TW202020144A - 源自齒髓的細胞之製造方法 - Google Patents

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細田勇喜
渡部俊介
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串田尙
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Abstract

本發明揭示可作為藥劑而對人類投予的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞及其製造方法。該製造方法包含：(a)將齒髓以蛋白酶消化而製備齒髓之懸浮物的步驟；(b)培養該懸浮物而使該懸浮物所包含之多潛能幹細胞增殖的步驟；(c)使該經增殖的多潛能幹細胞成為懸浮於第一冷凍保存液之狀態而進行冷凍的步驟；(d)使該經冷凍的多潛能幹細胞解凍的步驟；(e)以黏著在粒子之表面的狀態培養該經解凍的多潛能幹細胞，而使多潛能幹細胞在該粒子之表面增殖的步驟；及(f)使該粒子與蛋白酶接觸，而使黏著在該粒子之表面的多潛能幹細胞自該粒子分離，而製備多潛能幹細胞之懸浮物的步驟。

Description

源自齒髓的細胞之製造方法
本發明有關於從齒髓可獲得之具有軟骨細胞分化能力及骨細胞分化能力的多潛能幹細胞，且有關於例如此種多潛能幹細胞之製造方法。
具有往複數系統之細胞的分化能力之幹細胞(多潛能幹細胞)已知可從多種組織得到。自骨髓所單離的間葉系幹細胞為其之一，具有分化為骨細胞、心肌細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等多種細胞之能力(專利文獻1~4)。利用此分化能力，而嘗試間葉系幹細胞對多種組織之再生醫療的應用。例如，為了使因心肌梗塞而壞死的心肌再生，而嘗試間葉系幹細胞之對心肌梗塞患者的投予，且已報告因此而患者的心臟功能改善(非專利文獻1)。
間葉系幹細胞係如上所述，已知並不受限於骨髓而可自脂肪組織(專利文獻5)、胎盤組織及臍帶組織(專利文獻6)等多種組織取得。
自齒組織亦可取得多潛能幹細胞，已報告例如多潛能幹細胞可自齒髓(專利文獻7~11)、齒濾泡(專利文獻12)、齒囊(專利文獻11、13)、齒乳突(專利文獻14)、齒根膜(專利文獻15)等取得。源自齒組織的多潛能幹細胞，一般被認為具有往脂肪細胞的分化能力(非專利文獻2~4)。
自齒髓之多潛能幹細胞的取得，係大致以以下的 程序進行(專利文獻16)。將軋碎被拔除齒(extracted tooth)所得之組織，以I型膠原蛋白酶與Dispase(註冊商標)來處理，通過過濾器而去除細胞塊，得到細胞之懸浮液。其次使用含20% FBS的DMEM培養基而使細胞在細胞培養盤內增殖。將附著在細胞培養盤之內面而增殖的細胞進行胰蛋白酶處理而剝離，且將其回收。如此進行所回收的細胞被認為是源自齒髓的多潛能幹細胞。此外，Dispase為源自多黏桿菌(Bacillus polymyxa)的中性蛋白酶。
齒髓係充滿牙齒的齒髓腔的疏鬆性結締組織，根據存在部位而被區分為冠部齒髓與根部齒髓。又，源自齒組織的多潛能幹細胞，一般被認為具有往脂肪細胞的分化能力(非專利文獻2~4)，另一方面，源自齒髓的幹細胞有不分化為脂肪細胞的報告(專利文獻8)。亦即，自齒髓所取得之幹細胞中有可根據往脂肪細胞的分化能力之有無而區別的至少2種類型存在的可能性。又，自乳齒的齒髓所取得之幹細胞，與自恆齒的齒髓所取得者比較，係具有高的增殖能力，且亦已報告高度表現FGF2、TGF-β、第I型膠原蛋白及第III型膠原蛋白等，與存在於恆齒的齒髓之幹細胞係性狀不同(專利文獻16)。其他，亦有顯示源自齒髓的多潛能幹細胞與往成骨細胞(osteoblast)的分化誘導有關，且與源自骨髓的間葉系幹細胞性質不同的報告(專利文獻11)。
源自齒髓的多潛能幹細胞，係被期待作為神經疾病治療劑的用途等之臨床應用(專利文獻17)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]美國專利第5486359號
[專利文獻2]美國專利第5827740號
[專利文獻3]美國專利第6835377號
[專利文獻4]美國專利第6387369號
[專利文獻5]日本特開2004-129549
[專利文獻6]日本特開2004-210713
[專利文獻7]日本特開2010-252778
[專利文獻8]WO2002/007679
[專利文獻9]日本特表2008-507962
[專利文獻10]WO2009/072527
[專利文獻11]日本特開2004-201612
[專利文獻12]日本特表2009-527223
[專利文獻13]日本特表2005-516616
[專利文獻14]日本特開2006-238875
[專利文獻15]日本特開2008-295420
[專利文獻16]日本特開2010-268715
[專利文獻17]日本特開2011-219432
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Katritsis DG. et. al., Catheter Cardiovasc Interv. 65(3): 321-9 (2005)
[非專利文獻2]Gronthos S. et. al., J Dent Res. 81(8): 531-5 (2002)
[非專利文獻3]Tirino V. et. al., Stem Cell Rev. 7(3): 608-15 (2011)
[非專利文獻4]Vishwanath VR et. al., J Conserv Dent. 16(5): 423-8 (2013)
本發明之一目的為提供一種新穎之源自齒髓的多潛能幹細胞製劑，其對腦中風之治療等有用且可對人類進行投予。本發明之其他目的為提供一種用以效率良好地製造源自齒髓的多潛能幹細胞之方法，其使此種多潛能幹細胞得以以足夠之量穩定供給市場。又，本發明之更進一步的目的為以可維持適於流通、保管之穩定性的形式來製造該細胞。
於朝向上述目的之研究中，本發明人等經專心致力反覆進行研究的結果，發現從自人類的被拔除齒取得的齒髓組織來效率良好地製造多潛能幹細胞經富集之源自齒髓的細胞之方法，完成本發明。亦即，本發明係包含下述者。
1.一種製造方法，其係多潛能幹細胞經富集之源自齒髓的細胞之製造方法，且其係包含下述而成：
(a)將齒髓以蛋白酶消化而製備齒髓之懸浮物的步驟；
(b)培養該懸浮物而使該懸浮物所包含之多潛能幹細胞增殖的步驟；
(c)使該經增殖的多潛能幹細胞成為懸浮於第一冷凍保存液之狀態而進行冷凍的步驟；
(d)使該經冷凍的多潛能幹細胞解凍的步驟；
(e)以黏著在載體粒子之表面的狀態培養該經解凍的多潛能 幹細胞，而使多潛能幹細胞在該載體粒子之表面增殖的步驟；
(f)使該載體粒子與蛋白酶接觸，而使黏著在該載體粒子之表面的多潛能幹細胞自該載體粒子分離的步驟；以及
(g)製備經分離的多潛能幹細胞之懸浮物的步驟。
2.如上述1記載之製造方法，其中於該步驟(c)或(d)中進行該多潛能幹細胞的品質檢查。
3.如上述2記載之製造方法，其中該品質檢查係對於以下細胞進行：自懸浮於該第一冷凍保存液之前的細胞所分取之細胞；自懸浮於該第一冷凍保存液之前的細胞所分取且經繼代之細胞；懸浮於該第一冷凍保存液而分取的冷凍前之細胞、分取並冷凍而剛解凍後之細胞、及/或分取且冷凍、解凍並進一步進行培養所得之細胞。
4.如上述3記載之製造方法，其中該品質檢查係進行關於下述品質檢查a~j的1個或2個以上：
品質檢查a：在光學顯微鏡下觀察時，呈現近似紡錘形的形態之細胞數佔細胞整體的比例為99%以上、99.5%以上、99.9%以上、或99.95%以上之驗證；
品質檢查b：細胞的生存率為50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或95%以上之驗證；
品質檢查c：於細胞的表面抗原標記之表現圖譜(expression pattern)中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性之驗證，或
於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD73及CD90的至少一個為陽性，且CD34為陰性之驗證；
品質檢查d：於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中， CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性之驗證，或
於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性之驗證；
品質檢查e：於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，在以干擾素γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性之驗證，或
於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，在以干擾素γ刺激細胞時，係在CD40為陰性、CD80為陰性、CD86為陰性、及MHC-II型抗原為陽性之中至少任一者之驗證；
品質檢查f：細胞係表現前列腺素E2及/或血管內皮生長因子(VEGF)，且就前列腺素E2而言，藉由以TNFα刺激細胞而其表現量增加之驗證；
品質檢查g：以含有誘導往軟骨細胞之分化的物質的培養基培養時，蛋白聚醣(aggrecan)的表現量增加之驗證；
品質檢查h：以含有誘導往骨細胞之分化的物質的培養基培養時，細胞中之鈣的累積量增加之驗證；
品質檢查i：在細胞培養盤上具有10次以上、14次以上、或15次以上的細胞分裂能力之驗證；
品質檢查j：在細胞培養盤上的細胞之平均倍增時間，於該品質檢查i的實施期間中為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內之驗證。
5.如上述1至4的任一者記載之製造方法，其係進一步包含下述而成：於步驟(g)中，於過濾膜負載該懸浮物，且回收通過的細胞。
6.如上述5記載之製造方法，其中該過濾膜係具有20μm~ 80μm之孔徑者。
7.如上述1至6的任一者記載之製造方法，其中該齒髓係從人類的恆齒或乳齒得到者。
8.如上述1至7的任一者記載之製造方法，其中步驟(a)中所使用的蛋白酶係包含絲胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶或此等之混合物者。
9.如上述1至7的任一者記載之製造方法，其中步驟(a)中所使用的蛋白酶係包含金屬蛋白酶者。
10.如上述1至7的任一者記載之製造方法，其中步驟(a)中所使用的蛋白酶係包含基質金屬蛋白酶、中性金屬蛋白酶或此等之混合物者。
11.如上述1至7的任一者記載之製造方法，其中步驟(a)中所使用的蛋白酶係包含膠原蛋白酶與中性金屬蛋白酶者。
12.如上述11記載之製造方法，其中該膠原蛋白酶係包含I型膠原蛋白酶、II型膠原蛋白酶、或此等之混合物者。
13.如上述10或11記載之製造方法，其中該中性金屬蛋白酶係包含嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、Dispase、或此等之混合物者。
14.如上述1至13的任一者記載之製造方法，其中步驟(c)中所使用的第一冷凍保存液係包含重碳酸林格氏液(bicarbonate Ringer's solution)、人類血清白蛋白、及DMSO而成者。
15.如上述1至14的任一者記載之製造方法，其中步驟(e)中所使用的載體粒子係於膨潤狀態下具有80~300μm之直徑之具有近似球形的形狀者。
16.如上述15記載之製造方法，其中該載體粒子係於膨潤狀態下具有開口於該載體粒子之表面的孔徑3~40μm之孔的多孔性者。
17.如上述1至16的任一者記載之製造方法，其中該載體粒子係包含明膠而成者。
18.如上述1至17的任一者記載之製造方法，其中步驟(f)中所使用的蛋白酶係包含絲胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、或其混合物者。
19.如上述1至17的任一者記載之製造方法，其中步驟(f)中所使用的蛋白酶係包含胰蛋白酶者。
20.如上述1至19的任一者記載之製造方法，其係進一步包含下述而成者：(h)使在步驟(g)得到的該懸浮物成為懸浮於第二冷凍保存液之狀態而進行冷凍的步驟。
21.如上述20記載之製造方法，其中步驟(h)中所使用的第二冷凍保存液係包含重碳酸林格氏液、人類血清白蛋白、及DMSO而成者。
22.如上述1至19記載之製造方法，其中於步驟(g)中，進行該多潛能幹細胞的品質檢查。
23.如上述20或21記載之製造方法，其中於步驟(g)或(h)中，進行該多潛能幹細胞的品質檢查。
24.如上述22或23記載之製造方法，其中該品質檢查係對於以下細胞進行：自懸浮於該第二冷凍保存液之前的細胞所分取之細胞；自懸浮於該第二冷凍保存液之前的細胞所分取且經繼代之細胞；懸浮於該第二冷凍保存液而分取的冷凍前之細胞、分取並冷凍而剛解凍後之細胞、及/或分取且冷凍、解凍並 進一步進行培養所得之細胞。
25.如上述22或24記載之製造方法，其中該品質檢查係進行關於下述品質檢查a’~j’的1個或2個以上：
品質檢查a’：在光學顯微鏡下觀察時，呈現近似紡錘形的形態之細胞數佔細胞整體的比例為99%以上、99.5%以上、99.9%以上、或99.95%以上之驗證；
品質檢查b’：細胞的生存率為50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或95%以上之驗證；
品質檢查c’：於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性之驗證，或
於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD73及CD90的至少一個為陽性，且CD34為陰性之驗證；
品質檢查d’：於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性之驗證，或
於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性之驗證；
品質檢查e’：於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，在以干擾素γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性之驗證，或
於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，在以干擾素γ刺激細胞時，係在CD40為陰性、CD80為陰性、CD86為陰性、及MHC-II型抗原為陽性之中至少任一者之驗證；
品質檢查f’：細胞係表現前列腺素E2及/或血管內皮生長因子(VEGF)，且就前列腺素E2而言，藉由以TNFα刺激細胞而 其表現量增加之驗證；
品質檢查g’：以含有誘導往軟骨細胞之分化的物質的培養基培養時，蛋白聚醣的表現量增加之驗證；
品質檢查h’：以含有誘導往骨細胞之分化的物質的培養基培養時，細胞中之鈣的累積量增加之驗證；
品質檢查i’：在細胞培養盤上細胞具有3次以上、4次以上、或5次以上的細胞分裂能力之驗證；
品質檢查j’：在細胞培養盤上的細胞之平均倍增時間，於該品質檢查i’的實施期間中為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內之驗證。
26.如上述22至25的任一者記載之製造方法，其中於步驟(g)或(h)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之CD107b的陽性率，係比於步驟(c)或(d)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之對應的陽性率還高者。
27.如上述22至26的任一者記載之製造方法，其中於步驟(g)或(h)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之CD39、CD49a、CD61、CD107a、CD107b、及CD143的陽性率，係比於步驟(c)或(d)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之對應的陽性率還高，且
於步驟(g)或(h)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之CD146的陽性率，係比於步驟(c)或(d)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之對應的陽性率還低者。
28.如上述22至27的任一者記載之製造方法，其中於步驟(g)或(h)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之IL-6、HGF、IGFBP-4、IL-11、TIMP-3、及TIMP-2的至少一個的表現 量，係比於步驟(c)或(d)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之對應的表現量還高者。
29.一種以如上述1至28的任一者記載之製造方法得到的細胞。
30.如上述29記載之細胞，其係CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性。
31.如上述30記載之細胞，其係CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性。
32.如上述31記載之細胞，其係藉由干擾素γ刺激時MHC-II型抗原變為陽性者。
33.一種源自齒髓的多潛能幹細胞，其具有以下之(1)~(4)的至少一個所示之特徵：
(1)CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性，藉由干擾素γ刺激時MHC-II型抗原變為陽性者，表現前列腺素E2及/或血管內皮生長因子，且就前列腺素而言，藉由TNFα刺激時表現量增加；
(2)CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45為陰性；
(3)CD47、CD81、及CD147的至少一個為陽性，CD19、CD34、及CD206的至少一個為陰性；
(4)CD47、CD81、及CD147的至少一個為陽性，CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個為陰性。
34.如上述33記載之細胞，其具有往骨細胞及軟骨細胞的 分化能力。
35.如上述33或34記載之細胞，其中在使細胞浮游於培養基中的狀態下之其平均直徑為16~20μm。
36.如上述33至35的任一者記載之細胞，其係在活體外之環境下具有3次以上的細胞分裂能力，且平均倍增時間為96小時以內者。
37.如上述33至35的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其具有以下特徵：
在活體外之環境下經10次以上、15次以上、16次以上、或17次以上的細胞分裂者，且其細胞分裂的平均時間為48小時以內者；
在活體外之環境下具有進行10次以上、14次以上、或15次以上的細胞分裂之能力者，且其細胞分裂的平均時間為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內。
38.如上述33至35的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其具有以下特徵：
在活體外之環境下經16次以上、21次以上、22次以上、或23次以上的細胞分裂者；
在活體外之環境下具有進行3次以上、4次以上、或5次以上的細胞分裂之能力者，且其細胞分裂的平均時間為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內。
39.如上述33至38的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係CD19、CD26、CD106、CD117、及CD271的至少一個 為陰性。
40.如上述33至39的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係CD140b及HLA-A、B、C的至少一個為陽性。
41.如上述33至40的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係CD56及CD146的至少一個為陰性。
42.如上述33至41的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係CD49e及CD95的至少一個為陽性。
43.如上述33至42的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係CD10、CD46、CD47、CD55、CD58、及CD59的至少一個為陽性。
44.如上述33至43的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現MMP-2、IGFBP-4、胱蛋白C(cystatin C)、IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、HGF、VEGF、TIMP-1、TIMP-2、及TIMP-3的至少一個者。
45.如上述33至44的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現GROα、VCAM-I、及IP-10的至少一個者。
46.如上述33至45的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現IL-6者，且為其表現量因TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加者。
47.如上述33至46的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現IL-11者，且為其表現量因TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加者。
48.如上述33至47的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現IP-10者，且為其表現量因TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加者。
49.如上述33至48的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現MCP-1者，且為其表現量因TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加者。
50.如上述33至49的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係因TNF-α刺激而GM-CSF的表現被誘導者。
51.如上述33至50的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現HGF者，且為其表現量因TNF-α刺激而減少及因干擾素γ刺激而增加者。
52.如上述33至51的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現IL-8者，且為其表現量因TNF-α刺激而增加者。
53.如上述33至52的任一者記載之源自齒髓的多潛能幹細胞，其中該齒髓係從人類的恆齒或乳齒得到者。
54.一種組成物，其係於含有人類血清白蛋白與二甲亞碸的重碳酸林格氏液中，以懸浮的狀態包含如上述33至53的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞者。
55.一種組成物，其係於含鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、碳酸氫離子、檸檬酸離子、人類血清白蛋白、及二甲亞碸的溶液中，以懸浮的狀態包含如上述33至53的任一者之源自齒髓的多潛能幹細胞者。
56.如上述55之組成物，其係分別以91~113mM的濃度包含鈉離子，以2.52~3.08mM的濃度包含鉀離子，以0.95~1.16mM的濃度包含鈣離子，以0.315~0.385mM的濃度包含鎂離子，以15.6~19.2mM的濃度包含碳酸氫離子，以1.04~1.28mM的濃度包含檸檬酸離子，以46~56g/L的濃度包含人類血清白蛋白，及以9~11%(v/v)的濃度包含二甲亞碸者。
57.如上述54至56的任一者之組成物，其係進一步包含乙醯色胺酸或其鹽及辛酸或其鹽者。
58.如上述54至57的任一者之組成物，其係以5×106~8×107個/mL的密度包含源自齒髓的多潛能幹細胞者。
59.如上述54至58的任一者之組成物，其係以1~20mL的量被封人容器者。
60.如上述59之組成物，其中該容器為玻璃或塑膠製。
61.如上述54至60的任一者之組成物，其係冷凍狀態者。
62.一種醫藥組成物，其係包含如上述54至61的任一者之組成物者。
63.如上述62之醫藥組成物，其係選自包含自體免疫疾病、發炎性疾病、類風溼性關節炎、克隆氏病、慢性發炎性腸病、心肌梗塞、腦中風(包含慢性期腦中風、急性期腦中風)、慢性發炎去髓鞘型多發性神經病變(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡、肝硬化(包含失代償性肝硬化(decompensated cirrhosis))、敗血症、骨關節炎、乾癬、及器官移植物排斥之群組的疾病之治療劑。
64.如上述62之醫藥組成物，其係用以於選自包含自體免疫疾病、發炎性疾病、類風溼性關節炎、克隆氏病、慢性發炎性腸病、心肌梗塞、腦中風(包含慢性期腦中風、急性期腦中風)、慢性發炎去髓鞘型多發性神經病變、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡、肝硬化(包含失代償性肝硬化)、敗血症、骨關節炎、乾癬、及器官移植物排斥之群組的疾病之治療中使用。
若根據本發明，則可提供一種新穎之源自齒髓的多潛能幹細胞製劑，其對腦中風之治療等有用且可對人類進行投予。又，若根據本發明，則可效率良好地製造此種多潛能幹細胞經富集且可對人類投予之源自齒髓的細胞(多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞)，因此能夠因應需求而穩定供給含有其作為有效成分而成之醫藥品。又，能以穩定的形式提供多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，因而亦可避免流通或保管中的品質劣化之疑慮。
[圖1]圖1係呈示在實施例7及實施例16得到的中間體及源自齒髓的細胞製劑個別所包含之源自齒髓的細胞(中間體細胞、及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞)之細胞粒徑的測定結果之平均的圖表。縱軸表示平均粒徑(μm)。由左依序顯示中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞的平均粒徑。誤差槓表示標準偏差(n=3)。
[圖2]圖2係呈示在實施例7及實施例16得到的源自齒髓的細胞的骨細胞分化能力試驗之結果的圖表。縱軸表示鈣濃度(μg/mL)。針對中間體細胞(實施例7)及源自齒髓的細胞製劑中的細胞(實施例16)個別，黑色棒表示自骨細胞分化誘導組的細胞游離的鈣濃度，白色棒表示自對照組的細胞游離的鈣濃度。
[圖3]圖3係呈示在實施例7及實施例16得到的源自齒髓的細胞的軟骨細胞分化能力試驗之結果的圖表。縱軸表示蛋白聚醣(ACAN)的Ct值。針對中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑中的細胞個別，黑色棒表示軟骨細胞分化誘導組的細胞的蛋白 聚醣(ACAN)之Ct值，白色棒表示對照組的細胞的蛋白聚醣(ACAN)之Ct值。
[圖4]圖4係呈示在實施例7及實施例16得到的源自齒髓的細胞的表面抗原之測定結果的圖表。縱軸表示陽性細胞的比率(%)。針對中間體細胞(黑色棒)及源自齒髓的細胞製劑中的細胞(白色棒)個別，由左依序顯示CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、及CD166之陽性細胞的比率。
[圖5]圖5係呈示在實施例7得到的中間體所包含之源自齒髓的細胞(中間體細胞)的表面抗原之測定結果的圖表。縱軸表示陽性細胞的比率(%)。由左依序個別顯示CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD46、CD47、CD49b、CD49c、CD49f、CD55、CD58、CD59、CD63、CD73、CD81、CD90、CD98、CD140b、CD147、CD151、CD164、CD166、EGF-R(表皮生長因子受體)、及HLA-A、B、C(人類白血球抗原-A、B、C)之陽性細胞的比率。數值係使用平均值，誤差槓表示標準誤差(n=9)。
[圖6]圖6係呈示在實施例16得到的源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞的表面抗原之測定結果的圖表。縱軸表示陽性細胞的比率(%)。由左依序顯示CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD46、CD47、CD49b、CD49c、CD49e、CD49f、CD55、CD58、CD59、CD63、CD73、CD81、CD90、CD95、CD98、CD140b、CD147、CD151、CD164、CD166、EGF-R、及HLA-A、B、C之陽性細胞的比率。數值係使用平均值，誤差槓表示標準誤差(n=7)。
[圖7]圖7係對於在實施例7及實施例16得到的中間體與 製劑之間，該等所包含之源自齒髓的細胞之陽性率之差為10%以上的表面抗原，呈示該等之差(在製劑之陽性率(%)-在中間體之陽性率(%))的圖表。由左依序顯示在CD39、CD49a、CD61、CD107a、CD107b、CD143、及CD146之結果。數值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n=7)。
[圖8]圖8係呈示在實施例7及實施例16得到的中間體及製劑中之源自齒髓的細胞的VEGF分泌能力試驗之結果的圖表。縱軸表示血管內皮生長因子(VEGF)的分泌量(pg/1×105個細胞)。
[圖9]圖9係呈示在實施例7及實施例16得到的中間體及製劑中之源自齒髓的細胞的前列腺素E2(PGE2)分泌能力試驗之結果的圖表。縱軸表示PGE2的分泌量(pg/1×105個細胞)。黑色棒表示在TNFα(腫瘤壞死因子α)刺激組的結果，白色棒表示在TNFα無刺激組的結果。
[圖10]圖10係呈示在實施例7及實施例16得到的源自齒髓的細胞的犬尿胺酸分泌能力試驗之結果的圖表。縱軸係針對中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑中的細胞個別顯示犬尿胺酸的分泌量(ng/1×105個細胞)。
[圖11A]圖11A係呈示在實施例7得到的中間體源自齒髓的細胞的低免疫原性(low immunogenicity)試驗之結果的圖表。縱軸表示陽性細胞的比率(%)。黑色棒表示在IFNγ(干擾素γ)無刺激組的結果，白色棒表示在IFNγ刺激組的結果。由左依序顯示MHC(主要組織相容性)I型抗原、MHC(主要組織相容性)II型抗原、CD40、CD80、及CD86之陽性細胞的比率。
[圖11B]圖11B係呈示在實施例16得到的製劑中之源自齒 髓的細胞的低免疫原性試驗之結果的圖表。縱軸表示陽性細胞的比率(%)。黑色棒表示在IFNγ無刺激組的結果，白色棒表示在IFNγ刺激組的結果。由左依序顯示MHC-I型抗原、MHC-II型抗原、CD40、CD80、及CD86之陽性細胞的比率。
[圖12]圖12係呈示在實施例7及實施例16得到的中間體及製劑個別所包含之源自齒髓的細胞的無刺激時之培養上清液中之細胞介素等各種因子的濃度之測定結果的圖表。縱軸表示各種因子的濃度(pg/1×105個細胞)。針對中間體細胞(黑色棒)及源自齒髓的細胞製劑中的細胞(白色棒)個別，由左依序顯示MMP-2(基質金屬蛋白酶-2)、IGFBP-4(類胰島素生長因子結合蛋白-4)、及胱蛋白C(cystatin C)的濃度。數值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n=3)。
[圖13]圖13係呈示在實施例7及實施例16得到的中間體與製劑個別所包含之源自齒髓的細胞的無刺激時之培養上清液中之細胞介素等各種因子的濃度之測定結果的圖表。縱軸表示各種因子的濃度(pg/1×105個細胞)。針對中間體細胞(黑色棒)及源自齒髓的細胞製劑中的細胞(白色棒)個別，由左依序顯示IL-6(介白素-6)、IL-11(介白素-11)、MCP-1(單核球趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1))、IL-8(介白素-8)、GROα(人類生長調節蛋白α(human growth regulated protein alpha))、HGF(肝細胞生長因子)、VEGF(血管內皮生長因子)、VCAM-1(血管細胞黏著分子-1)、TIMP-3(金屬蛋白酶組織抑制劑-3)、TIMP-2(金屬蛋白酶組織抑制劑-2)、及TIMP-1(金屬蛋白酶組織抑制劑-1)的濃度。數值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n=3)。
[圖14]圖14係呈示在實施例7及實施例16得到的中間體與製劑個別所包含之源自齒髓的細胞的無刺激時之培養上清液中之細胞介素等各種因子的濃度之測定結果之圖。縱軸表示各種因子的濃度(pg/1×105個細胞)。針對中間體(黑色棒)及製劑(白色棒)個別，由左依序顯示IL-23(介白素-23)、IL-21(介白素-21)、IFN-α(干擾素-α)、TNF-α、IL-18(介白素-18)、IL-33(介白素-33)、IL-27(介白素-27)、TARC(胸線及活化調節趨化介素)、ENA-78(上皮嗜中性球活化蛋白-78)、MIP-3α(巨噬細胞發炎蛋白-3α)、MIP-1β(巨噬細胞發炎蛋白-1β)、伊紅趨素(Eotaxin)、IP-10(干擾素γ誘導蛋白-10)、MIP-1α(巨噬細胞發炎蛋白-1α)、MIG(由干擾素γ誘導的單核因子(Monokine induced by gamma interferon))、I-TAC(干擾素誘導的T細胞α趨化劑(Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant))、SCF(幹細胞因子)、GM-CSF(顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor))、及ICAM-1(細胞間黏著分子-1)的濃度。數值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n=3)。
