5の溶出位置として定義する（図 3(b) 参照)。
[0059] さらに、血中に存在するコレステロールエステル転送蛋白の働きによって、 VLDL力 ら LDLへトリグリセリドが渡され、その代わりにコレステロールエステル力 LDLから VLD Lに渡される。 LDLはトリグリセリドリツチな粒子となり、 性リパーゼによって LDL内の トリグリセリドが分解され、 LDLは小型化する。この小型化された LDLのサイズはリポタ ンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例の集団では、健常男性の LDLサ ィズより有意に小さく、あるサイズの範囲内に分布している。従って、この LDLの平均 溶出位置を、アンカーピークのうち G10の溶出位置として定義する（図 3(b)参照)。
[0060] さらにまた、リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例では、 LDLや VLDLから HDLにトリグリセリドが渡され、その代わりに HDLからコレステロールエステ ルが LDLや VLDLに渡される。その結果、 HDLはトリグリセリドリツチとなり、 HDL内のト リグリセリドは肝性リパーゼによって分解され HDLは小型化する。したがって、リポタン ノ クリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例の集団では、 HDLのサイズは健常 男性の HDLより有意にサイズ小さぐそのサイズもある範囲内に分布している。したが つて、この HDLの平均溶出位置を、アンカーピークのうち G18の溶出位置として定義 する（図 3(b)参照)。
[0061] さらにまた、コレステロールエステル転送蛋白欠損症では HDLから LDLや VLDLに コレステロールエステルを渡し、その代わりに LDLや VLDLからトリグリセリドを受け取 れないため、 HDLはコレステロールエステルリッチになってそのサイズは大型化する。 特にコレステロールエステル転送蛋白完全欠損症では HDL中にはトリグリセリドがほ とんど存在しない。コレステロールエステル転送蛋白の完全欠損症の HDLサイズは、 健常男性より有意に大型化し、あるサイズの範囲内に分布している。したがって、この HDLの平均溶出位置を、アンカーピークのうち G15の溶出位置として定義する（図 3(d )参照)。
[0062] さらにまた、 ApoE2/2の type III hyperlipidemia症例においては、アポ Eの 158番目の Argが Cysへ置換する事により、アポ Eをリガンドとする LDL受容体（アポ B/E)、 LDL受 容体関連蛋白質、 VLDL-受容体との結合領域のコンフォーメーション変異して、小 V LDL (レムナント)の取り込みが低下し、血中に小 VLDLに相当する成分が増加し、特 異的なピークが観察される。従って、この症例群における VLDLの平均溶出位置を、 アンカーピークのうち G7の溶出位置として定義する（図 3(c)参照)。
[0063] 図 3に示したデータは、 TSKgel LipopropalXLカラム (東ソ一 (株)製）を使用して得ら れたデータである力 アンカーピークとして定義する際の根拠となるデータとしては、 他のカラムを使用して得られるデータを使用しても良 、。
[0064] 例えば、図 4に示すように、 Superose 6HR 10/30カラム（アマシャムフアルマシア社 製)を用いて同様にデータを得ることができ、このデータに基づいてアンカーピークを 定義することもできる。この場合、健常中年男性（30〜40歳代)プロファイルカゝら G9 及び G17の溶出位置を定義できる（図 4(a))。リポタンパクリパーゼ活性が無いかまた は非常に低い症例のプロファイル力 G10及び G18の溶出位置を定義できる（図 4(b) ；)。 ApoE2/2の type III hyperlipidemia症例のプロファイルから G7の溶出位置を定義で きる（図 4(c))。コレステロールエステル転送蛋白の完全欠損症のプロファイルから G1 5の溶出位置を定義できる（図 4(d))。
[0065] 以上のようにして、 G5、 G6、 G7、 G9、 G10、 G15、 G17及び G18をアンカーピークとし て、それぞれの溶出位置を定義する。
