WO2022181660A1 - スクリーニング方法に使用するためのヒト脂肪肝モデル細胞 - Google Patents

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WO2022181660A1
WO2022181660A1 PCT/JP2022/007494 JP2022007494W WO2022181660A1 WO 2022181660 A1 WO2022181660 A1 WO 2022181660A1 JP 2022007494 W JP2022007494 W JP 2022007494W WO 2022181660 A1 WO2022181660 A1 WO 2022181660A1
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cells
vldl
medium
fatty liver
human
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PCT/JP2022/007494
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English (en)
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真生 高橋
雅和 加国
奈美 吉川
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株式会社フェニックスバイオ
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening

Definitions

  • the present invention provides a human fatty liver model for use in screening methods for substances having effects on dyslipidemia including fatty liver, using the increase or decrease in very low density lipoprotein (VLDL) in the culture supernatant as an index. Regarding cells.
  • VLDL very low density lipoprotein
  • Fatty liver is a general term for diseases in which lipids such as neutral fat accumulate excessively in hepatocytes, causing liver damage.
  • lipids such as neutral fat accumulate excessively in hepatocytes, causing liver damage.
  • accumulation of lipid droplets is observed in 1/3 or more of the hepatocytes that constitute the hepatic lobules.
  • the frequency of fatty liver tends to increase year by year due to changes in eating habits and lifestyle habits.
  • NASH non-alcoholic fatty liver disease
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • liver cancer liver cancer
  • a non-human animal model showing the symptoms of fatty liver has been created to study the onset mechanism of fatty liver and its prevention and treatment.
  • a non-human animal model showing symptoms of fatty liver is prepared by transplanting human hepatocytes into a liver-damaged, immunodeficient non-human animal.
  • symptoms of fatty liver such as large lipid droplets and liver steatosis are observed.
  • an in vitro evaluation system for human fatty liver that is, a human fatty liver model cell, is desired in order to efficiently study the onset mechanism of fatty liver and its prevention and treatment.
  • human hepatocytes derived from fatty liver in vitro, they found that the cells caused disappearance of lipid droplets and the like, and that the symptoms of fatty liver could not be maintained. More specifically, human hepatocytes in which symptoms of fatty liver such as accumulation of lipid droplets are observed are separated and recovered from the fatty liver excised from the non-human animal model exhibiting symptoms of fatty liver described above. was cultured in vitro, the cells caused loss of lipid droplets, etc., and found that the symptoms of fatty liver could not be maintained.
  • the present invention provides a screening method for a substance that can maintain the symptoms of fatty liver such as the accumulation of lipid droplets in human hepatocytes derived from fatty liver and has an effect on dyslipidemia such as fatty liver.
  • An object of the present invention is to provide new human fatty liver model cells that can be used for
  • the present inventors have made intensive studies and found that culturing fatty liver-derived human hepatocytes in a medium containing dimethylsulfoxide results in accumulation of lipid droplets, secretion and accumulation of lipids, The inventors have found that the expression of fatty liver-related genes and the like can be observed, and that human fatty liver model cells that maintain the symptoms of fatty liver can be obtained.
  • the culture supernatant of the human fatty liver model cell contains very low density lipoprotein (VLDL) and low density lipoprotein (LDL), and the VLDL is contained more than the LDL,
  • VLDL very low density lipoprotein
  • LDL low density lipoprotein
  • the present inventors have found that it is possible to screen for substances that are effective against dyslipidemia such as fatty liver by using the increase or decrease in the VLDL content in the culture supernatant as an index.
  • a human fatty liver model cell for use in a method of screening for substances having effects on dyslipidemia including fatty liver, using the increase or decrease in very low density lipoprotein (VLDL) in the culture supernatant as an index. and A cell, characterized in that the culture supernatant of said cell contains VLDL and low density lipoprotein (LDL), said VLDL being higher than said LDL.
  • VLDL very low density lipoprotein
  • LDL low density lipoprotein
  • [3] The cell of [1] or [2], wherein the VLDL comprises Large-VLDL, Medium-VLDL, and Small-VLDL, and the Large-VLDL accounts for 70% by mass or more of the total VLDL.
  • [4-2] The amount of lipoprotein (more preferably triglyceride) contained in the culture supernatant is in the culture supernatant of fatty liver-derived human hepatocytes cultured under the same conditions except that it does not contain dimethyl sulfoxide
  • the cell according to any one of [1] to [4], which is 5-fold or more, 6-fold or more, 7-fold or more, 8-fold or more, or 9-fold or more the amount of lipoproteins (more preferably triglycerides) contained therein.
  • [5] The cells of [4], [4-1] or [4-2], wherein the fatty liver-derived human hepatocytes are collected from a chimeric non-human animal having human hepatocytes.
  • a screening method for a substance having an effect on dyslipidemia comprising: A step of administering a test substance to the cells of any one of [1] to [5], and A method comprising comparing the amount of very low density lipoprotein (VLDL) in the culture supernatant between cells treated with a test substance and cells not treated.
  • VLDL very low density lipoprotein
  • human fatty liver model cells in which accumulation of lipid droplets, secretion/accumulation of lipids, expression of fatty liver-related genes, etc. are observed, and very low density lipoprotein (VLDL) in the culture supernatant Human fatty liver model cells can be provided for use in a method of screening for substances having effects on dyslipidemia including fatty liver, using the increase or decrease in the index.
  • VLDL very low density lipoprotein
  • FIG. 1 shows photographs of monolayer cell cultures of PXB-cells cultured for 5 days in medium B (DMSO(+)) or medium C (DMSO(-)).
  • PXB-cells left) cultured in medium B (DMSO(+)); PXB-cells (right) cultured in medium C (DMSO(-)).
  • Figure 2 shows the measurement results of the total neutral fat (triglyceride) content of lipoproteins in the culture supernatant of PXB-cells cultured for 5 days in medium B (DMSO (+)) or medium C (DMSO (-)). show. The results are shown as relative values with the content in the culture supernatant of PXB-cells cultured in medium B (DMSO(+)) being "100".
  • FIG. 1 shows photographs of monolayer cell cultures of PXB-cells cultured for 5 days in medium B (DMSO(+)) or medium C (DMSO(-)).
  • PXB-cells left) cultured in medium B (DMSO(
  • FIG. 3 shows PXB-cells cultured for 5 days, 9 days, 12 days, and 14 days in medium B (DMSO (+)), HepG2 cells, and total cholesterol of lipoproteins in the culture supernatant of HuH7 cells (left ) and total triglyceride (right) content.
  • Figure 4 shows PXB-cells cultured for 5 days, 9 days, 12 days, and 14 days in medium B (DMSO (+)), HepG2 cells, and lipoproteins in the culture supernatant of HuH7 cells (4 types of sub group) cholesterol (left) and neutral fat (triglyceride) (right) content analysis results.
  • FIG. 5 shows intracellular total cholesterol (left) and total cholesterol in PXB-cells, HepG2 cells, and HuH7 cells cultured in medium B (DMSO (+)) for 5 days, 9 days, 12 days, and 14 days. The results of measurement of sex fat (triglyceride) (right) content are shown.
  • FIG. 6 shows the measurement results of expression levels of fatty liver-related genes (FASN, SREBF1, G6PC) in PXB-cells cultured in medium B (DMSO(+)) for 3 days and 6 days. The results are shown as relative values with the expression level of each gene in PXB-cells cultured for 3 days in medium B (DMSO(+)) being "1".
  • FIG. 7 shows the results of analyzing the neutral fat (triglyceride) content in each subgroup of lipoproteins in the culture supernatant of PXB-cells cultured for 2 days in medium D containing 0.75 mM oleic acid (A), and VLDL of the culture supernatant was analyzed for the neutral fat (triglyceride) content of each size of Large, Medium, and Small (B).
  • A 0.75 mM oleic acid
  • B VLDL of the culture supernatant
  • Figure 9 shows the result of analysis of the neutral fat (triglyceride) content in each lipoprotein subgroup in the culture supernatant of PXB-cells cultured for 2 days in medium D containing 10 ⁇ M, 50 ⁇ M, and 100 ⁇ M fenofibrate (A), Also shown are the results (B) of analysis of the neutral fat (triglyceride) content of large, medium, and small sizes of VLDL in the culture supernatant.
  • the human fatty liver model cells of the present invention can be produced by a method for producing human fatty liver model cells comprising the step of culturing fatty liver-derived human hepatocytes in a medium containing dimethylsulfoxide. can.
  • the method for producing human fatty liver model cells of the present invention is described below.
  • Fatty liver-derived human hepatocytes refers to human hepatocytes collected from fatty liver tissue, or those that have been frozen and then thawed. can be used.
  • Fatty liver tissue is a fatty liver tissue derived from a human patient with fatty liver, a non-human animal model obtained by transplanting human liver cells into an immunodeficient non-human animal with liver disease (hereinafter referred to as "chimeric non-human animal”). described) can be used.
  • Human hepatocytes can be collected from fatty liver tissue by conventionally known methods, namely collagenase perfusion method, centrifugation, elutriator, FCM (flow cytometry), means such as monoclonal antibodies that specifically recognize human hepatocytes. can be done using
  • the “fatty liver-derived human hepatocytes” are preferably human hepatocytes recovered from chimeric non-human animals from the viewpoint of being able to be mass-produced and stably supplied.
  • Human hepatocytes recovered from chimeric non-human animals Human liver cells recovered from fatty liver tissue derived from chimeric non-human animals that can be used in the present invention can be prepared by the following method.
  • chimeric non-human animal means a non-human animal in which part or all of the hepatocytes in the liver are replaced with human hepatocytes.
  • Non-human animals are preferably mammals, more preferably rodents. Rodents include rodents such as mice and rats, guinea pigs, squirrels, and hamsters, and rats such as mice and rats, which are widely used as laboratory animals, are particularly preferred.
  • Chimeric non-human animals having human hepatocytes are obtained by transplanting human hepatocytes into liver-damaged and immunodeficient non-human animals according to conventionally known techniques (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2002-45087, WO2008/001614, WO2013/145331). can be obtained by
  • Hepatic-damaged and immunodeficient non-human animals refer to immunodeficient animals that do not show rejection against heterologous animal-derived cells and means an animal in which the cells of the cell are damaged. Since the non-human animal-derived liver cells are damaged, the transplanted human hepatocytes easily proliferate, and the transplanted human hepatocytes maintain liver function.
  • liver-damaged and immunodeficient non-human animal can be produced by subjecting the same individual to liver damage-inducing treatment and immunodeficiency-inducing treatment.
  • liver injury-inducing treatment include administration of liver injury-inducing substances (e.g., carbon tetrachloride, yellow phosphorus, D-galactosamine, 2-acetylaminofluorene, pyrrolodin alkaloids, etc.) and surgical treatment (e.g., liver injury). partial excision, etc.).
  • liver injury-inducing substances e.g., carbon tetrachloride, yellow phosphorus, D-galactosamine, 2-acetylaminofluorene, pyrrolodin alkaloids, etc.
  • surgical treatment e.g., liver injury). partial excision, etc.
  • immunodeficiency-inducing treatment include administration of an immunosuppressive agent and removal of the thymus.
  • a liver-damaged immunodeficient non-human animal can be produced by subjecting a genetically immunodeficient animal to liver damage-inducing treatment.
  • genetically immunodeficient animals include animals with severe combined immunodeficiency (SCID) showing T-cell lineage deficiency, animals with lost T-cell function due to genetic thymic deficiency, and animals with the RAG2 gene. Knockout animals and the like can be used.
  • SCID mice NUDE mice, RAG2 knockout mice, IL2Rgc/Rag2 knockout mice, NOD mice, NOG mice, nude mice, nude rats, X-ray irradiated nude rats obtained by transplanting bone marrow of SCID mice Immunodeficient rats (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2007-228962, Transplantation, 60(7):740-7, 1995) and the like can be used.
  • a liver-damaged, immunodeficient non-human animal can also be produced by subjecting an animal with genetic liver damage to an immunodeficiency-inducing treatment.
  • animals with genetic liver damage transgenic animals into which a liver damage-inducing protein gene linked under the control of an enhancer and/or promoter of a protein specifically expressed in hepatocytes has been introduced can be used.
  • Hepatocyte-specific protein includes serum albumin, cholinesterase, Hagemann factor, etc. Enhancers and/or promoters that regulate the expression of these genes can be used.
  • Hepatopathy-inducing proteins include urokinase plasminogen activator (uPA), tissue plasminogen activator (tPA), and the like.
  • liver injury is induced because a liver injury-inducing protein is expressed in a hepatocyte-specific manner under the enhancer and/or promoter of a protein specifically expressed in hepatocytes.
  • animals with genetic liver disorders can be produced by knocking out genes responsible for liver function. Examples of the "gene responsible for liver function" include fumarylacetoacetate hydrolase gene and the like.
  • a liver-damaged, immunodeficient non-human animal can be produced by mating a genetically immunodeficient animal with a genetically liver-damaged animal of the same species.
  • liver injury immunodeficient non-human animals gene targeting, CRISPR-Cas9, zinc finger nuclease (ZFN), TALE nuclease (TALEN) and other genome editing technology and genetic recombination technology
  • the above immunity Fertilized eggs and pluripotent stem cells derived from non-human animals, or non-human animals that are genetically immunodeficient and/or have genetic liver damage, as genetic factors that cause insufficiency and/or liver damage can be produced by introducing (Wang, H. et al., Cell, 153, 910-918, (2013) Yang, H.
  • the "liver-damaged immunodeficient non-human animal” may have a gene that defines the trait of immunodeficiency and a gene that defines the trait of liver damage, each of which is homozygous, or heterozygous. may have
  • the liver-damaged and immunodeficient non-human animals of the present invention are represented by genotypes such as uPA (+/-)/SCID (+/+) and uPA (+/+)/SCID (+/+). Liver-damaged immunodeficient mice can be preferably used.
  • the "human hepatocytes" to be transplanted into the liver-damaged immunodeficient non-human animal may be human-derived hepatocytes.
  • Human hepatocytes isolated according to conventional methods such as the collagenase perfusion method can be used.
  • the human liver tissue may be liver tissue derived from a healthy individual, or may be liver tissue derived from a patient suffering from a disease such as fatty liver or liver cancer, but is preferably liver tissue derived from a healthy individual. be.
  • the age of the human from which hepatocytes are to be isolated is not particularly limited, it is preferable to isolate from the liver tissue of children under the age of 14. By using hepatocytes from children under the age of 14, a high replacement rate with human hepatocytes can be achieved after transplantation.
  • the isolated hepatocytes can be frozen and stored once and then thawed before use.
  • human hepatocytes may be proliferative human hepatocytes that have the ability to actively proliferate in vivo.
  • proliferating human hepatocytes means human hepatocytes that form colonies as populations of a single cell type under culture conditions (in vitro) and proliferate to increase the colonies.
