WO2024075676A1 - 脳性まひの予防又は治療剤 - Google Patents

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WO2024075676A1
WO2024075676A1 PCT/JP2023/035859 JP2023035859W WO2024075676A1 WO 2024075676 A1 WO2024075676 A1 WO 2024075676A1 JP 2023035859 W JP2023035859 W JP 2023035859W WO 2024075676 A1 WO2024075676 A1 WO 2024075676A1
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cells
preventive
therapeutic agent
dental pulp
cerebral palsy
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PCT/JP2023/035859
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義朗 佐藤
孝洋 神澤
忍 清水
昌弘 早川
博 湯川
泰之 三谷
宏美 有木
憲隆 福田
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キッズウェル・バイオ株式会社
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    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for cerebral palsy.
  • Cerebral palsy is caused by a variety of perinatal brain disorders, including neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), and neurological symptoms such as motor disorders and epilepsy appear in the chronic stage. There is a need to develop treatments that are effective even after symptoms of cerebral palsy have been confirmed in the chronic stage.
  • HIE neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy
  • Non-Patent Document 1 reports that administration of mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood into the subarachnoid space of cerebral palsy patients aged 4 to 14 improved the symptoms of cerebral palsy.
  • mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood there are still few cases of storing umbilical cord blood at birth, and it is difficult to use mesenchymal stem cells derived from one's own umbilical cord blood (autologous transplantation), especially in the distant phase.
  • mesenchymal stem cells derived from one's own umbilical cord blood autologous transplantation
  • there are various stem cells other than those derived from umbilical cord blood but stem cells differ greatly in their differentiation ability and secretion factors depending on their origin, so it is not possible to predict what type of stem cells will have the effect of improving cerebral palsy symptoms.
  • the objective of the present invention is to provide a preventive or therapeutic agent for cerebral palsy.
  • the present invention encompasses the following aspects:
  • the present invention relates to the following [1] to [20].
  • [1] A preventive or therapeutic agent for cerebral palsy comprising dental pulp stem cells and administered to a subject having symptoms of cerebral palsy.
  • the dental pulp stem cells are human deciduous dental pulp stem cells (stem cells derived from human deciduous dental pulp).
  • the cerebral palsy is cerebral palsy caused by hypoxia and/or ischemia.
  • the preventive or therapeutic agent according to any one of [1] to [6] wherein the cerebral palsy is caused by perinatal brain damage.
  • the preventive or therapeutic agent according to any one of [1] to [7] for use in improving motor function and/or memory learning function in a subject having symptoms of cerebral palsy.
  • the preventive or therapeutic agent according to [11] wherein 90% or more of the stem cell population is CD325 negative or CD51 positive.
  • SCF stem cell factor
  • ANGPTL4 angiopoietin-like 4
  • the preventive or therapeutic agent according to any one of [11] to [13], wherein the stem cell population has at least one of the following characteristics 1) to 3): 1) Produce at least 0.1 ng of SCF (stem cell factor) per 1 x 106 cells per 48 hours; 2) produce at least 500ng of BIGH3 (beta-inducing transforming growth factor) per 1x106 cells per 48 hours; 3) Produce at least 5 ng of ANGPTL4 per 1 x 10 cells per 48 hours.
  • FBS fetal bovine serum
  • the preventive or therapeutic agent according to any one of [1] to [15] which contains the dental pulp stem cells as an active ingredient (preferably the sole active ingredient).
  • the dental pulp stem cells are human deciduous dental pulp stem cells that have not been induced to differentiate and/or have not been genetically modified.
  • the present invention relates to the following [1] to [15].
  • a composition comprising dental pulp stem cells for use in the prevention or treatment of cerebral palsy, the composition being administered to a subject having symptoms of cerebral palsy.
  • the dental pulp stem cells are human deciduous dental pulp stem cells (stem cells derived from human deciduous dental pulp), preferably human deciduous dental pulp stem cells that have not been induced to differentiate (particularly, have not been induced to differentiate into neural cells) and/or have not been genetically modified.
  • the cerebral palsy is cerebral palsy caused by hypoxia and/or ischemia.
  • composition for use according to any one of [1] to [6] wherein the cerebral palsy is caused by perinatal brain damage.
  • the composition for use according to any one of [1] to [9] which is used to induce neurogenesis in a subject.
  • the composition for use according to [11] wherein 90% or more of the stem cell population is CD325 negative or CD51 positive.
  • SCF stem cell factor
  • ANGPTL4 angiopoietin-like 4
  • SCF stem cell factor
  • BIGH3 beta-inducing transforming growth factor
  • FBS fetal bovine serum
  • the present invention relates to the following [1] to [20].
  • [1] A method for preventing or treating cerebral palsy, comprising administering dental pulp stem cells to a subject, the subject having symptoms of cerebral palsy.
  • [2] The method according to [1], wherein the cerebral palsy is remote cerebral palsy.
  • [3] The method according to [2], wherein the remote period is in infancy or later.
  • [4] The method according to [1], wherein the compound is administered multiple times (2 to 20 times, preferably 2 to 10 times, more preferably 2 to 5 times).
  • the dental pulp stem cells are human deciduous dental pulp stem cells (stem cells derived from human deciduous dental pulp).
  • the stem cell population has at least one of the following characteristics 1) to 3): 1) Produce at least 0.1 ng of SCF (stem cell factor) per 1 x 106 cells per 48 hours; 2) produce at least 500ng of BIGH3 (beta-inducing transforming growth factor) per 1x106 cells per 48 hours; 3) Produce at least 5 ng of ANGPTL4 per 1 x 10 cells in 48 hours.
  • the stem cell population is obtained by culturing cells enzymatically isolated from human dental pulp in a medium free of FBS (fetal bovine serum) in the presence of human platelet lysate.
  • FBS fetal bovine serum
  • the present invention relates to the following [1] to [13].
  • [1] Use of dental pulp stem cells in the manufacture of a preventive or therapeutic agent for cerebral palsy, wherein the preventive or therapeutic agent is for a subject having symptoms of cerebral palsy.
  • [2] The use described in [1], wherein the cerebral palsy is remote cerebral palsy.
  • [3] The use according to [2], wherein the remote stage is in infancy or later.
  • the dental pulp stem cells are human deciduous dental pulp stem cells (stem cells derived from human deciduous dental pulp).
  • [5] The use according to any one of [1] to [4], wherein the cerebral palsy is cerebral palsy caused by hypoxia and/or ischemia.
  • [6] The use according to any one of [1] to [5], wherein the cerebral palsy is caused by perinatal brain damage.
  • the prophylactic or therapeutic agent is for improving motor function and/or memory learning function of a subject having symptoms of cerebral palsy.
  • [8] The use according to any one of [1] to [7], wherein the subject is a human.
  • the dental pulp stem cells consist of a population of stem cells derived from human deciduous dental pulp, 90% or more of which are characterized as CD117 negative, CD73 positive, CD90 positive, and CD105 positive.
  • the use according to [9] wherein 90% or more of the stem cell population is CD325 negative or CD51 positive.
  • stem cell population has at least one of the following characteristics 1) to 3): 1) Produces SCF (stem cell factor) at a weight ratio of 1/10 or more of IL-6, 2) Produce ANGPTL4 (angiopoietin-like 4) at a weight ratio of 5 times or more compared to IL-6; 3) Produces BIGH3 (beta-induced transforming growth factor) at a weight ratio of more than 450 times that of IL-6.
  • SCF stem cell factor
  • ANGPTL4 angiopoietin-like 4
  • stem cell population has at least one of the following characteristics 1) to 3): 1) Produce at least 0.1 ng of SCF (stem cell factor) per 1 x 106 cells per 48 hours; 2) produce at least 500ng of BIGH3 (beta-inducing transforming growth factor) per 1x106 cells per 48 hours; 3) Produce at least 5 ng of ANGPTL4 per 1 x 10 cells in 48 hours.
  • stem cell population is obtained by culturing cells enzymatically isolated from human dental pulp in a medium free of FBS (fetal bovine serum) in the presence of human platelet lysate.
  • FBS fetal bovine serum
  • the present invention provides a preventive or therapeutic agent for cerebral palsy that utilizes dental pulp stem cells.
  • the results of the Horizontal Ladder test for a single administration of cells are shown.
  • the results of the Horizontal Ladder test when cells were administered multiple times are shown.
  • This figure shows a comparison of the results of the Horizontal Ladder test (Test Example 2) when cells were administered once and when they were administered multiple times.
  • the results of the Cylinder test when cells were administered multiple times are shown.
  • the results of shuttle avoidance when cells were administered multiple times are shown.
  • the results of body weight measurements (Test Example 3) are shown.
  • 1 shows the measurement results of brain weight ratio (Test Example 3). 4 shows the fluorescence intensity ratio (representing the abundance of the cells) of the cells in the brain after administration of deciduous dental pulp stem cells.
  • the percentage of BrdU/DCX double staining positive cells in the injured area of the hippocampal dentate gyrus after cell administration is shown.
  • the number of BrdU-positive cells in the injured area of the hippocampal dentate gyrus after cell administration is shown.
  • the number of NeuN-positive cells in the injured area of the hippocampal dentate gyrus after cell administration is shown.
  • 1 shows the results of a rotarod test in a perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy model in the case of a single dose of cells (Test Example 7).
  • 1 shows the results of a cylinder test in a severe perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy model in the case of multiple administrations of cells (Test Example 8).
  • 1 shows the proliferation rate of neural stem cells when co-cultured with neural stem cells, deciduous tooth pulp stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, and fibroblasts (Test Example 11). 1 shows the amount of BDNF in the culture supernatant after co-culture with neural stem cells (Test Example 11).
  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for cerebral palsy, which contains dental pulp stem cells.
  • the present invention relates to a neurogenesis promoter in the brain of a subject with cerebral palsy symptoms, which contains dental pulp stem cells (also referred to herein as the "preventive or therapeutic agent of the present invention”). These are described below.
  • Dental pulp stem cells are not particularly limited as long as they are stem cells obtained from dental pulp (derived from dental pulp).
  • Dental pulp stem cells include, for example, deciduous tooth pulp stem cells (dental pulp stem cells derived from deciduous teeth) and permanent tooth pulp stem cells (dental pulp stem cells derived from permanent teeth).
  • Dental pulp stem cells are neural crest-derived stem cells that can be collected easily and with minimal invasiveness, and are a cell population that co-expresses various undifferentiated nervous system markers and mesenchymal stem cell markers (Miura M. et al; Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 May 13;100(10):5807-123).
  • deciduous tooth pulp stem cells are preferred from the viewpoint of the preventive or therapeutic effect on cerebral palsy, and in particular deciduous tooth pulp stem cells collected from deciduous teeth within 48 hours after falling out or extraction are preferred.
  • the organisms from which dental pulp stem cells are derived are not particularly limited, and examples include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer.
  • Human dental pulp stem cells are preferred, human deciduous tooth pulp stem cells are even more preferred, and deciduous tooth pulp stem cells obtained from deciduous teeth within 48 hours after shed or extraction are particularly preferred.
  • the dental pulp stem cells are preferably dental pulp stem cells of the same biological species (human-derived if the subject is human) in order to suppress or avoid rejection reactions.
  • the dental pulp stem cells can be autologous dental pulp stem cells or allogeneic dental pulp stem cells.
  • prevention includes a state in which the onset of symptoms and the decline in physical function are suppressed or slowed, and “treatment” includes the alleviation of symptoms and the improvement of declined physical function. Examples of such symptoms and functions in the case of cerebral palsy include motor function, posture, memory, and learning.
  • Dental pulp stem cells can be selected as adhesive cells among dental pulp cells. Adhesive cells among dental pulp cells collected from shed baby or permanent teeth or their subcultured cells can be used as "dental pulp stem cells.” For example, dental pulp stem cells can be prepared by the method described below in JP 2011-219432 A.
  • the cells when they reach subconfluence (a state in which the cells occupy about 70% of the surface of the culture vessel) or confluence as observed with the naked eye, they are detached from the culture vessel and collected, and seeded again in a culture vessel filled with culture medium. Subculture may be repeated. For example, subculture is performed 1 to 8 times to grow the cells to the required number (for example, about 1 x 10 7 cells/ml).
  • the cells can be detached from the culture vessel by a conventional method such as trypsin treatment. After the above culture, the cells may be collected and stored (storage conditions are, for example, -150°C).
  • the culture medium may be a basal medium or a basal medium to which serum or the like has been added.
  • basal media may include Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (GIBCO, etc.), Ham's F12 medium (HamF12) (SIGMA, GIBCO, etc.), RPMI1640 medium, etc.
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • HamF12 Ham's F12 medium
  • RPMI1640 medium etc.
  • Two or more basal media may be used in combination.
  • An example of a mixed medium is a medium in which IMDM and HamF12 are mixed in equal amounts (for example, a medium sold under the product name IMDM/HamF12 (GIBCO)).
  • components that can be added to the medium include serum (fetal bovine serum, human serum, sheep serum, etc.), serum substitutes (Knockout serum replacement (KSR), etc.), bovine serum albumin (BSA), antibiotics, various vitamins, and various minerals.
  • serum fetal bovine serum, human serum, sheep serum, etc.
  • serum substitutes Kernockout serum replacement (KSR), etc.
  • bovine serum albumin BSA
  • antibiotics various vitamins, and various minerals.
  • the cells can be recovered by detaching the cells from the culture vessel by trypsin treatment or the like, followed by centrifugation.
  • the dental pulp stem cells thus recovered can be used to prepare the preventive or therapeutic agent of the present invention.
  • the dental pulp stem cells are a population of stem cells derived from genetically unmodified human deciduous dental pulp, at least 90% of which are CD117 negative, CD73 positive, CD90 positive, and CD105 positive (hereinafter also referred to as the "stem cell population of the present invention").
  • stem cell population of the present invention The structural and functional characteristics of the stem cell population of the present invention are described below.
  • CD117 is a transmembrane protein that functions as a tyrosine kinase receptor, also known as c-kit.
  • Conventionally known dental pulp stem cells are either CD117 positive or a heterogeneous population containing CD117 positive and CD117 negative cells (Hilkens et al., Cell and Tissue Research (2013) 353, 65-78; Deng et al., Frontiers in Cell and Developmental Biology, March 2021, volume 9, Article 661116; Ferro et al., PLoS ONE July 2012, volume 7, Issue 7, e41774; Lei et al., Stem Cell International, Volume 2021, Article ID 8886854), but the stem cell population of the present invention is characterized as CD117 negative.
  • the stem cell population of the present invention is characterized by being positive for mesenchymal stem cell markers CD73, CD90, and CD105.
  • CD325", “CD49d” and “CD51” are cell surface proteins that function as adhesion factors and are also known as N-cadherin (cadherin 2), integrin ⁇ 4 and integrin ⁇ V, respectively.
  • Conventionally known dental pulp stem cells are either CD325 positive or a heterogeneous population containing CD325 positive and CD325 negative cells (Deng et al., Frontiers in Cell and Developmental Biology, March 2021, volume 9, Article 661116; Madhoun et al., Frontiers in Cell and Developmental Biology, October 2021, volume 9, Article 717624), but the stem cell population of the present invention is preferably CD325 negative.
  • conventionally known dental pulp stem cells are heterogeneous populations containing both positive and negative cells for CD51 and CD49d (Lei et al., Stem Cell International, Volume 2021, Article ID 8886854; Alvarez et al., International Journal of Oral Science (2015), 7, 205-212), but it is preferable that the stem cell population of the present invention exhibits a positivity rate of 90%, 95%, 97%, 98% or 99% or more for CD49d and/or CD51.
  • the stem cell population of the present invention is preferably negative for the endothelial cell marker CD31, and also negative for hematopoietic stem cell markers such as CD34 and CD45.
  • the positive marker CD150 for mesenchymal stem cells is 90% or more, preferably 95% or more positive, and the negative markers CD14 and CD19 are negative.
  • the stem cell population of the present invention is preferably negative for HLA-DR, HLA-DQ, CD40, CD80, and CD86, which are involved in immunogenicity.