[0066] 次に、 extra essential peaksについては、数学的にピークの位置と幅が決まるもので ある。 extra essential peaksは、コンポーネントピークのサイズとその分布を固定した（ 時間と幅固定)ガウス近似によるコンポーネントピークの解析をするために必要なピ ークである。 extra essential peaksに相当するリポタンパク質のサブクラスの分布幅は 、 LDLと HDLではほぼ同じと仮定し、アンカーピークの間をほぼ等間隔に埋めるもと する。 G10と G15の間には 4個の extra essential peaks (Gll〜14)を設定し、 G7と G9の 間には 1個の extra essential peak(G8)を設定し、 G15と G17の間には 1個の extra essen tial peak (G16)を設定し、 G 18の後に 2個の extra essential peaks(G19及び G20)を設 定する。なお、 HDLに属する extra essential peaks (G16〜20)の位置は、別の HDL専 用カラムによる分析で、健常者集団のピーク観測頻度と再クロマトによる実験値との 対応を参考に定義することができる。
[0067] またコンポーネントピークの G8〜G20については、ほぼその位置は等間隔で幅も同 等となるように決めた。さらにコンポーネントピークの G2、 G3及び G4は Voidの G1とァ ンカーピークの G5の間におけるガウス近似をするために必要なピークで、ピーク間隔 と幅の規則力 決めた。
[0068] さらに、コンポーネントピークの幅の最小値は、その分析系で得られる FG (分子量 9 2のサイズが単一の粒子)幅、最大値は隣り合うピーク間隔の 2倍と定義することがで きる。
[0069] 20個のコンポーネントピークに対して、ピーク幅は、 SD (分) =ピークの半値幅（秒）
÷ 143 * 60で表される数値で設定することができる。具体的に 20個のコンポーネント ピークのピーク幅としては、 G01について 0.33 min、 G02について 0.40 min、 G03につ いて 0.55 min、 G04について 0.55 min、 G05について 0.55 min、 G06について 0.50 min 、 G07【こつ!ヽて 0.40 min、 G08【こつ!ヽて 0.38 min、 G09【こつ!ヽて 0.38 min、 G10【こつ!ヽ て 0.38 min、 Gil【こつ!/、て 0.38 min、 G12【こつ!/、て 0.38 min、 G13【こつ!/、て 0.33 min、 G14について 0.33 min、 G15について 0.33 min、 G16について 0.38 min、 G17について 0.38 min、 G18について 0.38 min、 G19について 0.38 min、 G20について 0.48minを入 力或いは予め設定する。
[0070] ステップ 2における波形処理手段は、例えば、ガウス波形処理計算アルゴリズムを 適用して実行することができる。ガウス波形処理計算アルゴリズムによれば、以下のよ うにして 20個のコンポーネントピークに分離することができる。 [0071] すなわち、先ず、クロマトグラム上の単一ピークの形を symmetric gaussian distributi onであると仮定すると、時刻 tにおけるピークの高さ h(t)は、ピークの位置 T、幅 (標準 偏差） σをもちいて
h(t)=HXexp(-(t-T)2/2a2)
と書ける（Hはピークの高さの最大値)。なお、ピーク形は他に、 (l)Peason VII, (2)Lore ntzian, (3)exponentially modified Gaussian, (4)Weibull, (5)bi-uaussian, (6)poisson,、 7)Gram- Charlier, combination of Gauss and Cauchy functions, (9)combination of statistical moments, (10)cam— driven analog peakなど力 S知られており、これら (1)〜(8) の!ヽずれかの形であると仮定することも可能である。
[0072] そして、 n番目のピークの高さ hn(t)は、 n番目のピークの位置 Tn、幅（標準偏差） σ η をもちいて
hn(t)= Hn X exp(— (t— Τη)2/2 σ n2) · · ·Ι
と書ける（Hnは η番目のピーク最大値 (高さ） )。
[0073] ここで、 exp(- (t- Τη)2/2 σ n2)=Gn(t)とおくと I式は
hn(t)= HnXGn(t) "·Π
と書ける。
[0074] Ν個のピークはそれぞれ独立であると仮定すると、時刻 tにおける合成波形 A(t)は、 A(t)=hl(t) + h2(t)+- · · ·+ hn-l(t) + hn(t)
= HlXGl(t) + H2XG2(t) + · ···+ Hn- 1 XGn- l(t) + HnXGn(t)
となる。