  • the expansion is sometimes referred to as "clonal expansion" in that the colony-constituting cells are of a single species.
  • such cells are cells whose cell number can be further increased by subculturing.
  • proliferative human hepatocytes examples include human small hepatocytes (Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-112092; Japanese Patent No. 3266766; US Patent No. 6,004,810; Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-179148: Japanese Patent No. 3211941, Japanese Unexamined Patent Publication No. 7-274951; Japanese Patent No. 3157984, Japanese Unexamined Patent Publication No. 9-313172; Japanese Patent No. 3014322).
  • the isolated human hepatocytes may be used as they are or after further purification. Purification of hepatocytes can be performed according to a conventional method, for example, using means such as centrifugation, elutriator, FCM, and a monoclonal antibody that specifically recognizes hepatocytes proliferating while forming colonies. can.
  • a monoclonal antibody that specifically recognizes hepatocytes proliferating while forming colonies.
  • Known monoclonal antibodies (WO2008/001614) that specifically recognize human hepatocytes and proliferating human hepatocytes can be used.
  • the human hepatocytes are human hepatocytes isolated from the liver tissue of a chimeric non-human animal having human hepatocytes according to a conventional method such as the collagenase perfusion method, or the human hepatocytes once frozen and then thawed.
  • human hepatocytes obtained by inducing pluripotent stem cells (e.g., embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), etc.), hepatic progenitor cells such as Clip cells, in vitro Proliferated human hepatocytes, cryopreserved hepatocytes, hepatocytes immortalized by introduction of a telomerase gene or the like, and mixtures of these hepatocytes and non-parenchymal cells can also be used.
  • pluripotent stem cells e.g., embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), etc.
  • hepatic progenitor cells such as Clip cells
  • in vitro Proliferated human hepatocytes in vitro Proliferated human hepatocytes
  • cryopreserved hepatocytes hepatocytes immortalized by introduction of a telomerase gene or the like
  • Transplantation of human hepatocytes into liver-damaged and immunodeficient non-human animals can be performed by transplanting into the liver of the non-human animal via the spleen. Alternatively, it can be implanted directly through the portal vein.
  • the number of human hepatocytes to be transplanted can be about 1 to 2 million, preferably about 200,000 to 1,000,000.
  • the sex of the liver-damaged immunodeficient non-human animal is not particularly limited.
  • the age of liver-damaged, immunodeficient non-human animals used for transplantation is not particularly limited, but if human hepatocytes are transplanted at a low age, the human hepatocytes can proliferate more actively as the animal grows. 0 to 40 days after birth, preferably about 8 to 40 days after birth can be used.
  • Animals after transplantation can be bred by conventional methods. For example, by rearing for about 40 to 200 days after transplantation, a chimeric non-human animal in which some or all of the hepatocytes in the non-human animal have been replaced with human hepatocytes can be obtained. In the liver of the chimeric non-human animal thus obtained, symptoms of fatty liver such as large lipid droplets and liver steatosis are observed (WO2008/001614).
  • Human hepatocytes can be collected from the chimeric non-human animal according to a conventional method such as the collagenase perfusion method.
  • the collection of human hepatocytes is preferably performed using a chimeric non-human animal in which human hepatocytes are contained at a high rate in the collected hepatocytes.
  • a chimeric non-human animal having one or more of the following characteristics It can be done using animals.
  • hepatocytes in the liver are human hepatocytes is replaced by (ii) a blood human albumin level of 0.1 mg/mL or more, preferably 0.5 mg/mL or more, more preferably 1 mg/mL or more, even more preferably 5 mg/mL or more, and even more preferably 10 mg/mL or more; be; (iii) 12 to 21 weeks, preferably 13 to 20 weeks, more preferably 14 to 19 weeks have passed since the transplantation of human hepatocytes.
  • the collected human hepatocytes may be used as they are, or human hepatocytes may be purified using a monoclonal antibody that specifically recognizes human hepatocytes or non-human animal hepatocytes.
  • a monoclonal antibody that specifically recognizes human hepatocytes or non-human animal hepatocytes.
  • the separated hepatocytes are reacted with a human hepatocyte-specific monoclonal antibody
  • the cells bound to the antibody are collected by FCM or a magnetic cell separation device, and the separated hepatocytes are treated as non-human animal hepatocytes.
  • human hepatocytes can be purified and collected by collecting cells that do not bind to the antibody using FCM or a magnetic cell separation device.
  • the collected human hepatocytes may be further collected in the same manner after being transplanted into a new liver-damaged, immunodeficient non-human animal as described above (passive transplantation). Passaging can be performed once or multiple times (eg, 2-4 times).
  • fatty liver-derived human hepatocytes can be cultured using a medium generally used for culturing animal cells.
  • a medium generally used for culturing animal cells.
  • a medium include, but are not limited to, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Williams Medium E, and the like.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Fetal bovine serum, insulin, epidermal growth factor, dexamethasone, buffers, antibiotics, pH adjusters, proline, ascorbic acid, nicotinamide and the like can be added to the medium as necessary.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMSO can be added to the medium in an amount (final concentration) of 1 to 4% by weight, preferably 1 to 2% by weight, for example 2% by weight.
  • Fatty liver-derived human hepatocytes are added to the medium at 0.21-21.3 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , preferably 1.07-3.2 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , for example 2.13. Seed at a volume of x105 cells/ cm2 . If the number of cells is less than 0.21, it may not be possible to obtain a sufficient amount of cells for human fatty liver model cells, while if the number of cells is more than 21.3 ⁇ 10 5 , cell growth will decrease and lipid content will decrease. Decrease in secretion and/or accumulation, etc. may occur.
  • Fatty liver-derived human hepatocytes may be cultured for a period of time sufficient for the cells to secrete and/or accumulate lipids, and are not particularly limited. 2-fold or more, 3-fold or more, 4-fold or more, or 5-fold or more, preferably 6-fold or more, more preferably 7-fold or more, more preferably 8-fold or more, than human hepatocytes derived from fatty liver cultured under conditions, Even more preferably, 9 times more lipid droplets can be formed for a sufficient period of time for cells to be encapsulated.
  • Such a culture period can be, for example, longer than 3 days, preferably 4 days or longer, and more preferably 5 days or longer.
  • the upper limit of the culture period is not particularly limited, it can be, for example, 17 days or less, preferably 13 days or less.
  • the medium can be replaced as appropriate during the culture period.
  • Human hepatocytes that secrete and/or accumulate lipids after the end of culture can be used as human fatty liver model cells.
  • the human fatty liver model cells of the present invention encapsulate many lipid droplets and secrete and / or accumulate a lot of lipids, similar to hepatocytes in human fatty liver. It is a human-derived cultured hepatocyte in which the expression of fatty liver-related genes and the like is observed and maintains the symptoms of fatty liver, more specifically, a monolayer hepatocyte culture.
  • the human fatty liver model cells of the present invention enclose many lipid droplets and have a high lipoprotein content and/or secretion amount.
  • "encapsulating many lipid droplets” means that in the culture of the above-mentioned fatty liver-derived human hepatocytes, cultured under the same conditions in the same medium except that DMSO was not added (e.g., more than 3 days 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, or 5 times or more, preferably 6 times or more, than fatty liver-derived human hepatocytes cultured for a long time, preferably 4 days or more, more preferably 5 days or more, It means that the human fatty liver model cells of the present invention encapsulate lipid droplets that are more preferably 7 times or more, still more preferably 8 times or more, still more preferably 9 times or more.
  • Lipoprotein is a complex particle for transporting lipids such as cholesterol and triglycerides from the site of absorption/synthesis to the site of use. It has a structure in which free cholesterol and apolipoprotein are arranged, and hydrophobic cholesterol and neutral lipid are arranged inside the particle.
  • High lipoprotein content and/or secretion amount means that in the culture of human hepatocytes derived from fatty liver described above, cultured under the same conditions in the same medium except that DMSO was not added (e.g., Longer than 3 days, preferably 4 days or more, more preferably 5 days or more cultured) human hepatocytes derived from fatty liver or lipoproteins (more preferably triglycerides) contained in the culture supernatant, 5 More than twice, preferably more than 6 times, more preferably more than 7 times, more preferably more than 8 times, even more preferably more than 9 times the amount of lipoprotein is the human fatty liver model cell of the present invention or its culture supernatant means contained within.
  • the amount of lipoproteins in cells or culture supernatant can be measured by a conventionally known technique as described below.
  • the human fatty liver model cell of the present invention can also be characterized by the lipoprotein subclass content in the culture supernatant.
  • Lipoproteins can be classified into several subclasses depending on their properties such as particle size, hydration density, and electrophoretic mobility.
  • lipoproteins are classified into chylomicrons (CM), ultra-low specific gravity Lipoprotein (Very Low Density Lipoprotein; VLDL), Low Density Lipoprotein (LDL), and High Density Lipoprotein (HDL) can be roughly classified into four.
  • VLDL has three further subclasses Large, Medium, and Small
  • LDL has four further subclasses Large, Medium, Small, and Very Small
  • HDL has five further subclasses Very Large, Large, Medium, Small, and Very Small.
  • Subclasses can be classified, each based on particle size.
  • CM has two further subclasses G01, G02
  • VLDL has five further subclasses G03, G04, G05, G06, G07
  • LDL has six further subclasses G08, G09, G10, G11, G12, G13.
  • HDL can be divided into seven further subclasses, G14, G15, G16, G17, G18, G19 and G20, each based on particle size.
  • Each subclass of lipoproteins in the culture supernatant was analyzed by a conventionally known method using gel filtration liquid chromatography (WO2007/052789; JP-A-9-15225; Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005; 25: 1-8 ; LipoSEARCH (registered trademark) (Skylight Biotech Co., Ltd.).
  • VLDL exhibits the highest content among lipoproteins.
  • VLDL shows a higher content than LDL, for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times 8-fold or more, 9-fold or more, 10-fold or more, or 15-fold or more amounts are included.
  • the content of VLDL cholesterol is higher than that of LDL cholesterol.
  • 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times or more, or 15 times or more contains an amount of
  • the content of VLDL is higher than that of HDL. Included are amounts of 30-fold or more, 40-fold or more, 50-fold or more, 60-fold or more, 70-fold or more, 80-fold or more, or 90-fold or more.
  • the content of VLDL cholesterol is higher than that of HDL cholesterol. More than twice, more than 25 times, more than 30 times, more than 40 times, more than 50 times, more than 60 times, more than 70 times, more than 80 times, or more than 90 times the amount of VLDL triglycerides Shows a higher content than neutral fat (triglyceride) of HDL, for example, 5 times or more, 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 25 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, Included are amounts of 60-fold or greater, 70-fold or greater, 80-fold or greater, or 90-fold or greater.
  • LDL shows a higher content than HDL, for example, 2.5 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times and greater, 7-fold or greater, 8-fold or greater, 9-fold or greater, or 10-fold or greater amounts are included.
  • the content of LDL cholesterol is higher than that of HDL cholesterol, for example, 2.5 times or more, 3 times or more, 4 times or more. , 5 times more, 6 times more, 7 times more, 8 times more, 9 times more, or 10 times more triglycerides in LDL than triglycerides in HDL showing a high content, e.g. be
  • Large-VLDL is contained in the highest ratio, and 70 masses of the entire VLDL % or more, preferably 75% by mass or more, more preferably 80% by mass or more, still more preferably 81% by mass or more, even more preferably 82% by mass or more (e.g., 83% by mass or more, 84% by mass or more). It is contained at a rate of 85% by mass or more.
  • VLDL neutral fat is large-VLDL, medium-VLDL, and small-VLDL neutral fat (triglycerides)
  • Large-VLDL neutral fat is contained in the highest proportion, 70% by mass or more, preferably 75% by mass or more, more preferably 75% by mass or more of the total amount of VLDL neutral fat (triglyceride) 80% by mass or more, more preferably 81% by mass or more, still more preferably 82% by mass or more (for example, 83% by mass or more, 84% by mass or more), and particularly preferably 85% by mass or more.
  • VLDL cholesterol is the sum of Large-VLDL, Medium-VLDL, and Small-VLDL cholesterols, of which Large-VLDL cholesterol is the highest. It is contained in a high proportion and is 70% by mass or more, preferably 75% by mass or more, more preferably 80% by mass or more, still more preferably 81% by mass or more, and even more preferably 82% by mass or more of the total amount of VLDL cholesterol (e.g. , 83% by mass or more, 84% by mass or more) is particularly preferably contained in a proportion of 85% by mass or more.
  • the human fatty liver model cell of the present invention can also be characterized by the expression level of the fatty liver-related gene in the cell.
  • fatty liver-related gene means a gene whose expression level is increased in hepatocytes of fatty liver compared to hepatocytes of healthy liver.
  • fatty liver-related genes include a gene encoding fatty acid synthase (gene name: FASN), a gene encoding SREBP-1 (gene name: SREBF1), and a gene encoding glucose-6-phosphatase (G6PC).
  • the gene encoding cholesterol 7 ⁇ -hydroxylase (CYP7A1) the gene encoding cholesteryl ester transfer protein (CETP), the gene encoding glucokinase (GCK), the gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (PCK1) etc.
  • the "high" expression level of the fatty liver-related gene is the above-mentioned fatty liver-derived human liver cultured in a DMSO-free medium or cultured in a DMSO-containing medium for 3 days or less It means that it is higher than the expression level of a fatty liver-related gene in cells, for example, 2-fold or more, preferably 3-fold or more, more preferably 3.5-fold or more.
  • the expression level of a fatty liver-related gene can be quantified by a conventionally known method, preferably by microarray analysis.
  • the human fatty liver model cells of the present invention are preferably cultured in a medium containing DMSO.
  • the human fatty liver model cells of the present invention show the highest content of VLDL among lipoproteins, compared to known hepatocytes (HepG2, HuH7, etc.), the model is more similar to human fatty liver hepatocytes. can be used as
  • the human fatty liver model cells of the present invention can be used as a model of human fatty liver, and can be used to detect changes in the very low density lipoprotein (VLDL) content in the culture supernatant. As an index, it can be used in a method of screening for substances that are effective against dyslipidemia including fatty liver.
  • VLDL very low density lipoprotein
  • Screening is carried out by administering a test substance to the culture of human fatty liver model cells of the present invention, and determining whether or not VLDL in the culture supernatant increases or decreases between the cells to which the test substance has been administered and the cells to which the test substance has not been administered, and/or Alternatively, it can be performed by comparing the degree of increase or decrease. More specifically, the screening involves administering a test substance to the culture of human fatty liver model cells of the present invention, and dividing VLDL in the culture supernatant between cells to which the test substance has been administered and cells to which it has not been administered. This can be done by comparing the presence or absence of an increase or decrease in the amount of sexual fat (triglyceride) or cholesterol and/or the degree of increase or decrease.