  • the stem cell population of the present invention is preferably positive for the adhesion factors CD29 (ITGB1), CD44, and CD166 (ALCAM), and negative for CD106 (VCAM).
  • the stem cell population of the present invention is CD73 positive, CD90 positive, and CD105 positive, preferably CD73 positive, CD90 positive, and CD105 positive and CD117 negative, and more preferably CD73 positive, CD90 positive, and CD105 positive, CD117 negative, and CD325 negative.
  • a marker protein or marker gene is "positive" when a stem cell population between passage numbers 2 and 8 is measured by a method known in the art (e.g., analysis of detection data by flow cytometry with isotype control), and the positivity rate of the protein or gene in the stem cell population is 30% or more, preferably 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, and more preferably 90% or more. Even more preferably, a marker protein or marker gene is "positive” when the positivity rate of the protein or gene in a stem cell population between passage numbers 2 and 8 is 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more.
  • a marker protein or marker gene being "positive” means that the positive rate of the protein or gene in a stem cell population between passage numbers 2 and 8 is 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, 99.9% or more, or 100%.
  • a marker protein or marker gene being "negative” means that, when detected in the same manner as above, the positive rate of the protein or gene in a stem cell population is less than 10%, preferably less than 7%, more preferably less than 6%, less than 5%, even more preferably less than 3%, or less than 2% (however, when a fluorescence intensity of 1% is set as the boundary value between positive and negative in the isotype control, the negative value is not less than 1%).
  • the passage of cells is performed when the cells reach 60% confluency.
  • the cell population of the present invention is characterized in that, between passage numbers 2 and 8, (1) the CD117 positivity rate is preferably less than 3%, more preferably less than 2%; (2) the positive rate of CD73 is preferably 98% or more, more preferably 99% or more; (3) The positive rate of CD90 is preferably 98% or more, more preferably 99% or more; and (4) The CD105 positivity rate is preferably 98% or more, more preferably 99% or more.
  • the cell population of the present invention may also have, at passage numbers 2 to 8, any two or more, three or more, or four or more of the following characteristics (5) to (20), in addition to the characteristics (1) to (4) described above.
  • the CD325 positivity rate is preferably less than 7%, more preferably less than 5%.
  • the positive rate of D49d and/or CD51 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, respectively.
  • the CD31 positivity rate is preferably less than 3%, more preferably less than 2%.
  • the CD34 positivity rate is preferably less than 7%, more preferably less than 5%.
  • the CD45 positivity rate is preferably less than 7%, more preferably less than 5%.
  • the positive rate of CD150 is preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • the CD14 positivity rate is preferably less than 7%, more preferably less than 5%.
  • the CD19 positivity rate is preferably less than 7%, more preferably less than 5%.
  • the positive rates of HLA-DR and HLA-DQ are preferably less than 7%, more preferably less than 5%, respectively.
  • the CD40 positivity rate is preferably less than 7%, more preferably less than 5%.
  • the CD80 positivity rate is preferably less than 7%, more preferably less than 5%.
  • the CD86 positivity rate is preferably less than 7%, more preferably less than 5%.
  • the CD29 positivity rate is preferably 96% or more, more preferably 98% or more.
  • the CD44 positivity rate is preferably 96% or more, more preferably 98% or more.
  • the positive rate of CD166 is preferably 96% or more, more preferably 98% or more.
  • the positive rate of CD106 is preferably less than 7%, more preferably less than 5%.
  • Detection of marker proteins can be performed by immunological assays using antibodies, such as ELISA, immunostaining, and flow cytometry.
  • the target protein can be detected by expressing a reporter protein together with the protein and detecting the reporter protein.
  • Detection of marker genes can be performed using nucleic acid amplification methods and/or nucleic acid detection methods, such as RT-PCR, microarrays, and biochips.
  • the stem cell population of the present invention produces cytokines useful for tissue regeneration at a higher level and is enriched in comparison with conventional dental pulp stem cells prepared using a medium containing FBS.
  • the stem cell population of the present invention is characterized by a higher ratio of the production of cytokines useful for tissue regeneration to inflammatory cytokines compared with conventional dental pulp stem cells.
  • Cytokines useful for tissue regeneration include, for example, SCF (stem cell factor), ANGPTL4 (angiopoietin-like 4), BIGH3 (beta-derived transforming growth factor), brain-derived trophic factor (BDNF), nerve growth factor (NGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), monocyte chemotactic factor-1 (MCP-1), and angiopoietin-2.
  • SCF stem cell factor
  • ANGPTL4 angiopoietin-like 4
  • BIGH3 beta-derived transforming growth factor
  • BDNF brain-derived trophic factor
  • NEF nerve growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • SDF-1 stromal cell-derived factor 1
  • MCP-1 monocyte chemotactic factor-1
  • angiopoietin-2 an example of an inflammatory cytokine is IL-6 (interleukin-6).
  • SCF Stem Cell Factor
  • produced a protein produced and secreted (collectively referred to as “produced” in this specification) by mammalian cells, and is known as a trophic factor that promotes the proliferation of hematopoietic stem cells in cultured cell experiments. SCF also acts on nerve cells and vascular endothelial cells that express its receptor, CD117, and is involved in neuroprotection (Dhandapani et al., J Neurochem. 2005 Oct;95(1):9-19.), neurogenesis (Jin et al., J Clin Invest. 2002 Aug;110(3):311-9; Osada et al., J Neurosurg Spine.
  • ANGPTL4 (Angiopoietin Like 4) is a protein produced and secreted by mammalian cells, and has been reported to have angiogenic effects (Le Jan et al., Am J Pathol. 2003 May;162(5):1521-8; Hermann et al., Clin Immunol. 2005 Apr;115(1):93-101; Ma et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Aug 10;107(32):14363-8) and anti-inflammatory effects (Cho et al., JCI Insight. 2019 Aug 22;4(16):e125437) in cultured cell and animal experiments. These effects are useful in treating ischemic diseases, inflammatory diseases, autoimmune diseases, and various other diseases that require tissue regeneration.
  • BIGH3 transforming growth factor beta induced
  • ⁇ ig-H3, keratoepithelin, or TGFBI transforming growth factor beta induced
  • TGFBI keratoepithelin
  • Angiopoietin-2 is a protein produced and secreted by mammalian cells, and is known to be involved in lymphatic vessel formation in lymphatic endothelial cells and vascular remodeling in tissues (Akwii et al., Cells 2019, 8, 471). Angiopoietin-2 is thought to be useful in treating diseases and tissue regeneration that require angiogenesis.
  • IL-6 is a protein produced and secreted by mammalian cells, and is known as an inflammatory cytokine that enhances immune responses and tissue inflammation. IL-6 is also a representative factor of a series of inflammatory cytokines called Senescence-Associated Secretion Phenomenon (SASP) produced by aging cells, and is thought to be the cause of chronic inflammation associated with aging (Rolt et al., Biogerontology. 2019 Jun;20(3):359-371, Di et al., PLoS One. 2014 Nov 24;9(11):e113572). For this reason, it is not desirable for cells administered for the purpose of disease treatment to produce a large amount of IL-6.
  • SASP Senescence-Associated Secretion Phenomenon
  • the stem cell population of the present invention can produce SCF at a weight ratio of at least 1/20 or more of IL-6, preferably at least 1/10 or more, more preferably 1/10 to 1/2, even more preferably 1/10 to 1/3, more preferably at least 1/5 or more, and even more preferably at least 1/3 (however, not exceeding the amount of IL-6 produced) between passages 2 and 8.
  • the stem cell population of the present invention can produce at least 0.1 ng, 0.13 ng, 0.15 ng, preferably at least 0.17 ng, and more preferably at least 0.20 ng of SCF per 1 x 106 cells in 48 hours of culture between passages 2 and 8.
  • the SCF produced by the administered cells is first taken up by the administered cells themselves via CD117 of their own or other administered cells, reducing the efficiency of their action on the endogenous cells of the subject on which they should act.
  • the stem cell population of the present invention has a high SCF production capacity and is CD117 negative, so when administered to a subject in need of tissue regeneration, it can exhibit excellent tissue regeneration effects.
  • the stem cell population of the present invention has a CD117 positivity rate of preferably less than 3%, more preferably less than 2%, between passage numbers 2 and 8; and is capable of producing SCF at a weight ratio that is at least 1/20 of that of IL-6, preferably at least 1/10, more preferably at least 1/5, and even more preferably at least 1/3 (however, the amount does not exceed that of IL-6).
  • the stem cell population of the present invention can produce ANGPTL4 at a weight ratio of at least 3 times, preferably at least 5 times, more preferably at a weight ratio of 5 to 20 times, even more preferably at a weight ratio of 5 to 15 times, even more preferably at least 10 times, and particularly preferably at a weight ratio of at least 20 times, compared to IL-6, between passage numbers 2 and 8. Furthermore, the stem cell population of the present invention can produce at least 4 ng, 4.5 ng, 5.0 ng, preferably at least 6.9 ng, and more preferably at least 7.0 ng of ANGPTL4 per 1 x 106 cells per 48 hours of culture between passage numbers 2 and 8.
  • the stem cell population of the present invention can produce BIGH3 at a weight ratio of 400 times or more, preferably 450 times or more, more preferably 450 times to 1500 times, and even more preferably 450 times to 1000 times that of IL-6, between passages 2 and 8. Furthermore, the stem cell population of the present invention can produce at least 400 ng, 450 ng, 500 ng, preferably at least 550 ng, and more preferably at least 600 ng of BIGH3 per 1 x 106 cells in 48 hours between passages 2 and 8.
  • the weight ratio of each humoral factor in the culture supernatant of the stem cell population of the present invention is determined by measuring the amount of each humoral factor contained in the culture supernatant after culture.
  • the stem cell population of the present invention is characterized in that, between passage numbers 2 and 8,
  • the cell population is capable of producing SCF at a weight ratio that is at least 20 times higher than that of IL-6, preferably at least 10 times higher, more preferably at least 15 times higher, and even more preferably at least 3 times higher (but not exceeding the amount of IL-6 produced); producing ANGPTL4 at a weight ratio that is at least 3 times higher than that of IL-6, preferably at least 5 times higher, more preferably at least 10 times higher, and even more preferably at least 20 times higher; and producing BIGH3 at a weight ratio that is at least 400 times higher than that of IL-6, preferably at least 450 times higher, more preferably 450 to 1500 times higher, and even more preferably 450 to 1000 times higher.
  • the stem cell population of the present invention When the stem cell population of the present invention is cultured in a medium containing no other animal-derived components (particularly FBS) in the presence of human platelet lysate (hPL), it can produce SCF at a weight ratio of at least one-tenth of IL-6, preferably at least one-fifth, more preferably at least one-half, and even more preferably at least one-third (however, the weight ratio does not exceed that of IL-6) between passages 2 and 8.
  • hPL human platelet lysate
  • the stem cell population of the present invention when cultured in a medium containing no other animal-derived components in the presence of hPL, it can produce SCF at a weight ratio of at least about three times, preferably at least about five times, and even more preferably at least about seven times, more than when cultured in a medium containing FBS.
  • the stem cell population of the present invention When the stem cell population of the present invention is cultured in a medium containing no other animal-derived components (particularly FBS) in the presence of human platelet lysate (hPL), it can produce ANGPTL4 at a weight ratio of at least about 5 times that of IL-6, preferably at least about 10 times or more, and more preferably at least about 20 times or more, between passages 2 and 8. Furthermore, when the stem cell population of the present invention is cultured in a medium containing no other animal-derived components in the presence of hPL, it can produce ANGPTL4 at a weight ratio of at least about 3 times or more, preferably at least about 5 times or more, and more preferably at least about 7 times or more, compared to when cultured in a medium containing FBS.
  • the stem cell population of the present invention When the stem cell population of the present invention is cultured in a medium containing no other animal-derived components (particularly FBS) in the presence of human platelet lysate (hPL), it can produce VEGF at a weight ratio of at least about 2 times that of IL-6, preferably at least about 5 times or more, and more preferably at least about 10 times or more, between passages 2 and 8. Furthermore, when the stem cell population of the present invention is cultured in a medium containing no other animal-derived components in the presence of hPL, it can produce VEGF at a weight ratio of at least about 2 times or more, preferably at least about 3 times or more, and more preferably at least about 5 times or more, compared to when cultured in a medium containing FBS.
  • the stem cell population of the present invention can also suppress the amount of IL-6 produced when cultured in a medium containing no other animal-derived components in the presence of hPL, compared to when cultured in a medium containing FBS.
  • the stem cell population of the present invention has high production capacity of SCF, ANGPTL4, and BIGH3, and a low production rate of IL-6, so there is little risk of inflammatory reactions and it can safely exert a tissue regeneration effect.
  • the stem cell population of the present invention is multipotent and has the ability to differentiate into at least adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, and nerve cells, as shown in the Examples described below.
  • Differentiation into target cells can be induced by culturing the stem cell population of the present invention in the presence of a differentiation inducer appropriate for the target cells, according to the methods disclosed in the Examples of this specification or known in the art (e.g., Marion et al., Methods Enzymol. (2006); 420: 339-361, Wang et al., Molecular Medicine Reports (2016); 14: 5551-5555).
  • the stem cell population of the present invention produces high levels of cytokines useful for tissue regeneration, and has physiological activities (functions) in vivo or in vitro, such as neural progenitor cell proliferation, neurite extension, vascular endothelial cell proliferation, vascular endothelial cell attraction, blood vessel-like structure construction, and immunosuppressive activity.
  • the stem cell population of the present invention can be produced by enzymatically isolating cells from human dental pulp, culturing the cells in a medium containing no FBS (fetal bovine serum) in the presence of human platelet lysate (hPL), and obtaining a colony-forming cell population as the stem cell population.
  • FBS fetal bovine serum
  • the "dental pulp” used in the present invention may be either the pulp of a deciduous tooth or a permanent tooth, but the pulp of an extracted tooth such as a deciduous tooth or a wisdom tooth is preferred for ease of acquisition.
  • the extracted tooth should be extracted within 72 hours, more preferably within 48 hours, and particularly preferably within 48 hours.
  • a method for enzymatically isolating a cell population from the collected dental pulp includes, for example, treating with an enzyme containing collagenase, preferably collagenase and a neutral protease (e.g., dispase or thermolysin), separating the cells, and isolating them by centrifugation. When isolating a cell population from the collected dental pulp, it is preferable to treat with a reagent that does not contain mammalian and bacterial components.
  • the isolated cells are cultured in the presence of human platelet lysate (hPL) in a medium that does not contain other animal-derived serum components, particularly FBS.
  • Human platelet lysate (hPL) is obtained by dissolving platelets extracted from human blood using a freeze/thaw cycle, and is rich in various growth factors and cytokines necessary for cell culture.
  • the amount of human platelet lysate (hPL) added to the medium or the content in the medium but for primary culture, it is approximately 5-20%, preferably 5-15%, more preferably 7-15%, and most preferably approximately 10%. The same applies for subculture.
  • the term “about” refers to a value that varies by plus or minus 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, or 1%, respectively, from the reference value.
  • the term “about” refers to a range of plus or minus 10%, 5%, or 1%, respectively, from the reference value.
  • the “medium” used in the present invention is not particularly limited as long as it does not contain other unpurified animal-derived components, especially FBS, but it is preferable to use a serum-free medium.
  • serum-free medium refers to a medium that does not contain unconditioned or unpurified serum, and also includes media containing purified blood-derived components or factors (growth factors) derived from animal tissues, as long as it does not contradict the purpose of the present invention.
  • serum-free media examples include basic media without added serum, such as ⁇ MEM medium, DMEM medium, BME medium, Eagle MEM medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, F-12 medium, DMEM/F12 medium, IMDM/F12 medium, Ham's medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, or mixtures thereof, and commercially available serum-free media for mammalian cells, such as MesenCult-ACF (STEMCELL Technologies), STEMPRO MSC SFM (Thermo Fischer Scientific), UltraCULTURE Serum-free (Lonza), etc.
  • basic media without added serum such as ⁇ MEM medium, DMEM medium, BME medium, Eagle MEM medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, F-12 medium, DMEM
  • the "culture medium” does not contain any mammalian-derived components, and it is particularly preferable that it is animal-free.