[0075] データポイント数を mとすると、 III式は下のように m個かける。
[0076] A(tl)= HI X Gl(tl)+ H2 X G2(tl) + · ···+ Hn- 1 XGn- l(tl) + HnXGn(tl)
A(t2)= HI X Gl(t2)+ H2 X G2(t2) + ····+ Hn— 1 X Gn- l(t2) + HnX Gn(t2)
A(tm)= HI X Gl(tm) + H2 X G2(tm) + + Hn- 1 X Gn-l(tm) + HnX Gn(tm) 時刻 tにおける実際のクロマトグラム波形を R(t)とすると、 R(t)=A(t)となるようなピーク 数 ピークの位置 T、幅（標準偏差） σを求めるのが、 curve fitting methodである。実 際には、非線形最小二乗法により、すべての時刻で R(t)=A(t)とはならないから、（R(t )-A(t))2の和が最小となるパラメータを求める。
[0077] なお、 curve fitting method以外でも、 ί列えば、 iterative method (Fletcher Powell, M arquardt, Newton- Raphson, Simplex minimization, Box-Complex methodなど)を適用 することもできる。但し、 curve fitting method以外の手法においては、 initial valueが 計算結果に影響を及ぼすこと、波形（Gaussianなのか Lorentzianなの力）をあらかじめ 仮定しなければならないこと、ピーク数が大きいと (4個以上)収束が難しいこと、など が欠点とされている。したがって、いかに真の値に近い初期値を求めるかがポイントと なり、これらの欠点をクリアするためのピーク分離法として、（l)factor analysis, (2)mom ents analysis, (3)orthogonal polynominal analysis, inverse diffusion models:ど;^最 近報告され、これらを本アルゴリズムに適用することもできる。
[0078] ここで ti (i=l,2, · · · ,m)は定数であるため、任意の Gn(ti)も定数となる。すると上記 ΠΙ 式は、
A(tl)= Hl X Gl(tl)+ H2 X G2(tl) + · · · ·+ H19 X Gn- l(tl) + H20 X G20(tl)
A(t2)= HI X Gl(t2)+ H2 X G2(t2) + · · · ·+ H19 X Gn- l(t2) + H20 X G20(t2)
A(tm)= HI X Gl(tm) + H2 X G2(tm) + · · · ·+ H19 X G19(tm) + H20 X G20(tm) のように m個できる。 R(t)=A(t)とすると、未知数が Hl、 H2、 · · · ·、 H19、 H20の 20個で 構成される一次式が m個できることとなる。仮に、 m=20なら解は一次連立方程式を解 くことにより、解は求まる。
[0079] 実際のデータにおいてはデータポイント数が 20ではな!/ヽが、本アルゴリズムにおい ては、高速処理するために計算しやすい 20ポイント (例えば、 20個のサブクラムにお けるピークの位置 20力所)を便宜的に選んで計算する。なお、本アルゴリズムにおい ては、データポイント数を 20ケ所に選択せずに、最小二乗法で求めることも可能であ る。
[0080] 以上で説明したステップ 1及びステップ 2からなるフローチャートによれば、システム コントローラー 9から出力されたクロマトグラム (例えば図 2に示すクロマトグラム）を、 2 0個のサブクラスに対応するピークからなる近似波形を算出することができる。
[0081] 本発明に係る分析方法では、次に、以上の分析プログラムによって得られた近似波 形に基づいて、低比重リポタンパク質に相当するピークの中で、小粒子径低比重リポ タンパク質に含まれるコレステロール量の合計を算出する。ここで小粒子径低比重リ ポタンパク質とは、低比重リポタンパク質の中で比較的に小粒子径である低比重リポ タンパク質を意味する。より具体的に小粒子径低比重リポタンパク質とは、低比重リポ タンパク質の平均粒子径以下のサブクラスを意味する。上述した例においては、低比 重リポタンパク質に相当するピークは G08〜G13のピークであり、低比重リポタンパク 質の平均粒子径としては 25.5nmとすることができる。すなわち、上述した例において 、小粒子径低比重リポタンパク質とは、 G10〜G13のピークに相当する。また、小粒子 径低比重リポタンパク質としては、 G11〜G13のピークとして定義してもよい。