[圖15]圖15係在實施例7及實施例16得到的中間體與製劑之間，於該等所包含之源自齒髓的細胞的無刺激時之培養上清液中之細胞介素等各種因子當中，針對在製劑的濃度比中間體還高者，呈示該等之比(在製劑的濃度/在中間體的濃度)的圖表。由左依序顯示IL-6、IL-23、IL-11、MCP-1、ENA-78、HGF、VEGF、MMP-2、IGFBP-4、胱蛋白C、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1的濃度比。數值係使用平均值，誤差槓表示標準誤差(n=3)。
[圖16]圖16係針對在實施例7及實施例16得到的中間體與製劑個別所包含之源自齒髓的細胞，呈示無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激之個別的組之培養上清液中之IL-6濃度的圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105個細胞)。針對中間體(黑色棒)及製劑(白色棒)個別，由左依序顯示在無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的濃度。數值係使用平均值，誤差槓表示標準誤差(n=3)。
[圖17]圖17係針對在實施例7及實施例16得到的中間體與製劑個別所包含之源自齒髓的細胞，呈示無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激之個別的組之培養上清液中之IL-11濃度的圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105個細胞)。針對中間體(黑色棒)及製劑(白色棒)個別，由左依序顯示無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。數值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n=3)。
[圖18]圖18係針對在實施例7及實施例16得到的中間體與製劑個別所包含之源自齒髓的細胞，呈示無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激之個別的組之培養上清液中之IP-10濃度的圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105個細胞)。針對中間體(黑色棒)及製劑(白色棒)個別，由左依序顯示無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。數值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n=3)。
[圖19]圖19係針對在實施例7及實施例16得到的中間體與製劑個別所包含之源自齒髓的細胞，呈示無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激之個別的組之培養上清液中之MCP-1濃度的圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105個細胞)。針對中間體(黑色棒) 及製劑(白色棒)個別，由左依序顯示無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。數值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n=3)。
[圖20]圖20係針對在實施例7及實施例16得到的中間體與製劑個別所包含之源自齒髓的細胞，呈示無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激之個別的組之培養上清液中之GM-CSF濃度的圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105個細胞)。針對中間體(黑色棒)及製劑(白色棒)個別，由左依序顯示在無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。數值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n=3)。
[圖21]圖21係針對在實施例7及實施例16得到的中間體與製劑別所所包含之源自齒髓的細胞，呈示無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激之個別的組之培養上清液中之HGF濃度的圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105個細胞)。針對中間體(黑色棒)及製劑(白色棒)個別，由左依序顯示在無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。數值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n=3)。
[圖22]圖22係針對在實施例7及實施例16得到的中間體與製劑個別所包含之源自齒髓的細胞，呈示無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激之個別的組之培養上清液中之IL-8濃度的圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105個細胞)。針對中間體(黑色棒)及製劑(白色棒)個別，由左依序顯示在無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。數值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n=3)。
[用以實施發明的形態]
多潛能幹細胞係指具有自我複製能力而且還具有往2種以上之細胞的分化能力之細胞。可藉由本發明而得之源自人類齒髓的多潛能幹細胞，較佳為具有往軟骨細胞及骨細胞的分化能力者，但並不特別受限於此。
可藉由本發明而得之多潛能幹細胞具有往軟骨細胞的分化能力，係藉由例如，定量將細胞以含有已知誘導細胞往軟骨細胞的分化之物質的培養基培養時的蛋白聚醣基因的表現量而可確認。蛋白聚醣係構成軟骨的細胞外基質之主要分子，若細胞往軟骨細胞的分化被誘導，則表現量增加。於此測定法中，就誘導細胞往軟骨細胞的分化的物質(軟骨細胞分化誘導物質)而言，可使用例如TGF-b3。實施例20中記載之測定法，係往軟骨細胞的分化能力的測定法之較佳的一例。
可藉由本發明而得之多潛能幹細胞具有往骨細胞的分化能力，係藉由例如，定量將細胞以含有已知誘導細胞往骨細胞的分化之物質的培養基培養時的細胞中之鈣的累積量而可確認。若往骨細胞的分化被誘導，則於細胞累積鈣。於此測定法中，就誘導往骨細胞的分化的物質(骨細胞分化誘導物質)而言，例如，可單獨或組合使用地塞米松(dexamethasone)、β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate)、醣胺聚醣、抗壞血酸、骨形成因子2(BMP-2)、及此等之鹽。例如，組合地塞米松、抗壞血酸鹽、及β-甘油磷酸鹽者，可較佳地使用來作為骨細胞分化誘導劑。實施例19中記載之測定法，係往骨細胞的分化能力的測定法之較佳的一例。
於本發明中，所謂「多潛能幹細胞經富集之源自 齒髓的細胞」或「多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞」，係指源自齒髓，且比起從齒髓直接採集之細胞而多潛能幹細胞所佔的比例(個數比例)經提高之細胞的集合，包含從齒髓經利用培養等之選擇而最終被單離的多潛能幹細胞。從齒髓直接採集之細胞，係多潛能幹細胞與其以外的細胞混合存在者。若將其進行培養，則多潛能幹細胞因與其他細胞比較而增殖能力高，所以相較於培養開始時，而於培養結束時多潛能幹細胞的比率提高。藉由反覆進行培養，而多潛能幹細胞的比率變得更為提高，因此亦可得到幾乎僅含多潛能幹細胞的細胞。換言之，所謂「多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞」，係指多潛能幹細胞佔細胞整體的比率藉由在進行培養等之過程中多潛能幹細胞增殖，而包含比剛從齒髓採集後更為提高的多潛能幹細胞。齒髓為源自人類者，特別稱為「多潛能幹細胞富集之源自人類齒髓的細胞」。
於本發明中，從齒髓直接單離之多潛能幹細胞、及從齒髓經培養而可得之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞所包含之多潛能幹細胞，係總稱為「源自齒髓的多潛能幹細胞」，依照上下文亦有時僅稱為「源自齒髓的幹細胞」或「齒髓幹細胞」。齒髓為源自人類者，特別稱為「源自人類齒髓的多潛能幹細胞」，亦有時僅稱為「源自人類齒髓的幹細胞」或「人類齒髓幹細胞」。為本說明書中記載之一實施形態的「中間體所包含之細胞(中間體細胞)」及「源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞」，係實質上僅含多潛能幹細胞者，皆為源自齒髓的多潛能幹細胞。
於本發明中，對於檢查對象的細胞集團，所謂於 其表面抗原標記的表現圖譜中某抗原為陽性時，意指在將細胞之集團作為整體觀察時，所觀察的細胞當中，較佳為30%以上，更佳為40%以上，進一步較佳為50%以上，更進一步較佳為60%以上，更進一步較佳為70%以上，更進一步較佳為80%以上，更進一步較佳為90%以上，特佳為95%以上係該抗原為陽性。表面抗原的表現圖譜，能夠以例如實施例21或22中記載之方法來調查，但不受限於此等。
於本發明中，對於檢查對象的細胞集團，所謂於其表面抗原標記的表現圖譜中某抗原為陰性時，意指將細胞之集團作為整體觀察時，所觀察的細胞當中，較佳為小於20%，更佳為小於10%，進一步較佳為小於5%，更進一步較佳為小於2%，特佳為小於1%係該抗原為陽性。表面抗原的表現圖譜，能夠以例如實施例21或22中記載之方法來調查，但不受限於此等。
本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，以含有已知誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基培養時，就整體而言觀察到蛋白聚醣的表現量增加。又，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，以含有已知誘導往骨細胞的分化之物質的培養基培養時，就整體而言觀察到細胞中之鈣的累積量增加。亦即，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於作為整體觀察時，具備往軟骨細胞及骨細胞的分化能力。
於一實施形態中，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體(集團)觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105、及CD166的至 少一個為陽性。同樣地，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係CD34及CD45的至少一個為陰性。例如，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，例如，CD73及CD90為陽性，且CD34為陰性。又，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性。此表現圖譜係與間葉系幹細胞共通。
又，於一實施形態中，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性。例如，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，例如，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性。此等之表面抗原標記為陽性的細胞，已知於移植到同種異體的個體時，有作為抗原被辨識而從活體內被排除之傾向。此等之表面抗原標記的至少一個為陰性，顯示本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞具有那麼低免疫原性之性質，且於移植到同種異體的個體時有不易從活體內被排除之傾向。又，於此等表面抗原標記之表現圖譜中，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、CD86維持陰性，而MHC-II型抗原可變為陽性。例如，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性。
於一實施形態中，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之 表現圖譜中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性。此時，在以IFN-γ刺激細胞時，例如，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原可變為陽性。
於一實施形態中，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞(源自齒髓的多潛能幹細胞)，係
(a-1)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD29、CD46、CD47、CD59、CD73、CD81、CD90、CD147、及HLA-A、B、C的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係70%以上，更佳係80%以上，進一步較佳係90%以上為陽性。
又，於一實施形態中，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(a-2)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD9、CD44、CD49b、CD49c、CD55、CD98、及EGF-R的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係65%以上，更佳係75%以上為陽性，進一步較佳係80%以上為陽性。
又，於一實施形態中，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(a-3)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD49f、CD140b、及CD166的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的 細胞時，所觀察之細胞較佳係60%以上，更佳係70%以上為陽性，進一步較佳係75%以上為陽性。
又，於一實施形態中，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(a-4)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD10、CD13、CD58、CD63、CD105、CD151、及CD164的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係60%以上，更佳係65%以上為陽性，進一步較佳係70%以上為陽性。
於一實施形態中，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，較佳為具有上述(a-1)、(a-2)、(a-3)、及(a-4)所示特徵的2個以上，更佳為3個以上，進一步較佳為具有此等全部的特徵者。例如，具有上述(a-1)及(a-2)所示特徵的細胞，係本發明之較佳的一實施形態。
於一實施形態中，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(a-5)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD120b、CD132、CD158a、CD161、CD184、CD195、CD206、CD210、CD212、CD226、CD244、CD267、CD278、CD279、CD282、CD294、SSEA-1(階段特異性胚胎抗原-1(stage-specific embryonic antigen-1))、TRA-1-60、SSEA-3(階段特異性胚胎抗原-3)、CLA(皮膚淋巴球相關抗原)、及整合素β7(Integrin β7)的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個 別的細胞時，所觀察之細胞較佳係10%以下，更佳係5%以下，進一步較佳係2%以下，更進一步較佳係僅1%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，
(a-6)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD8b、CD11b、CD15s、CD16、CD19、CD24、CD31、CD32、CD62E、CD62P、CD66f、CD86、CD88、CD94、CD100、CD103、CD114、CD117、CD118、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD128b、CD135、CD137、CD137配體、CD150、CD163、CD172b、CD177、CD178、CD180、CD197、CD220、CD229、CD231、CD255、CD268、CD305、CD314、CD321、CDw327、CDw328、CD329、CD335、CD336、BLTR-1(白三烯(leukotriene)B4受體)、CLIP、CMRF-44、CMRF-56、fMLP-R(N-甲醯甲硫胺醯基-白胺醯基-苯丙胺酸受體)、不變的NKT(invariant natural killer cell)、及γδTCR(γδT細胞受體)的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係10%以下，更佳係5%以下的細胞為陽性，進一步較佳係僅2%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，
(a-7)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD1a、CD1b、CD1d、CD2、CD3、CD5、CD6、CD7、 CD8a、CD11c、CD15、CD18、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27、CD28、CD33、CD34、CD35、CD37、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42b、CD45、CD45RB、CD45RO、CD48、CD50、CD53、CD62L、CD64、CD66(a、c、d、e)、CD69、CD70、CD72、CD80、CD84、CD85、CD87、CD89、CDw93、CD97、CD106、CD134、CD138、CD144、CD154、CD158b、CD162、CD183、CD205、CD235a、CD271、CD309、CD326、CD337、αβTCR(αβT細胞受體)、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係10%以下，更佳係僅5%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，較佳為具有上述(a-1)、(a-2)、(a-3)、(a-4)、(a-5)、(a-6)、及(a-7)所示特徵的2個以上，更佳為3個以上，進一步較佳為具有此等全部的特徵者。例如，具有上述(a-1)及(a-5)所示特徵的細胞，係本發明之較佳的一實施形態。
於本發明之一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，例如表現前列腺素E2(PGE2)及/或血管內皮生長因子(VEGF)者，且就前列腺素E2(PGE2)而言，藉由以TNFα刺激細胞，而其表現量增加。VEGF由於係具有血管生成作用之物質，因此多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞可藉由將其對人類進行投予，而透過VEGF在體內促進血管的形成，所以可作為必須發揮血管生成作用之疾病治療劑來使用。又，PGE2由於具有強力的消炎作 用，因此多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞可藉由將其對人類進行投予，而透過PGE2來在體內對發炎部位作用，且抑制發炎所伴隨的組織破壞，所以可作為發炎所伴隨的組織破壞之抑制劑來使用。但是，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞之效果，並不受限於透過VEGF與PGE2而發揮者。
於本發明之一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，於在IFN-γ存在下培養時，使犬尿胺酸的分泌量增加。犬尿胺酸可於抑制T細胞之增殖的同時，使單核球分化為抗發炎性的M2巨噬細胞。是以，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞可藉由將其對人類進行投予，而透過犬尿胺酸來發揮消炎作用。
於本發明之一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD34、及CD206的至少一個或全部為陰性。又，於本發明之一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個或全部為陰性。
於本發明之一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD19、CD26、CD106、CD117、及CD271的至少一個為陰性，例如此等全部為陰性。
於本發明之一實施形態中，多潛能幹細胞富集之 源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD140b、及HLA-A、B、C的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
於本發明之一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD10、CD46、CD47、CD55、CD58、及CD59的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
於本發明之一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45的至少一個為陰性。
於本發明之一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性。此時，在以IFN-γ刺激細胞時，例如，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性。而且，為表現前列腺素E2及/或血管內皮生長因子(VEGF)者，且就前列腺素而言，藉由以TNFα刺激細胞，而其分泌量增加。再者，藉由以IFN-γ進行刺激，而犬尿胺酸的分泌量增加。
本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於將其培養時，分泌多種體液因子(humoral factor)。
(a-8)於一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於將其培養時，表現MMP-2、IGFBP-4、及胱蛋白C的至少一個，較佳為表現此等全部。
(a-9)於一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於將其培養時，表現IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、GROα、HGF、VEGF、VCAM-I、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1的至少一個，較佳為表現此等全部。
(a-10)又，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於將其培養時，表現IL-23、TNF-α、IL-18、IL-33、IL-27、TARC、ENA-78、MIP-3α、MIP-1β、IP-10、SCF、及ICAM-1的至少一個，較佳為表現此等全部。
(a-11)又，於一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於將其培養時，不表現IL-21、伊紅趨素(Eotaxin)、MIP-1α、MIG、I-TAC、及GM-CSF的至少一個，較佳為不表現此等全部或幾乎不表現者。
(a-12)又，於一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於將其在TNF-α存在下、或IFN-γ存在下培養時，相較於在此等不存在下培養時，而IL-6的表現量增加。
(a-13)又，於一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於將其在TNF-α存在下、或IFN-γ存在下培養時，相較於在此等不存在下培養時，而IL-11的表現量增加。
(a-14)又，於一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於將其在TNF-α存在下、或IFN-γ存在下培養時，相較於在此等不存在下培養時，而IP-10的表現量增加。
(a-15)又，於一實施形態中，多潛能幹細胞富集 之源自齒髓的細胞，係於將其在TNF-α存在下、或IFN-γ存在下培養時，相較於在此等不存在下培養時，而MCP-1的表現量增加。
(a-16)又，於一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於將其在TNF-α存在下培養時，GM-CSF的表現被誘導，但於在IFN-γ存在下培養時，GM-CSF的表現不被誘導。
(a-17)又，於一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於將其在TNF-α存在下培養時，相較於在TNF-α不存在下培養時，而HGF的表現量減少；另一方面，係於將其在IFN-γ存在下培養時，相較於在IFN-γ不存在下培養時，而HGF的表現量增加。
(a-18)又，於一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於將其在TNF-α存在下培養時，相較於在TNF-α不存在下培養時，而IL-8的表現量增加。
本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，亦可為源自齒髓的多潛能幹細胞佔大部分者。平面培養中之源自齒髓的多潛能幹細胞，在光學顯微鏡下，許多的情形係作為近似紡錘形的附著細胞而在細胞培養盤上被觀察到。但是，依照培養條件，並不一定是作為紡錘形的附著細胞而被觀察到。
於本發明中稱為「齒髓」時，係指充滿牙齒的齒髓腔的疏鬆性結締組織，其包含：包含血管、神經及淋巴管的結締組織、與於邊緣部(marginal region)中有進行自象牙質之內側的沈積與修復之能力的造牙本質細胞(odontoblast)層。又，齒髓可根據存在部位而區分為冠部齒髓與根部齒髓，但於 本發明中稱為齒髓時，係指至少包含冠部齒髓或根部齒髓之任一方者。又，對於本發明中所使用的齒髓所源自的動物種並無特別限制，但動物種較佳為哺乳動物，更佳為靈長類，進一步較佳為人類。
用以取得齒髓的牙齒，可為恆齒亦可為乳齒，又，亦可為門齒、犬齒、小臼齒、及大臼齒之任一者。此種牙齒較佳為並未罹患齲齒等的健康的牙齒。例如，因進行醫療而被拔牙之健康的被拔除齒，可較佳地使用於本發明中。特別是第3大臼齒，由於從每1個牙齒可獲得之齒髓之量多，而且，因牙齒的矯正等理由而作為被拔除齒容易取得健康的狀態者，所以可特佳地使用。此處，對於被取得牙齒的人類的年齡，並無特別限定，但較佳為自10歲起至50歲為止的人類所取得之牙齒，更佳為自15歲起至45歲為止的人類所取得之牙齒。又，對於被取得牙齒的人類的性別亦無特別限制。
用以取得齒髓的牙齒，較佳為使用拔牙後72小時以內者，更佳為使用拔牙後24小時以內者，進一步較佳為使用拔牙後12小時以內者。被拔除齒係以重碳酸林格氏液等清洗之後，以殺菌劑進行殺菌處理。對於此時所使用的殺菌劑並無特別限定，但較佳為對革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌之任一者都顯示抗菌作用者，可使用例如1%葡萄糖酸洛赫西定溶液。
齒髓可藉由機械性地軋碎被拔除齒而使齒髓露出，藉以自被拔除齒取得。自被拔除齒所取出的齒髓，較佳為使用剪刀等器具切碎之後，藉由蛋白酶進行消化。
藉由以蛋白酶進行消化，而構成齒髓的各個細胞係從自被拔除齒所取得的齒髓游離。此時所使用的蛋白酶，較 佳為包含絲胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、或此等之混合物者，但並不特別受限於此等，只要是能夠使構成齒髓的各個細胞游離的蛋白酶，亦即可分解蛋白質性的細胞黏著分子者即可。
就此時所較佳使用的金屬蛋白酶而言，可舉出基質金屬蛋白酶、中性金屬蛋白酶、或此等之混合物。就基質金屬蛋白酶而言，可較佳地使用膠原蛋白酶、明膠酶、或此等之混合物。又，就膠原蛋白酶而言，較佳為I型膠原蛋白酶、II型膠原蛋白酶、或此等之混合物。就中性金屬蛋白酶而言，可較佳地使用嗜熱菌蛋白酶、Dispase、或此等之混合物
作為較佳之蛋白酶的組合之一例，可舉出I型膠原蛋白酶、II型膠原蛋白酶、及嗜熱菌蛋白酶之混合物。作為蛋白酶而使用此混合物之情形，反應液中之蛋白酶的活性，較佳為調整成0.17~1.33單位/mL。可較佳地使用含有I型膠原蛋白酶、II型膠原蛋白酶及嗜熱菌蛋白酶的Liberase(註冊商標)(Roche公司)來作為蛋白酶。
使用II型膠原蛋白酶與Dispase的混合液之情形，II型膠原蛋白酶與Dispase的濃度分別較佳為1~2mg/mL與3000~7000單位/mL，更佳為約1.5mg/mL與約5000單位/mL。
藉由蛋白酶來消化自被拔除齒所取得的齒髓之際的較佳的反應溫度為35~37.5℃，而且較佳的反應時間為30分鐘~3小時。例如，齒髓係藉由蛋白酶而在37℃進行2小時處理。但是，反應溫度及反應時間應依照蛋白酶的種類、濃度等進行適宜調整。
經蛋白酶消化的齒髓，由於使構成齒髓的各個細 胞自齒髓游離，所以可藉由以微量滴管進行反覆吸排(pipetting)等機械性手段進行解體。此時，較佳為於藉由機械性手段來將齒髓解體之前，預先使蛋白酶失活。此可藉由將使蛋白酶失活之成分添加至反應溶液來進行，就該種成分而言，有EDTA等的螯合劑、含有FBS的細胞培養用培養基等。藉由將齒髓解體，而可得到構成齒髓之細胞等在溶液中以浮游狀態存在的懸浮物。此懸浮物中包含自齒髓游離之多潛能幹細胞。為了將蛋白酶與上清液一起去除，較佳為一旦將此懸浮物進行離心而使細胞等不溶物沈澱。經沈澱之細胞等，係去除上清液之後，再度被懸浮。就用於再懸浮之溶液而言，可使用例如含有FBS的細胞培養用培養基。可這樣地得到之齒髓的懸浮物中，除了自齒髓游離之細胞以外，亦包含齒髓的組織片。
使齒髓的解體物懸浮於細胞培養用培養基而成的齒髓懸浮物，係添加至細胞培養盤，而在該盤上培養。可用於此的細胞培養用培養基，較佳為添加有胎牛血清之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)。於培養基中所添加之胎牛血清的濃度(v/v%)較佳為8~25%，更佳為10~25%，例如為20%。於表1呈示達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(胎牛血清添加前)的詳細組成之一例。亦可於培養基中適宜地添加3~5mM，例如4mM的L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸。又，亦可根據期望而於培養基中添加鏈黴素等抗生素。於培養基中添加鏈黴素之情形，係以在培養基中其濃度成為10mg/L~250mg/L的方式，例如成為100mg/L的方式來進行。又，各成分能夠置換為其等效物，例如能夠置換為其鹽。
在細胞培養盤上培養從1個被拔除齒，例如從1個成人的第3大臼齒得到的齒髓之懸浮物之情形，該盤的培養面積較佳為0.3~4cm2，更佳為0.6~2cm2，例如為1cm2。於細胞培養盤中所添加之培養基的量，對培養面積每1cm2，較佳為250μL~1mL，例如為500μL。例如，將使從1顆成人的第3大臼齒得到的齒髓之懸浮物懸浮於500μL的培養基而成者，添加於培養面積為1cm2的細胞培養盤上，而培養細胞。
[表1]
Figure 108127022-A0202-12-0039-2
在細胞培養盤上培養齒髓懸浮物時的溫度較佳為35~37.5℃，例如為37℃。齒髓懸浮物的培養，係例如進行到 細胞藉由增殖而於該盤上形成可目視之大小的群落為止。此時之群落，從上方看時為近似圓形，其直徑為1~3mm左右，但並不特別受限於此等，例如，群落亦有為不定形之情形。齒髓懸浮物的培養中，培養基係與新的進行交換，使成分可保持在某一定的範圍內。培養基的交換，係例如於每1~6日、每2~4日、每1日、每2日、每3日、每4日進行。培養基的交換，可將培養基之總量交換為新的培養基，亦可交換一部分。將培養基的一部分交換為新的培養基之情形，將舊培養基的例如1/4~4/5、1/4、1/3、1/2、或4/5量去除，其次添加等量之新的培養基。亦可在此培養基交換的過程中，將齒髓之懸浮物中所包含的浮游細胞、組織片等除去。
藉由培養齒髓之懸浮物而於細胞培養盤上形成群落的細胞，可藉由將其以蛋白酶進行處理來從該盤剝離而進行回收。對於此時所使用的蛋白酶，只要是可分解蛋白質性的細胞黏著分子者，則無特別限定，但較佳為絲胺酸蛋白酶，更佳為胰蛋白酶。使用胰蛋白酶之情形，其濃度較佳為0.1~0.5%(w/v)，更佳為0.25%(w/v)。