  • sexual fat triglyceride
  • the screening is performed by administering a test substance to the culture of the human fatty liver model cell of the present invention, and comparing Large-VLDL in the culture supernatant between the cells to which the test substance was administered and the cells to which the test substance was not administered. It can be performed by comparing the presence or absence of increase/decrease and/or the degree of increase/decrease. More specifically, the screening is performed by administering a test substance to the culture of human fatty liver model cells of the present invention, and detecting Large-VLDL in the culture supernatant between cells to which the test substance has been administered and cells to which it has not been administered.
  • Test substance-administered cells and non-administered cells may be the same culture before and after administration of the test substance, or separate cultures that are manipulated in the same manner except for the presence or absence of test substance administration. It may be a culture.
  • dyslipidemia includes fatty liver, dyslipidemia (hyperlipidemia), and diseases and symptoms caused by or at a high risk of being caused by them (e.g., arteriosclerosis, thrombosis, NASH, cirrhosis, liver cancer , myocardial infarction, stroke, etc.).
  • “substances having an effect on dyslipidemia” include substances that are effective for dyslipidemia, substances that adversely affect dyslipidemia, and the like.
  • a “substance effective against dyslipidemia” means a substance capable of reducing the amount of VLDL produced in human fatty liver cells. More specifically, the substance means a substance capable of reducing the amount of triglycerides or cholesterol in VLDL produced by human fatty liver cells. More preferably, the substance means a substance capable of reducing the amount of Large-VLDL secreted in human fatty liver cells. More specifically, the substance means a substance capable of lowering the amount of triglycerides or cholesterol in Large-VLDL produced by human fatty liver cells. These substances may contribute to treating or ameliorating dyslipidemia.
  • the amount of VLDL (especially, the amount of VLDL neutral fat (triglyceride) or cholesterol), preferably the amount of Large-VLDL (especially, When a decrease in neutral fat (triglyceride amount) or cholesterol amount) in Large-VLDL is confirmed, the test substance improves at least one symptom of dyslipidemia, especially fatty liver, and the present invention It can be determined to be a "substance effective against dyslipidemia".
  • Large-VLDL produces Small-LDL through metabolism (Ronald M Krauss, Diabetes Care.
  • the amount of VLDL (especially, the amount of VLDL neutral fat (triglyceride) or cholesterol), preferably the amount of Large-VLDL (especially, When a decrease in triglyceride (triglyceride) content or cholesterol content in Large-VLDL is confirmed, the test substance improves at least one symptom of dyslipidemia, particularly arteriosclerosis. It can be determined to be a "substance effective against dyslipidemia". Specific examples of substances that cause such a decrease in the amount of VLDL include fenofibrate, lomitapide, etc., which are known as active ingredients of antihyperlipidemia drugs.
  • the human fatty liver model cells of the present invention can be used for detection using the increase or decrease of VLDL in the cells as an index.
  • Substances that are effective against dyslipidemia diseases and symptoms can be determined to be effective not only in the treatment or improvement of the diseases and symptoms, but also in the prevention thereof.
  • a substance that adversely affects dyslipidemia means a substance that can exacerbate at least one symptom in human fatty liver cells.
  • the substance is the amount of VLDL produced by human fatty liver cells (especially the amount of neutral fat (triglyceride) or cholesterol in VLDL), preferably the amount of Large-VLDL (especially the amount of Large-VLDL It means a substance capable of increasing neutral fat (triglyceride content) or cholesterol content).
  • lipid abnormalities such as fatty liver and arteriosclerosis, VLDL content (especially VLDL neutral fat (triglyceride) content or cholesterol content), preferably Large-VLDL content (especially Large-VLDL neutral fat content) (triglyceride content) or cholesterol content).
  • the amount of VLDL (especially, the amount of VLDL neutral fat (triglyceride) or cholesterol), preferably the amount of Large-VLDL (especially, If an increase in the neutral fat (triglyceride) content or cholesterol content of Large-VLDL is confirmed, the test substance can exacerbate at least one symptom of dyslipidemia such as fatty liver or arteriosclerosis. , can be determined to be the "substance that adversely affects dyslipidemia" of the present invention. Specific examples of substances that cause such an increase in the amount of VLDL include oleic acid and the like. It can be detected using human fatty liver model cells.
  • Test substances include, but are not limited to, low-molecular-weight compounds, amino acids, nucleic acids, lipids, sugars, extracts of natural products, and the like.
  • PXB mice production of chimeric mice (PXB mice) having human hepatocytes)
  • PXB mice were produced according to a conventionally known method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-45087). Namely, the enhancer of albumin synthesized in the liver and the urokinase plauminogen activator (uPA) gene (cDNA-uPA) linked to the promoter were introduced into all cells, and immunodeficient mice (SCID) were introduced into all cells. mice) were mated to produce immunodeficient liver-damaged mice (cDNA-uPA(+/-)/SCID mice).
  • uPA urokinase plauminogen activator
  • a 3-week-old cDNA-uPA(+/-)/SCID mouse was anesthetized, the skin around the spleen and the rectus abdominis muscle were incised with scissors, and the tip of the spleen was pinched to fix it at a position where cells could be easily injected. Then, a glass syringe filled with a human hepatocyte suspension was used to inject the cells by pricking the tip of the spleen.
  • the spleen was put back into the body of the mouse, the skin and peritoneum were sewn up with a plastic surgical needle, the incision was closed, and the mouse to be transplanted was confirmed to have no abnormality in respiration, and was reared in a breeding cage.
  • PXB mice that are 17 to 22 weeks old, weigh 15 to 20 g, and have a serum human albumin level of 10 mg/mL or higher (human hepatocyte replacement rate of 95% or higher calculated from the human albumin level) were selected. , were used in the following experiments.
  • the dilution factor for the desired seeding density was calculated and diluted with medium A. Gently pour 500 ⁇ L of the diluted cell suspension into each well of the culture plate, allow to stand for about 20 minutes until the cells lightly adhere to the bottom, then gently transfer to an incubator (37° C., 5% CO 2 ) and culture. did.
  • DMSO-containing medium On the day after seeding, medium A was removed, 500 ⁇ L of medium B (DMSO(+)) was added, the cells were gently transferred to an incubator (37°C, 5% CO 2 ), and cultured. . On the 5th, 7th, 8th, and 12th days from the start of culture using medium B (DMSO(+)), the medium was replaced with new medium B (DMSO(+)). After 14 days of culture using medium B (DMSO(+)), the intracellular cholesterol and triglyceride levels were analyzed for lipoproteins in the cells as described below.
  • HepG2 cells, HuH7 cells Culture of Known Hepatocytes
  • Known hepatocytes were seeded in 500 ⁇ L of medium A, gently transferred to an incubator (37° C., 5% CO 2 ), and cultured for 7 days. After completion of the culture, analysis of lipoproteins in the culture supernatant described below and analysis of lipoproteins in the cells described below were performed.
  • the medium used for culture was removed, 500 ⁇ L of medium D for analysis was added, the cells were gently transferred to an incubator (37° C., 5% CO 2 ), and cultured for 2 days. After that, the culture supernatant was collected, and the lipoproteins contained in the culture supernatant (80 ⁇ L) were fractionated into four subgroups, CM, VLDL, LDL, and HDL fractions, by gel filtration HPLC. Cholesterol and triglycerides contained in each fraction were quantified by online enzymatic reaction. Concentration analysis was performed using a computer program unique to Skylight Biotech.
  • Diacolor Liquid TG-S (manufactured by Toyobo) was used, and standard serum for cholesterol and triglyceride concentrations in CM, VLDL, LDL, and HDL was manufactured by Kyowa Hakko Kirin Co. It was used.
  • Triglycerides in cells were measured using Cholestest (registered trademark) TG (Sekisui Medical Co., Ltd.) according to the manufacturer's instructions. That is, after the cells were washed with PBS, the water was completely drained (stored at -80°C until measurement), 200 ⁇ L of TG enzyme solution (1) was added to each cell well, and the mixture was incubated at 37°C for 10 minutes to react. (remove free glycerol). Next, detach the cells with a pipette, transfer to a centrifuge tube and centrifuge at 10,000 rpm for 10 minutes.
  • Cholestest registered trademark
  • TG Sekisui Medical Co., Ltd.
  • Cholesterol in cells was measured using Cholestest (registered trademark) CHO (Sekisui Medical Co., Ltd.) according to the manufacturer's instructions. That is, after the cells were washed with PBS, the water was completely drained (stored at -80°C until measurement), 200 ⁇ L of CHO enzyme solution (1) was added to each cell well, and the cells were incubated at 37°C for 10 minutes.
  • RNA from PXB-cells cultured in medium B for 3 days or 6 days was extracted using TRIzol (registered trademark) + Direct zol (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • microarray analysis was performed according to the manufacturer's instructions, and fatty liver-related genes FASN, SREBF1, The expression levels of G6PC, CYP7A1, CETP, GCK, and PCK1 were analyzed.
  • Perfusate and medium Perfusate A, perfusate B, perfusate C, medium A, medium B, medium C, and medium D had the following compositions.
  • FIG. 1 shows PXB-cells cultured for 5 days in medium B (DMSO(+)) or medium C (DMSO(-)).
  • medium B DMSO (+)
  • DMSO (+) DMSO (+)
  • DMSO (+) DMSO (+)
  • DMSO (-) medium C
  • lipid droplets shown in white
  • FIG. 2 shows lipoproteins (including CM, VLDL, LDL, and HDL) in the culture supernatant collected after 5 days of culture in medium B (DMSO (+)) or medium C (DMSO (-)). shows the measurement results of the total neutral fat (triglyceride) content of The results are shown as relative values with the content in the culture supernatant of PXB-cells cultured in medium B (DMSO(+)) being "100". PXB-cells cultured in medium B (DMSO(+)) secreted higher (approximately 9-fold) total triglycerides in lipoproteins than cultured in medium C (DMSO(-)) was accepted.
  • DMSO (+) DMSO (+)
  • DMSO (-) medium C
  • Fig. 3 shows PXB-cells cultured for 5, 9, 12, and 14 days in medium B (DMSO (+)), and The analysis results of lipoproteins in each culture supernatant of known hepatocytes (HepG2 cells, HuH7 cells) are shown.
  • FIG. 4 shows the results of analyzing four subgroups of lipoproteins contained in the culture supernatant.
  • PXB-cells cultured in medium B (DMSO(+)) were confirmed to contain the most VLDL in both cholesterol and triglycerides, regardless of the culture period.
  • DMSO (+) medium B (DMSO (+)) (containing CM, VLDL, LDL, HDL ratio (weight ratio)).
  • VLDL peak observed in PXB-cells was not observed in the culture supernatants of HepG2 cells and HuH7 cells, and was specifically secreted in PXB-cells cultured in medium B (DMSO (+)). It was confirmed that
  • Table 5 shows the results of analysis of the amount of neutral fat (triglyceride) in Large-VLDL, Medium-VLDL, and Small-VLDL with respect to VLDL contained in the culture supernatant.
  • PXB-cells were cultured in medium B (DMSO(+)) for 13 days and then cultured in medium D for 2 days; Fresh human hepatocytes (BIOPREDIC International) (FHH) isolated from a healthy subject (no history of disease) cultured for 2 days; and HepG2 cells cultured in medium A for 2 days and then in medium D for 2 days, and HuH7 cells; and the analysis results of each culture supernatant.
  • medium B DMSO(+)
  • FHH Fresh human hepatocytes isolated from a healthy subject (no history of disease) cultured for 2 days
  • HepG2 cells cultured in medium A for 2 days and then in medium D for 2 days, and HuH7 cells
  • the ratio of Large-VLDL to the total VLDL in the culture supernatant is 81.5% (40.9/50.2) for PXB-cells, 69.2% (78.6/113.5) for FHH, It was 0% in HepG2 cells and 1.9% in HuH7 cells.
  • PXB-cells cultured in medium B (DMSO(+)) showed a significantly high proportion of Large-VLDL content.
  • PXB-cells cultured for 5, 9, 12, and 14 days in medium B (DMSO (+)), and known liver The analysis results of lipoproteins in each cell (HepG2 cells, HuH7 cells) are shown.
  • Fatty liver-related gene expression level Fig. 6 shows the result of analyzing the expression level of fatty liver-related genes (FASN, SREBF1, G6PC) in PXB-cells cultured for 3 days and 6 days in medium B (DMSO (+)) indicates The results are shown as relative values where the expression level of each gene on day 3 of culture is set to "1". For all genes, an increase in expression level was observed from day 3 to day 6 of culture. Moreover, although not shown in FIG. 6, an increase in the expression level of CYP7A1, CETP, GCK, and PCK1 was similarly observed from day 3 to day 6 of culture.
  • PXB-cells cultured in medium B can maintain the accumulation and secretion of lipids, and are also accompanied by the expression of fatty liver-related genes. It was confirmed that it can be used as a model cell.
  • oleic acid which is known to promote lipid accumulation in hepatocytes
  • the PXB-cells medium prepared above was replaced with medium D containing 0.75 mM oleic acid, gently transferred to an incubator (37° C., 5% CO 2 ), and cultured for 2 days. After completion of the culture, the total cholesterol and total triglycerides in the culture supernatant and cells were analyzed by the methods described in "Analysis of lipoproteins in culture supernatant" and "Analysis of lipoproteins in cells” above. ) were measured respectively. For controls, medium D (5 ⁇ L) alone was added instead of oleic acid.
  • lomitapide (Tokyo Kasei Co., Ltd.), which is known as a hyperlipidemia drug, was used.
  • the PXB-cells medium prepared above was replaced with medium D containing 1 nM and 5 nM lomitapide, respectively, and gently transferred to an incubator (37° C., 5% CO 2 ) and cultured for 2 days.
  • cholesterol and triglycerides in the culture supernatant and cells were removed by the methods described in the above "Analysis of lipoproteins in culture supernatant" and "Analysis of lipoproteins in cells”. measured respectively.
  • ethanol 5 ⁇ L was added instead of lomitapide.
  • FIG. 8 shows the result of analyzing the neutral fat (triglyceride) content in each subgroup of lipoproteins in the culture supernatant of PXB-cells cultured for 2 days with the addition of lomitapide (A ), and the result (B) of analyzing the neutral fat (triglyceride) content of each size of Large, Medium, and Small for VLDL of the culture supernatant.
  • the PXB-cells medium prepared above was replaced with medium D containing 10 ⁇ M, 50 ⁇ M and 100 ⁇ M of fenofibrate, respectively, gently transferred to an incubator (37° C., 5% CO 2 ), and cultured for 2 days. After completion of the culture, cholesterol and triglycerides in the culture supernatant and cells were removed by the methods described in the above "Analysis of lipoproteins in culture supernatant" and "Analysis of lipoproteins in cells”. measured respectively. For controls, only ethanol (5 ⁇ L) was added instead of fenofibrate.