[0082] ここで、各サブクラスに含まれるコレステロール量の合計は、上述したように算出さ れた近似波形の数値データを入力値とする積分回路を有する演算処理手段によつ て算出することができる。
[0083] 本発明に係る分析方法では、次に、上記工程で算出したコレステロール量の合計 を基準値と比較する。ここで、基準値としては、一例として、健常者群において測定さ れた低比重リポタンパク質に相当するピークの中で、低比重リポタンパク質の平均粒 子径以下のサブクラス（G10〜G13のピーク又は G11〜G13のピーク）に含まれるコレ ステロール量の合計の平均値とすることができる。一例としては、当該平均値として 2 Omg/dlを基準値とすることができる。このように算出した値を平均値とすることによつ て、健常者群と糖尿病患者群と間において低比重リポタンパク質の平均粒子径以下 のサブクラスに含まれる総コレステロール量を比較することができる。比較の結果、検 查対象の糖尿病患者に由来する被検試料において、低比重リポタンパク質の平均 粒子径以下のサブクラスに含まれる総コレステロール量が基準値以下であるか基準 値を超える値であるかを判別することができる。
[0084] 本発明に係る分析方法によって、糖尿病患者における大血管障害のリスクを判断 するための情報を取得することができる。すなわち、低比重リポタンパク質の平均粒 子径以下のサブクラスに含まれる総コレステロール量が基準値を超える値を示す糖 尿病患者に対しては、大血管障害を生じているか、大血管障害へ移行する可能性が 高 、ことを判断することができる。 [0085] ここで、大血管障害とは、 IMT (頸動脈内膜中膜複合体肥厚度)の増加と関連する 障害又は疾患として言 、換えることもできる。一般に IMTは頸動脈エコー検査により 測定される値で、従来、大血管障害のリスクを判定に使用されている。 IMTの増加と 関連する障害としては例えば、脳血管障害及び末梢神経障害を挙げることができ、 I MTの増加と関連する疾患としては例えば、虚血性心疾患及び及び冠動脈疾患を挙 げることができる。
実施例
[0086] 以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下 の実施例に限定されるものではない。
[0087] 〔実施例 1〕
本実施例では、糖尿病患者群として外来通院治療中の高脂血症合併糖尿病患者 45名（男性 26名、女性 19名、平均年齢 53. 2歳）から採取した血液サンプルを収集 した。また、健常者群として、人間ドック受診者 299名（男性 186名、女性 113名、平 均年齢 46. 3歳）カゝら採取した血液サンプルを収集した。
[0088] これら各群に対して、年齢、罹病期間及び BMI (body mass index)の臨床指標を調 查した。また、これら各群に対して、生化学検査として、空腹時血糖値 (FPG)及びグ リコヘモグロビン濃度 (HbAlc)を測定した。空腹時血糖値 (FPG)は、全自動ダルコ ース測定装置 GA-1160 (アークレイ株式会社)を用い、また、グリコヘモグロビン濃 度 (HbAlc)は、全自動グリコヘモグロビン測定装置 HA-8150 (アークレイ株式会社 )を用いて測定を行った。
[0089] また、図 1に示した分析装置を用いて、これら各群にリポタンパク質の分析を行い、 血中の総コレステロール量 (TC)、血中の総トリグリセリド量 (TG)、血中の高比重リポ タンパク質に含まれる総コレステロール量 (HDL— C)及び血中の低比重リポタンパ ク質に含まれる総コレステロール量 (LDL— C)を測定した。また、上述した分析プロ グラムによって、分析装置で得られたプロファイルを 20個のサブクラスに分画し、 G11 〜G13のコンポーネントピーク力も算出される「低比重リポタンパク質の平均粒子径以 下のサブクラス（小粒子径 LDL)に含まれる総コレステロール量 (chol)」を測定した。さ らに、図 1に示した分析装置で得られたプロファイルを用いて、低比重リポタンパク質 の溶出位置力も低比重リポタンパク質の平均粒子径を測定した。結果を表 1に示す。 なお、表 1において *は p< 0.001であり、 * *は p< 0.01である。
[表 1]
Figure imgf000021_0001
[0090] 表 1に示した結果から、糖尿病患者群においては、小粒子径 LDLに含まれるコレス テロール量の合計が健常者群と比較して有意に大であることが明らかとなった。そこ で、糖尿病患者群を、小粒子径 LDLに含まれるコレステロール量の合計が 20mg/dl 以上である群と当該合計が 20mg/dl未満である群とに分け、各群における IMTの最大 値の平均値を算出し比較した。