從上述盤所回收的細胞，係使其懸浮於細胞培養用培養基之後添加於細胞培養盤，而在該盤上開始培養。將此稱為初次的細胞培養。此時所使用的培養基較佳為添加有胎牛血清的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基。於培養基中所添加之胎牛血清的濃度(v/v%)，較佳為8~25%，更佳為8~20%，例如為10%。於表1呈示達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(胎牛血清添加前)的詳細組成之一例。亦可於培養基中適宜地添加3~5mM，例如4mM的L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸。又，亦可根據期 望而於培養基中添加鏈黴素等抗生素，但通常不在培養基中添加抗生素。於培養基中添加鏈黴素之情形，係以濃度成為10mg/L~250mg/L的方式，例如成為100mg/L的方式來添加。又，各成分能夠置換為其等效物，例如能夠置換為其鹽。
上述之初次的細胞培養的開始時，添加細胞使在細胞培養盤上的活細胞密度較佳成為2000~30000個細胞/cm2，更佳成為3000~20000個細胞/cm2，例如成為3000個細胞/cm2、5000個細胞/cm2、10000個細胞/cm2、20000個細胞/cm2。細胞的培養中，係交換培養基，使成分可保持在某一定的範圍內。此時，培養基的交換，係例如於每1~6日、每2~4日、每1日、每2日、每3日、或每4日進行。培養基的交換，可將培養基之總量交換為新的培養基，亦可交換一部分。將培養基的一部分交換為新的培養基之情形，將舊培養基的例如1/4~4/5、1/4、1/3、1/2、或4/5量去除，其次添加等量之新的培養基。在此培養基交換的過程中，原本的細胞中所包含的浮游細胞等被除去的結果，附著在細胞培養盤的細胞被選擇。
初次的細胞培養，係進行到細胞培養盤上的細胞較佳為幾乎長滿(confluent)為止。例如，培養係進行到成為細胞佔細胞培養盤之細胞可附著之面的85%以上、90%以上、或95%以上的狀態為止。在細胞培養盤上培養到幾乎長滿為止的細胞，可藉由將其以蛋白酶進行處理來從該盤剝離而進行回收。對於此時所使用的蛋白酶，只要是可分解蛋白質性的細胞黏著分子者，則無特別限定，但較佳為絲胺酸蛋白酶，更佳為胰蛋白酶。使用胰蛋白酶之情形，其濃度較佳為0.1~ 0.5%(w/v)，更佳為0.25%(w/v)。
從上述盤所回收的細胞，係再度使其懸浮於細胞培養用培養基之後添加於細胞培養盤，如此地在該盤上培養。此時所使用的培養基較佳為添加有胎牛血清的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基。於培養基中所添加之胎牛血清的濃度(v/v%)，較佳為8~25%，更佳為8~20%，例如為10%。於表1呈示達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(胎牛血清添加前)的詳細組成之一例。亦可於培養基中適宜地添加3~5mM，例如4mM的L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸。又，亦可根據期望而於培養基中添加鏈黴素等抗生素，但通常不在培養基中添加抗生素。於培養基中添加鏈黴素之情形，係以鏈黴素在培養基中的濃度成為10mg/L~250mg/L的方式，例如成為100mg/L的方式來添加。又，各成分能夠置換為其等效物，例如能夠置換為其鹽。而且，細胞的培養係進行到細胞培養盤上的細胞幾乎長滿為止。例如，培養係進行到成為細胞佔細胞培養盤之細胞可附著之面的85%以上、90%以上、或95%以上的狀態為止。
可藉由這樣地反覆進行細胞之自細胞培養盤的回收與在細胞培養盤上的培養，而使源自齒髓的細胞之細胞數增加。又，藉由培養中的培養基交換，而浮游細胞被除去，附著在細胞培養盤的細胞係優先被回收(其結果，被選擇)。源自齒髓的多潛能幹細胞由於具有附著在細胞培養盤之性質，所以藉由反覆進行此過程，而使多潛能幹細胞富集。亦即，經過在細胞培養盤上培養齒髓懸浮物的步驟、然後於培養後由該盤回收之步驟的細胞，係多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞。如此地，藉由反覆進行細胞之自細胞培養盤的回收與培養，而變得 使多潛能幹細胞更進一步富集。
細胞之自細胞培養盤的回收與培養亦包含初次的細胞培養，而較佳為3~20次，更佳為3~8次，進一步較佳為4~8次，例如反覆進行4次、5次、6次、7次或8次。在細胞培養盤上增殖而可得之細胞，於在初次的細胞培養結束之時間點以光學顯微鏡觀察時，雖然其中許多為呈現近似紡錘形的形態之多潛能之源自齒髓的細胞，但亦包含其以外的細胞。藉由反覆進行3次細胞之自細胞培養盤的回收與培養，而使源自齒髓的多潛能幹細胞富集到成為幾乎被多潛能之源自齒髓的細胞所佔為止。若反覆進行5次自細胞培養盤之細胞的回收與培養，則使源自齒髓的多潛能幹細胞更加富集，在光學顯微鏡下觀察時呈現近似紡錘形的形態之多潛能之源自齒髓的細胞以外之細胞，變得幾乎無法觀察到。換言之，藉由反覆進行5次以上細胞之自細胞培養盤的回收與培養，而變成源自齒髓的多潛能幹細胞實質上被單離。
如此進行而可得到的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞所包含之源自齒髓的多潛能幹細胞佔細胞整體的比率，較佳為99%以上，更佳為99.5%以上，進一步較佳為99.9%以上，更進一步較佳為99.95%以上。源自齒髓的多潛能幹細胞的比率，例如，可藉由將在光學顯微鏡下觀察時呈現近似紡錘形的形態之細胞數除以總細胞數而求出。
如此進行而可得到的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，能夠以懸浮於冷凍保存液的狀態進行冷凍保存。為了作成冷凍保存的對象，在細胞培養盤上的細胞之平均倍增時間較佳為96小時以內，更佳為84小時以內，進一步較佳為72 小時以內，進一步更佳為48小時以內，特佳為例如36小時以內、24小時以內。亦可對於平均倍增時間設定基準，且將平均倍增時間為某一定的時間以內者冷凍保存，並供應之後的利用。就此種基準而言，可適宜設定為例如84小時以內、72小時以內、48小時以內。不滿足此基準值的細胞係不冷凍保存而丟棄，藉此可僅選擇性地保存具有某一定以上之細胞分裂能力的細胞。平均倍增時間愈短則可謂細胞分裂能力愈高的細胞。
此時可使用之冷凍保存液的組成，係只要是不使哺乳動物細胞，特別是不使人類的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞死滅而可冷凍、解凍者，則無特別限制。冷凍保存液包含細胞保護劑。細胞保護劑係例如具有以下功能者：抑制在冷凍細胞時於細胞內形成冰的結晶而破壞細胞。就細胞保護劑而言，作為較佳者可舉出二甲亞碸(DMSO)、乙二醇、丙二醇、絲膠、甘油。亦可將此等當中2個以上組合來作為細胞保護劑使用。使用二甲亞碸作為細胞保護劑之情形，其濃度較佳為5~15%(v/v)，更佳為9~11%(v/v)，例如為10%(v/v)。冷凍保存液亦可包含緩衝劑。緩衝劑較佳為可將水溶液的pH調整成6~8，例如調整成6.8~7.8。就此種緩衝劑而言，可舉出例如含有碳酸離子、檸檬酸離子及鈉離子者。冷凍保存液可進一步包含人類血清白蛋白。使用人類血清白蛋白之情形，其濃度較佳為40~100g/L，更佳為46~56g/L，例如為51g/L。後述之於重碳酸林格氏液添加有人類血清白蛋白溶液與二甲亞碸者，係作為冷凍保存液而較佳者之一例。此外，後述之中間體細胞用冷凍保存液與製劑細胞用冷凍保存液，皆為冷凍保存液。於製程設置冷凍中間體細胞的步驟之情形，為了方便而將前者稱 為第一冷凍保存液(中間體細胞用冷凍保存液)，將後者稱為第二冷凍保存液(製劑細胞用冷凍保存液)。
冷凍保存之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，亦可作為後述之源自齒髓的細胞製劑使用，又，亦可作為(為了之後進一步進行增殖而保存的)中間體細胞使用。針對作為中間體細胞而將多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞冷凍保存之情形，於以下進行詳述。
就將多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞作為中間體細胞而進行冷凍保存之情形(以下，稱為「將細胞冷凍作為中間體細胞之情形」)而言，細胞之自細胞培養盤的回收與培養亦包含初次的細胞培養，而較佳為3~8次，進一步較佳為4~8次，例如反覆進行4次、5次、6次、7次或8次。
又，就將細胞冷凍作為中間體細胞之情形而言，從藉由培養齒髓懸浮物而形成在細胞培養盤上的群落所回收的細胞，較佳為到進行冷凍為止在細胞培養盤上培養細胞而使其分裂10次以上，更佳為使其分裂15次以上。例如，冷凍保存經13~20次、13~23次、14~20次分裂之細胞。理論上，藉由使其進行15次分裂，而細胞數增加到3×104倍以上。
又，就將細胞冷凍作為中間體細胞之情形而言，通常較佳係使細胞增殖到從1個被拔除齒(例如1個第三大臼齒)可獲得之細胞的數目成為3×105個以上為止，更佳係成為1×106個以上為止，進一步較佳係成為1×109個以上為止。
又，要成為作為中間體細胞之冷凍保存的對象，在細胞培養盤上的細胞之平均倍增時間較佳為96小時以內，更佳為84小時以內，進一步較佳為72小時以內，進一步更佳為 48小時以內，特佳為例如24小時以內、36小時以內。亦可對於平均倍增時間設定基準，且將平均倍增時間為某一定的時間以內者冷凍保存，並供應之後的利用。就此種基準而言，可適宜設定為例如84小時以內、72小時以內、48小時以內。不滿足此基準值的細胞係不冷凍保存而丟棄，藉此可僅選擇性地保存具有某一定以上之細胞分裂能力的細胞。平均倍增時間愈短則可謂細胞分裂能力愈高的細胞。
將細胞冷凍作為中間體細胞之情形，於冷凍保存前，藉由以蛋白酶進行處理來從細胞培養盤剝離而回收之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係以清洗溶液進行清洗。此時所使用的清洗溶液，係用以將培養基與蛋白酶充分除去者，對於其組成並無特別限定，可使用生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水、醋酸林格氏液、重碳酸林格氏液等，但較佳為於重碳酸林格氏液中添加人類血清白蛋白的溶液。醋酸林格氏液及重碳酸林格氏液可使用市售者。例如，就醋酸林格氏液而言，可使用PLASMA-LYTE(註冊商標)A(Baxter公司)、Physio(註冊商標)140(大塚製藥公司)；就重碳酸林格氏液而言，可使用BICARBON(註冊商標)注(味之素公司)。將較佳的重碳酸林格氏液之成分組成及電解質濃度之一例分別呈示於表2及表3。
[表2]
Figure 108127022-A0202-12-0047-3
[表3]
Figure 108127022-A0202-12-0047-4
又，作為於重碳酸林格氏液添加有人類血清白蛋白的清洗溶液的成分組成，於表4呈示較佳的一例。又，作為於重碳酸林格氏液添加有人類血清白蛋白的清洗溶液所包含之電解質濃度，於表5呈示較佳的一例。此外，表4及表5所示清洗溶液的成分當中，乙醯色胺酸鈉與辛酸鈉可省略。
[表4]
Figure 108127022-A0202-12-0048-7
[表5]
Figure 108127022-A0202-12-0048-8
將細胞冷凍作為中間體細胞之情形，以清洗溶液清洗後的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係一旦藉由離心分離等方法而回收。被回收的細胞，係以作成懸浮液的狀態(中間體細胞懸浮液)，進行冷凍而被保存。但是，亦可不回收細胞，且藉由將懸浮著細胞之溶液的組成使用超濾膜等進行置換，而製備中間體細胞懸浮液，將其冷凍而保存。中間體細胞 懸浮液的溶液部分(中間體細胞用冷凍保存液)的組成，係只要是不使哺乳動物細胞，特別是不使人類的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞死滅而可冷凍、解凍者，則無特別限制。中間體細胞用冷凍保存液包含細胞保護劑。細胞保護劑係例如具有以下功能者：抑制在冷凍細胞時於細胞內形成冰的結晶而破壞細胞。就細胞保護劑而言，作為較佳者可舉出二甲亞碸(DMSO)、乙二醇、丙二醇、絲膠、甘油。亦可將此等的2個以上組合來作為細胞保護劑使用。使用二甲亞碸作為細胞保護劑之情形，其濃度較佳為5~15%(v/v)，更佳為9~11%(v/v)，例如為10%(v/v)。冷凍保存液亦可包含緩衝劑。緩衝劑較佳為可將水溶液的pH調整成6~8，例如調整成6.8~7.8。就此種緩衝劑而言，可舉出例如含有碳酸離子、重碳酸離子、檸檬酸離子及鈉離子者。中間體細胞用冷凍保存液可進一步包含人類血清白蛋白。使用人類血清白蛋白之情形，其濃度較佳為40~100g/L，更佳為46~56g/L，例如為51g/L。
於重碳酸林格氏液添加有人類血清白蛋白溶液與二甲亞碸者，係作為中間體細胞用冷凍保存液而較佳者之一例。中間體細胞用冷凍保存液，較佳係氯化鈉為59~80.4mM、氯化鉀為2.3~3.08mM、氯化鈣二水合物為0.85~1.16mM、氯化鎂六水合物為0.28~0.385mM、碳酸氫鈉為14~19.2mM、檸檬酸鈉二水合物為0.94~1.28mM、人類血清白蛋白為46~56g/L、乙醯色胺酸鈉為3.73~4.55mM、辛酸鈉為3.74~4.58mM、DMSO為9~11%(v/v)。於表6呈示中間體細胞用冷凍保存液的組成之較佳的一例。亦即，中間體細胞用冷凍保存液的組成，大致係氯化鈉為65.8~80.4mM、氯 化鉀為2.52~3.08mM、氯化鈣二水合物為0.95~1.16mM、氯化鎂六水合物為0.315~0.385mM、碳酸氫鈉為15.7~19.2mM、檸檬酸鈉二水合物為1.04~1.28mM、人類血清白蛋白為46~56g/L、乙醯色胺酸鈉為3.73~4.55mM、辛酸鈉為3.74~4.58mM、DMSO為9~11%(v/v)。這當中，乙醯色胺酸鈉與辛酸鈉可省略。中間體細胞用冷凍保存液對生理食鹽水的滲透壓比，較佳為0.9~1.1。
又，包含鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、碳酸氫離子、檸檬酸離子、人類血清白蛋白、及二甲亞碸的溶液，可較佳地使用來作為中間體細胞用冷凍保存液。例如，分別以91~113mM的濃度包含鈉離子、以2.52~3.08mM的濃度包含鉀離子、以0.95~1.16mM的濃度包含鈣離子、以0.315~0.385mM的濃度包含鎂離子、以15.6~19.2mM的濃度包含碳酸氫離子、以1.04~1.28mM的濃度包含檸檬酸離子、以46~56g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以9~11%(v/v)的濃度包含二甲亞碸的溶液，為其較佳之一例。又例如，分別以100~102mM的濃度包含鈉離子、以2.71~2.77mM的濃度包含鉀離子、以1.01~1.03mM的濃度包含鈣離子、以0.335~0.345mM的濃度包含鎂離子、以16.9~17.2mM的濃度包含碳酸氫離子、以1.13~1.15mM的濃度包含檸檬酸離子、以52.2~54.3g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以10.3~10.9%(v/v)的濃度包含二甲亞碸的溶液，為其較佳之一例。進一步例如，分別以102mM的濃度包含鈉離子、以2.80mM的濃度包含鉀離子、以1.05mM的濃度包含鈣離子、以0.35mM的濃度包含鎂離子、以17.4mM的濃度包含碳 酸氫離子、以1.16mM的濃度包含檸檬酸離子、以51g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以10%(v/v)的濃度包含二甲亞碸的溶液，為其較佳之一例。進一步例如，分別以101mM的濃度包含鈉離子、以2.77mM的濃度包含鉀離子、以1.03mM的濃度包含鈣離子、以0.34mM的濃度包含鎂離子、以17.2mM的濃度包含碳酸氫離子、以1.15mM的濃度包含檸檬酸離子、以52g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以10%(v/v)的濃度包含二甲亞碸的溶液，為其較佳之一例。進一步包含乙醯色胺酸或其鹽之情形，其濃度較佳為3.73~4.55mM、4.24~4.41mM，例如為4.14mM、4.24mM。進一步包含辛酸或其鹽之情形，其濃度較佳為3.74~4.58mM、4.25~4.43mM，例如為4.16mM、4.25mM。
[表6]
Figure 108127022-A0202-12-0051-9
將細胞冷凍作為中間體細胞之情形，對於使多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞懸浮於中間體細胞用冷凍保存液之狀態的懸浮液中之細胞密度並無特別限制，但較佳為 2×106~8×107個/mL，更佳為4×106~3×107個/mL，進一步較佳為8×106~2×107個/mL，例如為1.1×107個/mL。懸浮於中間體細胞用冷凍保存液之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係分注在細胞冷凍保存用容器之後，被冷凍保存。
此時，分注在1個細胞冷凍保存用容器的細胞懸浮液之量，應依照用途等而適宜調整，但較佳為1~20mL。又，分注在1個細胞冷凍保存用容器的細胞數，較佳為5×106~9.2×108個。
關於作為細胞冷凍保存用容器所使用的容器，只要是其素材顯示在低溫之耐久性，且冷凍解凍內容物也不會破損者，則無特別限定。作為細胞的冷凍保存用容器，亦可使用市售者。例如，玻璃製及塑膠製(例如，聚烯烴樹脂製)的冷凍管(cryotube)，可較佳地使用來作為細胞冷凍保存用容器。此處，就玻璃製者而言，可特佳地使用素材為硼矽酸玻璃的小瓶。又，此處，聚烯烴樹脂包含聚乙烯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯、聚丙烯、包含乙烯與丙烯的共聚物、熱塑性彈性體。細胞的冷凍，較佳為藉由將細胞懸浮液分注而封入細胞冷凍保存用容器後，階段性地使溫度降低而進行。例如，作為細胞的冷凍方法，可採用到-6℃為止係以每1分鐘1℃的速度使溫度降低，之後進行急速冷凍的方法。細胞係以冷凍狀態被保存，但將細胞冷凍保存的溫度，較佳為-130℃以下，更佳為-170℃以下，進一步較佳為-180℃以下。例如，細胞能夠以將細胞冷凍保存用容器浸於液態氮(沸點：-196℃)的狀態保存。
如此地作為中間體細胞而冷凍保存之細胞，係於使用時解凍，而供應用以製造源自齒髓的細胞製劑的下一個步 驟。
於多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞之製程中，設置將經增殖的細胞作為中間體細胞而一旦保存之步驟，係多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞之步驟管理上極為有意義之事。例如，所期望之量的被拔除齒無法一次取得之情形，若將已取得之被拔除齒作為原材料，隨時開始源自齒髓的細胞之培養而進行製造到最終製品為止，則最終製品的批量變小，批次管理變繁雜。但是，因可藉由製造中間體細胞來預先保存，而在累積一定量的中間體細胞時，將其作為1批而開始下一個製程，所以可使最終製品的批量變大，批次管理變容易。
又，藉由設置作為中間體細胞進行保存之步驟，而在製程的中間階段，對於細胞的性狀等變得能夠品質檢查。是以，變得能夠僅在作為中間體細胞所得之細胞為滿足所期望之品質基準者之情形，將其供應至下一個製程。換言之，可在中間體細胞的製程結束時或其前後，除去不滿足所期望之品質基準的細胞。藉此而變得不會有不滿足所期望之品質基準的細胞被帶入以後的步驟，因此可提高製造出滿足所期望之品質基準的最終製品的機率。換言之，可使製造時的產率上升，可減少製造成本。
於製程中將細胞冷凍保存，一般而言係伴隨細胞在前後有細胞的性狀變化的危險性。又，依照細胞，亦有冷凍保存後之細胞增殖能力劣化者。相對於此，於本發明中作為中間體細胞而得之細胞，在冷凍之前後並未觀察到細胞的性狀之變化，且亦並未觀察到冷凍保存後之細胞增殖能力的劣化。
用以作為中間體細胞而保存的多潛能幹細胞富集 之源自齒髓的細胞，較佳為其所包含的細胞中之活細胞的比率高。冷凍保存前之活細胞的比率(細胞的生存率)，較佳為50%以上，更佳為60%以上，進一步較佳為70%以上，較佳為例如80%以上、90%以上、95%以上。亦可藉由適宜設定的基準，而僅將冷凍保存前之細胞的生存率為某一定的數值以上者作為中間體細胞進行保存。
用以作為中間體細胞而保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，在活體外之環境下，較佳為經10次以上的細胞分裂，例如經15次以上、16次以上、或17次以上的細胞分裂，而且，較佳為在該細胞分裂期間中的平均細胞分裂時間為48小時以內。
此外，於本發明中，在活體外之環境下進行細胞分裂係指例如：在與細胞培養用的培養基一起添加於細胞培養用燒瓶等培養容器的狀態下，使細胞進行細胞分裂。此時之培養溫度，較佳為34~38℃，更佳為36~38℃，例如為37℃。又，細胞較佳為以5% CO2存在下之濕潤環境培養。此時所使用的細胞培養用的培養基，只要是可用於哺乳動物細胞的培養者，則無特別限定，例如含有胎牛血清(FBS)的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)。培養基所包含之FBS的濃度，較佳為2~20%，更佳為5~20%，進一步較佳為8~15%，例如為10%。又，DMEM所包含之葡萄糖的濃度為5~20mM，例如為5mM。作為較佳的培養條件，可舉出培養溫度為37℃、為5% CO2存在下之濕潤環境、培養基為含有約5mM的葡萄糖與10% FBS的DMEM者。實施例5中記載之源自齒髓的細胞之培養法(即，細胞培養盤上、添加有10% FBS之含5.56mM葡 萄糖的DMEM培養基、5% CO2存在下、37℃)，係用以在活體外之環境下進行細胞分裂之較佳的方法之一例。
在活體外之環境下進行細胞分裂之情形的細胞之繼代，係使細胞從培養容器剝離，其次，以培養容器的底面積之1/20~1/3被細胞覆蓋的方式，將此細胞接種在新的培養容器而進行。於藉由細胞進行分裂而成為培養容器的底面積之70%以上、80%以上、或90%以上被細胞覆蓋的狀態之情形，係反覆進行繼代。
於一實施形態中，用以作為中間體細胞而保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，以含有已知誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基培養時，就整體而言觀察到蛋白聚醣的表現量增加。又，用以作為中間體細胞而保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，以含有已知誘導往骨細胞的分化之物質的培養基培養時，就整體而言觀察到細胞中之鈣的累積量增加。亦即，該多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係作為整體觀察時，具備往軟骨細胞及骨細胞的分化能力。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，CD34及CD45的至少一個為陰性。例如，該細胞，係作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD73及CD90為陽性，且CD34為陰性。又例如，該細胞，係作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係作為整體觀察時，例如，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性。例如，該細胞，係在將其作為整體觀察時，例如，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性。此等之表面抗原標記為陽性的細胞，已知於移植到同種異體的個體時，有作為抗原被辨識而從活體內被排除之傾向。此等之表面抗原標記的至少一個為陰性，顯示作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞具有那樣低免疫原性之性質，且於移植到同種異體的個體時，有不易從活體內被排除之傾向。又，於此等表面抗原標記之表現圖譜中，在以IFNγ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原可變為陽性。例如，於此等表面抗原標記之表現圖譜中，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性。又，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(b-1)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中， CD47、CD81、CD90、CD147、及HLA-A、B、C的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係80%以上，更佳係90%以上，進一步較佳係95%以上為陽性。
又，於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(b-2)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD29、CD46、CD55、CD59、CD73、及CD140b的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係70%以上，更佳係80%以上，進一步較佳係90%以上為陽性。
又，於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(b-3)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD9、CD44、CD49b、CD49c、CD98、及EGF-R的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係65%以上，更佳係75%以上，進一步較佳係80%以上為陽性。
又，於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(b-4)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD49f、及CD166的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係60%以上，更佳係70%以上，進一步較佳係75%以上為陽性。
又，於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(b-5)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD10、CD13、CD58、CD63、CD105、CD151、及CD164的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係60%以上，更佳係65%以上為陽性，進一步較佳係70%以上為陽性。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，較佳為具有上述(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、及(b-5)所示特徵的2個以上，更佳為3個以上，進一步較佳為具有此等全部的特徵者。例如，具有上述(b-1)及(b-2)所示特徵的細胞，係本發明之較佳的一實施形態。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(b-6)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD120b、CD132、CD158a、CD161、CD184、CD195、CD206、CD210、CD212、CD226、CD244、CD267、CD278、CD279、CD282、CD294、NKB1、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81、Vβ23、SSEA-3、CLA、及整合素β7的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係10%以下，更佳係5%以下，進一步較佳係2%以下，而且還進一步較佳係僅1%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(b-7)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD8b、CD11b、CD15s、CD16、CD19、CD24、CD31、CD32、CD62E、CD62P、CD66f、CD86、CD88、CD94、CD100、CD103、CD104、CD114、CD117、CD118、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD128b、CD135、CD137、CD137配體、CD150、CD163、CD172b、CD177、CD178、CD180、CD197、CD220、CD229、CD231、CD255、CD268、CD305、CD314、CD321、CDw327、CDw328、CD329、CD335、CD336、BLTR-1、CLIP、CMRF-44、CMRF-56、fMLP-R、Vβ8、不變的NKT、及γδTCR的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係10%以下，更佳係5%以下的細胞為陽性，進一步較佳係僅2%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(b-8)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD1a、CD1b、CD1d、CD2、CD3、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD11c、CD15、CD18、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27、CD28、CD33、CD34、CD35、CD37、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42b、CD45、CD45RB、CD45RO、CD48、CD50、CD53、CD62L、CD64、CD66(a、c、d、e)、CD69、CD70、CD72、CD74、 CD80、CD84、CD85、CD87、CD89、CDw93、CD97、CD106、CD134、CD138、CD141、CD144、CD154、CD158b、CD162、CD183、CD205、CD235a、CD271、CD309、CD326、CD337、αβTCR、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係10%以下，更佳係僅5%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，較佳為具有上述(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)、及(b-8)所示特徵的2個以上，更佳為3個以上，進一步較佳為具有此等全部的特徵者。例如，具有上述(b-1)及(b-6)所示特徵的細胞，係本發明之較佳的一實施形態。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係作為整體觀察時，例如表現前列腺素E2(PGE2)及/或血管內皮生長因子(VEGF)者，且就前列腺素E2(PGE2)而言，藉由以TNFα刺激細胞，而其表現量增加。
於本發明之一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於在IFN-γ存在下培養時，使犬尿胺酸的分泌量增加。
於本發明之一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD34、及 CD206的至少一個或全部為陰性。又，於別的一實施形態中，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個或全部為陰性。
於本發明之一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45的至少一個為陰性。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86，及MHC-II型抗原為陰性。此時，在以IFN-γ刺激細胞時，例如，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性。又，為表現前列腺素E2(PGE2)及/或血管內皮生長因子(VEGF)者，且就前列腺素E2(PGE2)而言，藉由以TNFα刺激細胞，而其分泌量增加。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係作為整體觀察時，於以含有已知誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基培養之情形，蛋白聚醣的表現量增加。又，於以含有已知誘導往骨細胞的分化之物質的培養基培養之情形，細胞中之鈣的累積量增加。亦即，該多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係作為整體觀察 時，具有往軟骨細胞及骨細胞的分化能力。
亦可在製程的管理使用以下方式：基於本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞顯示之上述表面抗原標記表現圖譜及/或其他基因表現圖譜，藉由適宜設定的基準，而僅將顯示特定之表現圖譜的細胞作為中間體細胞進行保存。
作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係源自齒髓的多潛能幹細胞(源自齒髓的多潛能幹細胞)佔大部分。該等在平面培養中的光學顯微鏡下，係作為近似紡錘形的附著細胞而被觀察到，且近似紡錘形之細胞佔細胞整體的比率較佳為99%以上，更佳為99.5%以上，進一步較佳為99.9%以上，進一步更佳為99.95%以上。源自齒髓的多潛能幹細胞的比率，可藉由將在光學顯微鏡下觀察時呈現近似紡錘形的形態之細胞數除以總細胞數而求出。亦可在製程的管理使用以下方式：基於上述，藉由適宜設定的基準，而僅將近似紡錘形之細胞的比率為某一定以上之細胞群作為中間體細胞進行保存。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係於作為整體觀察時，較佳為具有往軟骨細胞的分化能力與往骨細胞的分化能力者。換言之，中間體細胞，以含有已知誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基培養之情形，蛋白聚醣的表現量增加。又，中間體細胞，係於作為整體觀察時，以含有已知誘導往骨細胞的分化之物質的培養基培養之情形，細胞中之鈣的累積量增加。中間體細胞具有往軟骨細胞的分化能力及往骨細胞的分化能力，能夠分別以實施例20及實施例19中記載之方法來調查。可藉由此 等之方法，而僅將顯示具有往軟骨細胞的分化能力與往骨細胞的分化能力之細胞群，作為應保存之中間體細胞。但是，用以調查分化能力的方法，並不受限於實施例20及19中記載之方法。亦可藉由其他適當的手法，而僅將顯示具有往軟骨細胞的分化能力與往骨細胞的分化能力之細胞群，作為應保存之中間體細胞。