  • the method for producing the stem cell population of the present invention preferably comprises the steps of: i) enzymatically isolating a cell population from the collected dental pulp using a reagent that does not contain mammalian or bacterial components, ii) primary culturing the isolated cell population in a serum-free medium that does not contain other animal-derived unpurified components (particularly FBS) in the presence of human platelet lysate (hPL) to form colonies, and iii) culturing the obtained colonies in a serum-free medium that does not contain other animal-derived unpurified components (particularly FBS) in the presence of hPL.
  • the "culture medium” may contain various nutrients necessary for the maintenance and proliferation of cells and various components necessary for differentiation induction, as appropriate, within the scope of the present invention.
  • the nutrient sources may include carbon sources such as glycerol, glucose, fructose, sucrose, lactose, honey, starch, dextrin, etc., hydrocarbons such as fatty acids, oils and fats, lecithin, alcohols, etc., nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, urea, sodium nitrate, etc., inorganic salts such as table salt, potassium salts, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, sodium molybdate, sodium tungstate, manganese sulfate, various vitamins, amino acids, etc.
  • the pH of the medium obtained by mixing the above ingredients is in the range of 6.0 to 9.0, preferably 6.5 to 8.5, and more preferably 7.0 to 8.0.
  • the container is not particularly limited as long as it is one that is used for cell culture, and examples of containers that can be used include flasks, tissue culture flasks, dishes, Petri dishes, tissue culture dishes, multi-dishes, microplates, microwell plates, multi-plates, multi-well plates, microslides, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • the seeding density of the cells is not particularly limited, but it is preferable that it is not too high.
  • cells extracted from the dental pulp of one deciduous tooth are seeded in an area of 25 to 225 cm2 , preferably 75 to 150 cm2 .
  • the culture is performed at 36°C to 38°C, preferably 36.5°C to 37.5°C, under conditions of 1% to 25% O2 and 1% to 15% CO2 , with medium replacement.
  • Primary culture is preferably carried out until colonies are formed, grow, and detached. Once detachment of the colonies is confirmed, the cells are collected using a filter or the like. The collected cells are obtained as a highly homogeneous stem cell population without the need for special separation procedures.
  • the stem cell population may be further subcultured (expansion cultured) as necessary. Subculture is performed using the same medium as the primary culture. Subculture is performed when the cells reach 60% confluency during adhesion culture. Typically, primary culture cells are cultured for at least 7 days, preferably 9 days or more, more preferably 9 to 15 days to confirm colony formation, growth, and detachment, while cells after passage may be cultured for at least 1 day, preferably 2 days or more, more preferably 2 to 3 days.
  • the seeding density of the cells after passage is not particularly limited, but it is preferable that it is not too high. For example, the cells are seeded at a density of 1000 to 2000 cells/cm 2 , preferably 1300 to 1500 cells/cm 2 .
  • the produced stem cell population may be cryopreserved (for example, stored in a deep freezer at -152°C) until use, if necessary. Cryopreservation is performed, for example, by adding an appropriate cryoprotectant to the medium used for the cell culture.
  • cryoprotectants include dextran, DMSO, and commercially available cryopreservation solutions.
  • dental pulp stem cells can be used as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for cerebral palsy and a neurogenesis promoter.
  • the dental pulp stem cells used in the present invention can be used, for example, as a medicine.
  • Dental pulp stem cells may be used together with other active ingredients, and preferably dental pulp stem cells are used as the only active ingredient.
  • the dental pulp stem cells used in the present invention are cells that have not been induced to differentiate, and more preferably, cells that have not been induced to differentiate into nerve cells.
  • dental pulp stem cells can be genetically modified by various known methods, the dental pulp stem cells used in the present invention are preferably cells that have not been genetically modified.
  • Cerebral palsy is a permanent and changeable abnormality in movement, posture, or memory and learning in a child after birth, based on a non-progressive lesion involving the death of nerve cells in the brain that occurred between conception and the neonatal period (within four weeks of birth). However, it does not include progressive diseases, transient motor disorders, or motor developmental delays that are expected to normalize in the future.
  • the symptoms and severity of the disorder vary from person to person depending on the location of the lesion in the brain, there are classifications such as stiffness of the limbs (spastic type), excessive movement of the limbs (athetosis type), and decreased muscle tonus (ataxia type).
  • spastic type stiffness of the limbs
  • artosis type excessive movement of the limbs
  • muscle tonus ataxia type
  • Known complications include mental retardation, epilepsy, joint contracture, and scoliosis.
  • Cerebral palsy can be caused by abnormal brain formation or intrauterine infection before birth, hypoglycemia, intracranial hemorrhage, premature birth, or neonatal asphyxia (HIE) during the perinatal period, or infection by encephalitis or meningitis during the neonatal period, but is most often caused by damage during the perinatal period (perinatal brain damage).
  • HIE neonatal asphyxia
  • the type of cerebral palsy is not particularly limited. Cerebral palsy caused by various causes can be prevented or treated. Dental pulp stem cells are preferably effective for preventing the onset of cerebral palsy symptoms caused by perinatal brain damage, particularly cerebral palsy symptoms caused by hypoxia and/or ischemia, and for treating said symptoms.
  • the treatment may be provided, for example, when a patient has been diagnosed with neonatal asphyxia and/or periventricular leukomalacia during the perinatal period, or in the remote period (after six months after birth), and is particularly preferably provided for cerebral palsy in the remote period.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention may be used prophylactically, for example, in subjects suspected of having cerebral palsy (for example, subjects diagnosed with neonatal asphyxia and/or periventricular leukomalacia during the perinatal period), or may be used to inhibit or improve the progression of symptoms in subjects with cerebral palsy symptoms.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention may be preferably used to improve motor function and/or memory and learning function in subjects with cerebral palsy symptoms, and/or to promote neurogenesis in the brain of the subject.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention can be used to improve motor function and memory learning function in a subject with cerebral palsy symptoms, and even more preferably, the preventive or therapeutic agent of the present invention can be used to improve motor function and learning function and promote neurogenesis in the brain in a subject with cerebral palsy symptoms.
  • Neurogenesis is the generation of new nerve cells from neural stem cells. It is known that neurogenesis occurs not only during mammalian development but also in adults in specific regions such as the dentate gyrus and subventricular zone (Gage, J. of Neuroscience, February 1, 2002, 22(3): 612-613). When brain damage occurs due to perinatal disorders, etc., neural stem cells in the subventricular zone and dentate gyrus proliferate, and some of them migrate to the damaged area of the brain, forming a compensatory mechanism. However, it is known that such proliferation and migration of neural stem cells decreases after a certain time has passed after the injury (about one month on average, based on observations in animal models) (Visco et al., Experimental Neurology 340 (2021) 113-643).
  • the prevention or treatment of the present invention “promotes neurogenesis” means that the proliferation of neural stem cells and/or the increase in neurons in brain tissue (particularly the subventricular zone and dentate gyrus of the hippocampus as described above) in a subject with cerebral palsy is increased more significantly than in the absence of the prevention or treatment of the present invention.
  • Neurogenesis in the brain can be detected by combining markers such as bromodeoxyuridine (BrdU), doublecortin (DCX), and Ki-67.
  • BrdU bromodeoxyuridine
  • DCX doublecortin
  • Ki-67 Ki-67
  • NeuN can detect mature neurons in brain tissue.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention may be administered to a subject suspected of developing cerebral palsy even if the subject does not exhibit symptoms of cerebral palsy, to a subject with symptoms of cerebral palsy, or to a subject diagnosed with cerebral palsy.
  • Subjects suspected of developing cerebral palsy include, for example, subjects who were in a hypoxic state during the perinatal period, subjects who suffered from ischemia, subjects who suffered from neonatal asphyxia, and subjects who have been diagnosed with periventricular leukomalacia.
  • a "subject with symptoms of cerebral palsy" refers to a subject who exhibits one or more symptoms of cerebral palsy, and may be a subject who has been diagnosed with cerebral palsy or has not yet been diagnosed.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-mentioned active ingredient, and may further contain other ingredients as necessary.
  • the other ingredients are not particularly limited as long as they are pharma- ceutically acceptable ingredients.
  • the other ingredients include ingredients having pharmacological action as well as additives.
  • the other ingredients include carriers or vehicles, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, antiseptics, physiological saline, albumin, culture media, antibiotics, pH adjusters, growth factors, hormones, etc.
  • the carriers or vehicles include physiological saline, Ringer's solution, appropriate buffer solutions (e.g., phosphate buffer solutions), etc.
  • mammals include humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer.
  • the subject is preferably a human.
  • the agent can be administered from infancy onwards (1 year of age or older, e.g., 2 years of age or older, 3 years of age or older, 4 years of age or older, 5 years of age or older, or 6 years of age or older).
  • the subject can also be a subject with symptoms of cerebral palsy, for example, a subject diagnosed as having symptoms of cerebral palsy.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention can exert a therapeutic effect against cerebral palsy when administered to the above subjects.
  • the administration route of the preventive or therapeutic agent of the present invention may be, for example, intravenous injection (including drip infusion), intraarterial injection, intraportal vein injection, intradermal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or nasal administration.
  • Local administration may be used instead of systemic administration.
  • An example of local administration is direct injection into brain tissue.
  • dental pulp stem cells may be administered by suspending them in cell culture medium, physiological saline, complex electrolyte solution, or the like. These suspensions may contain serum, albumin, dextran, dimethyl sulfoxide, cryopreservation solution, or the like.
  • the content of dental pulp stem cells in the preventive or therapeutic agent of the present invention and the administration schedule may be determined taking into consideration the sex, age, body weight, pathology, etc. of the subject (patient).
  • the content of dental pulp stem cells per administration may be, for example, 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 11 cells/kg body weight.
  • multiple administrations may be consecutively or periodically.
  • the number of administrations is appropriately 2 to 20 times (preferably 2 to 10 times, 2 to 5 times).
  • the administration interval may be selected from 1 day to 4 weeks, and is preferably 7 to 24 days, 10 to 18 days. Multiple administrations can more significantly improve motor function and/or memory learning function and/or significantly promote neurogenesis in the brain in subjects with cerebral palsy symptoms.
  • Test Example 1 Preparation of human deciduous dental pulp stem cells
  • Deciduous dental pulp stem cells were prepared from human deciduous teeth. Specifically, the procedure was as follows. Dental pulp was scraped out from human deciduous teeth, cut into pieces, and then Liberase (Roche) was added at a final concentration of 0.05 mg/ml, and the mixture was treated for 15 minutes at 37°C with stirring. The reaction supernatant containing cells was collected, and 0.05 mg/ml Liberase was added to the remaining dental pulp tissue, and the mixture was treated for 15 minutes at 37°C with stirring. Cells were collected from the treated dental pulp tissue through a 70 mm strainer, and centrifuged together with the previously collected supernatant.
  • Liberase Roche
  • the collected cells were seeded in a culture vessel using MEM ⁇ (Gibco) containing 10% hPL, and isolated and cultured for more than 9 days until colonies were formed, grew, and detached. The medium was replaced 2 and 9 days after seeding. Once the colonies were confirmed to have detached, the cells were collected using TrypLE Select (Gibco), and expanded using the same medium.
  • Test Example 2 Evaluation of the therapeutic effect of deciduous tooth pulp stem cells on cerebral palsy ⁇ Test Example 2-1. Creation of a cerebral palsy model rat> A Rice-Vannucci model of HIE was established in 7-day-old male Wistar/ST rats. The left common carotid artery was ligated and hypoxic (8% O2 for 60 min) was administered. A sham-operated group was also established.
  • Test Example 2-1 Grouping by behavioral test> The model rats prepared in Test Example 2-1 were subjected to the Horizontal Ladder test at 25 to 28 days of age. Specifically, the rats were made to walk on a horizontal ladder, and the gait of the paralyzed leg was scored from 1 to 4 points (0 points: normal walking, 1 point: the paralyzed leg slips on the ladder but the leg does not fall, 2 points: the paralyzed leg falls from the ladder but the next step is normal, 3 points: the paralyzed leg falls from the ladder and the next step is also abnormal, 4 points: both legs fall from the ladder), and the score per step (score/step) was calculated. Only individuals that showed significantly abnormal findings compared to the Sham group were selected. The selected model rats were divided into two groups (cell administration group and vehicle group) so that the scores of the above test were similar.
  • Test Example 2-3 Cell Administration> At 35 days of age, 1x106 cells of deciduous dental pulp stem cells (Test Example 1) were administered to the cell administration group via the tail vein (single administration). In another batch of tests, at 35 days of age, 49 days of age, and 63 days of age, 1x106 cells of deciduous dental pulp stem cells (Test Example 1) were administered to the cell administration group via the tail vein (multiple administrations). Meanwhile, the vehicle group was administered only with medium not containing deciduous dental pulp stem cells in the same manner as the cell administration group.
  • a rat was placed inside the cylinder, and when the rat stood up and placed its forelimbs against the wall, the limb used [left (healthy side), right (affected side), or both] was recorded to evaluate the rate of limb use on the affected side.
  • the score was calculated using the formula: (L-R) / (L+R+B) (L: left side, R: right side, B: both sides). The more severe the injury, the less the right (affected side) limb was used (the higher the score).
  • Test Example 3 Measurement of body weight and brain weight ratio For each group in Test Example 2, the body weight and the brain weight ratio (cerebrum weight/cerebellum+brain stem weight) at the end of the test (110 days old) were measured.
  • the results of body weight measurements are shown in Figure 6, and the results of brain weight ratio measurements are shown in Figure 7.
  • the body weight of the Sham group was significantly higher, but no difference was observed between the Cell and Vehicle groups.
  • the brain weight ratio (cerebrum weight/cerebellum + brain stem weight) was significantly lower in the Vehicle group.
  • Test Example 4 Analysis of mechanism by comprehensive evaluation of target proteins
  • LC/MS liquid chromatography mass spectrometry
  • Test Example 6 Evaluation of neurogenesis using deciduous dental pulp stem cells
  • Test Example 6-1 Neurogenesis markers
  • deciduous dental pulp stem cells were administered multiple times to HIE model (Rice-Vannucci model) rats. From the day after the third cell administration, 50 mg/kg of bromodeoxyuridine (BrdU) was intraperitoneally administered once a day for a total of three days.
  • the rats were perfused with paraformaldehyde (PFA) and the brain tissue was harvested and embedded in a paraffin block.
  • the blocks were thinly sliced to prepare brain tissue sections, which were then subjected to (1) immunohistological staining using anti-BrdU antibody and (2) fluorescent double immunostaining using anti-BrdU antibody and anti-doublecortin (DCX) antibody.
  • PFA paraformaldehyde
  • the dentate gyrus and subventricular zone of the injured side of the hippocampus were evaluated in each section, and the number of BrdU-positive cells and the proportion of BrdU/DCX double staining-positive cells among the BrdU-positive cells were counted.
  • ⁇ Test Example 6-2 Neuromarker> The animals (Vehicle group, Cell group, and Sham group) that underwent behavioral experiments in Test Example 2 were perfused with PFA at 4 months of age, and brain tissue was collected and embedded in a paraffin block. The blocks were sliced into thin slices to prepare brain tissue sections, which were then immunohistochemically stained using an anti-NeuN antibody. The number of NeuN-positive cells in the injured hippocampal dentate gyrus in these slices was counted using the Stereology method.
  • test results presented in this invention suggest that neurogenesis is involved in the improvement in motor function and memory learning observed in individuals with cerebral palsy when deciduous tooth pulp stem cells are administered.
  • Test Example 7-1 Effect on perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy ⁇ Test Example 7-1: Preparation of dental pulp stem cells>
  • dental pulp was scraped out from extracted teeth (human deciduous teeth) within 48 hours after extraction in a sterile environment, cut into pieces, and then added with Liberase (MNP-S GMP Grade, Roche) at a final concentration of 0.05 mg/ml, and treated with stirring at 37°C for 15 minutes.
  • the reaction supernatant containing cells was collected, and 0.05 mg/ml of Liberase was further added to the remaining dental pulp tissue, and treated with stirring at 37°C for 15 minutes.