[0091] IMTは、超音波診断装置 Logiq7 (横河 GEメディカル社)により、機器使用マ-ユア ルに従って測定を行った。
[0092] 結果を表 2に示す。表 2において *は p〈0.001であり、 * *は p< 0.01である。
[表 2]
Figure imgf000021_0002
表 2に示した結果から、小粒子径 LDLに含まれるコレステロール量の合計が 20mg/ dl以上である群にぉ 、ては、当該合計が 20mg/dl未満である群と比較して IMTの最大 値が有意に大であった。 また、表 1に示した結果から、糖尿病患者群においては、低比重リポタンパク質の 平均粒子径が健常者群と比較して有意に小であることが明らかとなった。そこで、糖 尿病患者群を、低比重リポタンパク質の平均粒子径が 25nm以上の群と当該平均粒 子径が 25nm未満である群とに分け、各群における IMTの最大値の平均値を算出し 比較した。結果を表 3に示す。表 3において *は p< 0.001であり、 * *は p< 0.05で ある。
[表 3]
Figure imgf000022_0002
[0095] 表 3に示した結果から、低比重リポタンパク質の平均粒子径が 25nm未満である群 においては、当該平均粒子径が 25nm以上である群と比較して IMTの最大値が有意 に大であった。
[0096] また、糖尿病患者群を IMTの最大値が 1. Omm未満である群と当該最大値が 1. 0 mm以上である群とに分け、各群における小粒子径 LDLに含まれるコレステロール 量の合計及び低比重リポタンパク質の平均粒子径を比較した。その結果を表 4に示 す。表 4において *は p< 0.01であり、 * *は p< 0.05である。
[表 4]
Figure imgf000022_0001
[0097] 表 4に示した結果から、 IMTの最大値が 1. Omm以上である糖尿病患者群におい ては、当該最大値が 1. Omm未満である糖尿病患者群と比較して、小粒子径 LDLに 含まれるコレステロール量の合計が有意に大であり、低比重リポタンパク質の平均粒 子径が有意に小であることが明らかとなった。以上の結果から、検査対象の糖尿病患 者について、上述した分析プログラムによって 20個のサブクラスに分画した近似波形 を算出し、低比重リポタンパク質の平均粒子径以下のサブクラスに含まれるコレステ ロール量の合計値力 IMTの最大値に相関していることが明ら力となった。したがつ て、本実施例により、従来において IMTの最大値により判断されていた大血管障害 のリスクを、低比重リポタンパク質の平均粒子径以下のサブクラスに含まれるコレステ ロール量の合計によって判断できるといった新規知見を得ることができた。
[0098] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] 被検試料に含まれる小粒子径低比重リポタンパク質の分析により大血管障害を判 別するためのリポタンパク質の分析方法。
[2] 上記被検試料は糖尿病患者力 採取されたものであることを特徴とする請求項 1記 載の分析方法。
[3] 上記小粒子径低比重リポタンパク質の分析は、
上記被検試料に含まれるリポタンパク質を液体クロマトグラフィーで分離し、分離し たリポタンパク質に含まれる成分に由来する信号を検出する工程と、
少なくとも低比重リポタンパク質が粒子径により規定される複数のサブクラスにより 構成されていると仮定し、上記検出した信号を用いて、各サブクラスに対応するピー タカ なる近似波形を算出する工程と、
得られた近似波形に基づいて、低比重リポタンパク質に相当するピークの中で、小 粒子径低比重リポタンパク質に含まれる上記成分の合計量を算出する工程と、 算出した合計量を基準値と比較する工程と、
を含むことを特徴とする請求項 1記載の分析方法。
[4] 上記小粒子径低比重リポタンパク質は、上記信号力 算出される低比重リポタンパ ク質の平均粒子径以下のサブクラスであることを特徴とする請求項 3記載の分析方法
[5] 上記リポタンパク質の平均粒子径が 25.5應であることを特徴とする請求項 4記載の 分析方法。
[6] 上記低比重リポタンパク質は、上記近似波形において溶出位置が 28.0-28.61nmで あるピーク、溶出位置力 ¾5.4-25.64nmであるピーク、溶出位置が 22.9-23. lnmである ピーク、溶出位置が 20.6-20.8nmであるピーク、溶出位置が 18.5_18.7nmであるピーク 及び溶出位置が 16.6-16.8應であるピーク力もなるものと仮定することを特徴とする請 求項 3記載の分析方法。