於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係與於以下詳述之供應進一步培養步驟的中間體細胞相同，或亦可為實質上具有相同性質者。
作為中間體細胞被冷凍保存的細胞，較佳為在解凍前與解凍後，其性狀被保持。換言之，作為中間體細胞而冷凍保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，較佳為於將其解凍時，生存率、表面抗原標記之表現圖譜、細胞的形態、分化能力等與解凍前之細胞實質上相同。可藉由確認解凍後或者解凍而培養時的中間體細胞的性狀，而僅將在解凍的前後其性狀被保持之細胞，作為中間體細胞供應之後的培養步驟。
供應進一步培養步驟的中間體細胞，較佳係解凍後的生存率為50%以上，更佳係60%以上，進一步較佳係70%以上，較佳係例如生存率為80%以上、90%以上、95%以上。可藉由適宜設定的基準，而僅將解凍後的生存率為某一定的數值以上之中間體細胞，供應之後的培養步驟。解凍後之細胞的生存率，大致為80%~98%、85%~95%。
作為中間體細胞被冷凍保存的細胞，較佳為於解凍後培養時，具有10次以上的細胞分裂能力，更佳為具有15 次以上的細胞分裂能力，例如具有14次以上的細胞分裂能力。又，作為中間體細胞被冷凍保存的細胞，較佳為於解凍後培養時，在細胞培養盤上的平均倍增時間為96小時以內，更佳為84小時以內，進一步較佳為72小時以內，進一步較佳為48小時以內，進一步較佳為36小時以內。例如，亦可對於細胞分裂能力及平均倍增時間設定基準，而僅將細胞分裂能力為一定以上且平均倍增時間為某一定的時間以內者，供應之後的利用。此種基準可適宜設定為例如具有10次以上的細胞分裂能力且平均倍增時間為96小時以內、具有14次以上的細胞分裂能力且平均倍增時間為72小時以內、具有15次以上的細胞分裂能力且平均倍增時間為72小時以內等。可藉由不使用不滿足此基準的細胞，而僅將具有某一定以上之細胞分裂能力之中間體細胞，供應之後的培養步驟。在該步驟之培養條件，係針對多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞而可為與上述之至其為止的培養條件相同或同等者。
作為中間體細胞而要被冷凍保存的細胞，在活體外之環境下，較佳為經10次以上的細胞分裂，例如經15次以上、16次以上、或17次以上的細胞分裂，且較佳為在該細胞分裂期間中之平均細胞分裂時間為48小時以內。
供應進一步培養步驟的中間體細胞，係以含有已知誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基培養時，作為整體觀察到蛋白聚醣的表現量增加。又，本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係以含有已知誘導往骨細胞的分化之物質的培養基培養時，作為整體觀察到細胞中之鈣的累積量增加。該細胞係於作為整體觀察時，具備往軟骨細胞及骨細胞的分化 能力。
於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係作為整體觀察時，於解凍後或者解凍而培養時的表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，CD34及CD45的至少一個為陰性。例如，該細胞係CD73、CD90為陽性，且CD34為陰性。又例如CD73、CD90為陽性，且CD34為陰性。該細胞係CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性。
又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係作為整體觀察時，於剛解凍後或解凍而培養時的表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性。例如，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性。此等之表面抗原標記為陽性的細胞，已知於移植到同種異體的個體時，有作為抗原被辨識而從活體內被排除之傾向。此等之表面抗原標記為陰性，顯示供應進一步培養步驟的中間體細胞係那麼低免疫原性，且於移植到同種異體的個體時有不易從活體內被排除之傾向。又，於此等表面抗原標記之表現圖譜中，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、CD86維持陰性，而MHC-II型抗原可變為陽性。例如，以IFN-γ刺激細胞時，於此等表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性。
於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於剛解凍後或者解凍而培養時，作為整體觀察時，於 表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性。又，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性。
於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係
(c-1)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD47、CD81、CD90、CD147、及HLA-A、B、C的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係80%以上，更佳係90%以上，進一步較佳係95%以上為陽性。
又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係
(c-2)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中CD29、CD46、CD55、CD59、CD73、及CD140b的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係70%以上，更佳係80%以上，進一步較佳係90%以上為陽性。
又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係
(c-3)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD9、CD44、CD49b、CD49c、CD98、及EGF-R的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係65%以上，更佳係75%以上，進一步較佳係80%以上為陽性。
又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係
(c-4)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD49f、及CD166的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係60%以上，更佳係70%以上，進一步較佳係75%以上為陽性。
又，於一實施形態中，作為中間體細胞被保存的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係
(c-5)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD10、CD13、CD58、CD63、CD105、CD151、及CD164的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係60%以上，更佳係65%以上為陽性，進一步較佳係70%以上為陽性。
於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，較佳為具有上述(c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、及(c-5)所示特徵的2個以上，更佳為3個以上，進一步較佳為具有此等全部的特徵者。例如，具有上述(c-1)及(c-2)所示特徵的細胞，係本發明之較佳的一實施形態。
於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係
(c-6)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD120b、CD132、CD158a、CD161、CD184、CD195、CD206、CD210、CD212、CD226、CD244、CD267、 CD278、CD279、CD282、CD294、NKB1、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81、Vβ23、SSEA-3、CLA、及整合素β7的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係10%以下，更佳係5%以下，進一步較佳係2%以下，更進一步較佳係1%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係
(c-7)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD8b、CD11b、CD15s、CD16、CD19、CD24、CD31、CD32、CD62E、CD62P、CD66f、CD86、CD88、CD94、CD100、CD103、CD104、CD114、CD117、CD118、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD128b、CD135、CD137、CD137配體、CD150、CD163、CD172b、CD177、CD178、CD180、CD197、CD220、CD229、CD231、CD255、CD268、CD305、CD314、CD321、CDw327、CDw328、CD329、CD335、CD336、BLTR-1、CLIP、CMRF-44、CMRF-56、fMLP-R、Vβ8、不變的NKT、及γδTCR的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係10%以下，更佳係5%以下的細胞為陽性，進一步較佳係2%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係
(c-8)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中， CD1a、CD1b、CD1d、CD2、CD3、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD11c、CD15、CD18、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27、CD28、CD33、CD34、CD35、CD37、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42b、CD45、CD45RB、CD45RO、CD48、CD50、CD53、CD62L、CD64、CD66(a、c、d、e)、CD69、CD70、CD72、CD74、CD80、CD84、CD85、CD87、CD89、CDw93、CD97、CD106、CD134、CD138、CD141、CD144、CD154、CD158b、CD162、CD183、CD205、CD235a、CD271、CD309、CD326、CD337、αβTCR、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係10%以下，更佳係5%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，較佳為具有上述(c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)、(c-7)、及(c-8)所示特徵的2個以上，更佳為3個以上，進一步較佳為具有此等全部的特徵者。例如，具有上述(c-1)及(c-6)所示特徵的細胞，係本發明之較佳的一實施形態。
又，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係作為整體觀察時，例如表現前列腺素E2(PGE2)及/或血管內皮生長因子(VEGF)，且就前列腺素E2(PGE2)而言，藉由以TNFα刺激細胞，而其表現量增加。
於本發明之一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，於在IFN-γ存在下培養時，使犬尿胺酸的分泌量增加。
於本發明之一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD34、及CD206的至少一個或全部為陰性。又，於本發明之一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個或全部為陰性。
於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD19、CD26、CD106、CD117、及CD271的至少一個為陰性，例如此等全部為陰性。
於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD140b及HLA-A、B、C的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
於本發明之一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD46、CD47、CD55、CD58、及CD59的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
於本發明之一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45的至少一個為陰性。
又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性。此時，以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性。又，表現前列腺素E2(PGE2)及/或血管內皮生長因子(VEGF)，且就前列腺素E2(PGE2)而言，藉由以TNFα刺激細胞，而其分泌量增加。再者，藉由以IFN-γ進行刺激，而犬尿胺酸的分泌量增加。
源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其培養時，分泌多種體液因子。
(c-9)於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其培養時，表現MMP-2、IGFBP-4、及胱蛋白C的至少一個，較佳為表現此等全部。
(c-10)於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於將其培養時，表現IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、GROα、HGF、VEGF、VCAM-1、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1的至少一個，較佳為表現此等全部。
(c-11)又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於將其培養時，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於將其培養時，表現IL-23、TNF-α、IL-18、IL-33、IL-27、TARC、ENA-78、MIP-3α、MIP-1β、IP-10、SCF、及ICAM-1的至少一個，較佳為表現此等全部。
(c-12)又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於將其培養時，不表現IL-21、IFN-α、伊 紅趨素、MIP-1α、MIG、I-TAC、及GM-CSF的至少一個，較佳為不表現此等全部或幾乎不表現者。
(c-13)又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於將其在TNF-α存在下或IFN-γ存在下培養時，相較於在此等不存在下培養時，而IL-6的表現量增加。
(c-14)又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於將其在TNF-α存在下、或IFN-γ存在下培養時，相較於在此等不存在下培養時，而IL-11的表現量增加。
(c-15)又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於將其在TNF-α存在下或IFN-γ存在下培養時，相較於在此等不存在下培養時，而IP-10的表現量增加。
(c-16)又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於將其在TNF-α存在下、或IFN-γ存在下培養時，相較於在此等不存在下培養時，而MCP-1的表現量增加。
(c-17)又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於將其在TNF-α存在下培養時，GM-CSF的表現被誘導，但於在IFN-γ存在下培養時，GM-CSF的表現不被誘導。
(c-18)又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於將其在TNF-α存在下培養時，相較於在TNF-α不存在下培養時，而HGF的表現量減少；另一方面，係於將其在IFN-γ存在下培養時，相較於在IFN-γ不存在下培養 時，而HGF的表現量增加。
(c-19)又，於一實施形態中，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於將其在TNF-α存在下培養時，相較於在TNF-α不存在下培養時，而IL-8的表現量增加。
又，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於作為整體觀察時，於剛解凍後或者解凍而培養之情形，具有往軟骨細胞的分化能力與往骨細胞的分化能力。換言之，於以含有已知誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基培養之情形，蛋白聚醣的表現量增加，又，於以含有已知誘導往骨細胞的分化之物質的培養基培養之情形，細胞中之鈣的累積量增加。中間體細胞具有往軟骨細胞的分化能力及往骨細胞的分化能力，能夠分別以實施例20及實施例19中記載之方法來調查。可藉由此等之方法，而僅將顯示具有往軟骨細胞的分化能力與往骨細胞的分化能力之細胞群，作為供應進一步培養步驟的中間體細胞。但是，此等調查分化能力的方法，並不受限於實施例中記載之方法。亦可藉由其他適當的手法，而僅將顯示具有往軟骨細胞的分化能力與往骨細胞的分化能力之細胞群，作為中間體細胞供應之後的培養步驟。
亦可在製程的管理使用以下方式：基於本發明之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞顯示之上述表面抗原標記表現圖譜及/或其他基因表現圖譜，藉由適宜設定的基準，而僅將顯示特定之表現圖譜的細胞作為供應進一步培養步驟的中間體細胞。
又，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係於剛解凍後或者解凍而培養時，作為整體觀察時，源自齒髓的多潛 能幹細胞佔大部分。該等在平面培養中的光學顯微鏡下，係作為近似紡錘形的附著細胞而被觀察到，且近似紡錘形之細胞佔細胞整體的比率較佳為99%以上，更佳為99.5%以上，進一步較佳為99.9%以上，進一步更佳為99.95%以上。基於上述，可藉由適宜設定的基準，而僅將近似紡錘形之細胞的比率為某一定以上之細胞群作為中間體細胞供應之後的培養步驟。
又，供應進一步培養步驟的中間體細胞，將其解凍而培養時，較佳為具有10次以上的細胞分裂能力，更佳為具有15次以上的細胞分裂能力，例如具有14次以上的細胞分裂能力。又，供應進一步培養步驟的中間體細胞，將其解凍而在細胞培養盤上培養時的平均倍增時間較佳為96小時以內，更佳為84小時以內，進一步較佳為72小時以內，進一步更佳為48小時以內，進一步更佳為36小時以內。此時之細胞的培養條件，係與上述多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞的培養條件相同或同等者，可使用例如實施例5中記載之條件(即，細胞培養盤上、添加有10% FBS之含5.56mM葡萄糖的DMEM培養基、5% CO2存在下、37℃)。基於上述，可藉由適宜設定的基準，而僅將細胞分裂能力為某一定以上之細胞群作為中間體細胞供應之後的培養步驟。又，亦可藉由適宜設定的基準，而僅將平均倍增時間為某一定的時間內之細胞群，作為中間體細胞供應之後的培養步驟。就此種基準而言，係例如具有10次以上的細胞分裂能力且平均倍增時間為96小時以內、具有14次以上的細胞分裂能力且平均倍增時間為72小時以內、具有15次以上的細胞分裂能力且平均倍增時間為72小時以內。
亦即，供應進一步培養步驟的中間體細胞，係保 持所謂具有高的分裂能力且可分化為2種以上之細胞的幹細胞之性質者。供應進一步培養步驟的中間體細胞，亦可謂具有高的群落形成能力之細胞。此處，所謂群落形成能力，係指於將細胞接種於盤而培養時，細胞在盤上分裂而形成群落之能力。
中間體細胞，於將其解凍時，在使其浮游於溶液中，例如於培養基中的狀態下，直徑的平均較佳為20μm以下、18μm以下，例如為10~20μm，10~18μm、12~20μm、14~20μm、16~20μm。
將在中間體細胞的製程結束時或其前後所實施的品質檢查之項目，於以下例示為品質檢查a~k。品質檢查係進行關於此等之項目的1個或2個以上。亦可實施此等之項目全部。此時，供應品質檢查的細胞為以下任一者：(1)分取作為中間體細胞而懸浮於冷凍保存液之前的細胞的一部分之細胞；(2)分取作為中間體細胞而懸浮於冷凍保存液之前的細胞的一部分，使其進而經繼代之細胞；(3)用以作為中間體細胞冷凍而懸浮於冷凍保存液的冷凍前之細胞；(4)剛將作為中間體細胞冷凍者解凍後之細胞；或(5)將作為中間體細胞冷凍者解凍並進一步進行培養所得之細胞。只要沒有特別指定，亦可針對此等(1)~(5)之細胞的2種以上進行相同的品質檢查。
(品質檢查a)在光學顯微鏡下觀察時，呈現近似紡錘形的形態之細胞數佔細胞整體的比例為99%以上、99.5%以上、99.9%以上、或99.95%以上之驗證；
(品質檢查b)細胞的生存率為50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或95%以上之驗證；
(品質檢查c)於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中， CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性之驗證，或
於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD73及CD90的至少一個為陽性，且CD34為陰性之驗證；
(品質檢查d)於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性之驗證，或
於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性之驗證；
(品質檢查e)於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性之驗證，或
於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，在以IFN-γ刺激細胞時，係CD40為陰性、CD80為陰性、CD86為陰性、及MHC-II型抗原為陽性的至少一個之驗證；
(品質檢查f)細胞為表現前列腺素E2(PGE2)及/或血管內皮生長因子(VEGF)者，且就前列腺素E2(PGE2)而言，藉由以TNFα刺激細胞，而其表現量增加之驗證；
(品質檢查g)於以含有已知誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基培養時，蛋白聚醣的表現量增加之驗證；
(品質檢查h)於以含有已知誘導往骨細胞的分化之物質的培養基培養時，細胞中之鈣的累積量增加之驗證；
(品質檢查i)在細胞培養盤上具有10次以上、14次以上、或15次以上的細胞分裂能力之驗證；
(品質檢查j)在細胞培養盤上的細胞之平均倍增時間，於該品質檢查i的實施期間中為96小時以內、84小時以內、72小 時以內、48小時以內、或36小時以內之驗證。
(品質檢查k)在使細胞浮游於培養基中的狀態下之平均的直徑為20μm以下、18μm以下、10~20μm、10~20μm、10~18μm、12~20μm、14~20μm、或16~20μm之驗證。
上述品質檢查亦可針對(品質檢查a)~(品質檢查j)的10項目實施。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之9項目來實施。選擇9項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a、b、c、d、e、f、g、i、及j，但並不受限定。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之8項目來實施。選擇8項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a、b、c、d、e、f、i、及j，但並不受限定。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之7項目來實施。選擇7項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a、b、c、d、e、i、及j，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之6項目來實施。選擇6項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a、b、c、d、i、及j，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之5項目來實施。選擇5項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a、b、c、i、及j，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之4項目來實施。選擇4項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a、b、c、及j，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之3項目來實施。選擇3項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a、b、及c，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之2項目來實施。選擇2項目來實施品質檢 查之情形，係例如選擇品質檢查a及b、品質檢查a及c、品質檢查a及d、品質檢查a及e、品質檢查a及f、品質檢查a及g、品質檢查a及h、品質檢查a及i、品質檢查a及j、品質檢查b及c、品質檢查b及d、品質檢查b及e、品質檢查b及f、品質檢查b及g、品質檢查b及h、品質檢查b及i、品質檢查b及j、品質檢查c及d、品質檢查c及e、品質檢查c及f、品質檢查c及g、品質檢查c及h、品質檢查c及i、品質檢查c及j、品質檢查d及e、品質檢查d及f、品質檢查d及g、品質檢查d及h、品質檢查d及i、品質檢查d及j、品質檢查e及f、品質檢查e及g、品質檢查e及h、品質檢查e及i、品質檢查e及j、品質檢查f及i、品質檢查f及j、或品質檢查i及j，但並不受限定為此等。
[生產培養]
對於中間體細胞所進行之進一步培養步驟，係到達成為最終製品之多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞的製造之培養步驟，特別將此步驟稱為生產培養。
生產培養所使用之培養基，較佳為添加有胎牛血清的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基。於培養基中所添加之胎牛血清的濃度(v/v%)，較佳為8~25%，更佳為8~20%，例如為10%。於表1呈示達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(胎牛血清添加前)的詳細組成之一例。亦可根據期望而於培養基中添加3~5mM，例如4mM的L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸。又，於生產培養中通常不添加抗生素。但是，亦可於培養基中添加鏈黴素等抗生素。於培養基中添加鏈黴素之情形，係以鏈黴素在培養基 中的濃度成為10mg/L~250mg/L的方式，例如成為100mg/L的方式來添加。又，各成分能夠以其等效物置換，例如能夠以其鹽置換
生產培養可將細胞在細胞培養盤上進行，亦可於細胞培養裝置內，例如於生物反應器內，將細胞在微載體(microcarrier)上進行。又，生產培養亦可將細胞在細胞培養盤上培養而使其增殖以後，進一步於細胞培養裝置內，例如於生物反應器內在微載體上進行。又，就在微載體上培養細胞之情形而言，亦可使用振盪燒瓶取代生物反應器。於生產培養中，在細胞培養盤上培養細胞之情形，其條件係與培養上述的齒髓懸浮物所得之細胞的培養條件相同或類似者。換言之，係將解凍後的中間體細胞，反覆進行在細胞培養盤上的培養與回收，而使細胞數放大者。此外，就生物反應器而言，可較佳地使用由GE healthcare公司、Merck公司、Sartorius公司等所市售者。以下，針對使用生物反應器作為細胞培養裝置之細胞的培養法特別進行詳述。
於生產培養中，使用生物反應器而在微載體上培養細胞之情形，係將黏著有細胞的微載體，投入生物反應器，在培養基中攪拌微載體而培養細胞。微載體為細胞可黏著之素材的粒子(小粒子)，係為了在其表面上(就多孔性者而言，包含孔內的表面)培養細胞而使用。於該意義，微載體亦可稱為載體粒子或載體小粒子。細胞培養時(即水合時)之微載體的直徑(粒徑)較佳為50~400μm，例如為80~300μm、80~250μm、100~200μm、130~180μm。微載體亦可為從粒子表面朝向內側有開孔的多孔性者。就多孔性的微載體而言，細胞培養時之 其孔的直徑(孔徑)較佳為3~40μm，例如為5~25μm、10~20μm、5~15μm。
關於微載體的素材並無特別限定，只要是可將細胞以黏著在表面的狀態進行培養者，則可作為其素材使用。就微載體而言，有將高分子化合物成型為粒子狀者、陶瓷製粒子、玻璃製粒子等。就此種高分子化合物而言，可舉出例如乙烯樹脂、胺甲酸乙酯(urethane)樹脂、環氧樹脂、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酯、聚醯胺、聚醯亞胺、矽氧樹脂、酚樹脂、三聚氰胺樹脂、脲樹脂、苯胺樹脂、離子聚合物樹脂、聚碳酸酯、膠原蛋白、葡聚糖(dextran)、明膠、纖維素、藻酸鹽(alginate)及此等之混合物。微載體亦可為進一步藉由細胞黏著性分子等而修飾其表面者。就此種細胞黏著性分子而言，可舉出例如明膠、角蛋白、彈性蛋白、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、葡聚糖、硫酸葡聚糖(dextran sulfate)、硫酸軟骨素、玻尿酸鈉、N-異丙基丙烯醯胺、第I型至第XIX型膠原蛋白、纖網蛋白、玻連蛋白(vitronectin)、層連結蛋白-1至12、巢蛋白(nidogen)、肌糖蛋白(tenascin)、血小板反應蛋白(thrombospondin)、骨橋蛋白(osteopontin)、纖維蛋白原、聚-D-離胺酸、聚-L-離胺酸、幾丁質、幾丁聚醣、瓊脂糖凝膠(sepharose)、層連結蛋白、巢蛋白I(entactin I)、或含此等細胞黏著性分子之細胞黏著域的片段或者胜肽、及此等之混合物。又，微載體的比重，較佳為相對於培養基之比重接近1，較佳為0.9~1.2，例如為0.9~1.1，約為1.0。
素材為明膠基質，而細胞培養時的粒徑為130~180μm、孔徑為10~20μm(或5~15μm)者，可較佳地使用來 作為微載體。
生產培養時之細胞對微載體的黏著，係藉由在溶液中攪拌、混合細胞與微載體而進行。此步驟稱為細胞對微載體的黏著步驟。於黏著步驟中，在攪拌中與微載體接觸之細胞變得依序黏著於微載體的表面。此步驟中所使用的溶液，較佳為細胞培養用的培養基，但並不特別受限於此。黏著步驟中之細胞與微載體的攪拌亦可斷續地進行。此情形，例如於進行1分鐘~20分鐘攪拌之後，靜置10分鐘~2小時。
使用細胞培養用的培養基作為溶液而進行黏著步驟之情形，該步驟亦可在生物反應器內進行。在生物反應器內進行黏著步驟之情形，將細胞培養用的培養基、細胞及微載體投入生物反應器中進行攪拌，使細胞黏著於微載體。細胞黏著後，可在生物反應器內，照樣繼續進行細胞培養。在生物反應器內的黏著步驟中之細胞與微載體的攪拌亦可斷續地進行。此情形，例如於進行1分鐘~20分鐘攪拌之後，靜置10分鐘~2小時。