  • FIG. 9 shows the result of analyzing the neutral fat (triglyceride) content in each subgroup of lipoproteins in the culture supernatant of PXB-cells cultured for 2 days with the addition of fenofibrate.
  • A and the result (B) of analyzing the neutral fat (triglyceride) content of each size of Large, Medium, and Small for VLDL of the culture supernatant.
  • the amount of VLDL, especially Large-VLDL, in the culture supernatant (especially its neutral fat (triglyceride ) amount) as an indicator, it can be used to prevent, treat, or improve lipid abnormalities, including substances that adversely affect lipid abnormalities (oleic acid, etc.), lipid metabolism improving agents, and hyperlipidemia drugs. It was confirmed that effective substances (lomitapide, fenofibrate, etc.) can be screened.

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Abstract

本発明は、脂肪肝の肝組織の症状を呈し、脂肪肝をはじめとする脂質異常に効果を有する物質のスクリーニング方法に利用することが可能なヒト脂肪肝モデル細胞を提供することを目的とするものであり、培養上清中の超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の増減を指標にして、脂質異常に効果を有する物質のスクリーニング方法に使用するための、ヒト脂肪肝モデル細胞であって、該細胞の培養上清がＶＬＤＬ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を含有し、該ＶＬＤＬが該ＬＤＬよりも多く含むことを特徴とする、細胞を提供する。

Description

スクリーニング方法に使用するためのヒト脂肪肝モデル細胞
　本発明は、培養上清中の超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の増減を指標にして、脂肪肝をはじめとする脂質異常に効果を有する物質のスクリーニング方法に使用するための、ヒト脂肪肝モデル細胞に関する。
　脂肪肝は、肝細胞内に中性脂肪等の脂質が過剰に蓄積して、肝障害を生じる疾患の総称である。脂肪肝では肝小葉を構成する肝細胞の１／３以上に脂肪滴の蓄積が認められる。食生活や生活習慣の変化により、脂肪肝の頻度は年々増加する傾向にある。以前は、脂肪肝は放置しておいてもかまわないと考えられていたが、近年では、非アルコール性脂肪性肝障害（Ｎｏｎ－Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ　Ｆａｔｔｙ　Ｌｉｖｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ：ＮＡＦＬＤ）が注目され、脂肪肝から非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓がんへと移行する例もあることが明らかにされている。このため脂肪肝を適切に治療することが必要とされており、その病理に関する機能的な解明や、有効な治療薬の開発が試みられている。
　脂肪肝の発症メカニズムやその予防及び治療の研究のために、脂肪肝の症状を示す非ヒト動物モデルが作製されている。例えば、特許文献１には、肝障害免疫不全非ヒト動物にヒト肝細胞を移植することによって、脂肪肝の症状を示す非ヒト動物モデルが作製されている。この非ヒト動物モデルでは大型の脂肪滴や肝臓の脂肪化等、脂肪肝の症状が観察される。
ＷＯ２００８／００１６１４
　一方、非ヒト動物モデルは、作製や飼育・管理に多大な時間と労力、ならびに費用がかかる上、個体差や再現性の問題、倫理面での使用制限等の課題を有する場合がある。そのため、脂肪肝の発症メカニズムやその予防及び治療の研究を効率的に行うために、ヒト脂肪肝のｉｎ　ｖｉｔｒｏの評価系、すなわちヒト脂肪肝モデル細胞が切望されている。
　本発明者らは、脂肪肝由来のヒト肝細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏにて培養したところ、当該細胞は脂肪滴の消失等を生じ、脂肪肝の症状を維持することができないことを見出した。より具体的には、上述の脂肪肝の症状を示す非ヒト動物モデルより摘出された脂肪肝より、脂肪滴の蓄積等、脂肪肝の症状が観察されるヒト肝細胞を分離、回収し、これをｉｎ　ｖｉｔｒｏにて培養したところ、当該細胞は脂肪滴の消失等を生じ、脂肪肝の症状を維持することができないことを見出した。
　そこで、本発明は、脂肪肝由来のヒト肝細胞において、脂肪滴の蓄積をはじめとする脂肪肝の症状を維持することができ、脂肪肝をはじめとする脂質異常に効果を有する物質のスクリーニング方法に利用することが可能な、新たなヒト脂肪肝モデル細胞を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、脂肪肝由来のヒト肝細胞を、ジメチルスルホキシドを含む培地中にて培養することによって、脂肪滴の蓄積、脂質の分泌・蓄積、脂肪肝関連遺伝子の発現等が観察され、脂肪肝の症状を維持するヒト脂肪肝モデル細胞が得られることを見出した。また、当該ヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清には超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）が含まれ、当該ＶＬＤＬが当該ＬＤＬよりも多く含まれることを特徴としており、かかる培養上清中のＶＬＤＬ含量の増減を指標として脂肪肝をはじめとする脂質異常に効果を有する物質のスクリーニングを行うことが可能であることを見出した。
　本発明はこれらの知見に基づくものであり、以下の特徴を有する。
［１］　培養上清中の超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の増減を指標にして、脂肪肝をはじめとする脂質異常に効果を有する物質のスクリーニング方法に使用するための、ヒト脂肪肝モデル細胞であって、
　該細胞の培養上清がＶＬＤＬ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を含有し、該ＶＬＤＬが該ＬＤＬよりも多く含むことを特徴とする、細胞。
［２］　単層細胞培養物である、［１］の細胞。
［３］　前記ＶＬＤＬが、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬ、Ｍｅｄｉｕｍ－ＶＬＤＬ、及びＳｍａｌｌ－ＶＬＤＬを含み、該Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬをＶＬＤＬ全体の７０質量％以上の割合で含む、［１］又は［２］の細胞。
［４］　脂肪肝由来のヒト肝細胞を、ジメチルスルホキシドを含む培地中にて培養して得られた細胞である、［１］～［３］のいずれかの細胞。
［４－１］　ジメチルスルホキシドを含まないこと以外は同じ条件で培養された脂肪肝由来のヒト肝細胞の２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、又は９倍以上の脂質を内包する、［１］～［４］のいずれかの細胞。
［４－２］　培養上清中に含まれるリポタンパク質（より好ましくはトリグリセリド）量が、ジメチルスルホキシドを含まないこと以外は同じ条件で培養された脂肪肝由来のヒト肝細胞の培養上清中に含まれるリポタンパク質（より好ましくはトリグリセリド）量の５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、又は９倍以上である、［１］～［４］のいずれかの細胞。
［５］　脂肪肝由来のヒト肝細胞が、ヒト肝細胞を有するキメラ非ヒト動物より回収されたものである、［４］、［４－１］又は［４－２］の細胞。
［６］　脂質異常に効果を有する物質のスクリーニング方法であって、
　［１］～［５］のいずれかの細胞に被検物質を投与する工程、ならびに、
　被験物質を投与した細胞と投与されていない細胞との間で培養上清中の超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の量を比較する工程、を含む方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である２０２１年２月２６日に出願された日本国特許出願２０２１－　３０９１１号の明細書等に記載される内容を包含する。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとりいれるものとする。
　本発明によれば、脂肪滴の蓄積、脂質の分泌・蓄積、脂肪肝関連遺伝子の発現等が観察されるヒト脂肪肝モデル細胞であって、培養上清中の超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の増減を指標にして、脂肪肝をはじめとする脂質異常に効果を有する物質をスクリーニングする方法において使用されるヒト脂肪肝モデル細胞を提供することができる。
図１は、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））又は培地Ｃ（ＤＭＳＯ（－））で５日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの単層細胞培養物の写真図を示す。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ（左）；培地Ｃ（ＤＭＳＯ（－））で培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ（右）。 図２は、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））又は培地Ｃ（ＤＭＳＯ（－））で５日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培養上清中のリポタンパク質の総中性脂肪（トリグリセリド）含量の測定結果を示す。結果は、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培養上清中の当該含有量を「１００」とする相対値にて示す。 図３は、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で５日間、９日間、１２日間、及び１４日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ、ならびにＨｅｐＧ２細胞、及びＨｕＨ７細胞の培養上清におけるリポタンパク質の総コレステロール（左）及び総中性脂肪（トリグリセリド）（右）含量の測定結果を示す。 図４は、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で５日間、９日間、１２日間、及び１４日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ、ならびにＨｅｐＧ２細胞、及びＨｕＨ７細胞の培養上清におけるリポタンパク質（４種のサブグループ）のコレステロール（左）および中性脂肪（トリグリセリド）（右）含量について解析した結果を示す。 図５は、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で５日間、９日間、１２日間、及び１４日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ、ならびにＨｅｐＧ２細胞、及びＨｕＨ７細胞の細胞内における総コレステロール（左）及び総中性脂肪（トリグリセリド）（右）含量の測定結果を示す。 図６は、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で３日間、及び６日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓにおける脂肪肝関連遺伝子（ＦＡＳＮ、ＳＲＥＢＦ１、Ｇ６ＰＣ）の発現量の測定結果を示す。結果は、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で３日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの各遺伝子の発現量を「１」とする相対値にて示す。 図７は、０．７５ｍＭオレイン酸を含む培地Ｄで２日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培養上清におけるリポタンパク質の各サブグループにおける中性脂肪（トリグリセリド）含量について解析した結果（Ａ）、ならびに、培養上清のＶＬＤＬについて、Ｌａｒｇｅ、Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｍａｌｌの各サイズの中性脂肪（トリグリセリド）含量について解析した結果（Ｂ）を示す。 図８は、１ｎＭ、５ｎＭロミタピドを含む培地Ｄで２日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培養上清におけるリポタンパク質の各サブグループにおける中性脂肪（トリグリセリド）含量について解析した結果（Ａ）、ならびに、培養上清のＶＬＤＬについて、Ｌａｒｇｅ、Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｍａｌｌの各サイズの中性脂肪（トリグリセリド）含量について解析した結果（Ｂ）を示す。 図９は、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭフェノフィブラートを含む培地Ｄで２日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培養上清におけるリポタンパク質の各サブグループにおける中性脂肪（トリグリセリド）含量について解析した結果（Ａ）、ならびに、培養上清のＶＬＤＬについて、Ｌａｒｇｅ、Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｍａｌｌの各サイズの中性脂肪（トリグリセリド）含量について解析した結果（Ｂ）を示す。
１．ヒト脂肪肝モデル細胞
　本発明におけるヒト脂肪肝モデル細胞は、脂肪肝由来のヒト肝細胞を、ジメチルスルホキシドを含む培地中にて培養する工程を含むヒト脂肪肝モデル細胞の製造方法により製造することができる。以下、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の製造方法について記載する。
［１－１］脂肪肝由来のヒト肝細胞
　本発明において「脂肪肝由来のヒト肝細胞」とは、脂肪肝組織より回収されたヒト肝細胞、あるいは、それを一旦冷凍保存した後解凍したものを用いることができる。脂肪肝組織は、脂肪肝を有するヒト患者に由来する脂肪肝組織、肝障害免疫不全非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して得られた非ヒト動物モデル（以下、「キメラ非ヒト動物」と記載する）に由来する脂肪肝組織等を用いることができる。
　脂肪肝組織からのヒト肝細胞の回収は、従来公知の手法、すなわち、コラゲナーゼ灌流法や、遠心分離、エルトリエーター、ＦＣＭ（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体等の手段を用いて行うことができる。好ましくは、本発明において「脂肪肝由来のヒト肝細胞」とは、大量生産可能であり、安定して供給することができるという観点から、キメラ非ヒト動物より回収されたヒト肝細胞である。
［１－２］キメラ非ヒト動物より回収されたヒト肝細胞
　本発明において利用可能なキメラ非ヒト動物に由来する脂肪肝組織より回収されたヒト肝細胞は以下の手法により調製することができる。
・１－２－１　キメラ非ヒト動物
　本発明において「キメラ非ヒト動物」とは、肝臓における肝細胞の一部又は全部が、ヒト肝細胞に置換されている非ヒト動物を意味する。
　「非ヒト動物」は、哺乳動物であることが好ましく、げっ歯類であることがより好ましい。げっ歯類動物としては、マウス、ラットのようなネズミ、モルモット、リス、ハムスターなどが挙げられるが、実験動物として汎用されているマウス、ラットのようなネズミが特に好ましい。
　ヒト肝細胞を有するキメラ非ヒト動物は、従来公知の手法（特開２００２－４５０８７号公報、ＷＯ２００８／００１６１４、ＷＯ２０１３／１４５３３１）に準じて、肝障害免疫不全非ヒト動物にヒト肝細胞を移植することにより得ることができる。
・１－２－２　肝障害免疫不全非ヒト動物
　「肝障害免疫不全非ヒト動物」とは、異種動物由来の細胞に対して拒絶反応を示さない免疫不全であるとともに、非ヒト動物由来の肝臓の細胞が障害を受けている動物を意味する。非ヒト動物由来の肝臓の細胞が障害を受けていることにより、移植されたヒト肝細胞は増殖がしやすく、また、移植されたヒト肝細胞により肝機能が維持される。
　肝障害免疫不全非ヒト動物は、同一個体に、肝障害誘発処理、ならびに、免疫不全誘発処理を施すことにより作製することができる。「肝障害誘発処理」としては、肝障害誘発物質（例えば、四塩化炭素、黄リン、Ｄ－ガラクトサミン、２－アセチルアミノフルオレン、ピロロジンアルカロイド等）の投与や、外科的処理（例えば、肝臓の部分切除等）が挙げられる。「免疫不全誘発処理」としては、免疫抑制剤の投与や胸腺の摘出等が挙げられる。
　あるいは、肝障害免疫不全非ヒト動物は、遺伝的に免疫不全症の動物に、肝障害誘発処理を施すことによっても作製することができる。遺伝的に免疫不全症の動物としては、Ｔ細胞系不全を示す重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ：ｓｅｖｅｒｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）の動物、遺伝的な胸腺の欠損によりＴ細胞機能を失った動物、ＲＡＧ２遺伝子のノックアウト動物等を利用することができる。具体的には、ＳＣＩＤマウス、ＮＵＤＥマウス、ＲＡＧ２ノックアウトマウス、ＩＬ２Ｒｇｃ／Ｒａｇ２ノックアウトマウス、ＮＯＤマウス、ＮＯＧマウス、ヌードマウス、ヌードラット、Ｘ線照射したヌードラットにＳＣＩＤマウスの骨髄を移植して得られる免疫不全ラット（特開２００７－２２８９６２号公報、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６０（７）：７４０－７，１９９５）等を使用することができる。
　あるいは、肝障害免疫不全非ヒト動物は、遺伝的に肝障害を有する動物に免疫不全誘発処理を施すことによっても作製することができる。遺伝的に肝障害を有する動物としては、肝細胞特異的に発現するタンパク質のエンハンサー、及び／又はプロモーターの支配下に連結された肝障害誘発タンパク質遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を利用することができる。「肝細胞特異的に発現するタンパク質」としては、血清アルブミン、コリンエステラーゼ、ハーゲマン因子等が挙げられ、これら遺伝子の発現を調節するエンハンサー、及び／又はプロモーターを利用することができる。「肝障害誘発タンパク質」としては、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）、ティッシュープラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）等が挙げられる。このようなトランスジェニック動物においては、肝細胞特異的に発現するタンパク質のエンハンサー、及び／又はプロモーターの下、肝細胞特異的に肝障害誘発タンパク質が発現されるため、肝障害が誘導される。あるいは、遺伝的に肝障害を有する動物は、肝機能を担う遺伝子をノックアウトすることによっても作製することができる。「肝機能を担う遺伝子」としては、例えばフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ遺伝子等が挙げられる。
