JP6894674B2 - 肝臓組織再生用組成物 - Google Patents
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Description
[1]ヒト歯髄幹細胞を有効成分として含む、哺乳動物の肝臓組織再生用組成物。
[2]前記ヒト歯髄幹細胞が肝細胞に分化している、[1]に記載の肝臓組織再生用組成物。
[3]前記ヒト歯髄幹細胞がヒト乳歯歯髄幹細胞である、[1]または[2]に記載の肝臓組織再生用組成物。
[4]前記ヒト歯髄幹細胞が、CD29、CD73、CD90、CD105およびCD166を発現し、CD34、CD45およびCD133を発現しない、[1]〜[3]のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
[5]ヒトの肝疾患を治療するための、[1]〜[4]のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
[6]非ヒト哺乳動物の肝疾患を治療するための、[1]〜[4]のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
[7]肝疾患の治療の対象となる前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の体重15kg当たり5×106〜4×1010個のヒト歯髄幹細胞が、前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与される、[5]または[6]に記載の肝臓組織再生用組成物。
[8]前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の脾洞に投与される、[1]〜[7]のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
[9]前記肝疾患が、肝臓がん、肝不全、肝硬変、肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患および転移性がん、ならびに、がんの化学療法に起因する副作用に対し補助療法を必要とする病態からなる群から選択される、[5]〜[8]のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
自然脱落直前に抜去したヒトの乳歯または親知らずなどの永久歯をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液で消毒した後、滅菌した抜髄針またはスプーンエキスカベータ―を用いて、歯根管または歯髄腔を介して歯髄組織を採取する。
採取した歯髄組織を、それぞれ4mg/mlのコラゲナーゼIおよびディスパーゼにより、37℃で1時間処理する。
酵素処理により得られた細胞懸濁液を、面積25cm2のディッシュに播種し、10%ウシ胎仔血清(FBS)、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび0.25μg/mlのアムホテリシンBを含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で、CO2濃度5%の下で培養する。培養細胞が85〜90%のコンフルエントに達するまで細胞を培養し、面積25cm2の新たなディッシュに約105個/cm2となるように播種する。
培養細胞を、トリプシン処理等によりディッシュから剥離した後、遠心処理を施すことによって細胞を回収して、ハンクス平衡塩溶液(HBSS:Hanks’ Balanced Salt Solution)に約2×106個/100μlとなるように再懸濁する。このようにして回収した細胞を、本発明で使用する歯髄幹細胞として用いる。
(1)血中総コレステロール濃度
(2)血中アルブミン濃度
(3)ヘパプラスチンテスト(HPT)の値
(4)血中IV型コラーゲン濃度
(5)血中アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)濃度
(6)血中ヒアルロン酸濃度
具体的には、肝疾患に罹患した哺乳動物の個体において、本発明の組成物を適用した場合に、上記パラメータの少なくとも1つが正常個体と同程度の値となるか、または、正常個体の値に近づく傾向を示した場合に、本発明の組成物が肝疾患に対する治療効果を有するものであると判断する。
常法に従い、6〜12歳の健常なヒトから乳歯を採取した。なお、乳歯の採取、ならびに採取した乳歯の歯髄幹細胞の調製および使用については、事前に対象またはその保護者に説明し、同意を得てから行った。採取した乳歯から、滅菌した抜髄針を用いて歯根管を介して歯髄組織を採取した。採取した歯髄組織を、4mg/mlのディスパーゼII(GIBCO社製、製品番号:1728484)および4mg/mlのコラゲナーゼI(和光純薬工業株式会社製、製品番号:CTH2297)を用いて37℃で1時間消化した。消化後の細胞懸濁液を、面積25cm2のディッシュ(TPP社製)を用いて、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Invitrogen社製、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび0.25μg/mlのアムホテリシンBを含有)で、CO2濃度5%の雰囲気下、37℃の環境下で培養した。培養細胞が85〜90%のコンフルエントに達するまで培養した後、新たなディッシュに1×105個/cm2となるように継代した。
マイクロミニブタを用いて、以下の手順で肝疾患(非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD))罹患の動物モデルを作製した。
(1)血中総コレステロール濃度:214mg/dl
(2)血中アルブミン濃度:4.192mg/dl
(3)ヘパプラスチンテスト(HPT)の値:21.9%
(4)血中IV型コラーゲン濃度:0.095μg/ml
(5)血中アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)濃度:32U/l
(6)血中ヒアルロン酸濃度:32ng/ml
(1)血中総コレステロール濃度については、コレステロール脱水素酵素(UV)法を用いて測定した。
(2)血中アルブミン濃度については、ネフェロメトリー(BCP改良法)を用いて測定した。
(3)ヘパプラスチンテスト(HPT)値については、凝固時間測定を用いて測定した。
(4)血中IV型コラーゲン濃度については、Type IV collagen ELISA kit, ACB(フナコシ株式会社製)を用いて測定した。
(5)血中アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)濃度については、JSCC標準化対応法を用いて測定した。
(6)血中ヒアルロン酸濃度については、ラテックス凝集免疫比濁法を用いて測定した。
(1)血中総コレステロール濃度:87mg/dl
(2)血中アルブミン濃度:1.768mg/dl
(3)ヘパプラスチンテスト(HPT)の値:6.9%
(4)血中IV型コラーゲン濃度:0.998μg/ml
(5)血中アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)濃度:246U/l
(6)血中ヒアルロン酸濃度:51ng/ml
上述した方法により調製された、歯髄幹細胞を含む本発明の組成物を、上述した方法により作製された肝疾患罹患モデルの脾臓に適用して、本発明の組成物の肝疾患治療効果について検討した。
Claims (8)
- ヒト永久歯由来歯髄幹細胞を有効成分として含む、哺乳動物の肝臓組織再生用組成物。
- 前記ヒト永久歯由来歯髄幹細胞が肝細胞に分化している、請求項1に記載の肝臓組織再生用組成物。
- 前記ヒト永久歯由来歯髄幹細胞が、CD29、CD73、CD90、CD105およびCD166を発現し、CD34、CD45およびCD133を発現しない、請求項1または2に記載の肝臓組織再生用組成物。
- ヒトの肝疾患を治療するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
- 非ヒト哺乳動物の肝疾患を治療するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
- 肝疾患の治療の対象となる前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の体重15kg当たり5×106〜4×1010個のヒト永久歯由来歯髄幹細胞が、前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与される、請求項4または5に記載の肝臓組織再生用組成物。
- 前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の脾洞に投与される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
- 肝臓がん、肝不全、肝硬変、肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患および転移性がん、ならびに、がんの化学療法に起因する副作用に対し補助療法を必要とする病態からなる群から選択される少なくとも1つの肝疾患を治療するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
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