[7] 上記小粒子径低比重リポタンパク質は、上記近似波形において溶出位置が 22.9-2 3. lnmであるピーク、溶出位置が 20.6-20.8nmであるピーク、溶出位置が 18.5_18.7nm であるピーク及び溶出位置が 16.6-16.8nmであるピークに相当するサブクラスである ことを特徴とする請求項 6記載の分析方法。
[8] 上記小粒子径低比重リポタンパク質は、上記近似波形において溶出位置が 20.6-2 0.8nmであるピーク、溶出位置が 18.5-18.7nmであるピーク及び溶出位置が 16.6-16.8 應であるピークに相当するサブクラスであることを特徴とする請求項 6記載の分析方 法。
[9] 上記リポタンパク質に含まれる成分は、コレステロール及び/又はトリグリセリドである ことを特徴とする請求項 3記載の分析方法。
[10] 上記近似波形は、溶出位置が 90應より大であるピーク、溶出位置が 75應であるピ ーク、溶出位置が 64nmであるピーク、溶出位置が 53.6nmであるピーク、溶出位置が 4 4.5nmであるピーク、溶出位置が 36.56_36.8mであるピーク、溶出位置が 31.3_32.17n mであるピーク、溶出位置が 28.0-28.61nmであるピーク、溶出位置が 25.4_25.64nmで あるピーク、溶出位置が 22.9-23. lnmであるピーク、溶出位置が 20.6_20.8nmであるピ ーク、溶出位置が 18.5-18.7nmであるピーク、溶出位置が 16.6_16.8nmであるピーク、 溶出位置が 14.9-15. lnmであるピーク、溶出位置が 13.4_13.6nmであるピーク、溶出 位置が 12.0-12.2nmであるピーク、溶出位置が 10.8-1 l.Onmであるピーク、溶出位置 力 S9.7-9.9nmであるピーク、溶出位置が 8.7-8.9nmであるピーク及び溶出位置が 7.46- 7.6應であるピーク力 なることを特徴とする請求項 3記載の分析方法。
[11] 上記基準値は、健常者群において測定された低比重リポタンパク質に相当するピ ークの中で、小粒子径低比重リポタンパク質に含まれる上記成分の合計の平均値で あることを特徴とする請求項 3記載の分析方法。
[12] 上記リポタンパク質に含まれる成分は、コレステロールであり、かつ、上記基準値は 20mg/dlであることを特徴とする請求項 3記載の分析方法。
[13] 上記大血管障害は、頸動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加と関連する障害又は疾 患であることを特徴とする請求項 1記載の分析方法。
[14] 上記障害は脳血管障害及び/又は末梢神経障害であり、上記疾患は虚血性心疾 患及び/又は冠動脈疾患であることを特徴とする請求項 13記載の分析方法。
[15] 被検試料に含まれる複数クラスのリポタンパク質を分離する液体クロマトグラフィーと 上記液体クロマトグラフィーで分離したリポタンパク質に含まれる成分に由来する信 号を検出する検出手段と、
少なくとも低比重リポタンパク質が粒子径により規定される複数のサブクラスにより 構成されていると仮定し、上記検出した信号を用いて、各サブクラスに対応するピー クからなる近似波形を算出する近似波形算出手段と、
得られた近似波形に基づいて、低比重リポタンパク質に相当するピークの中で、小 粒子径低比重リポタンパク質に含まれる成分の合計量を算出する合計量算出手段と 算出した合計値を基準値と比較する比較処理手段とを含む、
糖尿病患者における大血管障害を判別するためのリポタンパク質の分析装置。
[16] 上記合計量算出手段は、上記信号力も算出される低比重リポタンパク質の平均粒 子径以下のサブクラスを上記小粒子径低比重リポタンパク質として上記合計量を算 出することを特徴とする請求項 15記載の分析装置。
[17] 上記合計量算出手段は、上記リポタンパク質の平均粒子径を 25.5應とすることを特 徴とする請求項 16記載の分析装置。
[18] 上記近似波形算出手段は、上記低比重リポタンパク質を、溶出位置が 28.0-28.61n mであるピーク、溶出位置が 25.4-25.64nmであるピーク、溶出位置が 22.9-23. lnmで あるピーク、溶出位置が 20.6-20.8nmであるピーク、溶出位置が 18.5_18.7nmであるピ ーク及び溶出位置が 16.6-16.8應であるピーク力もなるものと仮定した近似波形を算 出することを特徴とする請求項 15記載の分析装置。
[19] 上記合計量算出手段は、小粒子径低比重リポタンパク質を、上記近似波形におい て溶出位置が 22.9-23. lnmであるピーク、溶出位置が 20.6_20.8nmであるピーク、溶 出位置が 18.5-18.7nmであるピーク及び溶出位置が 16.6-16.8nmであるピークに相当 するサブクラスであると規定して上記合計量を算出することを特徴とする請求項 18記 載の分析装置。