　あるいは、肝障害免疫不全非ヒト動物は、遺伝的に免疫不全症の動物と、それと同種の遺伝的に肝障害を有する動物とを交配させることによっても作製することができる。
　あるいは、肝障害免疫不全非ヒト動物は、ジーンターゲティングや、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をはじめとするゲノム編集技術や遺伝子組換え技術を利用して、上記免疫不全及び／又は上記肝障害を生じる遺伝的要因を、非ヒト動物、あるいは遺伝的に免疫不全症である及び／又は遺伝的に肝障害を有する非ヒト動物に由来する受精卵、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等）に導入することによって作製することができる（Ｗａｎｇ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ，１５３，９１０－９１８，（２０１３）；Ｙａｎｇ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ，１５４，１３７０－１３７９，（２０１３））。
　本発明において「肝障害免疫不全非ヒト動物」は、免疫不全の形質を規定する遺伝子及び肝障害の形質を規定する遺伝子を、それぞれをホモ接合型で有していてもよいし、ヘテロ接合型で有していてもよい。例えば、本発明の肝障害免疫不全非ヒト動物としては、ｕＰＡ（＋／－）／ＳＣＩＤ（＋／＋）、ｕＰＡ（＋／＋）／ＳＣＩＤ（＋／＋）などの遺伝子型で表される肝障害免疫不全マウスを好適に利用することができる。
・１－２－３　移植されるヒト肝細胞
　本発明において肝障害免疫不全非ヒト動物に移植される「ヒト肝細胞」は、ヒト由来の肝細胞であればよく、例えば、ヒト肝組織から、コラゲナーゼ灌流法等の常法にしたがって単離されたヒト肝細胞を利用することができる。ヒト肝組織は健常人由来の肝組織であってもよいし、脂肪肝や肝臓がん等の疾患に罹患した患者由来の肝組織であってもよいが、好ましくは健常人由来の肝組織である。肝細胞を単離するヒトの年齢は特に制限されないが、１４歳以下の小児の肝組織より単離するのが好ましい。１４歳以下の小児の肝細胞を使用することにより、移植後、ヒト肝細胞による高置換率を達成することができる。また、単離した肝細胞を一旦冷凍保存した後解凍して用いることもできる。
　また、ヒト肝細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏで活発な増殖能を有する増殖性ヒト肝細胞であってもよい。「増殖性ヒト肝細胞」とは、培養条件下（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）において、単一細胞種の集団としてのコロニーを形成し、そのコロニーを増大させるように増殖するヒト肝細胞を意味する。その増殖は、コロニー構成細胞が単一種であるという点において「クローン性増殖」という場合もある。さらに、このような細胞は、継代培養によって細胞数をさらに増加することができる細胞である。
　増殖性ヒト肝細胞としては、ヒト小型肝細胞が挙げられる（特開平０８－１１２０９２号公報；日本特許第３２６６７６６号；米国特許第６，００４，８１０号、特開平１０－１７９１４８号公報：日本特許第３２１１９４１号、特開平７－２７４９５１公報；日本特許第３１５７９８４号、特開平９－３１３１７２号公報；日本特許第３０１４３２２号）。
　単離したヒト肝細胞は、そのまま用いてもよいし、さらに精製して用いてもよい。肝細胞の精製は常法にしたがって行うことができ、例えば、遠心分離、エルトリエーター、ＦＣＭ、コロニーを形成しながら増殖する肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体等の手段を用いて行うことができる。ヒト肝細胞や増殖性ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体は公知のもの（ＷＯ２００８／００１６１４）を利用することができる。
　あるいは、ヒト肝細胞は、ヒト肝細胞を有するキメラ非ヒト動物の肝組織から同様に、コラゲナーゼ灌流法等の常法にしたがって単離されたヒト肝細胞やそれを一旦冷凍保存した後解凍したもの、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等）より誘導して得られたヒト肝細胞、Ｃｌｉｐ細胞のような肝前駆細胞、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで増殖させたヒト肝細胞、凍結保存肝細胞、テロメラーゼ遺伝子等の導入により不死化させた肝細胞、これらの肝細胞と非実質細胞を混合させたもの等も利用することができる。
・１－２－４　ヒト肝細胞の移植
　肝障害免疫不全非ヒト動物へのヒト肝細胞の移植は、当該非ヒト動物の脾臓を経由して肝臓へ移植することにより行うことができる。あるいは、直接門脈から移植することもできる。移植するヒト肝細胞の数は、１～２００万個程度、好ましくは２０万～１００万個程度とすることができる。肝障害免疫不全非ヒト動物の性別は特に限定されない。また、移植に用いる肝障害免疫不全非ヒト動物の日齢は、特に限定されないが、低週齢のときにヒト肝細胞を移植すると、動物の成長とともにヒト肝細胞がより活発に増殖し得ることから、生後０～４０日程度、好ましくは生後８～４０日程度のものを使用することができる。
　移植後の動物は、常法により、飼育することができる。例えば、移植後４０～２００日間程度飼育することにより、非ヒト動物における肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたキメラ非ヒト動物を得ることができる。このようにして得られたキメラ非ヒト動物の肝臓には、大型の脂肪滴や肝臓の脂肪化等、脂肪肝の症状が観察される（ＷＯ２００８／００１６１４）。
・１－２－５　ヒト肝細胞の回収
　キメラ非ヒト動物からのヒト肝細胞の回収は、コラゲナーゼ灌流法等の常法にしたがって行うことができる。ヒト肝細胞の回収は、回収される肝細胞中にヒト肝細胞が高率で含まれるキメラ非ヒト動物を用いて行うことが好ましくは、例えば、以下の一又は複数の特徴を有するキメラ非ヒト動物を用いて行うことができる。
（ｉ）肝臓における肝細胞の６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上がヒト肝細胞に置換されている；
（ｉｉ）血中ヒトアルブミン量が０．１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、よりさらに好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上である；
（ｉｉｉ）ヒト肝細胞の移植後、１２週～２１週、好ましくは１３週～２０週、より好ましくは１４週～１９週、経過している。
　回収したヒト肝細胞はそのまま用いてもよいが、ヒト肝細胞又は非ヒト動物の肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて、ヒト肝細胞を精製して用いてもよい。分離した肝細胞をヒト肝細胞特異的モノクローナル抗体と反応させる場合は、当該抗体と結合した細胞をＦＣＭや磁気細胞分離装置で回収することによって、また、分離した肝細胞を非ヒト動物の肝細胞特異的モノクローナル抗体と反応させる場合は、該抗体と結合しなかった細胞をＦＣＭや磁気細胞分離装置を用いて回収することによって、ヒト肝細胞を精製して回収することができる。
　回収したヒト肝細胞はさらに、新たな肝障害免疫不全非ヒト動物へと上述のとおり移植した（継代移植）後に、同様に回収してもよい。継代移植は１回又は複数回（例えば、２～４回）行うことができる。
［１－３］脂肪肝由来のヒト肝細胞の培養
　本発明において、脂肪肝由来のヒト肝細胞の培養は、動物細胞の培養に一般的に用いられる培地を使用して行うことができる。このような培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウイリアムス培地Ｅ等が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくは、ＤＭＥＭを利用することができる。培地には必要に応じてさらに、ウシ胎児血清、インスリン、上皮成長因子、デキサメタゾン、緩衝剤、抗生物質、ｐＨ調整剤、プロリン、アスコルビン酸、ニコチンアミド等を適宜添加することができる。
　培地には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加する。ＤＭＳＯは培地中に１～４重量％、好ましくは１～２重量％、例えば２重量％の量（終濃度）となるように添加することができる。培地にＤＭＳＯを添加することによって、脂肪肝由来のヒト肝細胞における脂質の吸収及び／又は分泌機能を高め、脂質の蓄積を維持することができる。
　脂肪肝由来のヒト肝細胞は培地に、０．２１～２１．３×１０5細胞個／ｃｍ2、好ましくは１．０７～３．２×１０5細胞個／ｃｍ2、例えば、２．１３×１０5細胞個／ｃｍ2の量で播種する。０．２１より細胞が少ないと、ヒト脂肪肝モデル細胞として十分な量の細胞を得ることができない場合があり、一方、２１．３×１０5より細胞が多いと、細胞の生育低下、脂質の分泌及び／又は蓄積量の低下、等を生じる場合がある。
　脂肪肝由来のヒト肝細胞の培養は、細胞が脂質を分泌及び／又は蓄積するのに十分な期間行われればよく、特に限定されるものではないが、例えば、ＤＭＳＯを添加しないこと以外は同じ条件で培養された脂肪肝由来のヒト肝細胞の２倍以上、３倍以上、４倍以上、もしくは５倍以上、好ましくは６倍以上、より好ましくは７倍以上、さらに好ましくは８倍以上、よりさらに好ましくは９倍以上の脂肪滴を、細胞が内包するのに十分な期間行うことができる。このような培養期間としては例えば、３日間よりも長く、好ましくは４日以上、さらに好ましくは５日以上行うことができる。培養期間の上限は特に限定されないが、例えば、１７日以下、好ましくは１３日以下とすることができる。培養期間における培地の交換は適宜行うことができる。
　培養の終了後、脂質を分泌及び／又は蓄積するヒト肝細胞は、ヒト脂肪肝モデル細胞として利用することができる。
［２－１］脂肪滴とリポタンパク質分泌量
　本発明のヒト脂肪肝モデル細胞は、ヒト脂肪肝における肝細胞と同様に、多くの脂肪滴を内包し、多くの脂質を分泌及び／又は蓄積し、脂肪肝関連遺伝子の発現等が観察され、脂肪肝の症状を維持するヒト由来の培養肝細胞であり、より詳細には単層の肝細胞培養物である。
　本発明のヒト脂肪肝モデル細胞は多くの脂肪滴を内包し、かつ高いリポタンパク質の含有量及び／又は分泌量を有する。ここで「多くの脂肪滴を内包」とは、上述の脂肪肝由来のヒト肝細胞の培養において、ＤＭＳＯを添加しないこと以外は同じ培地中にて同じ条件で培養された（例えば、３日間よりも長く、好ましくは４日以上、さらに好ましくは５日以上培養された）脂肪肝由来のヒト肝細胞の２倍以上、３倍以上、４倍以上、もしくは５倍以上、好ましくは６倍以上、より好ましくは７倍以上、さらに好ましくは８倍以上、よりさらに好ましくは９倍以上の脂肪滴を、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞が内包することを意味する。細胞中の脂肪滴の量は、オイルレッドＯ染色等の従来公知の手法を用いて細胞内の脂肪滴を染色した後、さらに有機溶媒を用いてその色素を抽出することにより定量することができる。
　「リポタンパク質」とは、コレステロールや中性脂肪等の脂質を、吸収・合成部位から使用部へと運搬するための複合体粒子であり、一般的に、粒子の外側に親水性のリン脂質、遊離コレステロール、アポリポタンパク質が配置され、粒子の内側には疎水性のコレステロールや中性脂肪が配置された構造を有する。「高いリポタンパク質の含有量及び／又は分泌量」とは、上述の脂肪肝由来のヒト肝細胞の培養において、ＤＭＳＯを添加しないこと以外は同じ培地中にて同じ条件で培養された（例えば、３日間よりも長く、好ましくは４日以上、さらに好ましくは５日以上培養された）脂肪肝由来のヒト肝細胞又はその培養上清中に含まれるリポタンパク質（より好ましくはトリグリセリド）量の、５倍以上、好ましくは６倍以上、より好ましくは７倍以上、さらに好ましくは８倍以上、よりさらに好ましくは９倍以上の量のリポタンパク質が、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞又はその培養上清中に含まれることを意味する。細胞又は培養上清中のリポタンパク質の量は、後述するような従来公知の手法により測定することができる。
［２－２］リポタンパク質のサブクラスの含有量
　本発明のヒト脂肪肝モデル細胞は、培養上清中のリポタンパク質のサブクラスの含有量によっても特徴付けることができる。
　リポタンパク質はその粒子の大きさ、水和密度、電気泳動度等の性質の違いによりいくつかのサブクラスに分類することができる。本発明においてはリポタンパク質を、従来公知の手法（岡崎、生物物理化学　２００５年　４９巻　４号　ｐ．１１１－１１８）に準じて、下記粒子サイズに基づいて、カイロミクロン（ＣＭ）、超低比重リポタンパク質（Ｖｅｒｙ　Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＶＬＤＬ）、低比重リポタンパク質（Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（Ｈｉｇｈ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＤＬ）の４つに大きく分類することができる。さらに、ＶＬＤＬはＬａｒｇｅ，Ｍｅｄｉｕｍ，Ｓｍａｌｌの３つのさらなるサブクラスに、ＬＤＬはＬａｒｇｅ，Ｍｅｄｉｕｍ，Ｓｍａｌｌ，Ｖｅｒｙ　Ｓｍａｌｌの４つのさらなるサブクラスに、ＨＤＬはＶｅｒｙ　Ｌａｒｇｅ，Ｌａｒｇｅ，Ｍｅｄｉｕｍ，Ｓｍａｌｌ，Ｖｅｒｙ　Ｓｍａｌｌの５つのさらなるサブクラスに、それぞれ粒子サイズに基づいて分類することができる。また、ＣＭはＧ０１，Ｇ０２の２つのさらなるサブクラスに、ＶＬＤＬはＧ０３，Ｇ０４，Ｇ０５，Ｇ０６，Ｇ０７の５つのさらなるサブクラスに、ＬＤＬはＧ０８，Ｇ０９，Ｇ１０，Ｇ１１，Ｇ１２，Ｇ１３の６つのさらなるサブクラスに、ＨＤＬはＧ１４，Ｇ１５，Ｇ１６，Ｇ１７，Ｇ１８，Ｇ１９，Ｇ２０の７つのさらなるサブクラスに、それぞれ粒子サイズに基づいて分類することができる。
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　培養上清中のリポタンパク質の各サブクラスは、ゲル濾過液体クロマトグラフィー法を利用した従来公知の手法（ＷＯ２００７／０５２７８９；特開平９－１５２２５号公報；Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｖａｓｃ　Ｂｉｏｌ．２００５；２５：１－８；ＬｉｐｏＳＥＡＲＣＨ（登録商標）（株式会社スカイライト・バイオテック））により分画して定量することができる。
　本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清においては、リポタンパク質のうちＶＬＤＬが最も高い含有量を示す。
　本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清においては、ＶＬＤＬはＬＤＬよりも高い含有量を示し、例えば、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、又は１５倍以上の量が含まれる。
　より詳細には、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清においては、ＶＬＤＬのコレステロールはＬＤＬのコレステロールよりも高い含有量を示し、例えば、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、又は１５倍以上の量が含まれ、ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）はＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）よりも高い含有量を示し、例えば、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、又は１５倍以上の量が含まれる。
　さらに、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清においては、ＶＬＤＬはＨＤＬよりも高い含有量を示し、例えば、５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、２５倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、又は９０倍以上の量が含まれる。
　より詳細には、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清においては、ＶＬＤＬのコレステロールはＨＤＬのコレステロールよりも高い含有量を示し、例えば、５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、２５倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、又は９０倍以上の量が含まれ、ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）はＨＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）よりも高い含有量を示し、例えば、５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、２５倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、又は９０倍以上の量が含まれる。
　さらに、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清においては、ＬＤＬはＨＤＬよりも高い含有量を示し、例えば、２．５倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、又は１０倍以上の量が含まれる。
　より詳細には、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清においては、ＬＤＬのコレステロールはＨＤＬのコレステロールよりも高い含有量を示し、例えば、２．５倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、又は１０倍以上の量が含まれ、ＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）はＨＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）よりも高い含有量を示し、例えば、２．５倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、又は１０倍以上の量が含まれる。
　さらに、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清においては、ＶＬＤＬのＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬ、Ｍｅｄｉｕｍ－ＶＬＤＬ、及びＳｍａｌｌ－ＶＬＤＬのうち、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬが最も高い割合で含まれ、ＶＬＤＬ全体の７０質量％以上、好ましくは７５質量％以上、より好ましくは８０質量％以上、さらに好ましくは８１質量％以上、よりさらに好ましくは８２質量％以上（例えば、８３質量％以上、８４質量％以上）特に好ましくは８５質量％以上の割合で含まれる。