  • Cells were collected from the treated dental pulp tissue through a 70 mm strainer, and centrifuged together with the previously collected supernatant. The collected cells were seeded in a culture vessel (CellBind T75 flask) using MEM ⁇ (Gibco) containing 10% hPL (AventaCell BioMedical), and isolated and cultured for more than 9 days until colonies were formed, grew, and detached. The medium was replaced 2 and 9 days after seeding. Once detachment of the colonies was confirmed, the cells were collected using TrypLE Select (Gibco) and expanded in the same medium.
  • MEM ⁇ Gibco
  • hPL ventaCell BioMedical
  • Example 7-2 Evaluation test using cerebral palsy model rats> A neonatal rat hypoxic-ischemic encephalopathy model was created by ligating the left carotid artery of 7-day-old Wistar/ST rats under anesthesia for 1-2 hours, and then placing them in a hypoxic (8% O 2 ) environment for 1 hour. The next day, the vehicle or the human dental pulp stem cells of the present invention were administered intravenously at 1x10 5 cells to examine the effect of improving motor function in perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Specifically, a rotarod test was performed 41 days after administration, and the motor coordination and endurance of the limbs were evaluated by measuring the latency to fall from the rod.
  • Test Example 8 Effect on severe perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy.
  • the right common carotid artery of SD rats on the 7th day after birth was ligated and cut under anesthesia, and the rats were placed in a hypoxic (8% O 2 ) environment for 105 minutes to create a severe hypoxic-ischemic encephalopathy model in neonatal rats.
  • a sham group was also created at the same time.
  • the rats were divided into three groups using the rotarod method: a sham group (Sham), a solvent administration group (Vehicle), and a cell administration group (Cell).
  • the human dental pulp stem cells of the present invention (1 ⁇ 10 7 cells/kg) were administered intravenously into the tail vein.
  • a cylinder test was performed blindly. After euthanasia at 14 weeks of age, the whole brains of half of the animals in each group (5 in the sham group, 6 in the vehicle-treated group and 6 in the cell-treated group) were removed and the tissues were fixed in 4% paraformaldehyde-phosphate buffer. The cerebral tissue specimens were embedded in paraffin and sliced according to standard methods, and all animals were stained with HE and immunostained for myelin basic protein (MBP).
  • MBP myelin basic protein
  • Test Example 9 Surface marker analysis. Human dental pulp stem cells were prepared from extracted deciduous teeth of eight donors in the same manner as in Test Example 1. 1x105 cells per donor were analyzed with antibodies against various surface markers labeled with phycoerythrin (PE) (CD117 (#313204), CD31 (#303105), CD34 (#343606), CD45 (#368510), CD90 (#328110), CD105 (#323206), CD73 (#344004), CD325 (#350806), CD49d (#304303), CD51 (#327909), CD29 (#303003), CD44 (#338807), CD166 (#343904), and CD106 (#305805, all Biolegend) were reacted and data were collected using flow cytometry. Analysis was performed by gating so that the positive rate of the isotype control antibody was around 1%, and the positive rate of each surface marker was calculated.
  • PE phycoerythrin
  • the positive rates for CD117, CD325, and CD45 were less than 5% for all donor cells, and were determined to be negative.
  • the positive rates for CD73, CD90, CD105, CD49d, and CD51 were more than 96% for all donor cells, and were determined to be positive.
  • Test Example 10 Cytokine Production After subculture of the human dental pulp stem cells in 10% hPL/MEM ⁇ or 10% FBS/MEM ⁇ for 7 days, they were seeded in a 6-well plate at 5.76x105 cells/2.5 ml/well using the same medium, and the next day, the medium was replaced with 2.5 ml/well of MEM ⁇ without hPL, FBS, or phenol red. After 48 hours, the culture supernatant was collected, dispensed, and stored at -80°C.
  • the frozen samples were thawed, and the concentrations of SCF, ANGPTL4, BIGH3, and IL-6 in the samples were measured using a Multiplex HGF panel (Biolegend, #740180), a Human ANGPTL4 assay kit (IBL, #27749), a Human beta IG-H3 ELISA (abcam, #ab220651), and a Multiplex Neuroinflammatory panel (Biolegend, #740796), respectively, and the concentration ratios to IL-6 were calculated (Tables 2 and 3).
  • the amounts of various factors contained in the cell culture medium were calculated as the production amount per 1x106 cells from the volume of the culture supernatant and the number of seeded cells (Tables 4 and 5).
  • the culture supernatant of dental pulp stem cells subcultured in 10% hPL/MEM ⁇ had higher concentration ratios to IL-6 and higher production amounts per 1x106 cells for SCF, ANGPTL4, and BIGH3 compared to the culture supernatant of dental pulp stem cells subcultured in 10% FBS/MEM ⁇ .
  • Neural stem cells (Sigma-Aldrich, SCR022) collected from the hippocampal dentate gyrus of adult rats were primary cultured in 24-well plates according to the attached protocol (medium: DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) 100 ml, B-27 Supplement (50X) serum free 2.0 ml, GlutaMAX Supplement 1.0 ml, basic fibroblast growth factor (0.1 mg/ml) 20 ⁇ l) and used in subsequent experiments.
  • NSCs Neural stem cells
  • ⁇ Test Example 11-2 Cell staining> At 48 hours after the start of co-culture, the cell supernatant was collected and the cells on the plate were fixed with PFA. These cells were stained with Hoechst (nuclei), anti-SOX2 antibody (neuron marker), and anti-S-100 antibody (astrocyte marker). As a result of staining, the cells were positive for SOX2, but almost no S-100 positive cells were observed. This confirmed that SHED had no effect on the differentiation induction of NSCs during 48 hours of culture.
  • ⁇ Test Example 11-3 Evaluation of cell proliferation rate> The cells stained in Test Example 11-2 were counted by the Stereology method to count SOX2-positive cells, and the cell growth rate was calculated by standardizing the number of cells with the control. The results showed that SHED exhibited the highest NSC proliferation effect (FIG. 14).
  • BDNF brain-derived trophic factor
  • BDNF Brain-Derived Neurotrophic Factor
  • BDNF is a neurotrophic factor that is known to promote the development and elongation of nerve cells and mediate the regulation of synaptic function (Kowianski et al., Cell Mol Neurobiol (2016) 38:579-593), and has been reported to have neuroprotective effects (Lau et al., Cell Reports (2015)12:1353-1366, Numakawa et al., Histol Histopathol (2010) 25:237-258). These effects are thought to be useful for the treatment of various diseases that require neural tissue regeneration, in addition to neurodegenerative diseases.

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Abstract

本発明は、歯髄幹細胞を含有し、脳性まひの症状を有する対象に投与される、脳性まひの予防又は治療剤に関する。

Description

脳性まひの予防又は治療剤
関連出願:
 本明細書は、本願の優先権の基礎である特願2022-159434(2022年10月3日出願)、PCT/JP2022/036892(2022年10月3日出願)及び特願2023-071438(2023年4月25日出願)の明細書に記載された内容を包含する。
技術分野:
 本発明は、脳性まひの予防又は治療剤等に関する。
 脳性まひでは、新生児低酸素性虚血性脳症(HIE)をはじめとする様々な周産期脳障害が原因となり、遠隔期(慢性期)に運動障害やてんかんなどの神経症状が現れる。遠隔期に脳性まひの症状を確認してからでも効果をもたらす治療法の開発が必要である。
 非特許文献1では、臍帯血由来の間葉系幹細胞を4~14歳の脳性まひ患者のくも膜下腔に投与した結果、脳性まひの症状が改善したことが報告されている。ただ、出生時に臍帯血を保存する例はまだ少なく、特に遠隔期には自己の臍帯血由来の間葉系幹細胞を利用すること(自家移植)は困難である。また、臍帯血由来幹細胞以外にも多様な幹細胞が存在するが、幹細胞は、その由来に応じて、分化能力、分泌因子等が大きく異なるので、どのような幹細胞であれば脳性まひ症状の改善効果を有するかについて予測することはできない。
Amanat et al. Stem Cell Research & Therapy (2021) 12:439
 本発明は、脳性まひの予防又は治療剤を提供することを課題とする。
 本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、驚くべきことに、歯髄幹細胞が脳性まひの予防又は治療作用、及び脳内での神経新生を促進する作用を有することを見出した。本発明者はこの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
 第1の態様において、本発明は以下の[1]~[20]に関する。
[1] 歯髄幹細胞を含有し、脳性まひの症状を有する対象に投与される、脳性まひの予防又は治療剤。
[2] 前記脳性まひが遠隔期の脳性まひである、[1]に記載の予防又は治療剤。
[3] 前記遠隔期が幼児期以降である、[2]に記載の予防又は治療剤。
[4] 複数回(2回~20回、好ましくは2~10回、さらに好ましくは2回~5回)投与される、[1]~[3]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[5] 前記歯髄幹細胞がヒト乳歯歯髄幹細胞(ヒト乳歯歯髄由来の幹細胞)である、[1]~[4]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[6] 前記脳性まひが低酸素及び/又は虚血に起因する脳性まひである、[1]~[5]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[7] 前記脳性まひが、周産期脳障害に起因するものである、[1]~[6]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[8] 脳性まひの症状を有する対象の運動機能及び/又は記憶学習機能の改善のために用いるための、[1]~[7]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[9] 対象がヒトである、[1]~[8]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[10] 対象において脳の神経を新生させる、[1]~[9]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[11] 歯髄幹細胞が、その90%以上がCD117陰性、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105陽性で特徴づけられる、ヒト乳歯歯髄由来の幹細胞集団からなる、[1]~[10]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[12] 前記幹細胞集団が、その90%以上がCD325陰性であるか、CD51陽性である、[11]に記載の予防又は治療剤。