生物反應器一般係指固定化酵素反應裝置等生化學的反應器、與發酵槽或生物學的排水處理裝置等生物學的反應器‧微生物學的反應器。在本發明中之後述的實施例中所使用的生物反應器，係適合使多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞黏著於微載體而在培養基中一邊攪拌一邊進行培養。該生物反應器具有：用以培養細胞的培養槽、用以攪拌培養基的攪拌裝置、氣相投入口、液相投入口、排水口、感測器部。培養槽係具有近似圓筒型的內腔之槽。以此狀態，可在培養槽內培養黏著有微載體的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞。培養槽 的內腔中，係設置有用於培養槽內的培養基之攪拌裝置。攪拌裝置，係例如葉輪，藉由其旋轉而攪拌培養基。利用葉輪之培養基的攪拌，係以細胞所黏著之微載體的大部分不會沈澱在培養槽之內腔的底面，而成為浮游於培養基中之狀態的方式來調整。葉輪的旋轉速度應根據培養槽的形狀、葉輪的形狀、微載體的種類等，而適宜選擇，但例如為30~100rpm、50~80rpm、約70rpm。氣相投入口係用於將空氣、氧、二氧化碳等氣相送入培養槽中。氣相投入口，其出口可在培養基的液面下，此情形，氣相係成為氣泡而被送入培養基。液相投入口係用於將培養基、葡萄糖溶液等各種溶液投入培養槽內。排水口係用於將培養槽內的培養基排出，於培養基交換之際，培養基由此排水口被排出。排水口還可用於將細胞所黏著之微載體與培養基一起取出。於培養中將微載體進行取樣時、或於在培養結束後回收微載體之際，可使用此排水口。感測器部包含測定培養槽內的培養基之溫度、pH、溶氧濃度的感測器。感測器部可進一步包含測定葡萄糖濃度、乳酸濃度的感測器。用於測定溶液之溫度、pH、溶氧濃度、葡萄糖濃度及乳酸濃度的感測器，可自周知者適宜選擇而設置。
生物反應器的培養槽係以被固定於生物反應器內、或可拆取的方式設置。藉由以可拆取的方式設置培養槽，而培養槽清洗變得容易。通常，培養槽為金屬製或硬質樹脂製，於使用後進行清洗而反覆使用。亦可於生物反應器內裝設柔軟的樹脂製的培養用袋來代替這種培養槽，將培養基及細胞投入袋內而進行培養。培養用袋係在生物反應器內以可與通常的培養槽同様地操作的方式被支撐。培養用袋由於可一次性使 用，因而變得不需使用後的清洗操作，可提高培養之際的作業效率。
於生產培養中，在培養基中的葡萄糖濃度成為某數值以下之情形，係對培養基補充葡萄糖。例如，於葡萄糖濃度成為0.1mM以下之情形，以終濃度成為5~7mM的方式補充葡萄糖。又，於生產培養中，在乳酸濃度成為某數值以上之情形，將培養基的全部或一部分進行交換。例如，於乳酸濃度成為20mM以上之情形，將培養基的全部進行交換，或以乳酸濃度成為例如5mM以下、2mM以下的方式將培養基的一部分進行交換。
在生物反應器內的培養中，對於培養基，係由氣相投入口供給氧、空氣、及CO2。氧的供給量係以培養基中的溶氧濃度成為飽和濃度的50~100%的方式，例如以溶氧濃度被保持於50%或100%的方式進行控制。又，CO2的流量係以培養基的pH被保持於例如7.0~7.8的方式供給，而使細胞可較佳地成長。溶氧濃度及pH由於係以感測器部而經時性地監測，因此於所監測到的數值偏離所設定之值時，可藉由因應其來增減氧、CO2的供給量，而將溶氧濃度、pH保持於一定之值。又，亦可配合細胞的增殖，而對生物反應器內供給追加的微載體。
在生物反應器內的培養係進行到細胞佔微載體的表面到成為某比率為止。此時的比率可適宜設定為例如20%、40%、85%、95%、98%。又，在生物反應器內的培養係進行到在微載體的表面上之細胞密度為被細胞所佔到成為某數值為止。此時之細胞密度可適宜設定為例如3000、5000、10000、 20000、22000個/cm2。
於生產培養結束後，作為源自齒髓的細胞製劑而進行冷凍的細胞，較佳係自作為齒髓懸浮物的培養中於細胞培養盤上形成群落之細胞而被回收起經15次以上分裂者，更佳係經20次以上分裂者。例如，冷凍保存經15~30次、15~23次、15~20次、20~30次，20~28次、或23~26次分裂的細胞。
經過中間體細胞然後於生產培養結束後作為源自齒髓的細胞製劑而進行冷凍的細胞，較佳係自作為齒髓懸浮物的培養中於細胞培養盤上形成群落之細胞而被回收起至作成中間體細胞為止經10次以上分裂者，更佳為經15次以上分裂者。例如，冷凍保存經13~20次、13~23次、或14~20次分裂的細胞作為中間體細胞。其次，將中間體細胞解凍而開始的生產培養中，較佳為自開始起至作成源自齒髓的細胞製劑為止，使細胞分裂5次以上，較佳為例如分裂8次以上或10次以上。特別是於生產培養中使用微載體的培養之際，細胞較佳係以分裂2~5次為佳，較佳為例如分裂2~3次。
自中間體細胞起至取得源自齒髓的細胞製劑為止，培養細胞而使其分裂時的細胞的平均倍增時間，就在細胞培養盤上培養細胞之情形而言，較佳為96小時以內，更佳為84小時以內，進一步較佳為72小時以內，進一步更佳為48小時以內，進一步更佳為36小時以內。自中間體細胞起至取得源自齒髓的細胞製劑為止，培養細胞而使其分裂時的細胞的平均倍增時間，就使用微載體來培養細胞之情形而言，較佳為8日以內，更佳為6日以內，進一步較佳為5日以內，進一步較佳為4 日以內，例如為2~8日、2~7日、2~6日、2.5~6日、或2.5~5.5日。
亦可對於生產培養全期間中或使用微載體的培養之際的細胞之平均倍增時間設定基準，且僅將平均倍增時間為該基準以內者冷凍保存，並供應之後的利用。就此種基準而言，例如，就在細胞培養盤上進行培養之情形而言，可適宜設定為84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內；就使用微載體而進行培養之情形而言，可適宜設定為8日以內、6日以內、5日以內、4日以內或3日以內等。不滿足此基準值的細胞係不冷凍保存而丟棄，藉此可僅選擇性地保存具有某一定以上之細胞分裂能力的細胞來作為源自齒髓的細胞製劑。
於生產培養中，到取得源自齒髓的細胞製劑為止，較佳係使細胞增殖到從1個被拔除齒(例如1個第三大臼齒)可獲得之多潛能幹細胞的數目成為1×106個以上為止，更佳係成為1×107個以上為止，進一步較佳係成為3×107個以上為止，進一步更佳係成為1×108個以上為止，進一步更佳係成為1×109個以上為止，例如成為1×107~1×1010個為止。理論上，藉由使其進行20次、25次、及30次分裂，而細胞數係分別增加到1×106倍以上、3×107倍以上、及1×109倍以上。
[製劑的製造]
生產培養結束後，微載體係以黏著有細胞的狀態回收，在該狀態下進行清洗。對於此時可作為用以清洗微載體的清洗液而使用的溶液，只要是不對細胞造成損傷，且不阻礙絲胺酸蛋 白酶及金屬蛋白酶，特別是不阻礙胰蛋白酶之酵素活性者，則無特別限定，但較佳為生理食鹽水、PBS、低葡萄糖DMEM培養基(不含血清)、具有表4所示之組成的清洗溶液，可使用例如低葡萄糖DMEM培養基(不含血清)。
清洗後的微載體，係藉由蛋白酶來進行處理。對於此時所使用的蛋白酶，只要是可分解蛋白質性的細胞黏著分子者，則無特別限定，但較佳為絲胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶或其混合物，就絲胺酸蛋白酶而言，胰蛋白酶為較佳者之一，就金屬蛋白酶而言，明膠酶為較佳者之一。藉由進行蛋白酶處理，而細胞自微載體游離。又，微載體的素材為明膠等蛋白質之情形，係藉由蛋白酶處理，而微載體本身被分解。此時，若微載體為多孔性，則附著在孔內的表面之細胞亦自微載體游離。為多孔性之明膠基質的微載體之情形，藉由以蛋白酶進行處理，而明膠被分解，可得到包含游離之細胞與明膠之分解物的懸浮液。此情形，就蛋白酶而言，特佳為胰蛋白酶、明膠酶、或其混合物。
微載體的素材為明膠等蛋白質之情形，藉由蛋白酶，而可得到包含自微載體游離之細胞與為微載體材料的蛋白質之分解物(於素材為明膠時，為明膠之分解物)的懸浮液。為了將游離之源自齒髓的細胞製劑製劑化，較佳為藉由細胞的清洗操作來從此懸浮液除去蛋白酶、微載體的材料之分解物等雜質。以下，針對微載體之材料為明膠之情形的細胞之清洗操作進行詳述。
藉由利用蛋白酶之處理所得之懸浮液，可反覆進行利用離心分離之回收與利用清洗溶液之懸浮來清洗。蛋白酶 及細微的明膠之分解物可藉由離心分離來除去。但是，明膠之分解物當中，亦有於進行離心時與細胞一起沈澱之大小的殘渣。這種明膠之粗大的殘渣之去除，可藉由膜過濾等手段來進行。從此種觀點來看，進行膜過濾之情形，其過濾膜的孔徑較佳為20~80μm。例如可使用孔徑為25μm、26μm、27μm、28μm、30μm、50μm、70μm、80μm的過濾膜。利用過濾膜之過濾，可藉由於以大孔徑的過濾膜進行過濾之後，以小孔徑的過濾膜來進行過濾，來防止過濾膜的阻塞，而效率良好地進行。例如，可最初以孔徑為60~100μm的過濾膜進行過濾之後，以孔徑為25~50μm的過濾膜進行過濾，亦可最初以孔徑為60~75μm的過濾膜進行過濾之後，以孔徑為25~30μm的過濾膜進行過濾。利用過濾膜之過濾，亦可藉由僅以小孔徑的過濾膜來進行過濾而進行。此情形所使用之過濾膜的孔徑較佳為25~50μm，更佳為25~30μm，例如孔徑為25μm、26μm、27μm、28μm、30μm的過濾膜。此時，明膠之粗大的殘渣不會通過過濾膜而被留下，細胞被回收在濾液中。但是，亦可不回收細胞，且將懸浮著細胞之溶液使用超濾膜等而置換為後述之冷凍保存液(製劑細胞用冷凍保存液)，來製備冷凍前製劑細胞懸浮液。
上述清洗操作中所使用的清洗溶液，係用以將培養基與蛋白酶充分除去者，微載體為明膠等蛋白質之情形，係亦用以除去其分解物者。對於此種清洗溶液的組成並無特別限定，可使用生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水、醋酸林格氏液、重碳酸林格氏液等，但較佳為於重碳酸林格氏液添加有人類血清白蛋白之溶液。醋酸林格氏液及重碳酸林格氏液可使用 市售者。例如，就醋酸林格氏液而言，可使用PLASMA-LYTE A(Baxter公司)、Physio140(大塚製藥公司)；就重碳酸林格氏液而言，可使用BICARBON注射劑(味之素公司)。將較佳的重碳酸林格氏液之成分組成及電解質濃度之一例分別呈示於表2及表3。
作為清洗溶液的成分組成，於表4呈示較佳的一例。又，作為清洗溶液所包含之電解質濃度，於表5呈示較佳的一例。此外，表4及表5所示清洗溶液的成分當中，乙醯色胺酸鈉與辛酸鈉亦可省略。
此外，為了於利用蛋白酶之處理後去除雜質，而進行離心分離與膜過濾之情形，可先進行離心分離，接著進行膜過濾，亦可先進行膜過濾，接著進行離心分離，但較佳為先進行膜過濾，接著進行離心分離。
以清洗溶液清洗後的回收細胞，係作成懸浮於冷凍保存液(製劑細胞用冷凍保存液)的狀態。將此懸浮液(冷凍前製劑細胞懸浮液)封入細胞冷凍保存用容器中而予以冷凍者，係源自齒髓的細胞製劑當中最適於保存、運送的形態者。冷凍前製劑細胞懸浮液的溶液部分(製劑細胞用冷凍保存液)的組成，只要是不使哺乳動物細胞，特別是不使人類的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞死滅而可冷凍、解凍者，則無特別限制。製劑細胞用冷凍保存液包含細胞保護劑。細胞保護劑係例如具有以下功能者：抑制在冷凍細胞時於細胞內形成冰的結晶而破壞細胞。就細胞保護劑而言，作為較佳者可舉出二甲亞碸(DMSO)、乙二醇、丙二醇、絲膠、甘油。亦可將此等的2個以上組合來作為細胞保護劑使用。使用二甲亞碸作為細胞保護劑 之情形，其濃度較佳為5~15%(v/v)，更佳為9~11%(v/v)，例如為10%(v/v)。冷凍保存液亦可包含緩衝劑。緩衝劑較佳為可將水溶液的pH調整成6~8，例如調整成6.8~7.8。就該緩衝劑而言，可舉出例如含有碳酸離子、重碳酸離子、檸檬酸離子及鈉離子者。製劑細胞用冷凍保存液可進一步包含人類血清白蛋白。使用人類血清白蛋白之情形，其濃度較佳為40~100g/L，更佳為46~56g/L，例如為51g/L。
於重碳酸林格氏液添加有人類血清白蛋白溶液與二甲亞碸者，係作為製劑細胞用冷凍保存液而較佳者之一例。製劑細胞用冷凍保存液，較佳係氯化鈉為59~80.4mM、氯化鉀為2.3~3.08mM、氯化鈣二水合物為0.85~1.16mM、氯化鎂六水合物為0.28~0.385mM、碳酸氫鈉為14~19.2mM、檸檬酸鈉二水合物為0.94~1.28mM、人類血清白蛋白為46~56g/L、乙醯色胺酸鈉為3.73~4.55mM、辛酸鈉為3.74~4.58mM、DMSO為9~11%(v/v)。表6所示中間體細胞用冷凍保存液，可較佳地使用來作為製劑細胞用冷凍保存液。亦即，製劑細胞用冷凍保存液，大致可較佳地使用可作為中間體細胞用冷凍保存液使用者。例如，其組成係氯化鈉為65.8~80.4mM、氯化鉀為2.52~3.08mM、氯化鈣二水合物為0.95~1.16mM、氯化鎂六水合物為0.315~0.385mM、碳酸氫鈉為15.7~19.2mM、檸檬酸鈉二水合物為1.04~1.28mM、人類血清白蛋白為46~56g/L、乙醯色胺酸鈉為3.73~4.55mM、辛酸鈉為3.74~4.58mM、DMSO為9~11%(v/v)。表6所示者以外，氯化鈉為70.8~71.3mM、氯化鉀為2.71~2.73mM、氯化鈣二水合物為1.01~1.02mM、氯 化鎂六水合物為0.335~0.345mM、碳酸氫鈉為16.9~17.0mM、檸檬酸鈉二水合物為1.12~1.14mM、人類血清白蛋白為53.6~54.3g/L、乙醯色胺酸鈉為4.36~4.41mM、辛酸鈉為4.37~4.43mM、DMSO為10.6~10.9%(v/v)。此外，此等之中，乙醯色胺酸鈉與辛酸鈉可省略。製劑細胞用冷凍保存液對生理食鹽水的滲透壓比，較佳為0.9~1.1。
又，包含鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、碳酸氫離子、檸檬酸離子、人類血清白蛋白、及二甲亞碸的溶液，可較佳地使用來作為中間體細胞用冷凍保存液。例如，分別以91~113mM的濃度包含鈉離子、以2.52~3.08mM的濃度包含鉀離子、以0.95~1.16mM的濃度包含鈣離子、以0.315~0.385mM的濃度包含鎂離子、以15.6~19.2mM的濃度包含碳酸氫離子、以1.04~1.28mM的濃度包含檸檬酸離子、以46~56g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以9~11%(v/v)的濃度包含二甲亞碸的溶液，係其較佳之一例。又例如，分別以100~102mM的濃度包含鈉離子、以2.71~2.77mM的濃度包含鉀離子、以1.01~1.03mM的濃度包含鈣離子、以0.335~0.345mM的濃度包含鎂離子、以16.9~17.2mM的濃度包含碳酸氫離子、以1.13~1.15mM的濃度包含檸檬酸離子、以52.2~54.3g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以10.3~10.9%(v/v)的濃度包含二甲亞碸的溶液，係其較佳之一例。進一步例如，分別以102mM的濃度包含鈉離子、以2.80mM的濃度包含鉀離子、以1.05mM的濃度包含鈣離子、以0.35mM的濃度包含鎂離子、以17.4mM的濃度包含碳酸氫離子、以1.16mM的濃度包含檸檬酸離子、以51g/L的濃 度包含人類血清白蛋白、及以10%(v/v)的濃度包含二甲亞碸的溶液，係其較佳之一例。進一步例如，分別以101mM的濃度包含鈉離子、以2.77mM的濃度包含鉀離子、以1.03mM的濃度包含鈣離子、以0.34mM的濃度包含鎂離子、以17.2mM的濃度包含碳酸氫離子、以1.15mM的濃度包含檸檬酸離子、以52g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以10%(v/v)的濃度包含二甲亞碸的溶液，係其較佳之一例。進一步例如，分別以100mM的濃度包含鈉離子、以2.71mM的濃度包含鉀離子、以1.01mM的濃度包含鈣離子、以0.34mM的濃度包含鎂離子、以16.9mM的濃度包含碳酸氫離子、以1.13mM的濃度包含檸檬酸離子、以53.6g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以10.7%(v/v)的濃度包含二甲亞碸的溶液，係其較佳之一例。進一步包含乙醯色胺酸或其鹽之情形，其濃度較佳為3.73~4.55mM，更佳為4.24~4.41mM，例如為4.14mM、4.24mM、4.36mM等。進一步包含辛酸或其鹽之情形，其濃度較佳為3.74~4.58mM，更佳為4.25~4.43mM，例如為4.16mM、4.25mM、4.37mM等。
對於懸浮於製劑細胞用冷凍保存液之狀態的懸浮液中之細胞密度並無特別限制，但較佳為5×106~8×107個/mL，更佳為1.5×107~3×107個/mL，進一步較佳為2.1×107~3.0×107個/mL，例如為2.5×107個/mL。懸浮的多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係分注在細胞冷凍保存用容器之後，被冷凍保存。
使多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞懸浮於製劑細胞用冷凍保存液之狀態中之細胞懸浮液的組成，係按照所 懸浮之細胞密度而不同，但大致係氯化鈉為59~61mM、氯化鉀為2.3~2.6mM、氯化鈣二水合物為0.85~0.98mM、氯化鎂六水合物為0.28~0.32mM、碳酸氫鈉為14~16mM、檸檬酸鈉二水合物為0.94~1.08mM、人類血清白蛋白為49~50g/L、乙醯色胺酸鈉為4.0~4.1mM、辛酸鈉為4.0~4.1mM、DMSO為9~11%(v/v)。
分注在1個細胞冷凍保存用容器的細胞懸浮液之量，應適宜調整，但較佳為1~20mL。又，分注在1個細胞冷凍保存用容器的細胞數，較佳為5×106~9.2×108個。
用以冷凍保存懸浮於製劑細胞用冷凍保存液的細胞之較佳的容器、細胞的冷凍及保存之程序及條件，係與針對中間體細胞之冷凍保存而已記載者相同。
這樣地冷凍保存的細胞，能夠使用來作為：含有多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞作為有效成分而成之醫藥(源自齒髓的細胞製劑)。此情形，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞係以冷凍狀態搬運，於使用時解凍而對患者進行投予。
經生產培養而可得之源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，較佳係剛解凍後的生存率為50%以上，更佳係60%以上，進一步較佳係70%以上，較佳係例如生存率為80%以上、90%以上、95%以上。可藉由適宜設定的基準，而僅將生存率為某一定的數值以上者作成源自齒髓的細胞製劑而供應作為醫藥。
源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，以含有已知誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基培養時，就整體而言觀 察到蛋白聚醣的表現量增加。又，該細胞以含有已知誘導往骨細胞的分化之物質的培養基培養時，就整體而言觀察到細胞中之鈣的累積量增加。亦即，該細胞係於作為整體觀察時，具備往軟骨細胞及骨細胞的分化能力。
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性。同樣地，該細胞係CD34及CD45的至少一個為陰性。例如，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於剛解凍後或者解凍而培養時的表面抗原標記之表現圖譜中，CD73及CD90為陽性，且CD34為陰性；或例如CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性。
又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性。例如，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，剛解凍後或者解凍而培養時的表面抗原標記之表現圖譜係CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性者。此等之表面抗原標記為陽性的細胞，已知於移植到同種異體的個體時，有作為抗原被辨識而從活體內被排除之傾向。此等之表面抗原標記的至少一個為陰性，顯示多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞係那麼低免疫原性，且於移植到同種異體的個體時，有不易從活體內被排除之傾向。又，於此等表面抗原標記之表現圖譜中，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、 CD86維持陰性，而MHC-II型抗原可變為陽性。例如，以IFN-γ刺激細胞時，例如，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性。
又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於剛解凍後或者解凍而培養時的表面抗原標記之表現圖譜中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性。以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性。
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係
(d-1)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD29、CD44、CD59、及CD164的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係80%以上，更佳係90%以上，進一步較佳係95%以上為陽性。
又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係
(d-2)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD9、CD13、CD46、CD47、CD58、CD63、CD73、CD81、CD90、CD98、CD147，HLA-A、B、C及EGF-R的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係70%以上，更佳係80%以上，進一步較佳係90%以上為陽性。
又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係
(d-3)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD49b、CD49c、CD49e、CD55、CD95、CD151、及CD166的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係65%以上，更佳係75%以上為陽性，進一步較佳係80%以上為陽性。
又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係
(d-4)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD10、CD49f、CD105、及CD140b的至少一個為陽性，較佳為此等全部為陽性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係60%以上，更佳係70%以上為陽性，進一步較佳係75%以上為陽性。
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，較佳為具有上述(d-1)、(d-2)、(d-3)、及(d-4)所示特徵的2個以上，更佳為3個以上，進一步較佳為具有此等全部的特徵者。例如，具有上述(d-1)及(d-2)所示特徵的細胞，係本發明之較佳的一實施形態。
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係
(d-5)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD1a、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD11b、CD11c、CD15、CD15s、CD16、CD18、 CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD28、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD37、CD38、CD41a、CD86、CD87、CD88、CD89、CDw93、CD94、CD100、CD102、CD103、CD114、CD117、CD118、CD120b、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD128b、CD132、CD134、CD135、CD137、CD137配體、CD138、CD144、CD150、CD153、CD154、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD172b、CD177、CD178、CD180、CD184、CD195、CD196、CD197、CD205、CD206、CD210、CD212、CD220、CD226、CD229、CD231、CD235a、CD244、CD255、CD267、CD268、CD278、CD279、CD282、CD294、CD305、CD309、CD314、CD321、CDw327、CDw328、CD329、CD335、CD336、CD337、BLTR-1、CLIP、CMRF-44、CMRF-56、fMLP-R、SSEA-1、TRA-1-60、CLA、整合素β7、及不變的NKT的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係10%以下，更佳係5%以下，進一步較佳係2%以下，更進一步較佳係僅1%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係
(d-6)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD1b、CD6、CD27、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD45、CD45RB、CD48、CD50、CD53、CD57、CD62E、 CD62L、CD62P、CD64、CD66b、CD66f、CD69、CD70、CD72、CD75、CD84、CD85、CD97、CD99R、CD183、CD193、SSEA-3、及γδTCR的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係10%以下，更佳係5%以下，進一步較佳係僅2%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係
(d-7)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD4v4、CD14、CD36、CD45RA、CD45RO、CD66(a、c、d、e)、CD79b、CD83、CD106、CD152、CD209、CD271、CD275、CD326、MIC A/B、及αβTCR的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係10%以下，更佳係5%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係
(d-8)作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD26、CD40、CD56、CD80、CD146、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性，較佳為此等全部為陰性。此處，此等之抗原，於觀察整體所包含之個別的細胞時，所觀察之細胞較佳係20%以下，更佳係僅10%以下的細胞為陽性。
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，較佳為具有上述(d-1)、(d-2)、(d-3)、(d-4)、(d-5)、(d-6)、(d-7)、及(d-8)所示特徵的2個以上，更佳為3個以 上，進一步較佳為具有此等全部的特徵者。例如，具有上述(d-1)及(d-5)所示特徵的細胞，係本發明之較佳的一實施形態。
又，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係作為整體觀察時，於剛解凍後或者解凍後的培養，為表現前列腺素E2(PGE2)及/或血管內皮生長因子(VEGF)者，且就前列腺素E2(PGE2)而言，藉由以TNFα刺激細胞，而其表現量增加。
又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於在IFN-γ存在下培養時，使犬尿胺酸的分泌量增加者。
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD34、及CD206的至少一個或全部為陰性。又，於本發明之一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個或全部為陰性
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係CD19、CD26、CD34、CD56、CD106、CD117、CD146、及CD271的至少一個為陰性，例如此等全部為陰性。
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD140b及HLA-A、B、C的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD10、CD49e及CD95的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
於本發明之一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD46、CD47、CD55、CD58、及CD59的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
於本發明之一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45的至少一個為陰性。
又，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於剛解凍後或者解凍而培養時，作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性。又，以IFN-γ刺激細胞時，例如，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性。又，表現前列腺素E2(PGE2)及/或血管內皮生長因子(VEGF)，且就前列腺素E2(PGE2)而言，藉由以TNFα刺激細胞，而其分泌量增加。
源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其培養時，分泌多種體液因子。
(d-9)於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其培養時，表現MMP-2、IGFBP-4、及胱蛋白C的至少一個，較佳為此等全部。
(d-10)又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其培養時，表現IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、GROα、HGF、VEGF、VCAM-1、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1的至少一個，較佳為此等全部。
(d-11)又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其培養時，係於將其培養時，表現IL-23、IFN-α、TNF-α、IL-18、IL-27、TARC、ENA-78、MIP-3α、MIP-1β、IP-10、SCF、及ICAM-1的至少一個，較佳為表現此等全部。
(d-12)又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其培養時，不表現IL-21、伊紅趨素、MIP-1α、MIG、I-TAC、IP-10、及GM-CSF的至少一個，較佳為不表現此等全部或幾乎不表現者。
(d-13)又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，將其培養時的IL-6、IL-23、IL-11、MCP-1、ENA-78、HGF、VEGF、MMP-2、IGFBP-4、胱蛋白C、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1的表現量的至少一個，相較於中間體細胞的表現量而為增加。例如，IL-6、IL-11、HGF、TIMP-3、及TIMP-1的表現量，相較於中間體細胞的表現量而為增加。
(d-14)又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其在TNF-α存在下、或IFN-γ存在下培養時，相較於在此等不存在下培養時，而IL-6的表現量增加。
(d-15)又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製 劑所包含之細胞，係於將其在TNF-α存在下、或IFN-γ存在下培養時，相較於在此等不存在下培養時，而IL-11(介白素-11)的表現量增加。
(d-16)又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其在TNF-α存在下、或IFN-γ存在下培養時，相較於在此等不存在下培養時，而IP-10的表現量增加。
(d-17)又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其在TNF-α存在下、或IFN-γ存在下培養時，相較於在此等不存在下培養時，而MCP-1的表現量增加。
(d-18)又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其在TNF-α存在下培養時，GM-CSF的表現被誘導，但於在IFN-γ存在下培養時，GM-CSF的表現不被誘導。
(d-19)又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其在TNF-α存在下培養時，相較於在TNF-α不存在下培養時，而HGF的表現量減少；另一方面，係於將其在IFN-γ存在下培養時，相較於在IFN-γ不存在下培養時，而HGF的表現量增加。
(d-20)又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其在TNF-α存在下培養時，相較於在TNF-α不存在下培養時，而IL-8的表現量增加。