　より詳細には、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清において、ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）は、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬ、Ｍｅｄｉｕｍ－ＶＬＤＬ、及びＳｍａｌｌ－ＶＬＤＬの各中性脂肪（トリグリセリド）の総和であり、このうちＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）が最も高い割合で含まれ、ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）の全量の７０質量％以上、好ましくは７５質量％以上、より好ましくは８０質量％以上、さらに好ましくは８１質量％以上、よりさらに好ましくは８２質量％以上（例えば、８３質量％以上、８４質量％以上）特に好ましくは８５質量％以上の割合で含まれる。また、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清において、ＶＬＤＬのコレステロールは、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬ、Ｍｅｄｉｕｍ－ＶＬＤＬ、及びＳｍａｌｌ－ＶＬＤＬの各コレステロールの総和であり、このうちＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬのコレステロールが最も高い割合で含まれ、ＶＬＤＬのコレステロールの全量の７０質量％以上、好ましくは７５質量％以上、より好ましくは８０質量％以上、さらに好ましくは８１質量％以上、よりさらに好ましくは８２質量％以上（例えば、８３質量％以上、８４質量％以上）特に好ましくは８５質量％以上の割合で含まれる。
［２－３］脂肪肝関連遺伝子の発現量
　本発明のヒト脂肪肝モデル細胞はまた、細胞における脂肪肝関連遺伝子の発現量によっても特徴付けることができる。
　本発明において「脂肪肝関連遺伝子」とは、健康な肝臓の肝細胞と比べて脂肪肝の肝細胞において発現量の増大が認められる遺伝子を意味する。このような脂肪肝関連遺伝子としては、脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子（遺伝子名：ＦＡＳＮ）、ＳＲＥＢＰ－１をコードする遺伝子（遺伝子名：ＳＲＥＢＦ１）、グルコース－６－ホスファターゼをコードする遺伝子（Ｇ６ＰＣ）、コレステロール７α－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子（ＣＹＰ７Ａ１）、コレステリルエステル転送タンパク質をコードする遺伝子（ＣＥＴＰ）、グルコキナーゼをコードする遺伝子（ＧＣＫ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１をコードする遺伝子（ＰＣＫ１）等が挙げられる。ここで、脂肪肝関連遺伝子の「高い」発現量とは、ＤＭＳＯ非含有の培地中にて培養された、又はＤＭＳＯ含有の培地中にて３日以下培養された上述の脂肪肝由来のヒト肝細胞における脂肪肝関連遺伝子の発現量と比べて高いこと、例えば、２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは３．５倍以上高いことを意味する。
　脂肪肝関連遺伝子の発現量は、従来公知の手法により定量することが可能であり、好ましくはマイクロアレイ解析により行うことができる。
　本発明のヒト脂肪肝モデル細胞は、ＤＭＳＯを含む培地中にて培養することが好ましい。
　本発明のヒト脂肪肝モデル細胞は、リポタンパク質のうちＶＬＤＬが最も高い含有量を示すことから、既知肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７等）と比較して、よりヒト脂肪肝の肝細胞に類似したモデルとして用いることができる。
［２－４］ヒト脂肪肝モデル細胞の用途
　本発明のヒト脂肪肝モデル細胞は、ヒト脂肪肝のモデルとして用いることができ、培養上清中の超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）含量の増減を指標にして、脂肪肝をはじめとする脂質異常に効果を有する物質をスクリーニングする方法において利用することができる。
　スクリーニングは、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養物に被験物質を投与し、被験物質を投与した細胞と投与されていない細胞との間で培養上清中のＶＬＤＬの増減の有無、及び／又は当該増減の程度を比較することによって行うことができる。より詳細には、スクリーニングは、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養物に被験物質を投与し、被験物質を投与した細胞と投与されていない細胞との間で培養上清中のＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量又はコレステロール量の増減の有無、及び／又は当該増減の程度を比較することによって行うことができる。より好ましくは、スクリーニングは、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養物に被験物質を投与し、被験物質を投与した細胞と投与されていない細胞との間で培養上清中のＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬの増減の有無、及び／又は当該増減の程度を比較することによって行うことができる。より詳細には、スクリーニングは、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養物に被験物質を投与し、被験物質を投与した細胞と投与されていない細胞との間で培養上清中のＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量又はコレステロール量の増減の有無、及び／又は当該増減の程度を比較することによって行うことができる。「被験物質を投与した細胞と投与されていない細胞」は、被験物質投与前後の同一の培養物であってもよいし、被験物質投与の有無が異なるだけでその他は同様に操作された別々の培養物であってもよい。
　本発明において「脂質異常」としては、脂肪肝、脂質異常症（高脂血症）ならびにそれらより生じる、もしくは生じるリスクが高い疾患や症状（例えば、動脈硬化、血栓、ＮＡＳＨ、肝硬変、肝臓がん、心筋梗塞、脳卒中等）が挙げられる。
　本発明において「脂質異常に効果を有する物質」としては、脂質異常に有効な物質及び脂質異常に悪影響を及ぼす物質等が挙げられる。「脂質異常に有効な物質」とは、ヒト脂肪肝細胞におけるＶＬＤＬの産生量を低下させることが可能な物質を意味する。より詳細には、当該物質とは、ヒト脂肪肝細胞より産生されるＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量又はコレステロール量を低下させることが可能な物質を意味する。より好ましくは、当該物質とは、ヒト脂肪肝細胞におけるＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬの分泌量を低下させることが可能な物質を意味する。より詳細には、当該物質とは、ヒト脂肪肝細胞より産生されるＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量又はコレステロール量を低下させることが可能な物質を意味する。これらの物質は、脂質異常を治療又は改善することに寄与し得る。脂肪肝では通常、リポタンパク質のＶＬＤＬの産生量、及びＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量が増大することが知られている。また、中性脂肪（トリグリセリド）の産生量とＶＬＤＬサイズとの間には相関関係があり（「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｌｉｐｉｄｓ　ａｎｄ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」　Ｋｅｎｎｅｔｈ　Ｒ．ら、Ｅｎｄｏｔｅｘｔ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｊａｎｕａｒｙ　１９，２０２１．）、中性脂肪（トリグリセリド）の産生量が増大するとＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬ量の増大が確認される。このため、被験物質を投与した本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清において、ＶＬＤＬ量（特に、ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量又はコレステロール量）、好ましくはＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬ量（特に、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド量）又はコレステロール量）の減少が確認される場合には、当該被験物質は脂質異常、特に脂肪肝の少なくとも一つの症状を改善するものであり、本発明の「脂質異常に有効な物質」であると判定することができる。また、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬは代謝によりＳｍａｌｌ－ＬＤＬを生じるが（Ｒｏｎａｌｄ　Ｍ　Ｋｒａｕｓｓ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ．２００４　Ｊｕｎ；２７（６）：１４９６－５０４．）、このＳｍａｌｌ－ＬＤＬは酸化により変性して、血管壁に沈着されやすくなり、動脈硬化の原因となり得る（木庭ら、脈管学　Ｖｏｌ．４６，２００６，ｐ．４４１－４４８）。このため、被験物質を投与した本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清において、ＶＬＤＬ量（特に、ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量又はコレステロール量）、好ましくはＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬ量（特に、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量又はコレステロール量）の減少が確認される場合には、当該被験物質は脂質異常、特に動脈硬化の少なくとも一つの症状を改善するものであり、本発明の「脂質異常に有効な物質」であると判定することができる。このようなＶＬＤＬ量の減少生じる物質の具体例としては、高脂血症治療薬の有効成分として知られるフェノフィブラート、ロミタピド等が例示され、下記実施例にて詳述されるとおり、培養上清中のＶＬＤＬの増減を指標にして、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞を用いて検出することができる。また、脂質異常の疾患や症状に有効な物質は、その疾患や症状の治療又は改善だけでなく、予防にも有効であると判定することができる。
　一方、「脂質異常に悪影響を及ぼす物質」とは、ヒト脂肪肝細胞における少なくとも一つの症状を増悪させ得る物質を意味し、本発明においては、ヒト脂肪肝細胞におけるＶＬＤＬの産生量を増加させることが可能な物質を意味する。より詳細には、当該物質とは、ヒト脂肪肝細胞より産生されるＶＬＤＬ量（特に、ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量又はコレステロール量）、好ましくはＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬ量（特に、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド量）又はコレステロール量）を増加させることが可能な物質を意味する。上述のとおり、脂肪肝や動脈硬化等の脂質異常と、ＶＬＤＬ量（特に、ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量又はコレステロール量）、好ましくはＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬ量（特に、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド量）又はコレステロール量）との間には相関関係がある。このため、被験物質を投与した本発明のヒト脂肪肝モデル細胞の培養上清において、ＶＬＤＬ量（特に、ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量又はコレステロール量）、好ましくはＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬ量（特に、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量又はコレステロール量）の増加が確認される場合には、当該被験物質は脂肪肝や動脈硬化等の脂質異常の少なくとも一つの症状を増悪し得るものであり、本発明の「脂質異常に悪影響を及ぼす物質」であると判定することができる。このようなＶＬＤＬ量の増加を生じる物質の具体例としては、オレイン酸等が例示され、下記実施例にて詳述されるとおり、培養上清中のＶＬＤＬの増減を指標にして、本発明のヒト脂肪肝モデル細胞を用いて検出することができる。
　被験物質としては、低分子化合物、アミノ酸、核酸、脂質、糖類、天然物の抽出物等が挙げられるが、これらに限定はされない。
　以下、実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
Ｉ．試験方法
１．脂肪肝由来のヒト肝細胞の調製
（ヒト肝細胞を有するキメラマウス（ＰＸＢマウス）の作製）
　ＰＸＢマウスは従来公知の手法（特開２００２－４５０８７号公報）に準じて作製した。すなわち、肝臓で合成されるアルブミンのエンハンサー、及びプロモーターに連結したウロキナーゼプラウミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）遺伝子（ｃＤＮＡ－ｕＰＡ）が全細胞に導入された遺伝的肝障害マウスと、免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）とを交配させて免疫不全肝障害マウス（ｃＤＮＡ－ｕＰＡ（＋／－）／ＳＣＩＤマウス）を作製した。
　３週齢のｃＤＮＡ－ｕＰＡ（＋／－）／ＳＣＩＤマウスに麻酔をかけ、脾臓辺りの皮膚ならびに腹直筋をハサミで切開し、脾臓の先端をつまんで細胞を注入しやすい位置に固定した。次いで、ヒト肝細胞懸濁液を充填したガラスシリンジを用いて、脾臓の先端から針を刺し、細胞を注入した。その後、脾臓をマウスの体内へ戻し、皮膚および腹膜を形成外科用強弯針で縫い、切開部分を閉じ、移植対象マウスの呼吸に異常がないことを確認し、飼育ケージ内で飼育した。
　１７週齢～２２週齢、体重１５～２０ｇであり、かつ血清中のヒトアルブミン量が１０ｍｇ／ｍＬ以上（ヒトアルブミン量から換算したヒト肝細胞置換率９５％以上）であるＰＸＢマウスを選抜し、以下の実験に用いた。
（細胞分離）
　麻酔下のＰＸＢマウスを解剖台に載せ、医療用テープで固定後に開腹した。留置針を門脈に挿し、灌流液Ａを送流し、脱血した。灌流液Ｂを送流し肝組織中のコラーゲンを溶解し、腸管や胃を傷つけないよう肝臓を切り出し、灌流液Ｃ中で肝臓を揺らして肝細胞をほぐし、遊離した。未消化組織片を除去するために、セルストレイナーに通過させ、肝細胞をチューブに回収した。
（細胞調整）
　回収した肝細胞（ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ）を遠心分離し、上清を取り除いた後、得られた沈殿に、培地Ａを４０ｍＬ加え静かに混合した。この操作を２回繰り返し、上清中に浮遊した不純物や脂質等を除去した。細胞塊を単離するために、セルストレイナーに通過させ、チューブに回収した。細胞数の計測は、トリパンブルー色素排除法で血球計算盤を使用して行い、計数した値より、細胞密度、総細胞数、及び生存率を求めた。
（播種）
　細胞懸濁液の細胞密度から、目的とする播種密度の希釈倍率を算出し、培地Ａにて希釈した。希釈した細胞懸濁液５００μＬを培養プレートの各Ｗｅｌｌに静かに注ぎ、細胞が底面に軽く接着するまで約２０分間静置した後、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、培養した。
　２．ＤＭＳＯ含有培地中で培養した培養上清中のリポタンパク質の解析
　播種の翌日培地Ａを除去して、５００μＬの培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））または培地Ｃ（ＤＭＳＯ（－））を添加し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、５日間培養した。培養終了後、顕微鏡カメラを用いて細胞像を撮影後に培養上清を回収し、下記培養上清中のリポタンパク質の解析を行った。
　３．ＤＭＳＯ含有培地中で５～１４日間培養した培養上清中のリポタンパク質の解析
・ＤＭＳＯ含有培地中で５日間培養
　播種の翌日培地Ａを除去して、５００μＬの培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を添加し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、培養した。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた培養開始から１日目及び２日目に、培地を新しい培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））に交換した。
　培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた５日間の培養終了後、下記培養上清中のリポタンパク質の解析を行った。
・ＤＭＳＯ含有培地中で９日間培養
　播種の翌日培地Ａを除去して、５００μＬの培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を添加し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、培養した。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた培養開始から５日目、７日目、及び８日目に、培地を新しい培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））に交換した。
　培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた９日間の培養終了後、下記培養上清中のリポタンパク質の解析を行った。
・ＤＭＳＯ含有培地中で１２日間培養
　播種の翌日培地Ａを除去して、５００μＬの培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を添加し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、培養した。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた培養開始から５日目、７日目、及び８日目に、培地を新しい培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））に交換した。
　培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた１２日間の培養終了後、下記培養上清中のリポタンパク質の解析を行った。
・ＤＭＳＯ含有培地中で１４日間培養
　播種の翌日培地Ａを除去して、５００μＬの培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を添加し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、培養した。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた培養開始から５日目、７日目、８日目、及び１２日目に、培地を新しい培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））に交換した。