[13] 前記幹細胞集団が、下記1)~3)の少なくとも1つの特性を有する、[11]又は[12]に記載の予防又は治療剤:
1)SCF(幹細胞因子)をIL-6の10分の1以上の重量比で産生する、
2)ANGPTL4(アンジオポエチン様4)をIL-6の5倍以上の重量比で産生する、
3)BIGH3(ベータ誘導トランスフォーミング成長因子)をIL-6の450倍以上の重量比で産生する。
[14] 前記幹細胞集団が、下記1)~3)の少なくとも1つの特性を有する、[11]~[13]のいずれかに記載の予防又は治療剤:
1)1×106細胞あたり48時間で少なくとも0.1ngのSCF(幹細胞因子)を産生する、
2)1×106細胞あたり48時間で少なくとも500ngのBIGH3(ベータ誘導トランスフォーミング成長因子)を産生する、
3) 1×106細胞あたり48時間で少なくとも5ngのANGPTL4を産生する。
[15] 前記幹細胞集団が、ヒト歯髄から酵素的に単離した細胞を、ヒト血小板溶解物の存在下で、FBS(ウシ胎児血清)を含まない培地で培養することにより取得されたものである、[11]~[14]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[16] 前記歯髄幹細胞を有効成分(好ましくは単一の有効成分)として含有する、[1]~[15]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[17] 前記歯髄幹細胞が、分化誘導されていない及び/又は遺伝子改変されていないヒト乳歯歯髄幹細胞である、[1]~[16]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[18] 前記歯髄幹細胞が、神経細胞に分化誘導されていないヒト乳歯歯髄幹細胞である、[1]~[17]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[19] 前記対象が、新生児仮死であった及び/又は脳室周囲白質軟化症と診断されたヒトである、[1]~[18]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[20] 前記対象が、出生後6か月以降のヒトである、[1]~[19]のいずれかに記載の治療剤。
 第2の態様において、本発明は以下の[1]~[15]に関する。
[1] 脳性まひの予防又は治療における使用のための、歯髄幹細胞を含む組成物であって、脳性まひの症状を有する対象に投与される、前記組成物。
[2] 前記脳性まひが遠隔期の脳性まひである、[1]に記載の使用のための組成物。
[3] 前記遠隔期が幼児期以降である、[2]に記載の使用のための組成物。
[4] 前記対象に複数回(2回~20回、好ましくは2~10回、さらに好ましくは2回~5回)投与される、[1]~[3]のいずれかに記載の使用のための組成物。
[5] 前記歯髄幹細胞がヒト乳歯歯髄幹細胞(ヒト乳歯歯髄由来の幹細胞)である、好ましくは、分化誘導されていない(特に、神経細胞に分化誘導されていない)及び/又は遺伝子改変されていないヒト乳歯歯髄幹細胞である、[1]~[4]のいずれかに記載の使用のための組成物。
[6] 前記脳性まひが低酸素及び/又は虚血に起因する脳性まひである、[1]~[5]のいずれかに記載の使用のための組成物。
[7] 前記脳性まひが、周産期脳障害に起因するものである、[1]~[6]のいずれかに記載の使用のための組成物。
[8] 脳性まひの症状を有する対象の運動機能及び/又は記憶学習機能の改善のために用いるための、[1]~[7]のいずれかに記載の使用のための組成物。
[9] 対象がヒトである、例えば、出生後6か月以降のヒトである、あるいは、新生児仮死であった及び/又は脳室周囲白質軟化症と診断されたヒトである、[1]~[8]のいずれかに記載の使用のための組成物。
[10] 対象において脳の神経を新生させる、[1]~[9]のいずれかに記載の使用のための組成物。
[11] 前記歯髄幹細胞が、その90%以上がCD117陰性、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105陽性で特徴づけられる、ヒト乳歯歯髄由来の幹細胞集団からなる、[1]~[10]のいずれかに記載の使用のための組成物。
[12] 前記幹細胞集団が、その90%以上がCD325陰性であるか、CD51陽性である、[11]に記載の使用のための組成物。
[13] 前記幹細胞集団が、下記1)~3)の少なくとも1つの特性を有する、[11]又は[12]に記載の使用のための組成物:
1)SCF(幹細胞因子)をIL-6の10分の1以上の重量比で産生する、
2)ANGPTL4(アンジオポエチン様4)をIL-6の5倍以上の重量比で産生する、
3)BIGH3(ベータ誘導トランスフォーミング成長因子)をIL-6の450倍以上の重量比で産生する。
[14] 前記幹細胞集団が、下記1)~3)の少なくとも1つの特性を有する、[11]~[13]のいずれかに記載の使用のための組成物:
1)1×106細胞あたり48時間で少なくとも0.1ngのSCF(幹細胞因子)を産生する、
2)1×106細胞あたり48時間で少なくとも500ngのBIGH3(ベータ誘導トランスフォーミング成長因子)を産生する、
3) 1×106細胞あたり48時間で少なくとも5ngのANGPTL4を産生する。
[15] 前記幹細胞集団が、ヒト歯髄から酵素的に単離した細胞を、ヒト血小板溶解物の存在下で、FBS(ウシ胎児血清)を含まない培地で培養することにより取得されたものである、[11]~[14]のいずれかに記載の使用のための組成物。
 第3の態様において、本発明は以下の[1]~[20]に関する。
[1] 対象に歯髄幹細胞を投与することを含む、脳性まひの予防又は治療方法であって、前記対象が脳性まひの症状を有する対象である、前記方法。
[2] 前記脳性まひが遠隔期の脳性まひである、[1]に記載の方法。
[3] 前記遠隔期が幼児期以降である、[2]に記載の方法。
[4] 複数回(2回~20回、好ましくは2~10回、さらに好ましくは2回~5回)投与される、[1]に記載の方法。
[5] 前記歯髄幹細胞がヒト乳歯歯髄幹細胞(ヒト乳歯歯髄由来の幹細胞)である、[1]に記載の方法。
[6] 前記脳性まひが低酸素及び/又は虚血に起因する脳性まひである、[1]に記載の方法。
[7] 前記脳性まひが、周産期脳障害に起因するものである、[1]に記載の方法。
[8] 脳性まひの症状を有する対象の運動機能及び/又は記憶学習機能を改善させる、[1]に記載の方法。
[9] 対象がヒトである、[1]に記載の方法。
[10] 対象において脳の神経を新生させる、[1]に記載の方法。
[11] 前記歯髄幹細胞が、その90%以上がCD117陰性、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105陽性で特徴づけられる、ヒト乳歯歯髄由来の幹細胞集団からなる、[1]に記載の方法。
[12] 前記幹細胞集団が、その90%以上がCD325陰性であるか、CD51陽性である、[11]に記載の方法。
[13] 前記幹細胞集団が、下記1)~3)の少なくとも1つの特性を有する、[11]に記載の方法:
1)SCF(幹細胞因子)をIL-6の10分の1以上の重量比で産生する、
2)ANGPTL4(アンジオポエチン様4)をIL-6の5倍以上の重量比で産生する、
3)BIGH3(ベータ誘導トランスフォーミング成長因子)をIL-6の450倍以上の重量比で産生する。
[14] 前記幹細胞集団が、下記1)~3)の少なくとも1つの特性を有する、[11]に記載の方法:
1)1×106細胞あたり48時間で少なくとも0.1ngのSCF(幹細胞因子)を産生する、
2)1×106細胞あたり48時間で少なくとも500ngのBIGH3(ベータ誘導トランスフォーミング成長因子)を産生する、
3) 1×106細胞あたり48時間で少なくとも5ngのANGPTL4を産生する。
[15] 前記幹細胞集団が、ヒト歯髄から酵素的に単離した細胞を、ヒト血小板溶解物の存在下で、FBS(ウシ胎児血清)を含まない培地で培養することにより取得されたものである、[11]に記載の方法。
[16] 前記歯髄幹細胞が単一の有効成分として投与される、[1]に記載の方法。
[17] 前記歯髄幹細胞が、分化誘導されていない及び/又は遺伝子改変されていないヒト乳歯歯髄幹細胞である、[1]に記載の方法。
[18] 前記歯髄幹細胞が、神経細胞に分化誘導されていないヒト乳歯歯髄幹細胞である、[1]に記載の方法。
[19] 前記対象が、新生児仮死であった及び/又は脳室周囲白質軟化症と診断されたヒトである、[1]に記載の方法。
[20] 前記対象が、出生後6か月以降のヒトである、[1]に記載の方法。
 第4の態様において、本発明は以下の[1]~[13]に関する。
[1] 脳性まひの予防又は治療剤の製造における、歯髄幹細胞の使用であって、前記予防又は治療剤が脳性まひの症状を有する対象のためのものである、前記使用。
[2] 前記脳性まひが遠隔期の脳性まひである、[1]に記載の使用。
[3] 前記遠隔期が幼児期以降である、[2]に記載の使用。
[4] 前記歯髄幹細胞がヒト乳歯歯髄幹細胞(ヒト乳歯歯髄由来の幹細胞)である、[1]~[3]のいずれかに記載の使用。
[5] 前記脳性まひが低酸素及び/又は虚血に起因する脳性まひである、[1]~[4]のいずれかに記載の使用。
[6] 前記脳性まひが、周産期脳障害に起因するものである、[1]~[5]のいずれかに記載の使用。
[7] 前記予防又は治療剤が、脳性まひの症状を有する対象の運動機能及び/又は記憶学習機能の改善のためのものである、[1]~[6]のいずれかに記載の使用。
[8] 対象がヒトである、[1]~[7]のいずれかに記載の使用。
[9] 前記歯髄幹細胞が、その90%以上がCD117陰性、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105陽性で特徴づけられる、ヒト乳歯歯髄由来の幹細胞集団からなる、[1]~[8]のいずれかに記載の使用。
[10] 前記幹細胞集団が、その90%以上がCD325陰性であるか、CD51陽性である、[9]に記載の使用。
[11] 前記幹細胞集団が、下記1)~3)の少なくとも1つの特性を有する、[9]又は[10]に記載の使用:
1)SCF(幹細胞因子)をIL-6の10分の1以上の重量比で産生する、
2)ANGPTL4(アンジオポエチン様4)をIL-6の5倍以上の重量比で産生する、
3)BIGH3(ベータ誘導トランスフォーミング成長因子)をIL-6の450倍以上の重量比で産生する。
[12] 前記幹細胞集団が、下記1)~3)の少なくとも1つの特性を有する、[9]~[11]のいずれかに記載の使用:
1)1×106細胞あたり48時間で少なくとも0.1ngのSCF(幹細胞因子)を産生する、
2)1×106細胞あたり48時間で少なくとも500ngのBIGH3(ベータ誘導トランスフォーミング成長因子)を産生する、
3) 1×106細胞あたり48時間で少なくとも5ngのANGPTL4を産生する。
[13] 前記幹細胞集団が、ヒト歯髄から酵素的に単離した細胞を、ヒト血小板溶解物の存在下で、FBS(ウシ胎児血清)を含まない培地で培養することにより取得されたものである、[9]~[12]のいずれかに記載の使用。
 本発明によれば、歯髄幹細胞を利用した脳性まひの予防又は治療剤を提供することができる。
細胞単回投与の場合のHorizontal Ladder testの結果(試験例2)を示す。 細胞複数回投与の場合のHorizontal Ladder testの結果(試験例2)を示す。 細胞単回投与の場合と細胞複数回投与の場合とを合わせてHorizontal Ladder testの結果(試験例2)を比較した図を示す。 細胞複数回投与の場合のCylinder testの結果(試験例2)を示す。 細胞複数回投与の場合のShuttle avoidanceの結果(試験例2)を示す。 体重の測定結果(試験例3)を示す。 脳重量比の測定結果(試験例3)を示す。 乳歯歯髄幹細胞投与後の脳における当該細胞の蛍光強度比(当該細胞の存在量を表す)を示す。 細胞投与後の脳海馬歯状回受傷部における、BrdU/DCX二重染色陽性細胞の割合を示す。 細胞投与後の脳海馬歯状回受傷部における、BrdU陽性細胞数を示す。 細胞投与後の脳海馬歯状回受傷部における、NeuN陽性細胞数を示す。 細胞単回投与の場合の周産期低酸素性虚血性脳症モデルのロータロッドテストの結果(試験例7)を示す。 細胞複数回投与の場合の重症周産期低酸素性虚血性脳症モデルのシリンダーテストの結果(試験例8)を示す。 神経幹細胞と、乳歯歯髄幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、線維芽細胞との共培養による、神経幹細胞の増殖率(試験例11)を示す。 神経幹細胞との共培養による、培養上清中のBDNF量(試験例11)を示す。
 本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
 本発明は、その一態様において、歯髄幹細胞を含有する、脳性まひの予防又は治療剤に関する。また、本発明の別の態様において、歯髄幹細胞を含有する、脳性まひ症状を有する対象の脳における神経新生促進剤(本明細書において、併せて「本発明の予防又は治療剤」と示すこともある。)、に関する。以下、これらについて説明する。
1.歯髄幹細胞
1.1 由来
 歯髄幹細胞は、歯髄から得られる(歯髄に由来した)幹細胞であれば特に限定されない。歯髄幹細胞としては、例えば乳歯歯髄幹細胞(乳歯由来の歯髄幹細胞)、永久歯歯髄幹細胞(永久歯由来の歯髄幹細胞)等が挙げられる。歯髄幹細胞は低侵襲で容易に採取が可能な神経堤由来の幹細胞であり、様々な未分化神経系マーカーおよび間葉系幹細胞マーカーを共発現する細胞集団である(Miura M. et al; Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 May 13;100(10):5807-123)。歯髄幹細胞としては、脳性まひの予防又は治療効果等の観点から、乳歯歯髄幹細胞が好ましく、特に脱落又は抜歯後48時間以内の乳歯から採取される乳歯歯髄幹細胞が好ましい。
 歯髄幹細胞の由来生物は、特に制限されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類動物などが挙げられる。好ましくはヒトの歯髄幹細胞、さらに好ましくはヒトの乳歯歯髄幹細胞、特に好ましくは脱落又は抜歯後48時間以内の乳歯から得られる乳歯歯髄幹細胞である。
 本発明の予防又は治療剤の適用対象(患者等)との関係においては、拒絶反応を抑制又は回避するため、歯髄幹細胞は、同一生物種(適用対象ヒトであればヒト由来)の歯髄幹細胞であることが好ましい。また、歯髄幹細胞は、自家歯髄幹細胞又は他家歯髄幹細胞であることができる。「予防」とは症状の発症や身体機能の低下を抑制あるいは鈍化させる状態を含み、「治療」とは症状の緩和や低下している身体機能の改善を含む。こういった症状や機能の例として、脳性まひであれば、運動機能、姿勢、記憶、学習が挙げられる。
 歯髄幹細胞は、歯髄細胞の中の接着性細胞として選別可能である。脱落した乳歯や永久歯から採取した歯髄細胞の中の接着性細胞又はその継代細胞を「歯髄幹細胞」として用いることができる。例えば、以下に示す、特開2011-219432号公報に記載の方法等により歯髄幹細胞を調製することができる。
 (1)歯髄の採取
 自然に脱落した乳歯(又は抜歯した乳歯、或いは永久歯)をクロルヘキシジンまたはポビドンヨード溶液で消毒した後、歯冠部を分割し歯科用リーマーにて歯髄組織を回収する。
 (2)酵素処理
 採取した歯髄組織を基本培地(例えばMEMα)に懸濁し、0.02~2mg/mlの組織分解酵素(例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ等)で処理する。遠心操作により酵素処理後の歯髄細胞を回収する。
 (3)細胞培養(接着性細胞の選択)
 細胞を基本培地で再懸濁し、付着性細胞培養用ディッシュに播種する。5%CO2、37℃に調整したインキュベータにて培養した後、必要応じて細胞を洗浄してから、コロニーを形成した接着性細胞を0.05%トリプシン・EDTAにて5分間、37℃で処理する。ディッシュから剥離した歯髄細胞を、必要に応じて洗浄してから、付着性細胞培養用ディッシュに播種し拡大培養を行う。例えば、肉眼で観察してサブコンフルエント(培養容器の表面の約70%を細胞が占める状態)又はコンフルエントに達したときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を1~8回行い、必要な細胞数(例えば約1×107個/ml)まで増殖させる。尚、培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。以上の培養の後、細胞を回収して保存することにしてもよい(保存条件は例えば-150℃)。
 培養液には基本培地、或いは基本培地に血清等を添加したもの等を使用可能である。尚、基本培地としてはDMEMの他、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)(GIBCO社等)、ハムF12培地(HamF12)(SIGMA社、GIBCO社等)、RPMI1640培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。混合培地の一例として、IMDMとHamF12を等量混合した培地(例えば商品名:IMDM/HamF12(GIBCO社)として市販される)を挙げることができる。また、培地に添加可能な成分の例として、血清(ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等)、血清代替物(Knockout serum replacement(KSR)など)、ウシ血清アルブミン(BSA)、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
 (4)細胞の回収
 細胞は、トリプシン処理等で培養容器から細胞を剥離した後、遠心処理を施すことによって回収することができる。このようにして回収した歯髄幹細胞を用いて本発明の予防又は治療剤を調製することができる。
 ある実施形態において、歯髄幹細胞は、少なくともその90%以上がCD117陰性、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105陽性である、遺伝子改変されていないヒト乳歯歯髄由来の幹細胞集団(以下「本発明の幹細胞集団」とも記載する)である。以下、本発明の幹細胞集団の構造的又は機能的特性について記載する。
1.2 マーカー