又，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於剛解凍後或者解凍而培養時，作為整體觀察時，於以含有已知誘 導往軟骨細胞的分化之物質的培養基培養之情形，蛋白聚醣的表現量增加。又，該多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係以含有已知誘導往骨細胞的分化之物質的培養基培養之情形，作為整體觀察時，細胞中之鈣的累積量增加。亦即，該多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞具有往軟骨細胞及骨細胞的分化能力。源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞具有往軟骨細胞的分化能力及往骨細胞的分化能力，能夠分別以實施例20及實施例19中記載之方法來調查。可藉由此等之方法，而僅將被確認具有往軟骨細胞的分化能力與往骨細胞的分化能力之細胞群，作為製品來供應醫療機構等。
可藉由適宜設定的基準，而僅將顯示既定的表面抗原標記之表現圖譜及/或基因表現圖譜的細胞作為源自齒髓的細胞製劑來進行保存。
又，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於剛解凍後或者解凍而培養時，作為整體觀察時，源自齒髓的多潛能幹細胞佔大部分。平面培養中之源自齒髓的多潛能幹細胞，在光學顯微鏡下係作為近似紡錘形的附著細胞而被觀察到。在光學顯微鏡下觀察時的平面培養中之近似紡錘形之細胞佔細胞整體的比率，較佳為99%以上，更佳為99.5%以上，進一步較佳為99.9%以上，更進一步較佳為99.95%以上。可藉由適宜設定的基準，而僅將近似紡錘形之細胞的比率為某一定以上之源自齒髓的細胞製劑作為製品來供應醫療機構等。
又，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其解凍而培養時，具有3次以上的細胞分裂能力者，較佳為具有4次以上，更佳為具有5次以上，進一步較佳為具有10次以上 的細胞分裂能力者。又，源自齒髓的細胞製劑，較佳為將其解凍而在細胞培養盤上培養時的平均倍增時間為96小時以內，更佳為84小時以內，進一步較佳為72小時以內，進一步更佳為48小時以內，進一步更佳為36小時以內。此時之細胞的培養條件，係與上述多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞相同或者同等者，可使用例如實施例5中記載之條件。可藉由適宜設定的基準，而僅將細胞分裂能力為某一定以上之源自齒髓的細胞製劑作為製品來供應醫療機構等。又，亦可藉由適宜設定的基準，而僅將平均倍增時間為某一定的時間內之源自齒髓的細胞製劑作為製品而供應醫療機構等。就此種基準而言，係例如具有3次以上的細胞分裂能力且平均倍增時間為72小時以內、具有4次以上的細胞分裂能力且平均倍增時間為72小時以內、具有5次以上的細胞分裂能力且平均倍增時間為72小時以內。
亦即，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係保持所謂具有高的分裂能力且可分化為2種以上之細胞的幹細胞之性質者。供應進一步培養步驟的中間體細胞，亦可謂具有高的群落形成能力之細胞。
源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係在活體外之環境下，較佳為經16次以上的細胞分裂者，例如經21次以上、22次以上、或23次以上的細胞分裂者。
源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係於將其解凍時，在使其浮游於溶液中，例如於培養基中之狀態下的其直徑的平均為20μm以下、18μm以下，例如為10~20μm、10~18μm、12~20μm、14~20μm、16~20μm。
將源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞的品質檢查 之項目，於以下例示作為品質檢查a’~k’。品質檢查係進行關於此等之項目的1個或2個以上。亦可實施此等之項目全部。此時，供應品質檢查的細胞為以下任一者：(1)分取作為源自齒髓的細胞製劑而懸浮於冷凍保存液之前的細胞的一部分之細胞；(2)分取作為源自齒髓的細胞製劑而懸浮於冷凍保存液之前的細胞的一部分，而使其進而經繼代之細胞；(3)用以作為源自齒髓的細胞製劑冷凍而懸浮於冷凍保存液的冷凍前之細胞；(4)剛將作為源自齒髓的細胞製劑冷凍者解凍後之細胞；或(5)將作為源自齒髓的細胞製劑冷凍者解凍並進一步進行培養所得之細胞。只要沒有特別指定，亦可針對此等(1)~(5)之細胞的2種以上進行相同的品質檢查。
(品質檢查a’)在光學顯微鏡下觀察時，呈現近似紡錘形的形態之細胞數佔細胞整體的比例為99%以上、99.5%以上、99.9%以上、或99.95%以上之驗證。
(品質檢查b’)細胞的生存率為50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或95%以上之驗證。
(品質檢查c’)於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性之驗證，或
於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD73及CD90的至少一個為陽性，且CD34為陰性之驗證。
(品質檢查d’)於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性之驗證，或
於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性之驗證。
(品質檢查e’)於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性之驗證，或
於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，在以IFN-γ刺激細胞時，係CD40為陰性、CD80為陰性、CD86為陰性、及MHC-II型抗原為陰性的至少一個之驗證。
(品質檢查f’)細胞為表現前列腺素E2(PGE2)及/或血管內皮生長因子(VEGF)者，且就前列腺素E2(PGE2)而言，藉由以TNFα刺激細胞，而其表現量增加之驗證。
(品質檢查g’)於以含有已知誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基培養時，蛋白聚醣的表現量增加之驗證。
(品質檢查h’)於以含有已知誘導往骨細胞的分化之物質的培養基培養時，細胞中之鈣的累積量增加之驗證。
(品質檢查i’)在細胞培養盤上細胞具有3次以上、4次以上、或5次以上的細胞分裂能力之驗證。
(品質檢查j’)在細胞培養盤上的細胞之平均倍增時間，於該品質檢查i’的實施期間中為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內之驗證。
(品質檢查k’)在使細胞浮游於培養基中的狀態下之平均的直徑為20μm以下、18μm以下、10~20μm、10~18μm、12~20μm、14~20μm、或16~20μm之驗證。
上述品質檢查亦可針對(品質檢查a’)~(品質檢查j’)的任意之10項目實施。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之9項目來實施。選擇9項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a’、b’、c’、d’、e’、f’、g’、i’、及 j’，但並不受限定。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之8項目來實施。選擇8項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a’、b’、c’、d’、e’、f’、i’、及j’，但並不受限定。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之7項目來實施。選擇7項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a’、b’、c’、d’、e’、i’、及j’，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之6項目來實施。選擇6項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a’、b’、c’、d’、i’、及j’，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之5項目來實施。選擇5項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a’、b’、c’、i’、及j’，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之4項目來實施。選擇4項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a’、b’、c’、及j’，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之3項目來實施。選擇3項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a’、b’、及c’，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中，選擇任意之2項目來實施。選擇2項目來實施品質檢查之情形，係例如選擇品質檢查a’及b’、品質檢查a’及c’、品質檢查a’及d’、品質檢查a’及e’、品質檢查a’及f’、品質檢查a’及g’、品質檢查a’及h’、品質檢查a’及i’、品質檢查a’及j’、品質檢查b’及c’、品質檢查b’及d’、品質檢查b’及e’、品質檢查b’及f’、品質檢查b’及g’、品質檢查b’及h’、品質檢查b’及i’、品質檢查b’及j’、品質檢查c’及d’、品質檢查c’及e’、品質檢查c’及f’、品質檢查c’及g’、品質檢查c’及h’、品質檢查 c’及i’、品質檢查c’及j’、品質檢查d’及e’、品質檢查d’及f’、品質檢查d’及g’、品質檢查d’及h’、品質檢查d’及i’、品質檢查d’及j’、品質檢查e’及f’、品質檢查e’及g’、品質檢查e’及h’、品質檢查e’及i’、品質檢查e’及j’、品質檢查f’及i’、品質檢查f’及j’、或品質檢查i’及j’，但並不受限定為此等。
本發明之多潛能幹細胞經富集之源自齒髓的細胞之製造方法，係培養齒髓所包含之多潛能幹細胞，將經增殖的多潛能幹細胞作為中間體細胞而冷凍保存後，將其解凍且進一步進行培養使其增殖，藉此而製造源自齒髓的細胞製劑。自中間體細胞起至製備源自齒髓的細胞製劑為止的步驟，包含以黏著在粒子之表面的狀態培養多潛能幹細胞的步驟。藉由包含此種步驟，而於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，成為具有與中間體細胞不同之性質者。
例如，若針對表面抗原的陽性率來看，則源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，相較於中間體細胞而CD39、CD49a、CD61、CD107a、CD107b、及CD143之任一者或此等全部的陽性率高。例如，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係相較於中間體細胞而CD107b的陽性率高。源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞的此等表面抗原的陽性率，係相較於中間體細胞而較佳為高10%以上者，更佳為高20%以上者。又，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係相較於中間體細胞而CD146的陽性率低。源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞的CD146的陽性率，係相較於中間體細胞而低20%以上、或低 50%以上。
又例如，若針對體液因子的表現量來看，則源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係相較於中間體細胞而IL-6、IL-23、IL-11、MCP-1、ENA-78、HGF、VEGF、MMP-2、IGFBP-4、胱蛋白C、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1之任一者或此等全部的表現量多。特別是，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係相較於中間體細胞而IL-6、IL-11、HGF、IGFBP-4、TIMP-3、及TIMP-1之任一者或此等全部的表現量多。特別是，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係相較於中間體細胞而IL-6及HGF之任一者或此等全部的表現量多。
中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係保持所謂具有高的分裂能力且可分化為2種以上之細胞的幹細胞之性質者。此等之細胞，亦可謂具有高的群落形成能力之細胞。
中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45的至少一個為陰性。又，中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，於表面抗原標記之表現圖譜中，例如，CD73及CD90為陽性，且CD34為陰性。此表現圖譜係與間葉系幹細胞共通。但是，亦具有特徵性質。
於本發明之一實施形態中，中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD34、及CD206的至少一個或全 部為陰性。又，於本發明之一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個或全部為陰性。
於一實施形態中，中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD19、CD26、CD34、CD106、CD117、及CD271的至少一個為陰性，例如此等全部為陰性。又，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係CD19、CD26、CD34、CD56、CD106、CD117、CD146、及CD271的至少一個為陰性，例如此等全部為陰性。在此等之中，CD106雖功能尚未充分查明，但由於在發炎部位的血管內皮細胞表現，而被認為參與發炎性訊息的活化。此等之表面抗原的表現圖譜，係與一般而言作為具有高的群落形成能力之幹細胞而已知者不同，但令人驚訝的是，即使如此，中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞還是具有高的群落形成能力。
於一實施形態中，中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD140b及HLA-A、B、C的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD49e及CD95的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
於一實施形態中，中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD10為陽性。CD10的功能尚未充分查明，但因分解腦啡或P物質(substance P)等發炎相關物質、及發炎相關胜肽，而有參與發炎反應的解除之可能性。
又，於一實施形態中，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，相較於中間體細胞而CD39的陽性率高。又，此等之細胞皆CD73為陽性。CD39係與CD73互相合作而將ATP變換成腺苷(adenosine)，藉此而使細胞外腺苷濃度上升。腺苷係具有將免疫反應負調控而抑制發炎的功能。此功能被認為於CD39的陽性率高的源自齒髓的細胞製劑中，相較於中間體細胞而較高。
又，於一實施形態中，中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD46為陽性。CD46被認為是藉由抑制補體(C3)的活性，而參與補體依賴性細胞毒性的迴避。
又，於一實施形態中，此等之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD47為陽性。CD47係賦予細胞對於因巨噬細胞所致吞噬的抵抗性。
又，於一實施形態中，此等之細胞，係將其作為整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD55為陽性。CD55被認為具有調節補體之傳統路徑或第二路徑的功能，參與因補體所致細胞損傷的迴避。
又，於一實施形態中，此等之細胞，係將其作為 整體觀察時，於表面抗原標記之表現圖譜中，CD58為陽性。CD58的功能尚未充分查明，但有暗示其藉由誘導調節型T細胞(Treg細胞)，而有助於發炎反應的解除。
又，於一實施形態中，此等之細胞係CD59為陽性。CD59被認為藉由作用於補體(C9)以阻礙膜攻擊複合物(membrane attack complex)的形成，而參與因補體所致細胞損傷的迴避。
中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係分泌多種體液因子者。於一實施形態中，中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係分泌MMP-2、IGFBP-4、胱蛋白C、IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、HGF、VEGF(血管內皮細胞生長因子：Vasculara Endothelial Growth Factor)、TIMP-1、TIMP-2、及TIMP-3的至少一個，例如分泌此等全部。除了這些以外，中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係分泌GROα、VCAM-I、及IP-10的至少一個，例如分泌此等全部。
於一實施形態中，中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞係分泌IL-6。IL-6的分泌量係因TNF-α刺激、及IFN-γ刺激而增加。IL-6係已知為發炎性細胞介素，但已知在IL-6缺陷小鼠，肝臟中的發炎反應惡化等，被認為具有消炎作用。
中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係分泌多種體液因子者。於一實施形態中，中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞係分泌IL-11。IL-11的分泌量係因TNF-α刺激、及IFN-γ刺激而增加。IL-11被認為是藉 由抑制發炎性細胞介素的分泌，而顯示消炎作用。
中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係分泌多種體液因子者。於一實施形態中，中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞係分泌IP-10。IP-10的分泌量係因TNF-α刺激、及IFN-γ刺激而增加。IP-10被認為是藉由抑制發炎性細胞介素的分泌，而顯示消炎作用。
源自齒髓的細胞係具有消炎作用等功能。上述之表面抗原、體液因子、及其他之要素的一部分或全部係互相合作而發揮其功能。
包含本發明之源自齒髓的細胞製劑作為有效成分之醫藥組成物，可作為多種疾病治療藥來使用。例如，源自齒髓的細胞製劑，可用於選自包含下述之群組的疾病或病症之治療及預防：自體免疫疾病、發炎性疾病、類風溼性關節炎、克隆氏病、慢性發炎性腸病、心肌梗塞、腦中風(包含慢性期腦中風、急性期腦中風)、慢性發炎去髓鞘型多發性神經病變、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡、肝硬化(包含失代償性肝硬化)、敗血症、骨關節炎、乾癬、及器官移植物排斥。就可作為自體免疫疾病等之治療藥使用的細胞製劑而言，已知包含間葉系幹細胞等幹細胞者。然而，習知的細胞製劑，並非對全部的患者顯示顯著治療效果者，其用法亦有限制。本發明之源自齒髓的細胞製劑，係對於可作為自體免疫疾病等之治療藥使用的細胞製劑加添多樣性者。例如，可藉由使用本發明之源自齒髓的細胞製劑來作為藉由習知的細胞製劑而無法得到治療效果的患者、罹患以習知的細胞製劑而治療效果並未被證明之疾病的患者之治療劑，而提供此種患者新的治療機會。
源自齒髓的細胞製劑，係對於罹患上述疾病的患者，藉由點滴靜脈注射、局部注射等手段來進行投予。
源自齒髓的細胞製劑係使用時進行解凍而使用。於使用時，源自齒髓的細胞製劑，係從液態氮保存容器取出且進行解凍。解凍係藉由例如，在36.5~37.5℃的水浴槽內加溫而進行。解凍後之源自齒髓的細胞製劑，可作為醫藥品而藉由點滴靜脈注射、局部注射等手段來對人類進行投予。點滴靜脈注射之情形，源自齒髓的細胞製劑係從小瓶移到透析袋之後，對患者藉由點滴靜脈注射來進行投予。局部注射之情形，源自齒髓的細胞製劑係從小瓶移到注射器之後，對患者的局部進行注射。
源自齒髓的細胞製劑之使用前的解凍，被預設於醫療機構中實施。源自齒髓的細胞製劑之對醫療機構的供給，係以例如以下的方式進行，但並不特別受限於此。源自齒髓的細胞製劑，係將被冷凍保存在其製造業者、販售業者等的保管庫者，因應醫療機構的需求，以冷凍狀態出貨而運送至醫療機構。以被冷凍之狀態搬入醫療機構的製劑，係於即將對患者進行投予前解凍，然後藉由靜脈注射等而對患者進行投予。作為將源自齒髓的細胞製劑以維持冷凍之狀態進行操作的裝置，可較佳地使用移動式低溫作業台(WO2017/099105)。
[實施例]
以下，參照實施例而更詳細地說明本發明，但並非意圖本發明受實施例所限定。
[實施例1：培養基及試藥之製備]
DMEM(10% FBS)培養基：於低葡萄糖DMEM(葡萄糖濃度5.56mM，GE healthcare公司)，以終濃度成為10%的方式添加有FBS(GE healthcare公司)者。
DMEM(20% FBS)培養基：於低葡萄糖DMEM(葡萄糖濃度5.56mM，GE healthcare公司)，以終濃度成為20%的方式添加有FBS(GE healthcare公司)者。
鏈黴素水溶液：於純水以終濃度成為0.01g/mL的方式溶解有硫酸鏈黴素者。
蛋白酶溶液：以成為終濃度2.5mg/mL的方式，於5mg的Liberase(Roche公司)加入低葡萄糖DMEM所製備者。係作為蛋白酶而含有I型膠原蛋白酶、II型膠原蛋白酶及嗜熱菌蛋白酶之溶液。
DMEM(20% FBS)鏈黴素培養基：以體積比，以100：1混合有DMEM(20% FBS)培養基與鏈黴素溶液者。
胰蛋白酶-EDTA溶液：0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液(Thermo Fisher Scientific公司)。
1%葡萄糖酸洛赫西定溶液：將5%(w/v)Fermajin溶液(SIOE PHARMACEUTICAL公司)以注射用水稀釋5倍者。
重碳酸林格氏液：具有下述表7及表8所呈示組成的BICARBON輸注液(AY PHARMACEUTICALS公司)。
[表7]
Figure 108127022-A0202-12-0115-10
[表8]
Figure 108127022-A0202-12-0115-12
人類血清白蛋白溶液：具有下述表9所呈示之組成的KENKETU ALBUMIN 25-NICHIYAKU(日本製藥公司)。
[表9]
Figure 108127022-A0202-12-0115-14
清洗溶液：以人類血清白蛋白的終濃度成為1.19%(w/v)的方式，於1000mL的重碳酸林格氏液 (BICARBON輸注液，AY PHARMACEUTICALS公司)添加有50mL的25%(w/v)人類血清白蛋白溶液(日本製藥公司)者。於表10及表11呈示清洗溶液的組成。
[表10]
Figure 108127022-A0202-12-0116-15
[表11]
Figure 108127022-A0202-12-0116-16
細胞保護液：以體積比，以成為11：9：5的方式混合有重碳酸林格氏液(BICARBON輸注液，AY PHARMACEUTICALS公司)、人類血清白蛋白25%溶液及二甲亞碸(DMSO，Mylan公司)者。
[表12]
Figure 108127022-A0202-12-0117-17
[實施例2：由人類被拔除齒的齒髓之取得]
將得到知情同意而取得之1個人類被拔除齒(第3大臼齒)，以重碳酸林格氏液(BICARBON注射劑)稍微清洗之後，使用1%葡萄糖酸洛赫西定溶液將被拔除齒的表面進行殺菌。其次，將被拔除齒軋碎之後，將齒髓自其他組織切除。
[實施例3：齒髓的酵素處理]
對在實施例2得到的齒髓，添加以低葡萄糖DMEM稀釋約10倍的蛋白酶溶液之後，在設定為37℃的水浴槽內放置到藉由目視而可確認組織已被充分地分解為止。
其次，將酵素處理後之細胞的總量移到離心管，添加DMEM(20% FBS)鏈黴素培養基使酵素反應停止之後，進行離心使組織片、細胞等沈澱。去除上清液，對所得之沈澱物添加DMEM(20% FBS)鏈黴素培養基，使組織片、細胞等懸 浮，再度進行離心而使細胞等沈澱。對沈澱物添加DMEM(20% FBS)鏈黴素培養基，以微量滴管進行反覆吸排(pipetting)而溫和地使細胞懸浮，而得到包含組織片、源自齒髓的細胞等的齒髓懸浮物。
[實施例4：齒髓懸浮物之培養]
將在實施例3所製備的齒髓懸浮物添加於細胞培養盤，5% CO2存在下，在37℃開始培養。一邊於每2~4日交換DMEM(20% FBS)鏈黴素培養基，一邊繼續進行培養到在該盤上所形成的群落可藉由目視確認為止。
[實施例5：源自齒髓的細胞之培養]
從藉由目視而確認有群落的細胞培養盤除去培養基，且添加胰蛋白酶-EDTA溶液，使細胞的表面被同溶液覆蓋，在37℃靜置5~10分鐘而剝離細胞。其次，對細胞培養盤添加DMEM(10% FBS)培養基而使反應停止的同時，使細胞懸浮。將此細胞懸浮液回收於離心管。將所回收的細胞進行離心(300×g、5分鐘)而使其沈澱，去除上清液。對離心管添加DMEM(10% FBS)培養基，使細胞懸浮而作成細胞懸浮液。
測定細胞懸浮液所包含之活細胞數之後，以成為3000~20000個細胞/cm2之細胞密度的方式，於細胞培養盤接種細胞，5% CO2存在下，在37℃開始培養。一邊於每2~4日交換DMEM(10% FBS)培養基，而一邊繼續進行培養到在該盤上細胞長滿為止。
從細胞長滿的細胞培養盤除去培養基之後，對該 盤添加胰蛋白酶-EDTA溶液，使細胞的表面被同溶液覆蓋。將該盤在37℃靜置5~10分鐘而剝離細胞。其次，對該盤添加與胰蛋白酶-EDTA溶液同量的DMEM(10% FBS)培養基而使反應停止的同時，使細胞懸浮。將此細胞懸浮液回收於離心管。將所回收的細胞進行離心(300×g、5分鐘)而使其沈澱，去除上清液，添加DMEM(10% FBS)培養基，使細胞懸浮。
反覆進行上述之細胞的回收與培養，使細胞增殖到活細胞數成為1×108個以上為止。此培養期間中之細胞的分裂次數(亦即在活體外環境下的分裂次數)為16~17次，細胞的平均倍增時間在整個培養期間中為2日(48小時)以內。
[實施例6：源自齒髓的細胞(中間體細胞)之回收]
從在實施例5之最後的培養中細胞長滿的細胞培養盤除去培養基，添加胰蛋白酶-EDTA溶液，使細胞的表面被同溶液覆蓋。在37℃靜置5~10分鐘，剝離細胞。其次，對細胞培養盤添加與胰蛋白酶-EDTA溶液同量的DMEM(10% FBS)培養基而使反應停止的同時，使細胞懸浮。將此細胞懸浮液回收於容器，進行離心使細胞沈澱，去除上清液。為了清洗細胞，添加清洗溶液500mL~1000mL使細胞懸浮之後，再度進行離心使細胞沈澱，去除上清液。反覆進行此細胞之清洗操作，最終，作為離心後的沈澱而回收細胞。將如此進行所得之細胞當成中間體細胞。
[實施例7：源自齒髓的細胞(中間體細胞)之冷凍]
以細胞濃度成為11×106個/mL(±5%)的方式，對在實施例 6所製備之細胞的沈澱加入清洗溶液與細胞保護液，使細胞懸浮。將如此進行所得之細胞懸浮液填充在冷凍保存用小瓶(素材：環烯共聚物，無菌密閉小瓶，Aseptic Technologies公司)而進行密封。將此細胞懸浮液當成中間體細胞懸浮液。於表13呈示中間體細胞懸浮液的溶液部分(中間體細胞用冷凍保存液)所包含之成分。將中間體細胞懸浮液使用程式冷凍儀(program freezer)冷凍之後，移到液態氮保存容器內保存。將此冷凍的中間體細胞懸浮液當成中間體細胞冷凍品。
[表13]
Figure 108127022-A0202-12-0120-18
[實施例8：源自齒髓的細胞(中間體細胞)之解凍]
將填充有在實施例7所製備之源自齒髓的細胞(中間體細胞)之小瓶，從液態氮保存容器取出，在36.5~37.5℃的水浴槽內加溫而解凍。將所解凍之細胞懸浮液移到離心管，加入30mL的DMEM(10% FBS)培養基使其懸浮。進行離心(300×g、5分鐘)使細胞沈澱，去除上清液。其次，添加DMEM(10% FBS) 培養基20mL使中間體細胞懸浮。
[實施例9：源自齒髓的細胞之生產培養(前培養)]
測定在實施例8所製備之細胞懸浮液所包含的中間體細胞之活細胞數之後，以成為20000個細胞/cm2以下之密度的方式，於細胞培養盤接種細胞，5% CO2存在下，在37℃開始培養。一邊於每2~4日交換DMEM(10% FBS)培養基，而一邊繼續進行培養到在細胞培養盤上細胞長滿為止。此外，由活細胞數所算出之解凍後的中間體細胞所包含之細胞的生存率(活細胞數/總細胞數×100%)，大致為85~95%。
除去細胞長滿的細胞培養盤之培養基，添加胰蛋白酶-EDTA溶液，使細胞的表面被同溶液覆蓋，在37℃靜置5~60分鐘，剝離細胞。其次，對細胞培養盤添加同量的DMEM(10% FBS)培養基而使反應停止的同時，使細胞懸浮。將細胞懸浮液回收於容器，進行離心使細胞沈澱，去除上清液。添加DMEM(10% FBS)培養基使細胞懸浮之後，再度進行離心使細胞沈澱，去除上清液。添加DMEM(10% FBS)培養基而再度使細胞懸浮。
測定細胞懸浮液所包含之活細胞數之後，以成為20000個細胞/cm2以下之密度的方式，於細胞培養盤接種細胞，5% CO2存在下，在37℃開始培養。一邊於每2~4日交換DMEM(10% FBS)培養基，而一邊繼續進行培養到在該盤上細胞長滿為止。
反覆進行上述之細胞的回收與培養，使細胞增殖到活細胞數成為1×109個以上為止。此中間體細胞在細胞培養 盤上的培養期間中之細胞的分裂次數為5~6次，細胞的平均倍增時間在整個培養期間中為2日(48小時)以內。
除去細胞長滿的細胞培養盤之培養基，添加胰蛋白酶-EDTA溶液。在37℃靜置5~60分鐘，剝離細胞。其次，對細胞培養盤添加DMEM(10% FBS)培養基而使反應停止的同時，使細胞懸浮。於容器中回收此細胞懸浮液。將所回收的細胞進行離心而使其沈澱，去除上清液。添加DMEM(10% FBS)培養基500mL~600mL使細胞懸浮之後，再度進行離心使細胞沈澱，去除上清液。添加DMEM(10% FBS)培養基500mL~600mL而再度使細胞懸浮。
[實施例10：源自齒髓的細胞之生產培養(生物反應器的準備)]
以電子天平量取微載體50g(±1.0g)，放入試劑瓶，於添加2000mL之PBS之後，以高壓釜進行滅菌。此外，微載體係粒徑為130~180μm(水合時)之細胞培養用的明膠素材之微載體，且使用具有耐熱性者而能夠以高壓釜進行滅菌處理。
於生物反應器裝設反應器用50L袋、通氣過濾器、及感測器迴路(sensor loop)，且進一步設置溫度感測器、pH計與溶氧測定儀。於生物反應器內(之袋)加入10L的DMEM(10% FBS)培養基與50g(乾重量)的微載體，一邊攪拌一邊在37℃進行加溫。此外，攪拌係使用設置於同裝置之葉輪而進行。
[實施例11：源自齒髓的細胞之生產培養(細胞對微載體的黏著步驟)]
測定在實施例9所製備之細胞懸浮液所包含的活細胞數之後，以成為1000~5000個細胞/cm3之密度的方式而添加於生物反應器內。將反應器內攪拌數分鐘之後，使攪拌停止，靜置1小時以上。反覆進行此攪拌與靜置，使細胞黏著至微載體。
[實施例12：源自齒髓的細胞之生產培養(細胞培養步驟)]
於黏著步驟結束後，攪拌生物反應器內，開始培養。於培養中定期地觀察生物反應器內，於微載體沈降在反應器的底部之情形，係提高反應器內的攪拌旋轉數，使微載體在培養基中成為浮游狀態。
生產培養係藉由實施例13中記載之測定，而進行到下述情形為止：細胞增殖到活細胞數成為5×109個以上為止。利用微載體之培養期間中之細胞的分裂次數為2~3次，細胞的平均倍增時間大致為3~6日。經生產培養之細胞，係在活體外環境下進行至少23次的細胞分裂者，係進行23~27次的細胞分裂者。
[實施例13：源自齒髓的細胞之生產培養(細胞數的測定)]
由反應器內採集包含微載體的培養液30~40mL而移到離心管，靜置5分鐘以上使微載體沈降之後除去上清液。加入25mL之PBS使細胞懸浮，於靜置5分鐘以上之後除去上清液。再1次進行此操作。將上清液去除後，對微載體添加胰蛋白酶-EDTA溶液。在37℃的水浴槽內振盪5~10分鐘之後，添加與胰蛋白酶-EDTA溶液同量的DMEM(10% FBS)培養基而使反應停止的同時，使細胞懸浮。將此細胞懸浮液進行離心 (300×g、5分鐘)而使細胞沈澱，去除上清液。添加DMEM(10% FBS)培養基1~5mL使細胞懸浮之後，測定細胞懸浮液所包含之活細胞數。
[實施例14：源自齒髓的細胞之生產培養(葡萄糖濃度及乳酸濃度的測定)]
由反應器內採集培養中的細胞懸浮液5~40mL而移到離心管，將細胞懸浮液靜置5分鐘以上使微載體沈降之後，將上清液的一部分移到新的1.5mL管。使用微量注射器採集上清液50μL，使用生物感測器(BF-7D，王子計測機器公司)測定上清液中之葡萄糖濃度及乳酸濃度。於葡萄糖濃度降低的情形，係補充葡萄糖使葡萄糖不成為小於0.1mM的濃度、或將培養基的全部或一部分進行交換。又，於乳酸濃度上升的情形，係將培養基的全部或一部分進行交換，使乳酸不成為20mM以上的濃度。
[實施例15：在生產培養所得之源自齒髓的細胞之回收]
確認細胞增殖到既定的細胞數為止後，停止反應器及感測器迴路的攪拌，靜置10分鐘以上使微載體沈降。去除盡可能之量的上清液之後，以殘存的培養基使細胞懸浮。將細胞懸浮液回收於10L袋(Thermo Fisher Scientific公司)內，於靜置5分鐘以上使微載體沈降之後，除去上清液。
加入低葡萄糖DMEM使微載體懸浮，於靜置5分鐘以上使微載體沈降之後，除去上清液。將此操作反覆進行數次。其次，對去除上清液後的微載體添加胰蛋白酶-EDTA溶 液。添加胰蛋白酶-EDTA溶液後，藉由在37℃的水浴槽內振盪30~60分鐘，而將細胞從微載體剝離的同時，分解微載體。