　培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた１４日間の培養終了後、下記培養上清中のリポタンパク質の解析を行った。
４．ＤＭＳＯ含有培地中で５～１４日間培養した細胞中のリポタンパク質の解析
・ＤＭＳＯ含有培地中で５日間培養
　播種の翌日培地Ａを除去して、５００μＬの培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を添加し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、培養した。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた培養開始から１日目及び２日目に、培地を新しい培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））に交換した。
　培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた５日間の培養終了後、細胞内のコレステロール及びトリグリセリド量について、下記細胞中のリポタンパク質の解析を行った。
・ＤＭＳＯ含有培地中で９日間培養
　播種の翌日培地Ａを除去して、５００μＬの培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を添加し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、培養した。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた培養開始から５日目、７日目、及び８日目に、培地を新しい培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））に交換した。
　培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた９日間の培養終了後、細胞内のコレステロール及びトリグリセリド量について、下記細胞中のリポタンパク質の解析を行った。
・ＤＭＳＯ含有培地中で１２日間培養
　播種の翌日培地Ａを除去して、５００μＬの培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を添加し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、培養した。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた培養開始から５日目、７日目、及び８日目に、培地を新しい培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））に交換した。
　培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた１２日間の培養終了後、細胞内のコレステロール及びトリグリセリド量について、下記細胞中のリポタンパク質の解析を行った。
・ＤＭＳＯ含有培地中で１４日間培養
　播種の翌日培地Ａを除去して、５００μＬの培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を添加し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、培養した。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた培養開始から５日目、７日目、８日目、及び１２日目に、培地を新しい培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））に交換した。
　培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を用いた１４日間の培養終了後、細胞内のコレステロール及びトリグリセリド量について、下記細胞中のリポタンパク質の解析を行った。
・既知肝細胞の培養
　既知肝細胞（ＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ７細胞）を５００μＬの培地Ａに播種し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、７日間培養した。培養終了後、下記培養上清中のリポタンパク質の解析、ならびに、下記細胞中のリポタンパク質の解析を行った。
５．解析方法
（培養上清中のリポタンパク質の解析）
　ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ、ＨｅｐＧ２、及びＨｕＨ７の培養上清中に含まれるリポタンパク質の解析には、株式会社スカイライト・バイオテック社のＬｉｐｏＳＥＡＲＣＨ（登録商標）法を用いた。
　上記培養終了後、培養に用いられた培地を除去して、５００μＬの解析用の培地Ｄを添加し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、２日間培養した。その後、培養上清を回収し、培養上清（８０μＬ）に含まれるリポタンパク質を、ゲル濾過ＨＰＬＣにより４種のサブグループである、ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、及びＨＤＬの画分に分画後、それぞれの画分に含まれるコレステロール及び中性脂肪（トリグリセリド）をオンライン酵素反応にて定量した。濃度解析にはスカイライト・バイオテック社独自のコンピュータープログラムを用いて解析を行った。なお、酵素反応については、Ｄｉａｃｏｌｏｒ　Ｌｉｑｕｉｄ　ＴＧ－Ｓ（東洋紡績製）を用い、ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、及びＨＤＬ中のコレステロール及び中性脂肪（トリグリセリド）濃度の標準血清は、協和発酵キリン株式会社製を使用した。
（細胞中のリポタンパク質の解析）
・細胞中トリグリセリド測定
　細胞中のトリグリセリドの測定は、コレステスト（登録商標）ＴＧ（積水メディカル株式会社）を製造元の指示書に従って用いて行った。すなわち、細胞をＰＢＳで洗浄後、完全に水を切り（測定までは－８０℃保存）、細胞Ｗｅｌｌ毎に２００μＬのＴＧ酵素液（１）を添加し、３７℃、１０分間保温し、反応させた（フリーのグリセロールを除去）。次いで、ピペットで細胞を剥離させ、遠心チューブに移し１０，０００ｒｐｍ×１０分間遠心分離した後、上清７．５μＬを９６穴マイクロプレートに移し、６８μＬのＴＧ酵素液（１）を添加し、３７℃、１０分間保温し、完全にフリーのグリセロールを除去した。次いで、２５μＬのＴＧ酵素液（２）を添加し、３７℃、１０分間保温した。得られた反応物について、５５０ｎｍにて吸光度を測定し、ＨＤＬ－Ｃ１８０Ａを標準としてトリグリセリド含量を算出（ＨＤＬ－Ｃ１８０Ａのトリグリセリド濃度は、５２．２６ｍｇ／ｄＬ）した。
・細胞中コレステロール測定
　細胞中のコレステロールの測定は、コレステスト（登録商標）ＣＨＯ（積水メディカル株式会社）を製造元の指示書に従って用いて行った。すなわち、細胞をＰＢＳで洗浄後、完全に水を切り（測定までは－８０℃保存）、細胞Ｗｅｌｌ毎に２００μＬのＣＨＯ酵素液（１）を添加し、３７℃、１０分間保温した。次いで、ピペットで細胞を剥離させ、遠心チューブに移し１０，０００ｒｐｍ×１０分間遠心分離した後、上清１５μＬを９６穴マイクロプレートに移し、６８μＬのＣＨＯ酵素液（１）を添加し、３７℃、１０分間保温した。次いで、２５μＬのＣＨＯ酵素液（２）を添加し、３７℃、１０分間保温した。得られた反応物について、５５０ｎｍにて吸光度を測定し、ＨＤＬ－Ｃ１８０Ａを標準としてコレステロール含量を算出（ＨＤＬ－Ｃ１８０Ａのトリグリセリド濃度は、１５２．６７ｍｇ／ｄＬ）した。
６．遺伝子発現量の解析
　培地Ｂで３日間又は６日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）＋Ｄｉｒｅｃｔ　ｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、製造元の指示書に従って用いて抽出した。
　抽出した総ＲＮＡサンプルの品質をバイオアナライザ（アジレント・テクノロジー株式会社）で評価した後、マイクロアレイ解析（アジレント・テクノロジー株式会社）を製造元の指示書に従って実施し、脂肪肝関連遺伝子であるＦＡＳＮ、ＳＲＥＢＦ１、Ｇ６ＰＣ、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＥＴＰ、ＧＣＫ、及びＰＣＫ１の発現量を解析した。
７．灌流液、培地
　灌流液Ａ、灌流液Ｂ、灌流液Ｃ、培地Ａ、培地Ｂ、培地Ｃ、及び培地Ｄは以下の組成のものを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
ＩＩ．結果
１．ＤＭＳＯ含有培地中で培養した培養上清中のリポタンパク質の解析結果
　図１は、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））又は培地Ｃ（ＤＭＳＯ（－））で５日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓを示す。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ（図１、左）においては、培地Ｃ（ＤＭＳＯ（－））で培養した場合（図１、右）と比べて多くの（およそ２倍）脂肪滴（白色で示される）が観察された。いずれの場合においても、ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓは単層細胞培養物を形成した。
　また、図２に、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））又は培地Ｃ（ＤＭＳＯ（－））で５日間の培養後に回収した培養上清中のリポタンパク質（ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、及びＨＤＬを含む）の総中性脂肪（トリグリセリド）含量の測定結果を示す。結果は、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培養上清中の当該含有量を「１００」とする相対値にて示す。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓでは、培地Ｃ（ＤＭＳＯ（－））で培養した場合と比べて高い（およそ９倍）リポタンパク質中の総中性脂肪（トリグリセリド）の分泌が認められた。
　これらの結果より、ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓを、ＤＭＳＯ含有の培地中で培養することにより、脂質の蓄積及び分泌を高く維持できることが確認された。
２．ＤＭＳＯ含有培地中で５～１４日間培養した培養上清中のリポタンパク質の解析結果
　図３に、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で５、９、１２、及び１４日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ、ならびに既知肝細胞（ＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ７細胞）の各培養上清中のリポタンパク質の解析結果を示す。
　ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓにおいては、培養上清における総コレステロール及び総中性脂肪（トリグリセリド）の含量は共に、５日間培養した後に最も高い値が認められ、９日間、１２日間、及び１４日間の培養後においては、それらの含量は共に若干低下するものの、維持されていた。
　一方、ＨｅｐＧ２細胞の培養上清における総コレステロール及び総中性脂肪（トリグリセリド）の含量は共に、ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓのそれらと比べて顕著に低いことが確認された。また、ＨｕＨ７細胞の培養上清における総コレステロール含量は、１２日間、及び１４日間培養後のＰＸＢ－ｃｅｌｌｓのそれと匹敵するものであったが、総中性脂肪（トリグリセリド）の含量は、ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓのそれと比べて顕著に低いことが確認された。
　さらに、培養上清中に含まれるリポタンパク質の４種のサブグループについて解析した結果を図４に示す。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓにおいては培養期間に関わらず、コレステロール及び中性脂肪（トリグリセリド）のいずれにおいても、ＶＬＤＬが最も多く存在することが確認された。以下に、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で５日間、９日間、１２日間、及び１４日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培養上清中のリポタンパク質の解析結果（ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬの含有比（重量比））を示す。
・５日間培養
（コレステロール）
ＣＭ：ＶＬＤＬ：ＬＤＬ：ＨＤＬ＝３：８６：８：３
（中性脂肪（トリグリセリド））
ＣＭ：ＶＬＤＬ：ＬＤＬ：ＨＤＬ＝３：９１：５：１
・９日間培養
（コレステロール）
ＣＭ：ＶＬＤＬ：ＬＤＬ：ＨＤＬ＝４：８２：９：２
（中性脂肪（トリグリセリド））
ＣＭ：ＶＬＤＬ：ＬＤＬ：ＨＤＬ＝３：９０：６：１
・１２日間培養
（コレステロール）
ＣＭ：ＶＬＤＬ：ＬＤＬ：ＨＤＬ＝２：８０：９：３
（中性脂肪（トリグリセリド））
ＣＭ：ＶＬＤＬ：ＬＤＬ：ＨＤＬ＝３：９０：６：１
・１４日間培養
（コレステロール）
ＣＭ：ＶＬＤＬ：ＬＤＬ：ＨＤＬ＝１：７９：１４：６
（中性脂肪（トリグリセリド））
ＣＭ：ＶＬＤＬ：ＬＤＬ：ＨＤＬ＝２：９１：６：１
　一方、ＨｕＨ７細胞においては、コレステロール及び中性脂肪（トリグリセリド）のいずれについても、培養上清中にはＬＤＬが最も多く、同条件で培養したＨｅｐＧ２細胞においては、コレステロール及び中性脂肪（トリグリセリド）のいずれについても、培養上清中にはＨＤＬが最も多く存在した。
　また、ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓで観察されたＶＬＤＬのピークは、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｕＨ７細胞の培養上清中においては観察されず、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓにおいて特異的に分泌されていることが確認された。
　さらに、培養上清中に含まれるＶＬＤＬについて、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬ、Ｍｅｄｉｕｍ－ＶＬＤＬ、及びＳｍａｌｌ－ＶＬＤＬの中性脂肪（トリグリセリド）量を解析した結果を表５に示す。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で１３日間培養した後、培地Ｄで２日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ；Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｔ　Ｎｏ．ＭＩＬ２１４－１００Ｍ：ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）で１日間培養した後、培地Ｄで２日間培養した健常者（既往症無し）より単離された新鮮なヒト肝細胞（ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）（ＦＨＨ）；ならびに、培地Ａで２日間培養した後、培地Ｄで２日培養したＨｅｐＧ２細胞、及びＨｕＨ７細胞；の各培養上清の解析結果を示す。
　培養上清中のＶＬＤＬ全体に占めるＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬの割合は、ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓでは８１．５％（４０．９／５０．２）、ＦＨＨでは６９．２％（７８．６／１１３．５）、ＨｅｐＧ２細胞では０％、ＨｕＨ７細胞では１．９％であった。培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓが、顕著に高いＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬ含有割合を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
３．ＤＭＳＯ含有培地中で５～１４日間培養した細胞中のリポタンパク質の解析結果
　図５に、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で５、９、１２、及び１４日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ、ならびに既知肝細胞（ＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ７細胞）の各細胞中のリポタンパク質の解析結果を示す。
　ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓにおいては、総コレステロールの含量は５日間培養した後に最も低い値が認められ、９日間、１２日間、及び１４日間の培養後にそれらの含量は共に若干増加した。総中性脂肪（トリグリセリド）の含量は、５日間培養した後に最も高い値が認められ、１９日間、１２日間、及び１４日間の培養後にそれらの含量は共に若干低下するものの、維持されていた。
　一方、ＨｅｐＧ２細胞の総コレステロール及び総中性脂肪（トリグリセリド）の含量は共に、ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓのそれらと比べて顕著に低いことが確認された。また、ＨｕＨ７細胞の総中性脂肪（トリグリセリド）含量は、９日間、１２日間、及び１４日間の培養後のＰＸＢ－ｃｅｌｌｓに匹敵することが確認されたが、５日間培養した後のＰＸＢ－ｃｅｌｌｓのそれと比べて顕著に低いことが確認された。総コレステロールについては、全期間のＰＸＢ－ｃｅｌｌｓに匹敵することが確認された。
　これらの結果より、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で培養することによってＰＸＢ－ｃｅｌｌｓは少なくとも２週間近くにわたって脂質（コレステロール及び中性脂肪（トリグリセリド））の蓄積、及び分泌を維持できることが確認された。特に、６日間の培養において最も高い中性脂肪（トリグリセリド））の蓄積、及びコレステロール及び中性脂肪（トリグリセリド）の分泌が確認された。さらに分泌されたリポタンパク質は、ＶＬＤＬを最も多く含むものであることが確認された。このような性質は、従来既知の肝細胞（ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞）においては認められず、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で培養されたＰＸＢ－ｃｅｌｌｓが従来既知の肝細胞とは異なる特性を有することが確認された。
４．脂肪肝関連遺伝子の発現量
　図６に、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で３日間、及び６日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓにおける脂肪肝関連遺伝子（ＦＡＳＮ、ＳＲＥＢＦ１、Ｇ６ＰＣ）の発現量を解析した結果を示す。結果は、培養３日目の各遺伝子の発現量を「１」とする相対値にて示す。いずれの遺伝子についても、培養３日目より培養６日間において発現量の上昇が認められた。また、図６には示さないが、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＥＴＰ、ＧＣＫ、及びＰＣＫ１についても同様に、培養３日目より培養６日間において発現量の上昇が認められた。