 「CD117」は、チロシンキナーゼ受容体として機能する膜貫通型タンパク質であり、c-kitとも呼ばれる。従来公知の歯髄幹細胞はCD117陽性であるか、あるいはCD117陽性細胞とCD117陰性細胞を含むヘテロな集団である (Hilkens et al., Cell and Tissue Research (2013) 353, 65-78; Deng et al., Frontiers in Cell and Developmental Biology, March 2021, volume 9, Article 661116; Ferro et al., PLoS ONE July 2012, volume 7, Issue 7, e41774;Lei et al., Stem Cell International, Volume 2021, Article ID 8886854) が、本発明の幹細胞集団はCD117陰性で特徴付けられる。また、本発明の幹細胞集団は、間葉系幹細胞マーカーであるCD73、CD90、及びCD105について陽性であることで特徴付けられる。
 「CD325」、「CD49d」及び「CD51」は接着因子として機能する細胞表面タンパク質であり、それぞれN-カドヘリン(カドヘリン2)、インテグリンα4、およびインテグリンαVとも呼ばれる。従来公知の歯髄幹細胞はCD325陽性であるか、CD325陽性細胞とCD325陰性細胞を含むヘテロな集団である (Deng et al., Frontiers in Cell and Developmental Biology, March 2021, volume 9, Article 661116;Madhoun et al., Frontiers in Cell and Developmental Biology, October 2021, volume 9, Article 717624) が、本発明の幹細胞集団はCD325陰性であることが好ましい。また、従来公知の歯髄幹細胞は、CD51及びCD49dについては、陽性細胞と陰性細胞の両方を含むヘテロな集団であるが (Lei et al., Stem Cell International, Volume 2021, Article ID 8886854; Alvarez et al., International Journal of Oral Science (2015), 7, 205-212)、本発明の幹細胞集団は、CD49d及び/又はCD51が、90%、95%、97%、98%又は99%以上の陽性率を示すことが好ましい。
 本発明の幹細胞集団は、内皮細胞マーカーであるCD31について陰性であり、CD34、CD45陰性などの造血幹細胞マーカーについても陰性であることが好ましい。また、間葉系幹細胞の陽性マーカーであるCD150は90%以上、好ましくは95%以上の陽性率であり、陰性マーカーであるCD14、CD19は陰性であることが好ましい。
 本発明の幹細胞集団は、免疫原性に関わるHLA-DR、HLA-DQ、CD40、CD80、CD86が陰性であることが好ましい。
 本発明の幹細胞集団は、接着因子であるCD29(ITGB1)、CD44、CD166(ALCAM)が陽性であり、CD106(VCAM)が陰性であることが好ましい。
 本発明の幹細胞集団は、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105 陽性であり、好ましくはCD73陽性、CD90陽性、及びCD105 陽性であり、かつCD117陰性であり、さらに好ましくは、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105 陽性であり、かつCD117陰性及びCD325陰性である。
 なお、本明細書中において、マーカータンパク質又はマーカー遺伝子が「陽性」であるとは、継代数2から8の間にある幹細胞集団を当該分野で公知の手法で計測(例、フローサイトメトリーによる検出データをアイソタイプコントロールにより解析)したとき、幹細胞集団における当該タンパク質又は遺伝子の陽性率が30%以上、好ましくは40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、より好ましくは90%以上を示す。さらに好ましくは、マーカータンパク質又はマーカー遺伝子が「陽性」であるとは、継代数2から8の間にある幹細胞集団における当該タンパク質又は遺伝子の陽性率が、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上であることを意味する。特に好ましくは、マーカータンパク質又はマーカー遺伝子が「陽性」であるとは、継代数2から8の間にある幹細胞集団における当該タンパク質又は遺伝子の陽性率が、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上、又は100%であることを意味する。マーカータンパク質又はマーカー遺伝子が「陰性」であるとは、前記と同様にして検出したとき、幹細胞集団における当該タンパク質又は遺伝子の陽性率が10%未満、好ましくは7%未満、より好ましくは6%未満、5%未満、さらに好ましくは3%未満、2%未満であることを意味する(ただし、アイソタイプコントロールにおいて蛍光強度1%を陽性・陰性の境界値として設定する場合、陰性の値は1%を下回らない)。ここで、細胞の継代は、接着培養時の場合、60%コンフルエンシー状態になったときに行なうものとする。
 本発明の細胞集団は、継代数2から8の間において、
(1) CD117の陽性率が好ましくは3%未満、より好ましくは2%未満であり;
(2) CD73の陽性率が好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上であり;
(3) CD90の陽性率が好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上であり;かつ
(4) CD105の陽性率が好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上である。
 本発明の細胞集団はまた、継代数2から8の間において、前記(1)-(4)の特徴に加え、さらに、以下の(5)から(20)のうちいずれか2つ以上、3つ以上、又は4つ以上の特徴を有していてもよい。
(5) CD325の陽性率が好ましくは7%未満、より好ましくは5%未満である
(6) D49d及び/又はCD51の陽性率がそれぞれ好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上である
(7) CD31の陽性率が好ましくは3%未満、より好ましくは2%未満である
(8) CD34の陽性率が好ましくは7%未満、より好ましくは5%未満である
(9) CD45の陽性率が好ましくは7%未満、より好ましくは5%未満である
(10) CD150の陽性率が好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上である
(11) CD14の陽性率が好ましくは7%未満、より好ましくは5%未満である
(12) CD19の陽性率が好ましくは7%未満、より好ましくは5%未満である
(13) HLA-DR及びHLA-DQの陽性率がそれぞれ好ましくは7%未満、より好ましくは5%未満である
(14) CD40の陽性率が好ましくは7%未満、より好ましくは5%未満である
(15) CD80の陽性率が好ましくは7%未満、より好ましくは5%未満である
(16) CD86の陽性率が好ましくは7%未満、より好ましくは5%未満である
(17) CD29の陽性率が好ましくは96%以上、より好ましくは98%以上である
(18) CD44の陽性率が好ましくは96%以上、より好ましくは98%以上である
(19) CD166の陽性率が好ましくは96%以上、より好ましくは98%以上である
(20) CD106の陽性率が好ましくは7%未満、より好ましくは5%未満である
 マーカータンパク質の検出は、ELISA、免疫染色、フローサイトメトリーなどの抗体を用いた免疫学的アッセイにより実施できる。細胞内に発現し、細胞表面には現れないタンパク質の場合は、当該タンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするタンパク質を検出できる。マーカー遺伝子の検出は、RT-PCR、マイクロアレイ、バイオチップなどの核酸増幅方法及び/又は核酸検出方法を用いて実施できる。
1.3 サイトカイン産生
 本発明の幹細胞集団は、FBSを含む培地を用いて調製される従来の歯髄幹細胞に比較して、組織再生に有用なサイトカインの産生量が高く、富化されている。とくに、本発明の幹細胞集団は、従来の歯髄幹細胞に比較して、炎症性サイトカインに対する、組織再生に有用なサイトカインの産生量の比率が高いという特徴を有する。
 組織再生に有用なサイトカインとしては、例えば、SCF(幹細胞因子)、ANGPTL4(アンジオポエチン様4)、BIGH3(ベータ誘導トランスフォーミング成長因子)、脳由来栄養因子(BDNF)、神経成長因子(NGF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、間質細胞由来因子1(SDF-1)、単球走化性促進因子(MCP-1)、Angiopoietin-2(アンジオポエチン2)を挙げることができる。炎症性サイトカインとしては、例えば、IL-6(インターロイキン-6)を挙げることができる。
 「SCF」(Stem Cell Factor)は、哺乳動物の細胞で生成、分泌される(併せて本明細書では“産生”という)タンパク質で、培養細胞実験において、造血幹細胞を増殖させる栄養因子として知られている。またSCFは、その受容体であるCD117を発現する神経細胞や血管内皮細胞に作用することで、神経保護(Dhandapani et al., J Neurochem. 2005 Oct;95(1):9-19.)、神経新生(Jin et al., J Clin Invest. 2002 Aug;110(3):311-9、Osada et al., J Neurosurg Spine. 2010 Oct;13(4):516-23)、神経突起伸長(Hirata et al., Development. 1993 Sep;119(1):49-56)、血管新生(Matsui et al., J Biol Chem. 2004 Apr 30;279(18):18600-7、Sun L., Cancer Cell. 2006 Apr;9(4):287-300、Kim et al., Cardiovasc Res. 2011 Oct 1;92(1):132-40)を促進することが、培養細胞実験や動物実験で報告されている。これらの作用は、神経疾患や虚血性疾患のみならず、腸管疾患や骨疾患など、組織再生を必要とする各種疾患治療に有用である。
 「ANGPTL4」(Angiopoietin Like 4)は、哺乳動物の細胞で生成、分泌されるタンパク質で、血管新生作用(Le Jan et al., Am J Pathol. 2003 May;162(5):1521-8、Hermann et al., Clin Immunol. 2005 Apr;115(1):93-101、Ma et al.,  Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Aug 10;107(32):14363-8)、抗炎症作用(Cho et al., JCI Insight. 2019 Aug 22;4(16):e125437)を有することが、培養細胞実験や動物実験で報告されている。これらの作用は、虚血性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患の他、組織再生を必要とする各種疾患治療に有用である。
 「BIGH3」(transforming growth factor beta induced)は、哺乳動物の細胞で生成、分泌されるタンパク質で、βig-H3, keratoepithelin、あるいはTGFBIとも呼ばれる。BIGH3は血管新生作用(Aitkenhead et al.,  Microvasc Res. 2002 Mar;63(2):159-71)、骨・軟骨分解抑制作用(Ruiz et al.,  Biomaterials. 2020 Jan;226:119544)を有することが、培養細胞実験や動物実験で報告されている。これらの作用は、虚血性疾患、骨・軟骨疾患の他、組織再生を必要とする各種疾患治療に有用と考えられる。
 「Angiopoietin-2」は、哺乳動物の細胞で生成、分泌されるタンパク質であり、リンパ内皮細胞におけるリンパ管の形成、組織内の血管リモデリングにかかわることが知られている(Akwii et al., Cells 2019, 8, 471)。Angiopoietin-2は血管新生を必要とするような疾患や組織再生の治療に有用と考えられる。
 「IL-6」は、哺乳動物の細胞で生成、分泌されるタンパク質で、免疫反応及び組織炎症を増大させる炎症性サイトカインとして知られている。またIL-6は、老化した細胞が産生するSASP(細胞老化随伴分泌現象)と呼ばれる一連の炎症性サイトカイン群の代表因子であり、老化に伴う慢性炎症の原因と考えられている(Rolt et al., Biogerontology. 2019 Jun;20(3):359-371、Di et al., PLoS One. 2014 Nov 24;9(11):e113572)。このことから、疾患治療を目的として投与される細胞がIL-6を多く産生することは好ましくない。
 具体的には、本発明の幹細胞集団は、継代数2から8の間において、SCFをIL-6の少なくとも20分の1以上の重量比、好ましくは少なくとも10分の1以上の重量比、より好ましくは10分の1~2分の1の重量比、さらに好ましくは10分の1~3分の1の重量比、より好ましくは少なくとも5分の1以上の重量比、さらに好ましくは少なくとも3分の1以上の重量比で産生しうる(ただし、IL-6の産生量を超えない)。また、本発明の幹細胞集団は、継代数2から8の間において、1×106細胞あたり培養48時間で少なくとも、0.1ng、0.13ng、0.15ng、好ましくは少なくとも0.17ng、より好ましくは少なくとも0.20ngのSCFを産生しうる。
 従来公知の歯髄幹細胞のように、対象に投与する細胞自体がCD117陽性である場合、投与細胞により産生されたSCFはまず初めに自己もしくは他の投与細胞のCD117を介して、投与細胞自身に取り込まれてしまうため、本来作用すべき投与対象の内在性の細胞に対する作用効率が低下してしまう。本発明の幹細胞集団は、SCFの産生能が高く、かつCD117陰性であるため、組織再生を必要とする対象に投与した場合に、優れた組織再生効果を発揮しうる。
 すなわち、本発明の幹細胞集団は、継代数2から8の間において、CD117の陽性率が好ましくは3%未満、より好ましくは2%未満であり;かつSCFをIL-6の少なくとも20分の1以上の重量比、好ましくは少なくとも10分の1以上の重量比、より好ましくは少なくとも5分の1以上の重量比、さらに好ましくは少なくとも3分の1以上の重量比で産生しうる(ただし、IL-6の産生量を超えない)。
 本発明の幹細胞集団は、継代数2から8の間において、ANGPTL4をIL-6の少なくとも3倍以上、好ましくは少なくとも5倍以上の重量比、より好ましくは5倍~20倍の重量比、さらに好ましくは5倍~15倍の重量比、また、さらに好ましくは少なくとも10倍以上の重量比、特に好ましくは少なくとも20倍以上の重量比で産生しうる。また、本発明の幹細胞集団は、継代数2から8の間において、1×106細胞あたり培養48時間で少なくとも4ng、4.5ng、5.0ng、好ましくは少なくとも6.9ng、より好ましくは少なくとも7.0ngのANGPTL4を産生しうる。
 本発明の幹細胞集団は、継代数2から8の間において、BIGH3をIL-6の400倍以上、好ましくは450倍以上の重量比、より好ましくは450倍~1500倍の重量比、さらに好ましくは450倍~1000倍の重量比で産生しうる。また、本発明の幹細胞集団は、継代数2から8の間において、1×106細胞あたり48時間で少なくとも、400ng、450ng、500ng、好ましくは少なくとも550ng、より好ましくは少なくとも600ngのBIGH3を産生しうる。
ここで、本発明の幹細胞集団の培養上清中の各液性因子の重量比は、培養後の培養上清中に含まれる各液性因子量を測定することで求められる。
 本発明の幹細胞集団は、継代数2から8の間において、
 SCFをIL-6の少なくとも20分の1以上の重量比、好ましくは少なくとも10分の1以上の重量比、より好ましくは少なくとも5分の1以上の重量比、さらに好ましくは少なくとも3分の1以上の重量比で産生(ただし、IL-6の産生量を超えない)し; ANGPTL4をIL-6の少なくとも3倍以上、好ましくは少なくとも5倍以上の重量比、より好ましくは少なくとも10倍以上の重量比、さらに好ましくは少なくとも20倍以上の重量比で産生し;かつ BIGH3をIL-6の400倍以上、好ましくは450倍以上の重量比、より好ましくは450倍~1500倍の重量比、さらに好ましくは450倍~1000倍の重量比で産生しうる細胞集団である。
 本発明の幹細胞集団は、ヒト血小板溶解物(hPL)存在下でその他の動物由来成分(特にFBS)を含まない培地中で培養した場合、継代数2から8の間において、SCFをIL-6の少なくとも10分の1以上の重量比、好ましくは少なくとも5分の1以上の重量比、より好ましくは少なくとも2分の1以上の重量比、さらに好ましくは少なくとも3分の1以上の重量比で産生しうる(ただし、IL-6の産生重量を超えない)。また、本発明の幹細胞集団は、hPL存在下でその他の動物由来成分を含まない培地中で培養した場合、FBSを含む培地中で培養した場合に比して、SCFを少なくとも約3倍以上、好ましくは少なくとも約5倍以上、さらに好ましくは少なくとも約7倍以上の重量比で産生しうる。
 本発明の幹細胞集団は、ヒト血小板溶解物(hPL)存在下でその他の動物由来成分(特にFBS)を含まない培地中で培養した場合、継代数2から8の間において、ANGPTL4をIL-6の少なくとも約5倍以上の重量比、好ましくは少なくとも約10倍以上の重量比、さらに好ましくは少なくとも約20倍以上の重量比で産生しうる。また、本発明の幹細胞集団は、hPL存在下でその他の動物由来成分を含まない培地中で培養した場合、FBSを含む培地中で培養した場合に比して、ANGPTL4を少なくとも約3倍以上、好ましくは少なくとも約5倍以上、さらに好ましくは少なくとも約7倍以上の重量比で産生しうる。
 本発明の幹細胞集団は、ヒト血小板溶解物(hPL)存在下でその他の動物由来成分(特にFBS)を含まない培地中で培養した場合、継代数2から8の間において、VEGFをIL-6の少なくとも約2倍以上の重量比、好ましくは少なくとも約5倍以上の重量比、さらに好ましくは少なくとも約10倍以上の重量比で産生しうる。また、本発明の幹細胞集団は、hPL存在下でその他の動物由来成分を含まない培地中で培養した場合、FBSを含む培地中で培養した場合に比して、VEGFを少なくとも約2倍以上、好ましくは少なくとも約3倍以上、さらに好ましくは少なくとも約5倍以上の重量比で産生しうる。
 本発明の幹細胞集団はまた、hPL存在下でその他の動物由来成分を含まない培地中で培養した場合、FBSを含む培地中で培養した場合に比して、IL-6の産生量を抑えることができる。