[20] 上記合計量算出手段は、小粒子径低比重リポタンパク質を、上記近似波形におい て溶出位置が 20.6-20.8nmであるピーク、溶出位置が 18.5-18.7nmであるピーク及び 溶出位置が 16.6-16.8應であるピークに相当するサブクラスであると規定して上記合 計量を算出することを特徴とする請求項 18記載の分析装置。
[21] 上記検出手段は、上記リポタンパク質に含まれるコレステロールを定量するコレステ ロール反応部と、上記リポタンパク質に含まれるトリグリセリドを定量するトリグリセリド 反応部とを備えることを特徴とする請求項 15記載の分析装置。
[22] 上記近似波形算出手段は、上記リポタンパク質を、溶出位置が 90應より大であるピ ーク、溶出位置が 75nmであるピーク、溶出位置が 64nmであるピーク、溶出位置が 53. 6nmであるピーク、溶出位置力 S44.5nmであるピーク、溶出位置力 ¾6.56-36.8nmである ピーク、溶出位置が 31.3-32.17nmであるピーク、溶出位置力 ¾8.0-28.61nmであるピ ーク、溶出位置力 ¾5.4-25.64nmであるピーク、溶出位置が 22.9-23. lnmであるピーク 、溶出位置が 20.6-20.8nmであるピーク、溶出位置が 18.5_18.7nmであるピーク、溶出 位置が 16.6-16.8nmであるピーク、溶出位置が 14.9-15. lnmであるピーク、溶出位置 が 13.4-13.6nmであるピーク、溶出位置が 12.0_12.2nmであるピーク、溶出位置が 10. 8-11.0nmであるピーク、溶出位置が 9.7-9.9nmであるピーク、溶出位置が 8.7-8.9nm であるピーク及び溶出位置が 7.46-7.6nmであるピーク力 なるものと仮定した近似波 形を算出することを特徴とする請求項 15記載の分析装置。
[23] 上記比較処理手段は、健常者群において測定された低比重リポタンパク質に相当 するピークの中で、小粒子径低比重リポタンパク質に含まれる上記成分の合計の平 均値を上記基準値とすることを特徴とする請求項 15記載の分析装置。
[24] 上記リポタンパク質に含まれる成分は、コレステロールであり、かつ、上記比較処理 手段は、 20mg/dlを上記基準値とすることを特徴とする請求項 15記載の分析装置。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020051928A (ja) * 2018-09-27 2020-04-02 国立大学法人九州大学 糖尿病に関する情報を取得する方法及びその利用
WO2021038892A1 (ja) 2019-08-26 2021-03-04 株式会社フェニックスバイオ ヒト脂肪肝モデル細胞
WO2022181660A1 (ja) 2021-02-26 2022-09-01 株式会社フェニックスバイオ スクリーニング方法に使用するためのヒト脂肪肝モデル細胞

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002139501A (ja) * 2000-10-30 2002-05-17 Mass Medical Kk リポ蛋白サブクラスの分析ならびに診断方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002139501A (ja) * 2000-10-30 2002-05-17 Mass Medical Kk リポ蛋白サブクラスの分析ならびに診断方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KINOSHITA M.: "4. Small Dense LDL to Domyaku Koka", ANNUAL REVIEW NAIBUNPITSU, TAISHA, vol. 2004, 26 January 2004 (2004-01-26), pages 20 - 24, XP003012523 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020051928A (ja) * 2018-09-27 2020-04-02 国立大学法人九州大学 糖尿病に関する情報を取得する方法及びその利用
JP7251722B2 (ja) 2018-09-27 2023-04-04 国立大学法人九州大学 糖尿病に関する情報を取得する方法及びその利用
WO2021038892A1 (ja) 2019-08-26 2021-03-04 株式会社フェニックスバイオ ヒト脂肪肝モデル細胞
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