　以上の結果より、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））で培養されたＰＸＢ－ｃｅｌｌｓは、脂質の蓄積、分泌を維持することができ、また、脂肪肝関連遺伝子の発現も伴うことから、ヒト脂肪肝モデル細胞として利用し得ることが確認された。
ＩＩＩ．Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬを指標としたヒト脂肪肝に効果を有する物質のスクリーニング
（１－１）オレイン酸の添加
・細胞の調製
　ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓを、培地Ａにて希釈した。希釈した細胞懸濁液５００μＬを培養プレートの各Ｗｅｌｌに静かに注ぎ、細胞が底面に軽く接着するまで約２０分間静置した後、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、培養した。播種の翌日培地Ａを除去して、５００μＬの培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））を添加し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、１３日間培養した。培養終了後、下記試験に用いた。
・スクリーニング試験
　被験物質として、肝細胞における脂質蓄積を促すことが知られているオレイン酸を用いた。
　上記調製したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培地を、オレイン酸を０．７５ｍＭの量で含む培地Ｄに交換し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、２日間培養した。
培養終了後、上記「培養上清中のリポタンパク質の解析」及び「細胞中のリポタンパク質の解析」に記載の手法にて、培養上清中及び細胞中の総コレステロール及び総中性脂肪（トリグリセリド）をそれぞれ測定した。
　対照には、オレイン酸の代わりに、培地Ｄ（５μＬ）のみを添加した。
（１－２）オレイン酸添加の結果
　図７に、オレイン酸を添加して、２日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培養上清におけるリポタンパク質の各サブグループにおける中性脂肪（トリグリセリド）含量について解析した結果（Ａ）、ならびに、培養上清のＶＬＤＬについて、Ｌａｒｇｅ、Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｍａｌｌの各サイズの中性脂肪（トリグリセリド）含量について解析した結果（Ｂ）を示す。
　オレイン酸の添加により、培養上清のＶＬＤＬが顕著に増加することが確認された。そして、当該ＶＬＤＬの中でも、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬのみについて有意な増加が確認された。
　また、オレイン酸を添加した細胞中の中性脂肪（トリグリセリド）含量の増加も確認された（データ示さず）。また、培養上清及び細胞中のコレステロール含量も、中性脂肪（トリグリセリド）含量と同様の推移が確認された（データ示さず）。
（２－１）ロミタピドの添加
・細胞の調製
　上記（１－１）にて記載した「細胞の調製」の方法において、培地Ｂ（ＤＭＳＯ（＋））での培養を６日間とした以外は、同様にしてＰＸＢ－ｃｅｌｌｓを調製し、下記試験に用いた。
・スクリーニング試験
　被験物質として、高脂血症治療薬として知られるロミタピド（東京化成）を用いた。
　上記調製したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培地を、ロミタピドを１ｎＭ、５ｎＭの量でそれぞれ含む培地Ｄに交換し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、２日間培養した。培養終了後、上記「培養上清中のリポタンパク質の解析」及び「細胞中のリポタンパク質の解析」に記載の手法にて、培養上清中及び細胞中のコレステロール及び中性脂肪（トリグリセリド）をそれぞれ測定した。
　対照には、ロミタピドの代わりに、エタノール（５μＬ）のみを添加した。
（２－２）ロミタピド添加の結果
　図８に、ロミタピド添加して、２日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培養上清におけるリポタンパク質の各サブグループにおける中性脂肪（トリグリセリド）含量について解析した結果（Ａ）、ならびに、培養上清のＶＬＤＬについて、Ｌａｒｇｅ、Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｍａｌｌの各サイズの中性脂肪（トリグリセリド）含量について解析した結果（Ｂ）を示す。
　５ｎＭのロミタピドの添加により、培養上清のＶＬＤＬが顕著に低下することが確認された。そして、当該ＶＬＤＬの中でも、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬのみについて有意な低下が確認された。
　一方、ロミタピドを添加した細胞中の中性脂肪（トリグリセリド）含量に変化は確認されなかった（データ示さず）。また、培養上清及び細胞中のコレステロール含量も、中性脂肪（トリグリセリド）含量と同様の推移が確認された（データ示さず）。
（３－１）フェノフィブラートの添加
・細胞の調製
　上記（１－１）にて記載した「細胞の調製」の方法と同様にしてＰＸＢ－ｃｅｌｌｓを調製し、下記試験に用いた。
・スクリーニング試験
　被験物質として、高脂血症治療薬と知られるフェノフィブラート（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。
　上記調製したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培地を、フェノフィブラートを１０μＭ，５０μＭ，１００μＭの量でそれぞれ含む培地Ｄに交換し、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）へ静かに移し、２日間培養した。培養終了後、上記「培養上清中のリポタンパク質の解析」及び「細胞中のリポタンパク質の解析」に記載の手法にて、培養上清中及び細胞中のコレステロール及び中性脂肪（トリグリセリド）をそれぞれ測定した。
　対照には、フェノフィブラートの代わりに、エタノール（５μＬ）のみを添加した。
（３－２）フェノフィブラート添加の結果
　図９に、フェノフィブラート添加して、２日間培養したＰＸＢ－ｃｅｌｌｓの培養上清におけるリポタンパク質の各サブグループにおける中性脂肪（トリグリセリド）含量について解析した結果（Ａ）、ならびに、培養上清のＶＬＤＬについて、Ｌａｒｇｅ、Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｍａｌｌの各サイズの中性脂肪（トリグリセリド）含量について解析した結果（Ｂ）を示す。
　１０μＭ，５０μＭ，１００μＭのフェノフィブラートの添加により、培養上清のＶＬＤＬが顕著に低下することが確認された。また、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬ、Ｍｅｄｉｕｍ－ＶＬＤＬ、Ｓｍａｌｌ－ＶＬＤＬのいずれにおいても、有意な低下が確認された。
　一方、フェノフィブラートを添加した細胞中の中性脂肪（トリグリセリド）含量に変化は確認されなかった（データ示さず）。また、培養上清及び細胞中のコレステロール含量も、中性脂肪（トリグリセリド）含量と同様の推移が確認された（データ示さず）。
　これらの結果より、ＤＭＳＯ含有培地中で培養して調製された、脂肪肝由来のヒト肝細胞によれば、培養上清中のＶＬＤＬ、特にＬａｒｇｅ－ＶＬＤＬ、の量（特にその中性脂肪（トリグリセリド）量）の増減を指標にして、脂質異常に悪影響を及ぼす物質（オレイン酸等）や、脂質代謝改善剤や高脂血症治療薬等をはじめとする、脂質異常の予防、治療又は改善に有効な物質（ロミタピド、フェノフィブラート等）をスクリーニングできることが確認された。

 

Claims (6)

  1. 　培養上清中の超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の増減を指標にして、脂質異常に効果を有する物質のスクリーニング方法に使用するための、ヒト脂肪肝モデル細胞であって、
    　該細胞の培養上清がＶＬＤＬ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を含有し、該ＶＬＤＬが該ＬＤＬよりも多く含むことを特徴とする、細胞。
  2. 　単層細胞培養物である、請求項１に記載の細胞。
  3. 　前記ＶＬＤＬが、Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬ、Ｍｅｄｉｕｍ－ＶＬＤＬ、及びＳｍａｌｌ－ＶＬＤＬを含み、該Ｌａｒｇｅ－ＶＬＤＬをＶＬＤＬ全体の７０質量％以上の割合で含む、請求項１又は２に記載の細胞。
  4. 　脂肪肝由来のヒト肝細胞を、ジメチルスルホキシドを含む培地中にて培養して得られた細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞。
  5. 　脂肪肝由来のヒト肝細胞が、ヒト肝細胞を有するキメラ非ヒト動物より回収されたものである、請求項４に記載の細胞。
  6. 　脂質異常に効果を有する物質のスクリーニング方法であって、
    　請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞に被検物質を投与する工程、ならびに、
    　被験物質を投与した細胞と投与されていない細胞との間で培養上清中の超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の量を比較する工程、を含む方法。

     
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Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07274951A (ja) 1994-04-11 1995-10-24 Res Dev Corp Of Japan 初代培養肝細胞の継代培養系
JPH08112092A (ja) 1994-08-23 1996-05-07 Res Dev Corp Of Japan クローン性増殖能を有する肝実質細胞とその取得 方法、並びにその継代培養方法
JPH0915225A (ja) 1995-04-28 1997-01-17 Tosoh Corp 血清リポタンパク質の分析方法
JPH09313172A (ja) 1996-05-28 1997-12-09 Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan 小型肝細胞の培養方法
JPH10179148A (ja) 1996-12-26 1998-07-07 Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan ヒト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養 および継代培養方法
US6004810A (en) 1994-04-11 1999-12-21 Research Development Corporation Of Japan Liver parenchymal cells having clonal growth ability, method for obtaining same, method for subculturing same, and subculturing system of primary hepatocytes
JP2002045087A (ja) 2000-05-19 2002-02-12 Japan Science & Technology Corp キメラ動物
WO2007052789A1 (ja) 2005-11-04 2007-05-10 Skylight Biotech Inc. 大血管障害を判別するためのリポタンパク質の分析方法
JP2007228962A (ja) 2006-01-31 2007-09-13 Hiroshima Industrial Promotion Organization ヒト肝細胞キメララットの作製方法
WO2008001614A1 (fr) 2006-06-29 2008-01-03 Hiroshima Industrial Promotion Organization Modèle animalier de stéatohépatite non alcoolique et modèle animalier de stéatose hépatique
WO2013145331A1 (ja) 2012-03-27 2013-10-03 株式会社トランスジェニック ヒト化マウス
JP2014204713A (ja) * 2013-03-21 2014-10-30 秋田県 肝細胞分化ステージを評価する新規測定法
JP2021030911A (ja) 2019-08-26 2021-03-01 マツダ株式会社 車両の後部構造
WO2021038892A1 (ja) * 2019-08-26 2021-03-04 株式会社フェニックスバイオ ヒト脂肪肝モデル細胞

Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07274951A (ja) 1994-04-11 1995-10-24 Res Dev Corp Of Japan 初代培養肝細胞の継代培養系
US6004810A (en) 1994-04-11 1999-12-21 Research Development Corporation Of Japan Liver parenchymal cells having clonal growth ability, method for obtaining same, method for subculturing same, and subculturing system of primary hepatocytes
JP3157984B2 (ja) 1994-04-11 2001-04-23 科学技術振興事業団 初代培養肝細胞の継代培養系
JPH08112092A (ja) 1994-08-23 1996-05-07 Res Dev Corp Of Japan クローン性増殖能を有する肝実質細胞とその取得 方法、並びにその継代培養方法
JP3266766B2 (ja) 1994-08-23 2002-03-18 科学技術振興事業団 ローン性増殖能を有する肝実質細胞とその取得方法、並びにその継代培養方法
JPH0915225A (ja) 1995-04-28 1997-01-17 Tosoh Corp 血清リポタンパク質の分析方法
JPH09313172A (ja) 1996-05-28 1997-12-09 Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan 小型肝細胞の培養方法
JP3014322B2 (ja) 1996-05-28 2000-02-28 科学技術振興事業団 小型肝細胞の培養方法
JP3211941B2 (ja) 1996-12-26 2001-09-25 科学技術振興事業団 ヒト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養および継代培養方法
JPH10179148A (ja) 1996-12-26 1998-07-07 Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan ヒト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養 および継代培養方法
JP2002045087A (ja) 2000-05-19 2002-02-12 Japan Science & Technology Corp キメラ動物
WO2007052789A1 (ja) 2005-11-04 2007-05-10 Skylight Biotech Inc. 大血管障害を判別するためのリポタンパク質の分析方法
JP2007228962A (ja) 2006-01-31 2007-09-13 Hiroshima Industrial Promotion Organization ヒト肝細胞キメララットの作製方法
WO2008001614A1 (fr) 2006-06-29 2008-01-03 Hiroshima Industrial Promotion Organization Modèle animalier de stéatohépatite non alcoolique et modèle animalier de stéatose hépatique
WO2013145331A1 (ja) 2012-03-27 2013-10-03 株式会社トランスジェニック ヒト化マウス
JP2014204713A (ja) * 2013-03-21 2014-10-30 秋田県 肝細胞分化ステージを評価する新規測定法
JP2021030911A (ja) 2019-08-26 2021-03-01 マツダ株式会社 車両の後部構造
WO2021038892A1 (ja) * 2019-08-26 2021-03-04 株式会社フェニックスバイオ ヒト脂肪肝モデル細胞

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARTERIOSCLER THROMB VASC BIOL, vol. 25, 2005, pages 1 - 8
HATA KEISHI, TOMATSU SAYAKA, TAKAHASHI MASAKI, SASAKI AKIRA, UMEKAWA YUI, MIYASHITA KAZUYA, OGURA KAZUMI, TOSHIMA GEN, MAEDA MASAH: "Lipoprotein profile and lipid metabolism of PXB-cells ® , human primary he- patocytes from liver-humanized mice: proposal of novel in vitro system for screening anti-lipidemic drugs", BIOMEDICAL RESEARCH, BIOMEDICAL RESEARCH PRESS INC, SAPPORO JAPAN, vol. 41, no. 1, 1 February 2020 (2020-02-01), Sapporo Japan , pages 33 - 42, XP055962298, ISSN: 0388-6107, DOI: 10.2220/biomedres.41.33 *
KENNETH R ET AL., INTRODUCTION TO LIPIDS AND LIPOPROTEINS, 19 January 2021 (2021-01-19)
KINIWA ET AL., THE JOURNAL OF JAPANESE COLLEGE OF ANGIOLOGY, vol. 46, 2006, pages 441 - 448
OKAZAKI, THE PHYSICO-CHEMICAL BIOLOGY, vol. 49, no. 4, 2005, pages 111 - 118
RONALD M KRAUSS, DIABETES CARE, vol. 27, no. 6, June 2004 (2004-06-01), pages 1496 - 504
TRANSPLANTATION, vol. 60, no. 7, 1995, pages 740 - 7
YANG, H ET AL., CELL, vol. 154, 2013, pages 1370 - 1379

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