 本発明の幹細胞集団は、SCF、ANGPTL4、BIGH3の産生能が高く、IL-6の産生比率が低いため、炎症反応のリスクが少なく、安全に組織再生効果を発揮しうる。
1.4 分化能
 本発明の幹細胞集団は分化多能性(multipotent)であり、後述する実施例に示すとおり、少なくとも、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、及び神経細胞に分化する能力を有する。目的細胞への分化誘導は、本明細書の実施例に開示するほか当該分野で公知の方法(例、Marion et al., Methods Enzymol. (2006); 420: 339-361、Wang et al., Molecular Medicine Reports (2016); 14: 5551-5555)にしたがい、本発明の幹細胞集団を目的細胞に応じた分化誘導因子の存在下で培養すればよい。
1.5 生理活性
 本発明の幹細胞集団は、組織再生に有用なサイトカインを高レベルで産生し、生体内又は生体外において、神経前駆細胞増殖作用、神経突起伸展作用、血管内皮細胞増殖作用、血管内皮細胞誘引作用、血管様構造体構築作用、免疫抑制作用などの生理活性(機能)を有する。
2.本発明の幹細胞集団の製造方法
 本発明の幹細胞集団は、ヒト歯髄から酵素的に細胞を単離し、前記細胞をヒト血小板溶解物(hPL)の存在下で、FBS(ウシ胎児血清)を含まない培地で培養し、コロニー形成する細胞集団を前記幹細胞集団として取得することにより、製造することができる。
 本発明で使用する「歯髄」は、乳歯又は永久歯のいずれの歯髄であってもよいが、取得の容易性からは、乳歯や親知らずなどの抜去歯の歯髄が好ましい。抜去歯は、抜歯後72時間以内、より好ましくは抜歯後48時間以内の歯を使用することが望ましく、特に好ましくは抜歯後48時間以内のヒト乳歯を使用することが望ましい。採取された歯髄から細胞集団を酵素的に単離する方法としては、例えば、コラゲナーゼを含む酵素、好ましくは、コラゲナーゼと中性プロテアーゼ(例えば、ディスパーゼ又はサーモリシン)で処理して細胞を分離し、遠心分離して単離する方法が挙げられる。採取された歯髄から細胞集団を単離する際には、哺乳類及びバクテリア由来の成分を含まない試薬による処理を行なうことが好ましい。
 単離された細胞は、ヒト血小板溶解物(hPL)の存在下で、他の動物由来血清成分、特にFBSを含まない培地で培養する。「ヒト血小板溶解物(hPL)」とは、ヒト血液から抽出した血小板を、freeze/thawサイクルにより溶解させて得られるもので、細胞培養に必要な各種の増殖因子やサイトカインが豊富に含まれている。ヒト血小板溶解物(hPL)の培地への添加量または培地中の含有量は特に限定されないが、初代培養の際は、約5~20%、好ましくは5~15%、より好ましくは7~15%、最も好ましくは約10%である。継代培養の際も同じである。
 なお、本明細書において、「約」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%まで変動する値を示す。好ましくは、「約」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ10%、5%、又は1%の範囲を示す。
 本発明で使用される「培地」は、他の動物由来未精製成分、特にFBSを含まなければ特に限定されないが、無血清培地を使用することが好ましい。本明細書において「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地であり、精製された血液由来成分や動物組織由来の因子(増殖因子)が混入している培地も、本発明の目的に反しない限り無血清培地に含まれる。無血清培地としては、例えば、血清を添加していない基本培地:例えば、αMEM培地、DMEM培地、BME培地、Eagle MEM培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、又はこれらの混合培地、市販の哺乳動物細胞用の無血清培地:例えば、MesenCult-ACF (STEMCELL Technologies)、STEMPRO MSC SFM (Thermo Fischer Scientific)、UltraCULTURE Serum-free (Lonza)等を挙げることができる。
 「培地」は、臨床使用のためには、哺乳動物由来の成分を含まないことが好ましく、特にanimal-freeであることが好ましい。
 本発明の幹細胞集団の製造法としては、抜歯後48時間以内のヒト乳歯を使用し、i)採取された歯髄から哺乳動物由来又はバクテリア由来成分を含まない試薬により酵素的に細胞集団を単離する工程、ii)単離された細胞集団を、ヒト血小板溶解物(hPL)の存在下で他の動物由来未精製成分(特にFBS)を含まない無血清培地で初代培養してコロニー形成させる工程、及びiii)得られたコロニーをhPLの存在下で、他の動物由来未精製成分(特にFBS)を含まない無血清培地で培養する工程、からなる方法が好ましい。
 「培地」は、本発明の目的を損なわない範囲で、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を適宜添加してもよい。例えば、栄養源としては、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等の無機塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム及び硫酸マンガン、各種ビタミン類、アミノ酸類等を含むことができる。
 上記の成分を配合して得られる培地のpHは6.0~9.0、好ましくは6.5~8.5、より好ましくは7.0~8.0の範囲である。
 歯髄から単離した細胞、及び本発明の幹細胞集団は付着培養される。容器は、細胞培養に使用されるものであれば特に限定されず、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルを使用することができる。
 細胞の播種密度は特に限定されないが、あまり高くなりすぎないほうが好ましい。例えば、乳歯1個の歯髄から抽出してきた細胞は、25~225 cm2、好ましくは75~150 cm2の面積に播種される。培養は、36℃~38℃、好ましくは36.5℃~37.5℃で、1%~25% O2、1%~15% CO2の条件下で、培地交換をしながら実施する。
 初代培養は、コロニーが形成され、成長し、剥離が確認されるまで行うことが好ましい。コロニーの剥離が確認されたら、フィルター等を用いて細胞を回収する。回収された細胞は、特別な分離手段なしに、均一性の高い幹細胞集団として取得される。
 幹細胞集団は、必要に応じてさらに継代培養(拡大培養)を行ってもよい。継代培養は初代培養と同じ培地を用いて実施する。継代は、接着培養時に60%コンフルエンシーに達したときに行なう。典型的には、初代培養細胞はコロニーの形成、成長、剥離を確認するため、少なくとも7日以上、好ましくは9日以上、より好ましくは9~15日間培養を行うが、継代後の細胞は、少なくとも1日以上、好ましくは2日以上、より好ましくは2~3日間培養すればよい。継代後の細胞の播種密度は特に限定されないが、あまり高くなりすぎないほうが好ましい。例えば、1000~2000 cells/cm2、好ましくは1300~1500 cells/cm2の密度で播種される。
 回収した幹細胞集団やその培養上清液は、安全のために、再度エンドトキシン試験、マイコプラズマ試験、無菌試験等を実施することが望ましい。
 製造された幹細胞集団は、必要に応じて、使用されるまで凍結保存(例えば、-152℃のディープフリーザーにて保存)してもよい。凍結保存は、例えば、上記細胞培養に用いた培地に適当な凍結保護剤を添加して行う。凍結保護剤としては、デキストラン、DMSO、市販の凍結保存液等を使用できる。
3.脳性まひの予防又は治療
 歯髄幹細胞は、脳性まひの予防又は治療効果、脳内での神経新生促進効果を有する。このため、歯髄幹細胞は、脳性まひの予防又は治療剤、神経新生促進剤の有効成分として利用することができる。本発明で用いる歯髄幹細胞は、例えば医薬として利用することが可能である。歯髄幹細胞は他の有効成分とともに利用してもよく、好ましくは、歯髄幹細胞を唯一の有効成分として利用する。
 好ましくは、本発明で用いる歯髄幹細胞は分化誘導を受けていない細胞であり、特に好ましくは神経細胞への分化誘導を受けていない細胞である。また、歯髄幹細胞は、種々公知の方法によって遺伝子改変を行なうことができるが、本発明で用いる歯髄幹細胞は好ましくは遺伝子改変されていない細胞である。
 脳性まひとは、受胎から新生児期(生後4週間以内)までの間に生じた児の脳での神経細胞死を含む非進行性病変に基づく、出生後の児の永続的かつ変化しうる運動又は姿勢、或いは記憶学習の異常である。ただし、進行性疾患、一過性の運動障害又は将来正常化するであろうと思われる運動発達遅滞は除かれる。脳の病変部位により障害の症状や程度には個人差がみられるが、手足の硬直(痙直型)、手足の過剰な動き(アテトーシス型)、筋トーヌスの低下(失調型)といった分類が存在する。合併症として、精神発達遅滞やてんかん、間接拘縮、脊椎側弯症が知られている。
 脳性まひは、出生前であれば脳の形成異常や胎内感染、周産期であれば低血糖や頭蓋内出血、早産、新生児仮死(HIE)、新生児期であれば脳炎、髄膜炎等への感染に起因するが、なかでも周産期における障害(周産期脳障害)が原因となる場合が多い。
 脳性まひの種類は、特に制限されない。各種原因による脳性まひが予防又は治療対象となる。歯髄幹細胞は、好ましくは周産期脳障害に起因する脳性まひ症状、特に、低酸素及び/又は虚血に起因する脳性まひの症状の発現の予防及び当該症状の治療に対して有効である。当該治療は、例えば周産期に新生児仮死であった及び/又は脳室周囲白質軟化症と診断された時に提供されてもよく、遠隔期(出生後6カ月以降)に提供されてもよいが、特に好ましくは遠隔期の脳性まひに対して提供される。 本発明の予防又は治療剤は、例えば脳性まひが疑われる対象(例えば周産期に新生児仮死であった及び/又は脳室周囲白質軟化症と診断された対象)に予防的に用いてもよく、脳性まひ症状を有する対象における症状の進行の抑制、改善のために用いてもよい。本発明の予防又は治療剤は、好ましくは、脳性まひ症状を有する対象における運動機能及び/又は記憶学習機能の改善のため、及び/又は対象の脳での神経新生促進のために用いることができる。より好ましくは、本発明の予防又は治療剤は、脳性まひ症状を有する対象における運動機能及び記憶学習機能の改善のために用いることができ、さらに好ましくは、本発明の予防又は治療剤は、脳性まひ症状を有する対象における運動機能及び学習機能の改善および脳での神経新生を促進するために用いることができる。
 神経新生とは神経幹細胞から新たな神経細胞が産出される現象であり、哺乳類の発生期だけでなく成体においても海馬歯状回や脳室下帯といった特定の領域で神経新生が生じることが知られている(Gage, J. of Neuroscience, February 1, 2002, 22(3): 612-613)。周産期障害等で脳障害が生じると、脳室下帯や海馬歯状回の神経幹細胞が増殖し、その一部は脳受傷部位に遊走する補償機構が機能するが、同時にこのような神経幹細胞の増殖や遊走は受傷後ある程度の時間経過(動物モデルの観察からは、平均して約ひと月)ののちは減少することが知られている(Visco et al., Experimental Neurology 340 (2021) 113643)。そのため脳性まひの脳障害は上述のような生体に備わる補償機構のみでは回復させることができない(Visco et al., Experimental Neurology 340 (2021) 113643、Chen et al., Frontiers in Pediatrics (2022) 10:986452)。
 本出願において本発明の予防又は治療が「神経新生を促進」するとは、脳性まひの対象において、脳組織(特に前述のような脳室下帯や海馬歯状回)での神経幹細胞の増殖及び/又は神経細胞の増加を、本発明の予防又は治療剤が投与されなかった場合よりも顕著に増加させることをいう。
 脳内の神経新生はブロモデオキシウリジン(BrdU)やダブルコルチン(DCX)、Ki-67などのマーカーを組み合わせて検出することができる。また、NeuNは脳組織内の成熟ニューロンを検出することができる。
 本発明の予防又は治療剤は、例えば脳性まひの症状が発現していなくても発症が疑われる対象に投与されてもよく、脳性まひの症状を有する対象に投与されてもよく、脳性まひと診断された対象に投与されてもよい。脳性まひの発症が疑われる対象としては、例えば周産期に低酸素状態であった対象、虚血であった対象、新生児仮死であった対象、脳室周囲白質軟化症と診断された対象などが挙げられる。本出願において「脳性まひの症状を有する対象」とは、脳性まひの症状を1つ以上発現している対象であり、脳性まひと診断されていても診断される前であってもよい。
 本発明の予防又は治療剤は、上記有効成分を含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではない。他の成分としては、薬理作用を有する成分のほか、添加剤も含まれる。他の成分としては、例えば担体ないし媒体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水、アルブミン、培地、抗生物質、pH調整剤、成長因子、ホルモン等が挙げられる。担体ないし媒体としては、例えば生理食塩水、リンゲル液、適当な緩衝液(例えばリン酸系緩衝液)等が挙げられる。
 本発明の予防又は治療剤の適用対象は特に限定されないが、哺乳動物では、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ等が挙げられる。
 適用対象は、好適にはヒトである。ヒトの場合、幼児期以降(1歳以上。例えば2歳以上、3歳以上、4歳以上、5歳以上、又は6歳以上)に投与するように用いることができる。また、適用対象は、脳性麻痺の症状を有する対象、例えば脳性麻痺の症状を有すると診断された対象であることができる。本発明の予防又は治療剤は、上記対象に投与しても、脳性まひの治療効果等を発揮することができる。
 本発明の予防又は治療剤の投与経路としては、例えば静脈内注射(点滴を含む)、動脈内注射、門脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経鼻投与等が挙げられる。全身投与によらず、局所投与することにしてもよい。局所投与として、脳組織への直接注入を例示することができる。本発明の予防又は治療剤を注射剤として投与する場合、歯髄幹細胞は細胞培養液、生理食塩水、複合電解質液等に懸濁して投与することができる。これら懸濁液には血清、アルブミン、デキストラン、ジメチルスルホキシド、凍結保存液等が含まれていてもよい。
 本発明の予防又は治療剤中の歯髄幹細胞の含有量、及び投与スケジュールは、対象(患者)の性別、年齢、体重、病態などを考慮して作成すればよい。歯髄幹細胞の含有量は、1回の投与当たり、例えば1×105~1×1011個/kg体重であることができる。単回投与の他、連続的又は定期的に複数回投与することにしてもよい。投与回数は、2~20回(好ましくは2~10回、2~5回)が適当である。投与間隔は、1日~4週間の間で選択することができ、好適には7日~24日、10日~18日である。複数回投与により、脳性まひ症状を有する対象における、運動機能及び/又は記憶学習機能をより顕著に改善し、及び/又は脳内の神経新生を顕著に促進することができる。
 以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
 試験例1.ヒト乳歯歯髄幹細胞の調製
 ヒト脱落乳歯より乳歯歯髄幹細胞を調製した。具体的には次のようにして行った。ヒト乳歯から歯髄を掻き出し、細断後、最終濃度0.05 mg/mlのリベラーゼ(Roche)を添加し、37℃で撹拌しながら15分間処理した。細胞を含む反応上清を回収し、残りの歯髄組織にさらに0.05 mg/mlのリベラーゼを加え、37℃で撹拌しながら15分間処理した。処理した歯髄組織から細胞を70 mmストレイナーを通して回収し、先に回収した上清と合わせて遠心分離した。回収した細胞を10%hPLを含むMEMα (Gibco)を用いて培養容器に播種し、コロニーが形成、成長、剥離するまで9日間以上、単離培養を行った。培地交換は播種2日後と9日後に行った。コロニーの剥離が確認されたら、TrypLE Select(Gibco)を用いて細胞を回収し、同培地を用いて拡大培養を行った。
 試験例2.乳歯歯髄幹細胞による脳性まひ治療効果の評価
 <試験例2-1.脳性まひモデルラットの作製>
 HIEモデル(Rice-Vannucciモデル)を作製した。具体的には、7日齢の雄Wistar/STラットに対して、左総頸動脈結紮及び低酸素負荷(O2 8% 60分)を行った。また、同時に、偽手術群(Sham群)のラットも作製した。
 <試験例2-2.行動試験による群分け>
 試験例2-1で作製されたモデルラットに対して、25~28日齢において、Horizontal Ladder testを行った。具体的には、ラットに水平の梯子上を歩行させ、麻痺足の歩容を1~4点(0点:正常歩行、1点:梯子上で麻痺足を滑らせるが足は落下しない、2点:梯子から麻痺足を落下させるが、次の歩行が正常、3点:梯子から麻痺足を落下させ、次の歩行も正常ではない、4点:両足を梯子から落下させる)でスコアリングし、1歩行あたりのスコア(score/step)を算出した。Sham群と比較して有意に異常所見を認めた個体のみを選抜した。選抜されたモデルラットについて、上記試験のスコアが同程度となるように、2群(細胞投与(Cell)群と媒体(Vehicle)群)とに分けた。
 <試験例2-3.細胞投与>
 細胞投与群に対して、35日齢において、1×106cellsの乳歯歯髄幹細胞(試験例1)を尾静脈より投与した(単回投与)。また、別のバッチの試験において、細胞投与群に対して、35日齢、49日齢、及び63日齢それぞれにおいて、1×106cellsの乳歯歯髄幹細胞(試験例1)を尾静脈より投与した(複数回投与)。一方で、Vehicle群に対しては、乳歯歯髄幹細胞を含まない培地のみを、細胞投与群と同様に投与した。
 <試験例2-4.評価試験>
 細胞投与群、Vehicle群、及びSham群に対して、Horizontal Ladder test、Cylinder test、及びShuttle avoidanceを行った。
 Horizontal Ladder testの方法は試験例2-2と同様である。
 Cylinder testにおいては、円筒内にラットを入れ、ラットが立ち上がって壁に前肢をつく際の肢[左(健側)、右(患側)、両側]を記録し、患側肢使用率を評価した。スコアは、式:(L-R) / (L+R+B) (L:左側、R:右側、B:両側) によって算出した。受傷が強いほど、右(患側)肢を使用する割合が減少(スコアが上昇)する。
 Shuttle avoidanceにおいては、ケージ内にラットを入れ、光と音で警告し、回避しないと電気刺激を行った。これを繰り返すことで記憶学習能力を評価した。連続2日間、1日あたり10×6セット(計60回)試行し1セット毎の回避率(Avoidance rate)を評価した。