為了將細胞懸浮液中殘存之微載體的片段、細胞塊等去除，使所回收的濾液通過孔徑20~35μm的過濾器，將細胞回收於過濾器的濾液。將所回收的濾液離心使細胞沈澱，去除上清液。為了清洗細胞，添加實施例1所製備的清洗溶液使細胞懸浮，再度進行離心使細胞沈澱，而去除上清液。反覆進行此清洗操作，最終，作為離心後的沈澱而回收細胞。
[實施例16：源自齒髓的細胞之製劑化及冷凍保存]
以細胞濃度成為25~31×106個/mL的方式，對在實施例15所回收之細胞的沈澱加入清洗溶液與細胞保護液，使細胞懸浮。將如此進行所得之細胞懸浮液填充在冷凍保存用小瓶(素材：環烯共聚物，無菌密閉小瓶，Aseptic Technologies公司)而進行密封。將此細胞懸浮液當成冷凍前源自齒髓的細胞製劑。於表14呈示冷凍前源自齒髓的細胞製劑的溶液部分(製劑細胞用冷凍保存液)所包含之成分。
[表14]
Figure 108127022-A0202-12-0126-19
將填充於小瓶之冷凍前源自齒髓的細胞製劑，藉由常規方法使用程式冷凍儀而冷凍之後，移到液態氮保存容器內保存。將此冷凍的細胞懸浮液當成包含源自齒髓的細胞作為有效成分之製劑(源自齒髓的細胞製劑)。
[實施例17：源自齒髓的細胞之性狀(細胞的形態等)]
將在實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及在實施例16所製備之源自齒髓的細胞製劑解凍，加入10mL的DMEM(10% FBS)培養基，稍微搖晃混合之後，進行離心(1500rpm、5分鐘)使細胞沈澱。去除上清液，添加10mL的DMEM(10% FBS)培養基使細胞懸浮，再度進行離心(1500rpm、5分鐘)使細胞沈澱。其次，使細胞懸浮於DMEM(10% FBS)培養基，以成為5000~10000個細胞/cm2之密度的方式，接種於細胞培養盤，培養至細胞成為90~100%滿(90~100% confluent)為止。藉由位相差顯微鏡，而觀察在細胞培養盤上的細胞之形態。將中 間體細胞冷凍品及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞進行培養而成者，全部為近似紡錘形的附著細胞，並未包含其他形狀的細胞。此外，由活細胞數所算出之解凍後的中間體細胞冷凍品及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞的生存率(活細胞數/總細胞數×100%)，大致為85~95%。
[實施例18：源自齒髓的細胞製劑之性狀(粒徑)]
將在實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及在實施例16所製備之源自齒髓的細胞製劑解凍，分別以D-PBS(-)溶液進行稀釋，製備約5×106個/mL的細胞稀釋液。細胞粒徑係藉由使用細胞活性計數影像分析儀(Vi-CellXR，Beckman Coulter公司)的影像分析法計測。關於使用細胞活性計數影像分析儀的影像分析法，略述於以下。對細胞稀釋液加入台酚藍而將細胞染色，將此細胞稀釋液送液使其通過細長的流路，拍攝複數張流路的顯微鏡放大影像。於死細胞，由於台酚藍透過細胞膜而被染色，於各個影像中，將作為有顏色之粒子被觀察到的細胞計測為死細胞，將作為透明之粒子被觀察到的細胞計測為活細胞。細胞粒徑係使用在其影像上所計測之1個粒子的直徑、與顯微鏡的放大倍率而算出。由所拍攝之全部的影像中之粒徑之值求出平均值。
(結果)
細胞粒徑(細胞之直徑)的平均值，於將中間體細胞冷凍細胞解凍者為17.36μm±1.40μm(平均值±SD，n=3)，於將源自齒髓的細胞製劑解凍者為16.98±1.23μm(平均值±SD， n=3)(圖1)。
[實施例19：源自齒髓的細胞之性狀(骨細胞分化能力)]
骨細胞分化能力，係將Pittenger MF.,et al.,Science.284,143-7(1999)、Colter DC.,et al.,Proc Natl Acad Sci USA.98,7841-5(2001)之記載等作為參考，而以下述方法進行調查。
分別將在實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及在實施例16所製備之源自齒髓的細胞製劑解凍，進行離心(1500rpm、5分鐘)使細胞沈澱。其次，使細胞懸浮於DMEM(10% FBS)培養基，以成為5000~15000個細胞/cm2之密度的方式，接種於細胞培養盤，培養到細胞成為90~100%滿為止。以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，於37℃靜置5~10分鐘而剝離細胞。添加DMEM(10% FBS)培養基使細胞懸浮，測定活細胞數。於塗布有第I型膠原蛋白的24孔細胞培養盤，以DMEM(10% FBS)培養基中的細胞密度(15000~25000個細胞/cm2)接種細胞，培養3天。將細胞分為2組，將其中一組的培養基更換為於骨細胞分化用基礎培養基(Lonza公司)添加有含地塞米松、L-麩醯胺酸、抗壞血酸鹽、青黴素/鏈黴素、間葉細胞生長補充劑(mesenchymal cell growth supplement，MCGS)、β-甘油磷酸鹽的骨細胞分化用添加因子套組(Lonza公司)之骨細胞分化誘導培養基，一邊於每3~4日交換培養基，一邊進行2~3週分化培養。將此組當成骨細胞分化誘導組。關於另一組，係將培養基更換為新的DMEM(10% FBS)培養基，一邊於每3~4日交換培養基，一邊 進行2~3週培養。將此組當成對照組。分別培養骨細胞分化誘導組及對照組的細胞後，以PBS清洗1次，對各孔添加0.4mL的10%甲酸，在室溫靜置1小時使累積於細胞之鈣自細胞游離。使用Calcium E-Test Wako(和光純藥公司)來定量游離之鈣濃度。
於圖2呈示測定結果。中間體細胞冷凍品、源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞之任一者皆相較於對照組，而於骨細胞分化誘導組中觀察到細胞之鈣濃度的上升。此結果顯示中間體細胞冷凍品及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞都往骨細胞分化，顯示本發明之源自齒髓的細胞具有往骨細胞的分化能力。
[實施例20：源自齒髓的細胞之性狀(軟骨細胞分化能力)]
軟骨細胞分化能力，係將Kiani C.,et al.Cell Res.12 19-32(2002)、Aung A.,et al.Arthritis Rheum.63 148-58(2011)之記載等作為參考，而以下述方法進行調查。
將在實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及在實施例16所製備之源自齒髓的細胞製劑解凍，進行離心(1500rpm、5分鐘)使細胞沈澱。其次，使細胞懸浮於DMEM(10% FBS)培養基，以成為5000~10000個細胞/cm2之密度的方式，接種於細胞培養盤，培養到細胞成為90~100%滿為止。以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，於37℃靜置5~10分鐘而剝離細胞。添加DMEM(10% FBS)培養基而使細胞懸浮，測定活細胞數。將細胞分為2組，使其中一組的細胞以1×106個/mL的濃度懸浮於為軟骨細胞分化誘導培養 基之Stem MACS(註冊商標)ChondroDiff培養基(Miltenyi Biotec公司)，將其各1mL接種在低吸附性容器(STEMFULL(註冊商標)，Sumitomo Bakelite公司)，使似球體形成。一邊於每3~4日交換培養基，一邊進行2~3週分化培養。將其當成軟骨細胞分化誘導組。關於另一組，則使用DMEM(10% FBS)培養基將細胞繼代培養，將其當成對照組。
培養後回收細胞，55℃溫浴中，以蛋白酶K處理30分鐘使細胞溶解。藉由RNeasy(註冊商標)Plus Mini套組(QIAGEN公司)，從溶解之細胞萃取全RNA(total RNA)而製備全RNA萃取液，其次使用吸光光度計(Denovix公司)，而測定全RNA萃取液所包含之RNA濃度。RNA濃度測定後，使用QuantiTect(註冊商標)反轉錄套組(QIAGEN公司)合成cDNA。進一步製備PCR反應液，以各組之cDNA 25ng作為模板，在[(50℃/2分鐘)×1循環，(95℃/10分鐘)×1循環，(95℃/15秒、60℃/1分鐘)×40循環]的PCR條件下進行即時反轉錄酶-聚合酶連鎖反應(real-time RT-PCR)，使蛋白聚醣基因與β-肌動蛋白基因增幅。於PCR引子，分別使用蛋白聚醣探針(Applied Biosystems公司/Assay ID：Hs00153936_m1)及β-肌動蛋白探針(Applied Biosystems公司/4310881E)。
於圖3呈示測定結果。判明了中間體細胞冷凍品、源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞之任一者皆相較於對照組，而在軟骨細胞分化誘導組，蛋白聚醣的Ct值(閾值循環(Threshold cycle))高。此結果顯示在軟骨細胞分化誘導組中，為構成軟骨的細胞外基質之主要分子的蛋白聚醣的表現量增加，顯示中間體細胞冷凍品及源自齒髓的細胞製劑所包含之 細胞皆具有往軟骨細胞的分化能力。
[實施例21：源自齒髓的細胞之性狀(表面抗原的測定-1)]
源自齒髓的細胞係與人類間葉系幹細胞相同地顯示近紡錘狀的形狀。於是，使用流式細胞儀，調查已知在人類間葉系幹細胞為陽性之表面抗原標記的CD73、CD90、CD105、及CD166、及已知在間葉系幹細胞為陰性之表面抗原標記的CD34與CD45之表現的有無。
將磷酸緩衝液生理食鹽水pH7.4、含BSA、粉末(SIGMA公司)溶解於純水，通過0.45μm過濾器，而製備PBS-B[含有0.138M氯化鈉、0.0027M氯化鉀、1%(w/v)牛血清白蛋白的0.01M磷酸緩衝生理食鹽水(pH7.4)]。將來自人類的IgG(SIGMA公司)溶解於PBS(Life technologies公司)，通過0.45μm過濾器而製備20mg/mL IgG溶液。於18mL的PBS-B加入2mL的20mg/mL IgG溶液，而製備阻斷溶液(blocking solution)。
又，使用FITC標識抗人類CD34抗體(anti-CD34-FITC，BD公司)作為抗CD34抗體、使用FITC標識抗人類CD45抗體(anti-CD45-FITC，Beckman Coulter公司)作為抗CD45抗體、使用FITC標識抗人類CD73抗體(anti-CD73-FITC，BD公司)作為抗CD73抗體、使用FITC標識抗人類CD90抗體(anti-CD73-FITC，BD公司)作為抗CD90抗體、使用PE標識抗人類CD105抗體(anti-CD105-R-PE，BD公司)作為抗CD105抗體、使用PE標識抗人類CD166抗體(anti-CD166-PE，Ancell公司)作為抗CD166抗體、及使用 FITC標識小鼠IgG1同型對照(anti-IgG1-FITC，Beckman Coulter公司)與PE標識小鼠IgG1同型對照(IgG1-PE，Beckman Coulter公司)作為對照抗體。
(細胞的染色方法)
將在實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及在實施例16所製備之源自齒髓的細胞製劑解凍，進行離心(1500rpm、5分鐘)使細胞沈澱。去除上清液，添加10mL的DMEM(10% FBS)培養基而使細胞懸浮，測定活細胞數。將細胞(1×107個)採集於50mL離心管，進行離心(1500rpm、5分鐘)使其沈澱，去除上清液。加入PBS-B使總量成為10mL而使細胞懸浮之後，再度將細胞進行離心(1500rpm、5分鐘)使其沈澱，去除上清液。其次，使細胞懸浮於1mL的阻斷溶液，在冰上靜置1小時。對9隻5mL反應管(編號(1)~(9))，如表15所呈示地添加各抗體溶液。其次，對各管，添加懸浮於阻斷溶液之細胞的懸浮液各100μL，稍微搖晃混合，在冰上靜置20分鐘，使各抗體溶液所包含之抗體與表現於細胞表面之表面抗原標記結合。其次，對各管添加PBS-B各3mL而混合之後，將細胞進行離心(1500rpm、5分鐘)使其沈澱，而去除上清液，去除未與細胞結合之抗體。反覆進行3次此抗體的去除操作。對各管加入400μL之PBS-B，使細胞懸浮。
[表15]
Figure 108127022-A0202-12-0133-21
(測定及解析)
針對管編號(1)~(9)的細胞，以BD FACSVerse(註冊商標)(BD公司)測定FITC及PE的各螢光色素之量，藉由與陰性對照之比較，而透過與表面抗原特異性地結合之抗體，求出於細胞表面所結合之螢光色素之量。此外，管(2)為管(3)~(6)的陰性對照，管(7)為(8)及(9)的陰性對照。管(1)為非染色細胞。
於圖4呈示測定結果。若針對管編號(5)、(6)、及(8)、(9)的細胞(分別為CD73、CD90、CD105、及CD166染色細胞)來看，則無論中間體細胞冷凍品、源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞之任一者，關於此等之表面抗原，85%以上的細胞為陽性。若針對管編號(3)與(4)的細胞(分別為CD34及CD45染色細胞)來看，則無論中間體細胞冷凍品、源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞之任一者，關於此等之表面抗原，大部分的細胞為陰性。此等之結果顯示源自齒髓的細胞係CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，CD34與CD45為陰性。
[實施例22：源自齒髓的細胞之性狀(表面抗原的測定-2)]
將在實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及在實施例16所製備之源自齒髓的細胞製劑解凍，將細胞懸浮液總量加入DMEM培養基。進行離心(300×g、5分鐘、室溫)，將上清液去除後，加入DMEM培養基進行懸浮。其次，將細胞使用BD Lyoplate(人類細胞篩選標記篩選盤(Human Cell Screening Marker Screening Panel)，BD公司)，使用抗表面抗原之抗體進行抗體染色。抗體染色係按照人類細胞篩選盤(Human cell screening panel，BD公司)的步驟準則(protocol)實施。於以下說明使用人類細胞篩選盤的表面抗原之測定方法的概略。對96孔盤的各孔分注細胞懸浮液。對各孔添加抗各種表面抗原之抗體作為一次抗體，靜置30分鐘，使表面抗原與抗體結合。進行離心使細胞沈澱，除去上清液。於清洗細胞之後，對各孔添加抗一次抗體之抗體作為二次抗體，靜置30分鐘，使表面抗原與抗體結合。二次抗體係藉由Alexa Fluor 647而被螢光標識者。進行離心使細胞沈澱，除去上清液。將細胞再懸浮，關於此細胞懸浮液，使用流式細胞測量術，螢光檢測二次抗體所結合之細胞作為陽性細胞，求出各表面抗原之陽性細胞的存在比率。測定係針對中間體細胞進行9批次，關於源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係針對7批次進行，而針對各抗原求出陽性比率。
(結果)
將於中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞中為陽性的表面抗原分別呈示於圖5、圖6。
在中間體細胞，關於CD47、CD81、CD90、CD147、及HLA-A、B、C，係在全部的批次顯示95%以上的陽性率。又，關於CD29、CD46、CD55、CD59、CD73、及CD140b，係在全部的批次顯示90%以上的陽性率。又，關於CD9、CD44、CD49b、CD49c、CD98、及EGF-R，係在全部的批次顯示80%以上的陽性率，大致顯示90%以上的陽性率。又，關於CD49f及CD166，係在全部的細胞顯示70%以上的陽性率，大致顯示90%以上的陽性率。又，關於CD13、CD58、CD63、CD151、及CD164，係在全部的細胞顯示60%以上的陽性率，大致顯示90%以上的陽性率(圖6)。除了這些以外，在中間體細胞，CD105亦為陽性(圖5)。
另一方面，在源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，關於CD29、CD59、CD44、及CD164，係在全部的批次顯示95%以上的陽性率，大致顯示98%以上的陽性率。又，關於CD9、CD13、CD46、CD47、CD58、CD63、CD73、CD81、CD90、CD98、CD147、EGF-R、及HLA-A、B、C，係在全部的批次顯示90%以上的陽性率，大致顯示95%以上的陽性率。又，關於CD49b、CD49c、CD49e、CD55、CD95、CD151、及CD166，係在全部的批次顯示80%以上的陽性率，除了CD95、CD151、及CD166以外，大致顯示90%以上的陽性率。又，CD10、CD49f、及CD140b係在全部的批次顯示70%以上的陽性率，大致顯示80%以上的陽性率(圖6)。除了這些以外，在源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，CD105亦為陽性(圖4)。
其次，將於中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所 包含之細胞中為陰性的表面抗原分別呈示於表16、表17。
在中間體細胞，關於CD120b、CD132、CD158a、CD161、CD184、CD195、CD206、CD210、CD212、CD226、CD244、CD267、CD278、CD279、CD282、CD294、NKB1、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81、Vβ23、SSEA-3、CLA、及整合素β7，係在全部的批次顯示1%以下的陽性率。又，關於CD8b、CD11b、CD15s、CD16、CD19、CD24、CD31、CD32、CD62E、CD62P、CD66f、CD86、CD88、CD94、CD100、CD103、CD104、CD114、CD117、CD118、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD128b、CD135、CD137、CD137配體、CD150、CD163、CD172b、CD177、CD178、CD180、CD197、CD220、CD229、CD231、CD255、CD268、CD305、CD314、CD321、CDw327、CDw328、CD329、CD335、CD336、BLTR-1、CLIP、CMRF-44、CMRF-56、fMLP-R、Vβ8、不變的NKT、及γδTCR，係在全部的批次顯示2%以下的陽性率，大致陽性率為1%以下。又，關於CD1a、CD1b、CD1d、CD2、CD3、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD11c、CD15、CD18、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD35、CD37、CD38、CD41a、CD41b、CD42b、CD45、CD45RB、CD45RO、CD48、CD50、CD53、CD62L、CD64、CD66(a、c、d、e)、CD69、CD70、CD72、CD74、CD84、CD85、CD87、CD89、CDw93、CD97、CD134、CD138、CD141、CD144、CD154、CD158b、CD162、 CD183、CD205、CD235a、CD309、CD326、CD337、及αβTCR，係在全部的細胞顯示5%以下的陽性率。又，關於CD26、CD106、及CD271，亦有在一部分的批次顯示超過5%之陽性率者，但陽性率的平均值為5%以下(表16A~表16-D)。除了這些以外，在中間體細胞，CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及MHC-II型抗原亦為陰性(圖4、圖11A)。
在源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，關於CD1a、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD11b、CD11c、CD15、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD28、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD37、CD38、CD41a、CD86、CD87、CD88、CD89、CDw93、CD94、CD100、CD102、CD103、CD114、CD117、CD118、CD120b、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD128b、CD132、CD134、CD135、CD137、CD137配體、CD138、CD144、CD150、CD153、CD154、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD172b、CD177、CD178、CD180、CD184、CD195、CD196、CD197、CD205、CD206、CD210、CD212、CD220、CD226、CD229、CD231、CD235a、CD244、CD255、CD267、CD268、CD278、CD279、CD282、CD294、CD305、CD309、CD314、CD321、CDw327、CDw328、CD329、CD335、CD336、CD337、BLTR-1、CLIP、CMRF-44、CMRF-56、fMLP-R、SSEA-1、TRA-1-60、CLA、整合素β7、及不變的NKT，係在全部 的批次顯示1%以下的陽性率。又，關於CD1b、CD6、CD27、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD45、CD45RB、CD48、CD50、CD53、CD57、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD66b、CD66f、CD69、CD70、CD72、CD75、CD84、CD85、CD97、CD99R、CD183、CD193、SSEA-3、及γδTCR，係在全部的批次顯示2%以下的陽性率，大致陽性率為1%以下。又，關於CD4v4、CD14、CD36、CD45RA、CD45RO、CD66(a、c、d、e)、CD79b、CD83、CD152、CD209、CD275、CD326、MIC A/B、及αβTCR，係在全部的批次顯示5%以下的陽性率，大致陽性率為2%以下。又，關於CD106及CD271，亦有在一部分的批次顯示超過5%之陽性率者，但陽性率的平均值為5%以下(表17A~表17E)。除了這些以外，在源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及MHC-II型抗原亦為陰性(圖4、圖11B)。
[表16A]
Figure 108127022-A0202-12-0139-22
[表16B]
Figure 108127022-A0202-12-0140-23
[表16C]
Figure 108127022-A0202-12-0141-24
[表16D]
Figure 108127022-A0202-12-0142-25
[表17A]
Figure 108127022-A0202-12-0143-26
[表17B]
Figure 108127022-A0202-12-0144-27
[表17C]
Figure 108127022-A0202-12-0145-28
[表17D]
Figure 108127022-A0202-12-0146-29
[表17E]
Figure 108127022-A0202-12-0147-30
將於中間體細胞與源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞中，陽性率有10%以上之差者呈示於表7。於以實施例9~15中記載之方法進一步培養中間體細胞所得之源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞中，係相較於中間體細胞而CD39、 CD49a、CD61、CD107a、CD107b及CD143的陽性率增加20%以上，另一方面，CD146的陽性率降低60%。此等之結果，係源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞具有與中間體細胞不同之性質。亦即顯示可藉由利用實施例9~15中記載之方法進行培養，而作為與中間體細胞不同之新的細胞，得到源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞。
[實施例23：源自齒髓的細胞之性狀((血管內皮細胞生長因子(VEGF)分泌能力試驗)]
將在實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及在實施例16所製備之源自齒髓的細胞製劑解凍，進行離心(1500rpm、5分鐘)使細胞沈澱。其次，使細胞懸浮於DMEM(10% FBS)培養基，以成為5000~15000個細胞/cm2之密度的方式，接種於細胞培養盤，培養到細胞成為90~100%滿為止。以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，於37℃靜置5~10分鐘而剝離細胞。添加DMEM(10% FBS)培養基使細胞懸浮，測定活細胞數。使細胞在DMEM(10% FBS)培養基以0.7×105個/mL的濃度懸浮之後，將其10mL接種於T25細胞培養盤，培養5天。培養後，回收培養上清液之總量，以電子天平(島津製作所)計測所回收之培養上清液的重量，到測定時為止以-80℃冷凍保存。回收‧去除上清液之後，以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，於37℃靜置5~10分鐘，進行剝離。添加DMEM(10% FBS)培養基使細胞懸浮，測定活細胞數。
將上述冷凍保存之培養上清液解凍，使用Quantikine ELISA Human VEGF套組(R&D Systems公司) 標識培養上清液中所包含之VEGF之後，使用微量盤讀取儀(microplate reader)(Molecular Devices公司)進行檢測。於以已知濃度的VEGF所作成的檢量曲線，內插所得之檢測值，求出培養上清液中所包含之VEGF濃度。VEGF的分泌量，係藉由下述式，而作為每細胞數的分泌量算出。
[VEGF的分泌量=VEGF濃度測定值×培養上清液的體積/活細胞數(1×105個)]
於圖8呈示測定結果之一例。此結果顯示：中間體細胞、源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞都具有VEGF的分泌能力，但其能力係在從中間體細胞經過進一步培養而到達源自齒髓的細胞製劑為止的過程中被增強。VEGF由於係具有血管生成作用之物質，因此源自齒髓的細胞製劑可藉由將其對人類進行投予，而透過VEGF在體內促進血管的形成。又，由於在經由中間體細胞而製造之源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，VEGF的分泌能力被增強，因此藉由此種製造方法所製造之源自齒髓的細胞製劑，可認為作為必須發揮血管生成作用之疾病治療藥更為有效。
[實施例24：源自齒髓的細胞之性狀(前列腺素E2(PGE2)分泌能力試驗)]
將在實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及在實施例16所製備之源自齒髓的細胞製劑解凍，進行離心(1500rpm、5分鐘)使細胞沈澱。其次，使細胞懸浮於DMEM(10% FBS)培養基，以成為5000~15000個細胞/cm2之密度的方式，接種於細胞培養盤，培養到細胞成為90~100%滿為止。以PBS清洗細胞， 添加胰蛋白酶-EDTA，於37℃靜置5~10分鐘，而剝離細胞。添加DMEM(10% FBS)培養基而使細胞懸浮，測定活細胞數。使細胞在DMEM(10% FBS)培養基以1×105個/mL的濃度懸浮之後，分別對12孔細胞培養盤中的6孔分接種1mL的細胞稀釋液。再者，對3孔加入含有40ng/mL之TNFα(R&D Systems公司)的DMEM(10% FBS)培養基各1mL，對剩下的3孔加入DMEM(10% FBS)培養基各1mL，將前者當成TNFα刺激組，將後者當成無刺激組(對照組)，而培養約24小時。培養後，回收培養上清液之總量，以電子天平(島津製作所)計測所回收之上清液的重量，到測定時為止以-80℃冷凍保存。回收‧去除上清液之後，以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，於37℃靜置5~10分鐘，而剝離細胞。添加DMEM(10% FBS)培養基而使細胞懸浮，測定活細胞數。
將上述冷凍保存之培養上清液解凍，使用前列腺素E2快速酵素免疫法套組(Prostaglandin E2 Express EIA Kit，Cayman Chemical公司)標識培養上清液中所包含之前列腺素E2(PGE2)後，使用微量盤讀取儀(Molecular Devices公司)進行檢測。於以已知濃度的PGE2所作成的檢量曲線，內插所得之檢測值，求出培養上清液中所包含之PGE2濃度。PGE2的分泌量係藉由下述式，而作為每細胞數1×105個的分泌量算出。
[PGE2的分泌量=PGE2濃度測定值×培養上清液的體積/活細胞數(1×105個)]
於圖9呈示測定結果。此結果顯示：中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞都具有TNFα反應性之 PGE2的分泌能力，但其能力在從中間體細胞經過進一步培養而到達源自齒髓的細胞製劑為止的過程中增加。PGE2由於具有強力的消炎作用，因此源自齒髓的細胞製劑可藉由將其對人類進行投予，而透過PGE2來在體內對發炎部位作用，且抑制發炎所伴隨的組織破壞。又，由於在經由中間體細胞而製造之源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，PGE2的分泌能力被增強，因此藉由此種製造方法所製造之源自齒髓的細胞製劑，可認為作為必須發揮消炎作用之疾病治療藥更為有效。
[實施例25：犬尿胺酸分泌試驗] (試驗方法)
將在實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及在實施例16所製備之源自齒髓的細胞製劑解凍之後，以成為5000~15000個細胞/cm2之密度的方式，接種於細胞培養燒瓶，到細胞成為90~100%滿為止培養4天。以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA(Thermo Fisher Scientific公司)，在37℃靜置5~10分鐘而剝離細胞。添加DMEM(10% FBS)培養基，使細胞懸浮，測定活細胞數。以成為15000~25000個細胞/cm2之密度的方式，而於2個細胞培養燒瓶接種細胞。當中對1個細胞培養燒瓶，係加入含有100U/mL之IFNγ(鹽野義製藥公司)的DMEM(10% FBS)培養基，對另1個細胞培養燒瓶係加入DMEM(10% FBS)培養基，將前者當成IFNγ刺激組，將後者當成無刺激組(對照組)，而培養3天。培養後，回收細胞培養上清液總量。以電子天平(島津製作所)計測所回收之細胞培養上清液的重量，到測定時為止以-80℃冷凍保存。回收‧去除上清 液之後，以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，在37℃靜置5~10分鐘而剝離細胞。添加DMEM(10% FBS)培養基使細胞懸浮，分別測定IFNγ刺激組及無刺激組的活細胞數。將上述冷凍保存的培養上清液解凍，添加30%三氯乙酸(NACALAI TESQUE公司)，進行離心(10000g、10分鐘)之後，使用HPLC(島津製作所)檢測培養上清液中所包含之犬尿胺酸。於以已知濃度的犬尿胺酸所作成的檢量曲線，內插所得之檢測值，求出培養上清液中所包含之犬尿胺酸濃度(莫耳濃度)。犬尿胺酸的分泌量係藉由下述式，而作為每細胞數的分泌量算出。
[犬尿胺酸的分泌量=犬尿胺酸濃度測定值×208.21×培養上清液的體積/活細胞數(1×105個)]
(結果)
於圖10呈示結果。中間體細胞及源自齒髓的細胞製劑都藉由在IFNγ存在下進行培養，而犬尿胺酸的分泌量顯著地增加。犬尿胺酸可於抑制T細胞之增殖的同時，使單核球分化為抗發炎性的M2巨噬細胞。是以，可認為多潛能幹細胞富集之源自齒髓的細胞可藉由將其對人類進行投予，而透過犬尿胺酸來發揮消炎作用。
[實施例26：源自齒髓的細胞之性狀(低免疫原性試驗)]
將在實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及在實施例16所製備之源自齒髓的細胞製劑解凍，進行離心(1500rpm、5分鐘)使細胞沈澱。其次，使細胞懸浮於DMEM(10% FBS)培養基，以成為5000~15000個細胞/cm2之密度的方式，接種於細胞培養盤，培養到細胞成為90~100%滿為止。以PBS清洗細胞， 添加胰蛋白酶-EDTA，於37℃靜置5~10分鐘而剝離細胞。添加DMEM(10% FBS)培養基使細胞懸浮，測定活細胞數。以成為15000~25000個細胞/cm2之密度的方式，而於2個細胞培養盤接種細胞。當中對1個細胞培養盤係加入含有100U/mL之IFNγ(鹽野義製藥公司)的DMEM(10% FBS)培養基，對另1個細胞培養盤係加入DMEM(10% FBS)培養基，將前者當成IFNγ刺激組，將後者當成無刺激組(對照組)，而培養3天。培養後，以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，於37℃靜置5~10分鐘而剝離細胞。添加DMEM(10% FBS)培養基使細胞懸浮，分別測定IFNγ刺激組及無刺激組的活細胞數。其次，將各組的細胞懸浮液離心(1500rpm、5分鐘)，去除上清液之後加入阻斷溶液(記載於實施例21)，以細胞濃度成為1×107個細胞/mL之方式進行調整，在冰上靜置1小時。
作為抗MHC-I型抗原、MHC-II型抗原、CD40、CD80、CD86之抗體，分別使用FITC標識抗人類MHC-I型抗原抗體(Ancell公司)、FITC標識抗人類MHC-II型抗原抗體(Ancell公司)、FITC標識抗人類CD40抗體(BD Biosciences公司)、FITC標識抗人類CD80抗體(BD Biosciences公司)、FITC標識抗人類CD86抗體(BD Biosciences公司)。又，作為對照抗體，使用FITC標識小鼠IgG1同型對照(Beckman Coulter公司)、及FITC標識小鼠IgG2a同型對照(BD Biosciences公司)。
對5mL反應管(編號(1)~(16))，如表16所示地添加各抗體溶液。其次，對5mL反應管(1)~(8)，係添加IFNγ刺激組的細胞懸浮液各100μL，又，對5mL反應管(9)~ (16)，係添加IFNγ無刺激組的細胞懸浮液各100μL，稍微搖晃混合，在冰上靜置20分鐘，使各抗體溶液所包含之抗體與表現於細胞表面之表面抗原標記結合。其次，添加PBS-B各3mL而混合之後，將細胞進行離心(1500rpm、5分鐘)使其沈澱，而去除上清液，去除未與細胞結合之抗體。反覆進行3次此抗體的去除操作。其次，對各管加入400μL之PBS-B，使細胞懸浮。
[表18]
Figure 108127022-A0202-12-0154-31
針對管編號(1)~(16)的細胞，以BD FACSVerse(BD公司)測定FITC的螢光色素之量，藉由與陰性對照的比較，而透過與表面抗原特異性地結合之抗體，求出於細胞表面所結合之螢光色素之量。此外，分別地，管(2)為管(4)及(6)~(8)的陰性對照，管(3)為管(5)的陰性對照，管(10)為管(12)及(14)~(16)的陰性對照，管(11)為(13)的陰性對照。管(1)及(9)為非染色細胞。
(結果)
於圖11A及圖11B呈示測定結果。若針對MHC-I型抗原的測定結果來看，則無論IFNγ刺激的有無，中間體細胞、源自 齒髓的細胞製劑都幾乎全部的細胞為陽性。若針對MHC-II型抗原的測定結果來看，則中間體細胞、源自齒髓的細胞製劑都在IFNγ無刺激下實質上全部的細胞為陰性，但因IFNγ刺激，而大部分的細胞變成陽性。若針對CD40、CD80、及CD86的測定結果來看，則無論IFNγ刺激的有無，中間體細胞、源自齒髓的細胞製劑都幾乎全部的細胞為陰性。
MHC-I型抗原及MHC-II型抗原係具有對免疫細胞提示抗原之功能的細胞表面抗原。又，MHC-I型抗原已知在幾乎全部的細胞表現，又，MHC-II型抗原已知在許多的細胞因IFNγ刺激而其表現被誘導。另一方面，CD40、CD80、及CD86係參與免疫系細胞之活化的表面抗原。亦即，由於中間體細胞冷凍品及源自齒髓的細胞製劑都不表現CD40、CD80、及CD86，因此可認為並不會積極地使免疫細胞活化。換言之，此等之結果顯示：中間體細胞冷凍品及源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，皆不具免疫原性，就進行IFNγ刺激之情形而言，亦皆為具有不會引起免疫原性之性質者。
[實施例27：中間體細胞與源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞的包含細胞介素之各種因子的分泌能力之測定] (前培養)
將在實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及在實施例16所製備之源自齒髓的細胞製劑解凍，將融解的細胞懸浮液總量加入DMEM培養基。進行離心(300×g、5分鐘、室溫)，將上清液去除後，加入DMEM培養基進行懸浮，使用Muse細胞分析儀(Muse Cell Analyzer，Millipore Sigma公司)計測細胞懸 浮液中的活細胞數與總細胞數，算出生存率。活細胞在中間體細胞冷凍品中的細胞係以成為7000個/cm2的方式，在源自齒髓的細胞製劑中的細胞係以成為12000個/cm2的方式，於T225燒瓶接種細胞，在CO2恆溫箱(incubator)內(37℃，5% CO2)培養4天。培養後，從T225燒瓶去除培養基之後，以DPBS清洗，添加0.25%胰蛋白酶-EDTA，而於CO2恆溫箱內靜置5分鐘。確認細胞的剝離之後，添加DMEM培養基使細胞懸浮，回收總量。進行離心(300×g、5分鐘、室溫)，使細胞沈澱。將上清液去除後，加入DMEM培養基進行懸浮，使用Muse細胞分析儀(Millipore Sigma公司)計測細胞懸浮液中的活細胞數與總細胞數，算出生存率。
(培養上清液之回收)
以活細胞的個數成為28000個/燒瓶的方式，於T25燒瓶接種在前培養所回收的細胞，分成無刺激組、TNFα及IFNγ刺激組而開始培養。各組的培養基量設為每1燒瓶10mL，TNFα的最終濃度調製為10ng/mL(原液2μg/mL)、IFNγ的最終濃度調製為100U/mL(原液1×106U/mL)。於培養開始之後第3日，將培養上清液各0.5mL回收於冷凍管，進行冷凍保存。於培養上清液回收後以DPBS清洗，添加0.25%胰蛋白酶-EDTA，而於CO2恆溫箱內靜置5分鐘。確認細胞的剝離之後，添加DMEM培養基，回收總量。進行離心(300×g、5分鐘、室溫)，將上清液去除後，加入DMEM培養基進行懸浮，使用Muse細胞分析儀(Millipore Sigma公司)計測細胞懸浮液中的活細胞數與總細胞數，算出生存率。
(細胞介素測定)
使用LEGENDplex(BioLegend公司)，而測定所回收之培養上清液所包含之包含細胞介素的各種因子的濃度。於以下略述LEGENDplex的測定原理。按著與珠粒結合之抗原(細胞介素的種類)而將不同的一次抗體添加至含測定對象之物質的試樣，使一次抗體與該物質結合。其次，添加經生物素化的二次抗體，使其與已與一次抗體結合之該物質結合，進一步使藻紅素(PE)標識鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)進行結合。抗生物素蛋白(avidin)係特異性地與生物素結合，因此可藉由將其以流式細胞測量術進行測定，而因應其螢光強度來定量與珠粒結合之藻紅素(PE)標識鏈黴抗生物素蛋白。此定量值係與試樣所包含之為測定對象之物質的量成比例，因此可定量該物質。
(結果：無刺激組中之各種因子的表現量)
於圖12呈示無刺激組中之培養上清液所包含之各種因子的濃度。中間體細胞與源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，皆高程度地表現MMP-2、IGFBP-4、及胱蛋白C(圖12)。
又，中間體細胞與源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，皆表現IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、GROα、HGF、VEGF、VCAM-1、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1(圖13)。
再者，中間體細胞與源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞雖微量，但皆表現IL-23、TNF-α、IL-18、IL-33、IL-27、TARC、ENA-78、MIP-3α、MIP-1β、IP-10、SCF、及ICAM-1(圖14)。又，中間體細胞與源自齒髓的細胞製劑所包 含之細胞，皆不表現或幾乎不表現IL-21、伊紅趨素(Exotaxin)、MIP-1α、MIG、I-TAC、及GM-CSF。IFN-α在中間體細胞雖未被檢測到表現，但在源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係微量地表現。又，表中雖未呈示，但於中間體細胞與源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞之任一者中，發炎性細胞介素之IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、及IL-13未表現，或幾乎未表現。
(結果：無刺激組中之各種因子的表現量之中間體細胞與源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞之間的差異)
針對於中間體細胞與源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞之間，表現量比較不同之因子，於圖15呈示培養上清液所包含之各種因子的濃度比。此等之因子，相較於中間體細胞而在源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞其表現量多。特別是IL-6、IL-11、HGF、IGFBP-4、TIMP-3、及TIMP-1，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞的表現量為中間體細胞的1.5倍以上。
(結果：因TNF-α及IFN-γ刺激所致之IL-6的表現量之變化)
於圖16呈示以TNF-α及IFN-γ進行刺激時的培養上清液所包含之IL-6的濃度。在中間體細胞，係於TNF-α及IFN-γ刺激之任一者中皆為IL-6的表現量相較於無刺激之情形而增加。關於源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞亦相同。
(結果：因TNF-α及IFN-γ刺激所致之IL-11的表現量之變化)
於圖17呈示以TNF-α及IFN-γ進行刺激時的培養上清液 所包含之IL-11的濃度。在中間體細胞，係於TNF-α及IFN-γ刺激之任一者中皆為IL-11的表現量相較於無刺激之情形而增加。關於源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞亦相同。
(結果：因TNF-α及IFN-γ刺激所致之IP-10的表現量之變化)
於圖18呈示以TNF-α及IFN-γ進行刺激時的培養上清液所包含之IP-10的濃度。在中間體細胞，係於TNF-α及IFN-γ刺激之任一者中皆為IP-10的表現量相較於無刺激之情形而增加。圖18中，無刺激之情形之IP-10的濃度未出現於圖中，那是因為IP-10的濃度低，如圖14所示，中間體細胞係於無刺激之情形亦表現。關於源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞亦相同。
(結果：因TNF-α及IFN-γ刺激所致之MCP-1的表現量之變化)
於圖19呈示以TNF-α及IFN-γ進行刺激時的培養上清液所包含之MCP-1的濃度。在中間體細胞，係於TNF-α及IFN-γ刺激之任一者中皆為MCP-1的表現量相較於無刺激之情形而增加。關於源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞亦相同。
(結果：因TNF-α及IFN-γ刺激所致之GM-CSF的表現量之變化)
於圖20呈示以TNF-α及IFN-γ進行刺激時的培養上清液所包含之GM-CSF的濃度。無刺激之情形，GM-CSF於中間體細胞與源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞之任一者中皆幾乎未 觀察到表現。中間體細胞，係因TNF-α刺激而GM-CSF的表現被誘導，但於IFN-γ刺激則表現並不被誘導。關於源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞亦相同。
(結果：因TNF-α及IFN-γ刺激所致之HGF的表現量之變化)
於圖21呈示以TNF-α及IFN-γ進行刺激時的培養上清液所包含之HGF的濃度。在中間體細胞，相較於無刺激之情形，HGF的表現量在因TNF-α刺激而減少的另一方面，係因IFN-γ刺激而增加。關於源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞亦相同。
(結果：因TNF-α及IFN-γ刺激所致之IL-8的表現量之變化)
於圖22呈示以TNF-α及IFN-γ進行刺激時的培養上清液所包含之IL-8的濃度。在中間體細胞，相較於無刺激之情形，IL-8的表現量因TNF-α刺激而增加，但於IFN-γ刺激則無變化。關於源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞亦相同。
[實施例28：源自齒髓的細胞之性狀(細胞分裂能力)]
將在實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及在實施例16所製備之源自齒髓的細胞製劑解凍，進行離心(1500rpm、5分鐘)使細胞沈澱。其次，使細胞懸浮於DMEM(10% FBS)培養基，以成為5000~15000個細胞/cm2之密度的方式，接種於細胞培養盤，培養到細胞成為90~100%滿為止。以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，於37℃靜置5~10分鐘而剝離細胞。添加DMEM(10% FBS)培養基而使細胞懸浮，測定活細胞數。再度以成為5000~15000個細胞/cm2之密度的方式，於細胞培養 盤接種細胞，培養到細胞成為90~100%滿為止。反覆進行細胞的繼代培養，於每次繼代培養結束時測定活細胞數，算出細胞的分裂次數。細胞的分裂次數，係由各繼代培養開始時的活細胞數與培養結束時的活細胞數，藉由下述式而算出。
細胞的分裂次數=log2(培養結束時的活細胞數/培養開始時的活細胞數)
(結果)
中間體細胞冷凍品所包含之細胞，係解凍後也具有14次以上的分裂能力，而且該時之倍增時間為3日以內(72小時以內)。又，源自齒髓的細胞製劑所包含之細胞，係解凍後也具有4次以上的分裂能力，而且該時之倍增時間為3日以內(72小時以內)。
[實施例29：源自齒髓的細胞製劑之使用例1]
源自齒髓的細胞製劑，係作為用以緩解類風溼性關節炎、膠原病等自體免疫疾病所伴隨的諸症狀的藥劑，而對於罹患此等疾病之患者，藉由點滴靜脈注射、局部注射等手段來進行投予。
[實施例30：源自齒髓的細胞製劑之使用例2]
源自齒髓的細胞製劑係使用時解凍而使用。於使用時，源自齒髓的細胞製劑係從液態氮保存容器取出，在36.5~37.5℃的水浴槽內加溫而被解凍。解凍後之源自齒髓的細胞製劑，可作為醫藥品而藉由點滴靜脈注射、局部注射等手段來對人類進 行投予。點滴靜脈注射之情形，源自齒髓的細胞製劑係從細胞冷凍保存用容器被移到透析袋之後，對患者藉由點滴靜脈注射來進行投予。局部注射之情形，源自齒髓的細胞製劑係從細胞冷凍保存用容器被移到注射器之後，對患者的局部進行注射。
[實施例31：源自齒髓的細胞製劑之使用例3]
源自齒髓的細胞製劑，係於使用前於醫療機構中解凍而使用。是以，源自齒髓的細胞製劑，係將被冷凍保存在其製造業者、販售業者等的保管庫者，因應醫療機構的需求，以冷凍狀態出貨而運送至醫療機構。以被冷凍之狀態搬入的製劑，係於醫療機構中於即將對患者進行投予前解凍，藉由點滴靜脈注射等手段而對患者進行投予。
[產業上利用之可能性]
本發明係有用於提供例如：含有可對人類投予之源自齒髓的細胞作為有效成分而成的醫藥品。

Claims (63)

  1. 一種製造方法，其係多潛能幹細胞經富集之源自齒髓的細胞的製造方法，且其係包含下述步驟而成：
    (a)將齒髓以蛋白酶消化而製備齒髓之懸浮物的步驟；
    (b)培養該懸浮物而使該懸浮物所包含之多潛能幹細胞增殖的步驟；
    (c)使該經增殖的多潛能幹細胞成為懸浮於第一冷凍保存液之狀態而進行冷凍的步驟；
    (d)使該經冷凍的多潛能幹細胞解凍的步驟；
    (e)以黏著在載體粒子之表面的狀態培養該經解凍的多潛能幹細胞，而使多潛能幹細胞在該載體粒子之表面增殖的步驟；
    (f)使該載體粒子與蛋白酶接觸，而使黏著在該載體粒子之表面的多潛能幹細胞自該載體粒子分離的步驟；以及
    (g)製備經分離的多潛能幹細胞之懸浮物的步驟。
  2. 如請求項1之製造方法，其中於該步驟(c)或(d)中，進行該多潛能幹細胞的品質檢查。
  3. 如請求項2之製造方法，其中該品質檢查係對於以下細胞進行：自懸浮於該第一冷凍保存液之前的細胞所分取之細胞；自懸浮於該第一冷凍保存液之前的細胞所分取且經繼代之細胞；懸浮於該第一冷凍保存液而分取的冷凍前之細胞、分取並冷凍而剛解凍後之細胞、及/或分取且冷凍、解凍並進一步進行培養所得之細胞。
  4. 如請求項3之製造方法，其中該品質檢查係進行關於下述品質檢查a~j的1個或2個以上：
    品質檢查a：在光學顯微鏡下觀察時，呈現近似紡錘形的形 態之細胞數佔細胞整體的比例為99%以上、99.5%以上、99.9%以上、或99.95%以上之驗證；
    品質檢查b：細胞的生存率為50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或95%以上之驗證；
    品質檢查c：於細胞的表面抗原標記之表現圖譜(expression pattern)中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性之驗證，或
    於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD73及CD90的至少一個為陽性，且CD34為陰性之驗證；
    品質檢查d：於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性之驗證，或
    於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性之驗證；
    品質檢查e：於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，在以干擾素γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性之驗證，或
    於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，在以干擾素γ刺激細胞時，係在CD40為陰性、CD80為陰性、CD86為陰性、及MHC-II型抗原為陽性之中至少任一者之驗證；
    品質檢查f：細胞係表現前列腺素E2及/或血管內皮生長因子(VEGF)，且就前列腺素E2而言，藉由以TNFα刺激細胞而其表現量增加之驗證；
    品質檢查g：以含有誘導往軟骨細胞之分化的物質的培養基培養時，蛋白聚醣(aggrecan)的表現量增加之驗證；
    品質檢查h：以含有誘導往骨細胞之分化的物質的培養基培 養時，細胞中之鈣的累積量增加之驗證；
    品質檢查i：在細胞培養盤上具有10次以上、14次以上、或15次以上的細胞分裂能力之驗證；
    品質檢查j：在細胞培養盤上的細胞之平均倍增時間，於該品質檢查i的實施期間中為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內之驗證。
  5. 如請求項1至4中任一項之製造方法，其係進一步包含下述而成：於步驟(g)中，於過濾膜負載該懸浮物，且回收通過的細胞。
  6. 如請求項5之製造方法，其中該過濾膜係具有20μm~80μm之孔徑者。
  7. 如請求項1至6中任一項之製造方法，其中該齒髓係從人類的恆齒或乳齒得到者。
  8. 如請求項1至7中任一項之製造方法，其中步驟(a)中所使用的蛋白酶係包含絲胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶或此等之混合物者。
  9. 如請求項1至7中任一項之製造方法，其中步驟(a)中所使用的蛋白酶係包含金屬蛋白酶者。
  10. 如請求項1至7中任一項之製造方法，其中步驟(a)中所使用的蛋白酶係包含基質金屬蛋白酶、中性金屬蛋白酶或此等之混合物者。
  11. 如請求項1至7中任一項之製造方法，其中步驟(a)中所使用的蛋白酶係包含膠原蛋白酶與中性金屬蛋白酶者。
  12. 如請求項11之製造方法，其中該膠原蛋白酶係包含I型膠原蛋白酶、II型膠原蛋白酶、或此等之混合物者。
  13. 如請求項10或11之製造方法，其中該中性金屬蛋白酶係包含嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、Dispase、或此等之混合物者。
  14. 如請求項1至13中任一項之製造方法，其中步驟(c)中所使用的第一冷凍保存液係包含重碳酸林格氏液(bicarbonate Ringer's solution)、人類血清白蛋白、及DMSO而成者。
  15. 如請求項1至14中任一項之製造方法，其中步驟(e)中所使用的載體粒子係於膨潤狀態下具有80~300μm之直徑之具有近似球形的形狀者。
  16. 如請求項15之製造方法，其中該載體粒子係於膨潤狀態下具有開口於該載體粒子之表面的孔徑3~40μm之孔的多孔性者。
  17. 如請求項1至16中任一項之製造方法，其中該載體粒子係包含明膠而成者。
  18. 如請求項1至17中任一項之製造方法，其中步驟(f)中所使用的蛋白酶係包含絲胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、或其混合物者。
  19. 如請求項1至17中任一項之製造方法，其中步驟(f)中所使用的蛋白酶係包含胰蛋白酶者。
  20. 如請求項1至19中任一項之製造方法，其係進一步包含下述而成者：(h)使在步驟(g)得到的該懸浮物成為懸浮於第二冷凍保存液之狀態而進行冷凍的步驟。
  21. 如請求項20之製造方法，其中步驟(h)中所使用的第二冷凍保存液係包含重碳酸林格氏液、人類血清白蛋白、及 DMSO而成者。
  22. 如請求項1至19中任一項之製造方法，其中於步驟(g)中，進行該多潛能幹細胞的品質檢查。
  23. 如請求項20或21之製造方法，其中於步驟(g)或(h)中，進行該多潛能幹細胞的品質檢查。
  24. 如請求項22或23之製造方法，其中該品質檢查係對於以下細胞進行：自懸浮於該第二冷凍保存液之前的細胞所分取之細胞；自懸浮於該第二冷凍保存液之前的細胞所分取且經繼代之細胞；懸浮於該第二冷凍保存液而分取的冷凍前之細胞、分取並冷凍而剛解凍後之細胞、及/或分取且冷凍、解凍並進一步進行培養所得之細胞。
  25. 如請求項22或24之製造方法，其中該品質檢查係進行關於下述品質檢查a’~j’的1個或2個以上：
    品質檢查a’：在光學顯微鏡下觀察時，呈現近似紡錘形的形態之細胞數佔細胞整體的比例為99%以上、99.5%以上、99.9%以上、或99.95%以上之驗證；
    品質檢查b’：細胞的生存率為50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或95%以上之驗證；
    品質檢查c’：於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD73、CD90、CD105及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性之驗證，或
    於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD73及CD90的至少一個為陽性，且CD34為陰性之驗證；
    品質檢查d’：於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性之驗證，或
    於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原的至少一個為陰性之驗證；
    品質檢查e’：於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，在以干擾素γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86維持陰性，而MHC-II型抗原變為陽性之驗證，或
    於細胞的表面抗原標記之表現圖譜中，在以干擾素γ刺激細胞時，係在CD40為陰性、CD80為陰性、CD86為陰性、及MHC-II型抗原為陽性之中至少任一者之驗證；
    品質檢查f’：細胞係表現前列腺素E2及/或血管內皮生長因子(VEGF)，且就前列腺素E2而言，藉由以TNFα刺激細胞而其表現量增加之驗證；
    品質檢查g’：以含有誘導往軟骨細胞之分化的物質的培養基培養時，蛋白聚醣的表現量增加之驗證；
    品質檢查h’：以含有誘導往骨細胞之分化的物質的培養基培養時，細胞中之鈣的累積量增加之驗證；
    品質檢查i’：在細胞培養盤上細胞具有3次以上、4次以上、或5次以上的細胞分裂能力之驗證；
    品質檢查j’：在細胞培養盤上的細胞之平均倍增時間，於該品質檢查i’的實施期間中為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內之驗證。
  26. 如請求項22至25中任一項之製造方法，其中於步驟(g)或(h)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之CD107b的陽性率，係比於步驟(c)或(d)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之對應的陽性率還高者。
  27. 如請求項22至26中任一項之製造方法，其中於步 驟(g)或(h)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之CD39、CD49a、CD61、CD107a、CD107b、及CD143的陽性率，係比於步驟(c)或(d)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之對應的陽性率還高，且
    於步驟(g)或(h)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之CD146的陽性率，比於步驟(c)或(d)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之對應的陽性率還低者。
  28. 如請求項22至27中任一項之製造方法，其中於步驟(g)或(h)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之IL-6、HGF、IGFBP-4、IL-11、TIMP-3、及TIMP-2的至少一個的表現量，係比於步驟(c)或(d)中供應品質檢查的多潛能幹細胞中之對應的表現量還高者。
  29. 一種以如請求項1至28中任一項之製造方法得到的細胞。
  30. 如請求項29之細胞，其係CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性。
  31. 如請求項30之細胞，其係CD40、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性。
  32. 如請求項31之細胞，其係藉由干擾素γ刺激時MHC-II型抗原變為陽性者。
  33. 一種源自齒髓的多潛能幹細胞，其具有以下之(1)~(4)的至少一個所示之特徵：
    (1)CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及MHC-II型抗原為陰性，藉由干擾素γ刺激時MHC-II型抗原變為陽性者，表現 前列腺素E2及/或血管內皮生長因子，且就前列腺素E2而言，藉由TNFα刺激時表現量增加；
    (2)CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45為陰性；
    (3)CD47、CD81、及CD147的至少一個為陽性，CD19、CD34、及CD206的至少一個為陰性；
    (4)CD47、CD81、及CD147的至少一個為陽性，CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個為陰性。
  34. 如請求項33之細胞，其具有往骨細胞及軟骨細胞的分化能力。
  35. 如請求項33或34之細胞，其中在使細胞浮游於培養基中的狀態下之其平均直徑為16~20μm。
  36. 如請求項33至35中任一項之細胞，其係在活體外之環境下具有3次以上的細胞分裂能力，且平均倍增時間為96小時以內者。
  37. 如請求項33至35中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其具有以下特徵：
    在活體外之環境下經10次以上、15次以上、16次以上、或17次以上的細胞分裂者，且其細胞分裂的平均時間為48小時以內者；
    在活體外之環境下具有進行10次以上、14次以上、或15次以上的細胞分裂之能力者，且其細胞分裂的平均時間為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內。
  38. 如請求項33至35中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其具有以下特徵：
    在活體外之環境下經16次以上、21次以上、22次以上、或23次以上的細胞分裂者；
    在活體外之環境下具有進行3次以上、4次以上、或5次以上的細胞分裂之能力者，且其細胞分裂的平均時間為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內。
  39. 如請求項33至38中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係CD19、CD26、CD106、CD117、及CD271的至少一個為陰性。
  40. 如請求項33至39中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係CD140b及HLA-A、B、C的至少一個為陽性。
  41. 如請求項33至40中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係CD56及CD146的至少一個為陰性。
  42. 如請求項33至41中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係CD49e及CD95的至少一個為陽性。
  43. 如請求項33至42中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係CD10、CD46、CD47、CD55、CD58、及CD59的至少一個為陽性。
  44. 如請求項33至43中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現MMP-2、IGFBP-4、胱蛋白C(cystatin C)、IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、HGF、VEGF、TIMP-1、TIMP-2、及TIMP-3的至少一個者。
  45. 如請求項33至44中任一項之源自齒髓的多潛能幹 細胞，其係表現GROα、VCAM-I、及IP-10的至少一個者。
  46. 如請求項33至45中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現IL-6者，且為其表現量因TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加者。
  47. 如請求項33至46中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現IL-11者，且為其表現量因TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加者。
  48. 如請求項33至47中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現IP-10者，且為其表現量因TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加者。
  49. 如請求項33至48中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現MCP-1者，且為其表現量因TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加者。
  50. 如請求項33至49中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係因TNF-α刺激而GM-CSF的表現被誘導者。
  51. 如請求項33至50中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現HGF者，且為其表現量因TNF-α刺激而減少及因干擾素γ刺激而增加者。
  52. 如請求項33至51中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其係表現IL-8者，且為其表現量因TNF-α刺激而增加者。
  53. 如請求項33至52中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞，其中該齒髓係從人類的恆齒或乳齒得到者。
  54. 一種組成物，其係於含有人類血清白蛋白與二甲亞碸的重碳酸林格氏液中，以懸浮的狀態包含如請求項33至53 中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞者。
  55. 一種組成物，其係於包含鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、碳酸氫離子、檸檬酸離子、人類血清白蛋白、及二甲亞碸的溶液中，以懸浮的狀態包含如請求項33至53中任一項之源自齒髓的多潛能幹細胞者。
  56. 如請求項55之組成物，其係分別以91~113mM的濃度包含鈉離子，以2.52~3.08mM的濃度包含鉀離子，以0.95~1.16mM的濃度包含鈣離子，以0.315~0.385mM的濃度包含鎂離子，以15.6~19.2mM的濃度包含碳酸氫離子，以1.04~1.28mM的濃度包含檸檬酸離子，以46~56g/L的濃度包含人類血清白蛋白，及以9~11%(v/v)的濃度包含二甲亞碸者。
  57. 如請求項54至56中任一項之組成物，其係進一步包含乙醯色胺酸或其鹽及辛酸或其鹽者。
  58. 如請求項54至57中任一項之組成物，其係以5×106~8×107個/mL的密度包含源自齒髓的多潛能幹細胞者。
  59. 如請求項54至58中任一項之組成物，其係以1~20mL的量被封入容器者。
  60. 如請求項59之組成物，其中該容器為玻璃或塑膠製。
  61. 如請求項54至60中任一項之組成物，其係冷凍狀態者。
  62. 一種醫藥組成物，其係包含如請求項54至61中任一項之組成物者。
  63. 如請求項62之醫藥組成物，其係選自包含自體免 疫疾病、發炎性疾病、類風溼性關節炎、克隆氏病、慢性發炎性腸病、心肌梗塞、腦中風(包含慢性期腦中風、急性期腦中風)、慢性發炎去髓鞘型多發性神經病變(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡、肝硬化(包含失代償性肝硬化(decompensated cirrhosis))、敗血症、骨關節炎、乾癬、及器官移植物排斥之群組的疾病之治療劑。
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