 Horizontal Ladder testの結果を図1~3に示す。乳歯歯髄幹細胞の投与によりHorizontal Ladder testで評価される運動機能が改善していることが分かった。また、複数回投与の場合の方が、改善効果がより強い傾向であった。
 Cylinder testの結果を図4に示す。乳歯歯髄幹細胞の投与によりCylinder testで評価される運動機能が改善していることが分かった。また、単回投与に比べて、複数回投与の場合の方が、顕著な改善効果を示した。
 Shuttle avoidanceの結果を図5に示す。乳歯歯髄幹細胞の投与によりShuttle avoidanceで評価される記憶学習機能が改善していることが分かった。また、単回投与に比べて、複数回投与の場合の方が、顕著な改善効果を示した。
 試験例3.体重及び脳重量比の測定
 試験例2の各群について、体重、及び試験終了時(110日齢)の脳重量比(大脳重量/小脳+脳幹重量)を測定した。
 体重の測定結果を図6に示し、脳重量比の測定結果を図7に示す。Sham群の体重は有意に高値を示したが、Cell群・Vehicle群に差は認めなかった。脳重量比(大脳重量/小脳+脳幹重量)はVehicle群で有意に低値となった。
 試験例4.標的タンパク質の網羅的評価によるメカニズム解析
 試験例2の複数回投与と同様に、乳歯歯髄幹細胞を複数回投与した。最後の細胞投与の2週間後に脳をホモゲナイズし、抽出したタンパク質を液体クロマトグラフィー質量分析(LC/MS)により網羅的に解析した。解析を行った全タンパク(n=1696)のうち、Vehicle群・細胞投与(Cell)群で6サンプル中5サンプル以上検出感度以下のタンパク質を除外(n=204)した。Vehicle群 vs 細胞投与群で有意な変動を認めたタンパク質が61種類得られた(p-value<0.05(student`s t-test) FDR<0.1 (Storey method))。これらは、HIEによる影響を除き、乳歯歯髄幹細胞投与によって影響を受けたと考えられるタンパク質群である。DAVIDを用いたGO解析を行い、Enrichment score>2となったクラスターを抽出した結果、神経新生、細胞の形態形成、軸索の新生、リン酸化プロセス、に関わるタンパク質が濃縮された。
 試験例5.量子ドットを用いた乳歯歯髄幹細胞の体内動態評価
 量子ドットでラベル化した乳歯歯髄幹細胞(1×106cells/body)をラットの尾静脈より投与した。細胞静注後、4つのTime point(A:静注後1時間、B:1日、C:2日、D:1週間)で評価を行った。各time pointで標的臓器(脳)を取り出し、in Vivo Imaging Systemを使用して蛍光強度を評価した。蛍光強度に基づいて、蛍光強度比=Cell群の各個体の蛍光強度 /各time pointのVehicle群の蛍光強度の平均値 を算出した。結果を図8に示す。
 試験例6.乳歯歯髄幹細胞を用いた、神経新生作用評価
 <試験例6-1:神経新生マーカー> 試験例2-1~2-3と同様にしてHIEモデル(Rice-Vannucciモデル)ラットに乳歯歯髄幹細胞を複数回投与した。細胞を3回目に投与した日の翌日より、Bromodeoxyuridine (BrdU) 50mg/kgを1日1回、計3日間腹腔内投与した。
 細胞3回目投与後2週間の時点で、ラットをParaformaldehyde (PFA) 灌流固定に付し、脳組織を採取してパラフィンブロックに包埋した。このブロックを薄切して脳組織切片を作成後、(1)抗BrdU抗体を用いた免疫組織学的染色と(2)抗BrdU抗体と抗Doublecortin (DCX) 抗体による蛍光二重免疫染色を行った。
 それぞれの切片で受傷側の海馬歯状回と脳室下帯を評価し、BrdU陽性細胞数、及びBrdU陽性細胞に占めるBrdU/DCX二重染色陽性細胞の割合を計測した。
 その結果、抗BrdU抗体による免疫組織学的染色では細胞投与(Cell)群において、受傷側海馬歯状回の最内層と側脳室上衣下層及び線条体にBrdU陽性細胞を認めた。また、蛍光二重染色では受傷側海馬歯状回におけるBrdU/DCX二重染色陽性細胞の割合が細胞投与群において有意に増加した(図9)。さらに、細胞投与群では、BrdU陽性細胞数が有意に増加した(図10)。
 <試験例6-2:神経マーカー>
 試験例2にて行動実験を実施した個体(Vehicle群、Cell群、Sham群)を、生後4か月齢の時点でPFA灌流固定し、脳組織を採取してパラフィンブロックに包埋した。このブロックを薄切し、脳組織切片を作成後、抗NeuN抗体を用いた免疫組織学的染色を実施した。これらの切片における受傷側海馬歯状回のNeuN陽性細胞数をStereology法を用いて計測した。
 その結果、海馬歯状回でのNeuN陽性細胞数は、Vehicle群に対して細胞投与群では有意に高値を示した(図11)。
 本試験結果から、静脈内投与された歯髄幹細胞が投与対象の脳内に移行しうることが示された。また、歯髄幹細胞を投与することにより、受傷した脳内、特に海馬歯状回において、神経新生が促進されることが示された。
 本発明に示す試験結果から、脳性まひの個体に対して乳歯歯髄幹細胞を投与することによりみられる運動機能、記憶学習の改善には神経新生が関与していると考えられる。
 試験例7.周産期低酸素性虚血性脳症に対する効果
 <試験例7-1:歯髄幹細胞の調製>
 試験例1と同様にして、 無菌環境下で、抜歯後48時間以内の抜去歯(ヒト乳歯)から歯髄を掻き出し、細断後、最終濃度0.05 mg/mlのリベラーゼ(MNP-S GMP Grade, Roche)を添加し、37℃で撹拌しながら15分間処理した。細胞を含む反応上清を回収し、残りの歯髄組織にさらに0.05 mg/mlのリベラーゼを加え、37℃で撹拌しながら15分間処理した。処理した歯髄組織から細胞を70 mmストレイナーを通して回収し、先に回収した上清と合わせて遠心分離した。回収した細胞を10%hPL (AventaCell BioMedical)を含むMEMα (Gibco)を用いて培養容器(CellBind T75フラスコ)に播種し、コロニーが形成、成長、剥離するまで9日間以上、単離培養を行った。培地交換は播種2日後と9日後に行った。コロニーの剥離が確認されたら、TrypLE Select(Gibco)を用いて細胞を回収し、同培地を用いて拡大培養を行った。
 <試験例7-2:脳性まひモデルラットでの評価試験>
 7日齢のWistar/STラットに対し、麻酔下、左頸動脈を結紮し、1~2時間置いた後、低酸素(8%O2)環境に1時間置くことで、新生仔ラット低酸素性虚血性脳症モデルを作製した。翌日、溶媒または本発明ヒト歯髄幹細胞を静脈内に1x105個投与することで、周産期低酸素性虚血性脳症に対する運動機能改善作用を検討した。具体的には、投与から41日後にロータロッド試験を実施し、ロッドから落下するまでの潜時を測定することで、四肢の運動協調性と持久力を評価した。
 その結果、偽処置群(正常群、Sham)と比べ、溶媒投与群(Vehicle)では落下潜時が大きく短縮、すなわち運動機能の明らかな障害を認めたが、細胞投与群(Cell)では落下潜時はほとんど短縮せず、運動機能の回復が認められた(図12)。このことから、本ヒト歯髄幹細胞は、周産期低酸素性虚血性脳症に対し、臨床で実施可能な経路およびタイミングでの投与により、比較的早い期間で、脳性麻痺の症状を回復させ得ると考えられた。
 試験例8.重症周産期低酸素性虚血性脳症に対する効果
 出産7日目のSDラットに対し、麻酔下で右総頚動脈を結紮後に切断し、低酸素(8%O2)環境に105分間置くことで、新生仔ラットの重症低酸素性虚血性脳症モデルを作製した。また同時に偽処置群も作製した。35日齢の時点でロータロッド法にて群分けし、偽処置群(Sham)、溶媒投与群(Vehicle)及び細胞投与群(Cell)の3群を設定した。5週齢、7週齢、9週齢及び11週齢(2週間間隔で4回)の時点で、本発明ヒト歯髄幹細胞を(1×107個/kg)を尾静脈内投与した。13週齢時にシリンダーテストをブラインド下で実施した。14週齢時に動物を安楽死させた後、各群の半数例(偽処置群5例、溶媒投与群及び細胞投与群各6例)について全脳を摘出した後に4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で組織を固定した。大脳組織標本を常法に従いパラフィン包埋・薄切し、全例についてHE染色及びmyelin basic protein(MBP)免疫染色を施した。溶媒投与群及び細胞投与群ともに殆どすべての個体で障害側(右側)の大脳の大部分が欠損していたために、非障害側の左大脳組織についてMBPの総長についてブラインド下で画像解析を実施した。
 シリンダーテストの結果、細胞投与群では、溶媒投与群と比較して障害側脳で支配される左前肢の使用割合が有意な高値を示し、細胞投与による運動機能障害の改善作用が認められた(図13A)。細胞投与と大脳組織の組織学的変化との関連性を検討する目的でMBPの免疫染色を実施し、その染色像から神経線維長を算出した。溶媒投与群に比較して、細胞投与群で総神経線維長の有意な増加が認められた(図13B)。以上のことから、本試験条件下において、本ヒト歯髄幹細胞は非障害側の大脳において神経線維を伸長(又は増加)させて傷害側の左前肢の機能回復に寄与している可能性が考えられる。
 以上より、重症の周産期低酸素性虚血性脳症に対し、臨床で実施可能な投与経路、投与タイミングでの反復投与により、脳性麻痺の運動機能障害を改善し、その作用機序の一部に非障害側での神経伸長が寄与することが示された。
 試験例9.表面マーカー解析
 試験例1と同様にして抜去乳歯から調製した8ドナー分のヒト歯髄幹細胞について、ドナー毎にそれぞれ1x105個を、フィコエリスリン(PE)で標識した各種表面マーカーの抗体(CD117(#313204)、CD31(#303105)、CD34(#343606)、CD45(#368510)、CD90(#328110)、CD105(#323206)、CD73(#344004)、CD325 (#350806)、CD49d (#304303)、CD51 (#327909)、CD29(#303003)、CD44(#338807)、CD166(#343904)、CD106(#305805)いずれもBiolegend社製)と反応させ、フローサイトメトリーを用いてデータを取得した。解析は、isotype control抗体の陽性率が1%前後となるようゲーティングした上で、各種表面マーカーの陽性率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 その結果、CD117、CD325およびCD45については、いずれのドナー細胞も陽性率は5%未満であり、陰性と判定された。CD73、CD90、CD105、CD49dおよびCD51については、いずれのドナー細胞も陽性率は96%以上であり、陽性と判定された
 試験例10.サイトカイン産生
 本ヒト歯髄幹細胞を10%hPL/MEMαまたは10%FBS/MEMαで7日間継代培養した後、6-well plateに5.76x105 cells/2.5 ml/wellとなるよう、同培地を用いて播種し、翌日、hPL不含FBS不含フェノールレッド不含MEMα 2.5 ml/wellに置換した。48時間後に培養上清を回収し、分注して-80℃で保管した。凍結サンプルを融解し、サンプル中のSCF、ANGPTL4、BIGH3及びIL-6濃度をそれぞれ、Multiplex HGF panel(Biolegend, #740180)、Human ANGPTL4 assay kit (IBL, #27749)、Human beta IG-H3 ELISA (abcam, #ab220651)及びMultiplex Neuroinflammatory panel(Biolegend, #740796)を用いて測定し、IL-6に対する濃度比をそれぞれ算出した(表2及び表3)。また、培養上清量及び播種細胞数から、細胞培養液中に含まれる各種因子の量を1x106細胞当たりの産生量として算出した(表4及び表5)。
 その結果、10%hPL/MEMαで継代培養後の歯髄幹細胞の培養上清では、10%FBS/MEMαで継代培養後の歯髄幹細胞の培養上清と比べ、SCF、ANGPTL4、BIGH3のいずれにおいても、IL-6に対する濃度比、および1x106細胞当たりの産生量が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 試験例11.神経新生に対する効果
 <試験例11-1:神経幹細胞との共培養実験>
 成獣ラットの海馬歯状回から回収された神経幹細胞(NSC)(Sigma-Aldrich社、SCR022)を付属プロトコルに準じて24ウェルプレートで初代培養(培地:DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) 100ml、B-27 Supplement (50X)  serum free 2.0ml、GlutaMAX Supplement 1.0ml、Basic fibroblast growth factor(0.1mg/ml) 20μl)し、以降の実験に用いた。
 NSCの初代培養から24時間経過後に、NSCが播種(1×10^4 cell/well)された各Wellに、試験例1と同様にして得られたヒト乳歯由来歯髄幹細胞(SHED)、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)又はヒト皮膚線維芽細胞(Fibroblast)をインサート(コーニング社 カルチャーインサート24ウェル用0.4μm PET 透明、品番353095)に播種(各々2×10^4 cell/well)したものを乗せ、無血清培地(Gibco社、MEM α nucleosides no phenol red INV 品番 41061029)下で共培養した。なお、共培養のコントロールとしては、NSCのみを培養したものを用いた。
 <試験例11-2:細胞染色>
 共培養開始後48時間の時点で、細胞上清を回収し、プレート上の細胞をPFAで固定した。これらの細胞を、Hoechst(核)、抗SOX2抗体(神経細胞マーカー)、及び抗S-100抗体(アストロサイトマーカー)で染色した。染色の結果、細胞はSOX2陽性であったが、S-100陽性のものはほとんどみられなかった。このことから、48時間の培養において、SHEDがNSCの分化誘導には影響を及ぼしていないことが確認された。
 <試験例11-3:細胞増殖率の評価>
 試験例11-2で染色した細胞をStereology法にてSOX2陽性細胞をカウントし、コントロールの細胞数で標準化することで細胞増殖率(growth rate)を算出した。
その結果、SHEDが最も高いNSCの増殖効果を示すことが示された(図14)。
 <試験例11-4:培養上清中のBCNF濃度の評価>
 試験例11-3で行なった共培養について、細胞固定前に回収したNSC培養側の培養上清中の脳由来栄養因子(BDNF)の濃度をELISAにより測定した。その結果、SHEDとの共培養において、培養上清中のBDNF濃度が優位に高いことが示された(図15)。
 以上の結果から、SHEDはNCSとの共培養により、NSCの増殖に寄与していることが示され、その効果はBM-MSCやFibroblastを上回ることが分かった。
 加えて、SHEDと共培養したNSCの培養上清には多くのBDNFが含まれることが示された。「BDNF」(Brain-Derived Neurotrophic Factor)は、哺乳動物の細胞で生成、分泌されるタンパク質で、哺乳動物の脳内に広く分布している。BDNFは神経栄養因子の一つであり、神経細胞の発生や伸長を促し、シナプス機能の調整に介在することが知られ(Kowianski et al., Cell Mol Neurobiol (2018) 38:579-593)、神経保護作用(Lau et al., Cell Reports (2015)12:1353-1366、Numakawa et al., Histol Histopathol (2010) 25:237-258)を有することが報告されている。これらの作用は、神経変性疾患の他、神経組織再生を必要とする各種疾患の治療に有用と考えられる。
 本試験の結果から、SHEDには、脳神経組織の変性部位において、残存するNSCに対してBDNFの産生などを通じてその増殖を促進することで、神経新生に寄与する可能性が示された。
 本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

 

Claims (15)

  1.  歯髄幹細胞を含有し、脳性まひの症状を有する対象に投与される、脳性まひの予防又は治療剤。
  2.  前記脳性まひが遠隔期の脳性まひである、請求項1に記載の予防又は治療剤。
  3.  前記遠隔期が幼児期以降である、請求項2に記載の予防又は治療剤。
  4.  複数回投与される、請求項1に記載の予防又は治療剤。
  5.  前記歯髄幹細胞がヒト乳歯歯髄幹細胞である、請求項1に記載の予防又は治療剤。
  6.  前記脳性まひが低酸素及び/又は虚血に起因する脳性まひである、請求項1に記載の予防又は治療剤。
  7.  前記脳性まひが、周産期脳障害に起因するものである、請求項1に記載の予防又は治療剤。
  8.  脳性まひの症状を有する対象の運動機能及び/又は記憶学習機能の改善のために用いるための、請求項1に記載の予防又は治療剤。
  9.  対象がヒトである、請求項1に記載の予防又は治療剤。
  10.  対象において脳の神経を新生させる、請求項1に記載の予防又は治療剤。
  11.  前記歯髄幹細胞が、その90%以上がCD117陰性、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105陽性で特徴づけられる、ヒト乳歯歯髄由来の幹細胞集団からなる、請求項1に記載の予防又は治療剤。
  12.  前記幹細胞集団が、その90%以上がCD325陰性であるか、CD51陽性である、請求項11に記載の予防又は治療剤。
  13.  前記幹細胞集団が、下記1)~3)の少なくとも1つの特性を有する、請求項11に記載の予防又は治療剤:
    1)SCF(幹細胞因子)をIL-6の10分の1以上の重量比で産生する、
    2)ANGPTL4(アンジオポエチン様4)をIL-6の5倍以上の重量比で産生する、
    3)BIGH3(ベータ誘導トランスフォーミング成長因子)をIL-6の450倍以上の重量比で産生する。
  14.  前記幹細胞集団が、下記1)~3)の少なくとも1つの特性を有する、請求項11に記載の予防又は治療剤:
    1)1×106細胞あたり48時間で少なくとも0.1ngのSCF(幹細胞因子)を産生する、
    2)1×106細胞あたり48時間で少なくとも500ngのBIGH3(ベータ誘導トランスフォーミング成長因子)を産生する、
    3) 1×106細胞あたり48時間で少なくとも5ngのANGPTL4を産生する。
  15.  前記幹細胞集団が、ヒト歯髄から酵素的に単離した細胞を、ヒト血小板溶解物の存在下で、FBS(ウシ胎児血清)を含まない培地で培養することにより取得されたものである、請求項11~14のいずれか1項に記載の予防又は治療剤。

     
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